Estimación de Biomasa en Un Proceso Batch: Aplicación A La Producción de - Endotoxinas de BT

XXII IACChE (CIIQ) 2006 / V CAIQ
ESTIMACIÓN DE BIOMASA EN UN PROCESO BATCH:

APLICACIÓN A LA PRODUCCIÓN DE ∂ - ENDOTOXINAS DE BT
A. N. Amicarelli *, F. A. di Sciascio *, H. D. Álvarez§ y O. Ortiz +.

*Instituto de Automática (INAUT). Universidad Nacional de San Juan.
E-mail:{amicarelli;fernando}@inaut.unsj.edu.ar
§
Escuela de Procesos y Energía. Facultad de Minas. Grupo de Automática.
Universidad Nacional de Colombia. E-mail: hdalvare@unalmed.edu.co
+Instituto de Ing. Química. Universidad Nacional de San Juan.
E-mail: rortiz@unsj.edu.ar
Resumen: La biomasa es una variable fundamental en los procesos biológicos,

incluso en ocasiones constituye el producto del proceso como en la producción de
∂ - endotoxinas de Bacillus thuringiensis (Bt) donde encuentra aplicación el
trabajo. Algunos estados pueden ser medidos en línea, pero normalmente la
biomasa no es susceptible de tal medición o es económicamente muy costosa.
Frecuentemente se pretende conocer estimaciones confiables de biomasa, por ello
en este trabajo se proponen dos observadores de estado a tal fin. El primero se
basa en el modelo de la dinámica de Oxígeno Disuelto (OD) para un bioproceso y
el segundo por medio de una Red Neuronal Artificial (RNA). A efectos de diseñar
el observador de estado basado en la dinámica de OD, se incorpora esta dinámica
al modelo fenomenológico del proceso proponiéndose un modelo basado en
primeros principios. Finalmente se analiza la fusión sensorial de los estimadores
de manera de comparar la estima de la variable a través de cada observador con la
proporcionada por un filtro de Kalman descentralizado.
Palabras claves: Observación de Estados, Procesos por Lotes, Modelado en

Bioprocesos
AAIQ Asociación Argentina de Ingenieros Químicos

IACCHE - Interamerican Confederation of Chemical Engineering
1. Introducción
La estimación de la biomasa en bioprocesos es un problema vigente debido a la

dificultad de obtener mediciones en línea de esta variable. En la literatura se utilizan
diferentes términos, para referirse a los observadores de estado: “softsensors”,
“software sensor”, “sensor virtual”, “observadores de estado”,” estimadores de
estado”,”sensor basado en modelo”,”sensor indirecto” y”filtros". Diversos autores
proponen definiciones para estos términos (Boillereaux L. y Flaus J, 2000; Bernard O.,
2001; Herbst J. y Pate W., 1999; Adilson J. y Rubens M., 2000) pero lo común a toda
la terminología empleada es su significado: la imposibilidad o dificultad para obtener
mediciones de ciertos estados y su posible inferencia a partir de otras variables del
proceso susceptibles de ser medidas en línea. El uso de observadores de estado en
procesos por lotes debe atender a las características particulares que poseen estos
procesos, sobre todo su variabilidad e incertidumbre. Russell S. et al (2000) asegura que
el problema de control de calidad en procesos batch y semibatch se puede reducir a la
estimación de los estados del proceso a partir de las condiciones iniciales y de proceso.
Dondo R. y Marqués D. (2002) enumeran algunas características. Se pueden mencionar
varios trabajos en donde se realiza estimación de estados en bioprocesos: Silveira M. y
Molina M. (2005) utilizan un modelo matemático basado en parámetros de respiración a
partir del balance de oxígeno para la estimación de la biomasa en Bt. Leal R. et al
(1997) realizan la estimación de biomasa a través de una red neuronal artificial.
Dochain D. (2002) propone un observador de estados para un bioproceso con cinética
de estructura conocida pero donde los parámetros cinéticos son desconocidos, propone
el uso de estos parámetros como parámetros extras de diseño para garantizar un error de
estado estacionario igual a cero. El autor divide a los observadores en dos clases: los
clásicos como el de Luenberger, Kalman y los asintóticos. La primera clase depende
completamente de la precisión del modelo, la segunda supone que la incertidumbre del
modelo radica en la cinética de los bioprocesos. En los trabajos de Leal R. et al (1997,
2001) se realiza la estimación de biomasa en un bioproceso usando como observador
diferentes RNA y provocando luego la fusión sensorial. Dorsey A. y Lee J., (2003)

abordaron el problema del desarrollo de modelos inferenciales para la predicción de

variables en procesos discontinuos empleando técnicas de identificación por
subespacios. Wang W. y Zhiqiang G. (2003) presentan un estudio de comparación de
desempeño entre las características de tres observadores: el de alta ganancia, el sliding-
mode y observadores extendidos. El observador extendido es más robusto. La
incertidumbre en el modelo y los parámetros hace que surjan los observadores
asintóticos los cuales no requieren el conocimiento perfecto del modelo, pero estos
observadores presentan gran dependencia de las condiciones de operación (Dochain D.,
2003).
Las dinámicas normalmente incorporadas al modelo fenomenológico de un
bioproceso son: variación de la concentración de biomasa (dX / dt ) , variación del
volumen del reactor (dV / dt ) , variación de la concentración de sustrato (dSp / dt ) ,
(dSs / dt ) (primario y eventualmente secundarios) y variación de la concentración de
producto (dP / dt ) (Ieroham S., 2003). Estos modelos suelen incorporar ecuaciones
algebraicas, la más utilizada es la de Monod (Monod J., 1949). El papel que desempeña
el Oxígeno Disuelto (OD) en los bioprocesos no es tratado frecuentemente en la
literatura, más bien es una excepción. Znad H. et al (2004) modelan la dinámica del OD
en el modelo de fermentación para la producción de ácido glucónico a través de
Aspergillus Niger. Nielsen D. et al (2003) presentan una correlación empírica para
representar el coeficiente de transferencia de oxígeno de un biorreactor. Existen
numerosos trabajos donde se modela la dinámica de OD pero la aplicación no se
encuentra en el área de bioprocesos (Lee J. et al, 1991; Gaudenta S., 2001; Radwan M.
et al, 2003; Donald D. et al, 2004). La dinámica de OD no es importante para los
microorganismos anaerobios, pero en el caso de los aerobios si lo es, sólo que muchos
procesos intentan asegurarse el suministro de oxígeno con un exceso del mismo y/o con
un control del OD en el medio, esto ocurre en el trabajo de Atehortúa P. et al (2005,
2006). Moraes I. et al (1981) reportan datos para la concentración crítica de oxígeno en
Bt, pero en estos trabajos no se tiene en cuenta que altas concentraciones de OD tienen
un efecto positivo sobre la formación de compuestos de O2 tóxicos para Bt que

generalmente producen un decaimiento bacteriano. Por otro lado, un bajo porcentaje de

OD produce la “inhibición por oxígeno” de los bioprocesos.
El trabajo se organiza de la siguiente manera: en la sección 2 se presenta el proceso
donde se implementan los resultados obtenidos, las herramientas y métodos empleados
en el modelado de la dinámica que se incorpora al proceso, como las usadas en el
desarrollo de los observadores de estado propuestos. En la sección 3 se presentan
resultados y discusión sobre el modelado de la dinámica del oxígeno disuelto (OD) y
sobre dos observadores propuestos. En la sección 4 se realiza un análisis de la estima
brindada por los observadores propuestos y la entregada por la fusión a través de un
filtro de Kalman descentralizado. Finalmente, en la sección 5 se exponen las
conclusiones.
2. Materiales y Métodos
2.1 Características del microorganismo y la planta
El proceso biotecnológico de interés corresponde a la producción de δ-endotoxinas

de Bacillus thuringiensis (Bt). Ésta es una bacteria formadora de esporas, la cual
durante el proceso de esporulación produce uno o más cuerpos cristalinos de naturaleza
proteica conocidos como δ-endotoxinas. Este microorganismo requiere una fuente de
carbono, aminoácidos y algunas sales para incrementar el crecimiento y la producción
de los cristales proteicos pero no es muy exigente en cuanto al pH en su crecimiento
(crece adecuadamente en valores entre 5.5 y 8.5, con un pH óptimo entre 6.5 y 7.5).
Puede crecer desde los 15ºC hasta los 45ºC pero la temperatura óptima se sitúa entre
26ºC y 30ºC. Posee dos etapas en su ciclo de vida, una donde sólo presenta crecimiento
y una segunda etapa donde esporula. Al final de crecimiento vegetativo, el agotamiento
del medio induce el inicio de la esporulación. Normalmente la esporulación está
acompañada por la síntesis de δ-endotoxinas. La planta consiste en un reactor de tanque
agitado con volumen nominal de 20 litros. Las fermentaciones se desarrollaron en 11
litros de medio de cultivo (volumen efectivo) y se inocularon al 10% (v/v) con el
cultivo de Bt. Mediante lazos de control tipo ON/OFF se mantuvo la temperatura
alrededor de 30ºC y el pH entre 6.5 – 8.5. Se evita la formación de espuma con el
agregado de antiespumante. El flujo de aire se fija en 22 [litros.min-1]. Los valores de

porcentaje de OD, pH y temperatura (T) se registran durante toda la fermentación. Se
calcula la biomasa a través de la medición del peso seco y la concentración de sustrato a
través del método de los azúcares reductores. La fermentación se suspende cuando
presenta 90% o más de lisis celular.
2.2 Modelo del Proceso
Se presenta un modelo fenomenológico disponible del proceso propuesto por

Atehortua P. et al (2005, 2006), es una modificación y corrección al modelo de Rivera
D. et al (1999).
dV
= Fen + Fmedio . fresco + F R − Fsal Balance Total de masas (1)
dt
dX v ⎛ FR ⎞ ⎛ Fen + Fmedio . fresco + FR ⎞
=⎜ ⎟ X v , R − ⎜⎜ ⎟⎟ X v + (μ − k s − k e )X v Balance de células vegetativas (2)
dt ⎝V ⎠ ⎝ V ⎠
dX s ⎛ FR ⎞ ⎛ Fen + Fmedio. fresco + FR ⎞

= ⎜ ⎟ X s , R − ⎜⎜ ⎟⎟ X s + k s X v − k l X s Balance de células esporuladas (3)
dt ⎝V ⎠ ⎝ V ⎠
dX ⎛ FR ⎞ ⎛ Fen + Fmedio . fresco + FR ⎞
=⎜ ⎟ X R − ⎜⎜ ⎟⎟ X + μX v − k e X v − k l X s Balance de Células totales (4)
dt ⎝ V ⎠ ⎝ V ⎠
μ max S p
μ= Velocidad de crecimiento específica (Monod) (5)
(K s + Sp )
dS p ⎛ Fen + Fmedio. fresco ⎞ ⎛F ⎞ ⎛ μ ⎞
= −⎜⎜ ⎟S p + ⎜ medio. fresco ⎟S p
⎟ ⎜ ⎟ medio. fresco
− ⎜⎜ + ms ⎟⎟ X v Balance de sustrato primario (6)
dt ⎝ V ⎠ ⎝ V ⎠ ⎝ Yx / s ⎠
Donde: F es flujo volumétrico, Sp es la concentración de sustrato primario, Ss es la

concentración de sustrato secundario, V es el volumen, Xv es la concentración de
células vegetativas, Xs es la concentración de células esporuladas, X es la concentración
de células totales, ρ es la densidad, ks es la velocidad especifica de esporulación, kl es
la velocidad específica de lisis, ke es la velocidad específica de muerte, Ks es la
constante de saturación de sustrato, YX/S es el coeficiente de rendimiento biomasa-
sustrato. Además se utilizan los siguientes subíndices: en son las corrientes de entrada
de reactivos, medio fresco es la corriente de entrada de medio fresco, R son las

corrientes de reciclo del filtro, F son corrientes provenientes del filtro, sal son corrientes
de salida. El modelo presenta el balance de sustrato secundario y ecuaciones algebraicas
que no se exponen aquí, para mayor detalle remitirse a (Atehortúa P. et al, 2005, 2006).
2.3 Herramientas de modelado empleadas y fundamentos
En la práctica se utiliza el concepto de concentración crítica (Cc) de OD:

concentración por encima de la cual la velocidad específica de consumo es
independiente de la concentración de O2 disuelto. Normalmente ocurre que en poco
tiempo (dependiendo del proceso) el crecimiento comenzará a estar limitado por O2, y
eventualmente tenderá a detenerse cuando la concentración tienda a cero, a menos que
sea repuesto continuamente y a una velocidad comparable a la de consumo. Este
aspecto es fundamental en el diseño de biorreactores destinados a cultivos aerobios, los
cuales deberán ser capaces de suministrar O2 a velocidades adecuadas. En el modelo
fenomenológico de Bt presentado por Atehortúa P. et a. (2005, 2006), no se incluye la
dinámica de OD. Ésta es importante para que el modelo refleje los efectos antes
mencionados, y además resulta útil para el control del proceso y la estimación de la
biomasa. En este caso no se tiene un control de OD por lo tanto el O2 aunque esté en
exceso, decae a valores menores que el valor crítico. En la Fig.1 se observa una
fermentación en la que el O2 es crítico durante gran parte del crecimiento, se muestra un
decaimiento importante en la fase exponencial de crecimiento del microorganismo.
Datos Experimentales de Fermentación de Bt

1.1
1
Concentración [gr/lts]
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3 Concentración de Células: X

0.2 Concentración de Oxígeno Disuelto: OD
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Tiempo [hr]
Fig. 1. Datos experimentales de OD y biomasa en fermentación de Bt

Tanto el modelado de la dinámica del OD para el proceso como el primer observador

de estado propuesto se basarán en la ley de conservación de masas. Esta ley puede
aplicarse a la masa total del sistema o a la de cualquier componente individual que
pertenezca a éste:
Velocidad de Acumulación o Disminución dentro del Sistema = Velocidad de
Entrada – Velocidad de Salida + Velocidad de Generación – Velocidad de Consumo
2.4 Herramienta empleada para estimación de estados
Redes Neuronales Artificiales. Las redes neuronales artificiales (RNA) son un

medio a través del cual puede codificarse el conocimiento empírico (conjunto de
mediciones) que caracterizan un fenómeno de interés. Las RNA son capaces de proveer
una buena solución al problema de identificación de modelos, estimación de variables,
reconocimiento de patrones, aproximación de funciones, entre otras, debido al alto
grado de paralelismo, la alta capacidad de generalización y la posibilidad de emplear
una arquitectura de múltiples entradas y salidas. Las mismas han probado que poseen la
capacidad de abstraer automáticamente características esenciales de datos y la de
generalizar a partir de la experiencia anterior, esto permite que los modelos de proceso
sean identificados a menor costo. Dentro de las tareas de supervisión y control
requeridas para optimizar la operación de un fermentador, el monitoreo de todas las
variables en línea es la mejor solución, pues los métodos fuera de línea retrasan la
posibilidad de conseguir resultados y requieren generalmente mayor esfuerzo. Algunas
medidas requeridas en el seno de una fermentación son determinadas a menudo por
métodos analíticos, fuera de línea a partir de muestras tomadas manualmente, es aquí
donde resultan de gran utilidad las RNA en bioprocesos.
Fusión Sensorial a través de un Filtro de Kalman Descentralizado.

El objetivo de esta sección es obtener el valor óptimo para la biomasa en el proceso
de Bt. Para realizar esto se consideran 2 secuencias de mediciones (estimaciones) de
biomasa X vi disponibles a partir de los observadores de estado propuestos, una del
observador basado en las dinámicas del oxígeno disuelto y la del sustrato y la otra

proveniente del observador basado en RNA. Asumiendo que el valor óptimo es X viOPT
para cada secuencia en tiempo y la relación entre estos valores está dada por:
X vi = X viOPT + v i (7)
Donde v i es una variable aleatoria de media cero y covarianza R i . Con el propósito

de obtener un valor óptimo para la estimación de biomasa X v , se considera el filtro de
Kalman descentralizado (Brawn, 1997). En la Fig. 3 se pueden ver los filtros locales
(uno para cada secuencia de mediciones), el filtro maestro y las diferentes variables
involucradas.
Secuencia Filtro de
de mediciones Kalman
Xv1 Local 1 Xv1OPT
Filtro
Secuencia Maestro o Filtro
Filtro de
de mediciones Kalman de Fusión Xv
Xv2 Local 2 Xv2OPT
Fig.2. Esquema de operación de fusión mediante un Filtro de Kalman Descentralizado
La media y covarianza para cada secuencia de mediciones son calculadas

recursivamente de acuerdo con:
(
Xˆ vi (k + 1) = Xˆ vi (k ) + μ X vi (k ) − Xˆ vi (k ) ) (8)
⎝
(
R i = R i + μ ⎛⎜ X vi − Xˆ vi ) − R ⎞⎟⎠
2 i
(9)
Donde X̂ vi es el valor medio de la secuencia X vi y 0 < μ < 1 es una constante de

diseño. Luego cada secuencia es filtrada individualmente:
(P ) = (M ) + (R )
i −1 i −1 i −1
(10)
[
X vi.OPT = P i m i M i ( ) + (R )
−1 i −1
X vi ] (11)
La ec. (10) brinda la matriz de información actualizada y la ec. (11) son las
actualizaciones de los estados estimados; M i y m i son el error de covarianza y los
valores de estimación previos para las secuencias de mediciones X vi respectivamente.
Todos los valores filtrados son fusionados para obtener el óptimo valor de la estimación
de biomasa.
⎡m ⎛ X i.OPT m i ⎞⎤
X v = P ⎢ + ∑ ⎜⎜ vl i − i ⎟⎟⎥ (12)
⎣M i ⎝ P M ⎠⎦
Con
∑ ⎡⎢⎣(P i ) ( )
−1 −1 ⎤
P −1 = M −1 + − Mi (13)
⎥⎦
i
Las actualizaciones para cada iteración están dadas por:

M i = Pi (14.a)
m =X
i i .OPT
v (14.b)
m = Xv (14.c)
M =P (14.d)
Así, se concluye que esta arquitectura permite la autonomía completa de los filtros
locales. El sistema alcanza optimalidad individual en cada filtro local y optimalidad
global en el filtro principal.
3. Resultados y discusión
3.1 Modelado de la Dinámica del Oxígeno Disuelto (OD) para el proceso de

producción de ∂ - endotoxinas de Bt
Se comienza a partir del balance general de este componente en el medio de cultivo.

Aplicando la ley de conservación para el oxígeno disuelto en fase líquida se tiene:
d (V ⋅ C OD
= Fen ⋅ C ODen − Fsal ⋅ C OD + V ⋅ rg − V ⋅ rc (15)
dt
Donde: rg es la velocidad de transferencia de O2 a la fase gaseosa y rc es la velocidad
de consumo de O2 en el biorreactor. Por otra parte el volumen de cultivo variará en el

tiempo según sean Fen y Fsal de la ecuación general:
dV
= ∑ Fen − ∑ Fsal (16)
dt
Dependiendo de como sean los Fen y Fsal surgen, básicamente, tres sistemas:
Sistema Continuo. Ambos caudales son iguales Fen= Fsal=F y por lo tanto V es
constante dV/dt = 0 por lo que la ec. (15) se reduce a:

dC OD
V⋅ = F ⋅ (C ODen − C OD ) + V ⋅ ( rg − rc ) (17)
dt
Por lotes Alimentado (Fedbatch). El caudal de salida es nulo Fsal=0 por lo que V
aumentará en el tiempo en función del caudal de entrada dV/dt=Fen. La ec. (15) queda:
d (V ⋅ C OD )
= Fen ⋅ C ODen + V ⋅ (rg − rc ) (18)
dt
Proceso por lotes (Batch). Ambos caudales son nulos Fen=Fsal=0 por lo que los dos
primeros términos de la ec. (15) desaparecen1 dV/dt=0.
d (COD )
= (rg − rc ) (19)
dt
Término de generación de oxígeno. Sólo una parte del caudal de aire introducido
en los reactores se disuelve en el medio, dependiendo de la eficiencia de los elementos
de aireación y de la proximidad a la concentración de saturación del O2 en el medio
líquido (C OD* ) . Esto se evidencia en el modelo de la forma:
rg = K3 ⋅ QA ⋅ (COD * − COD ) (20)
Donde: K 3 es la constante de aireación [litro-1, COD es la concentración de OD en el
medio, [g.litro-1], C
OD
* es la concentración de equilibrio de O2. [g.litro-1] y QA es el
caudal de aire que ingresa al biorreactor [litro.min-1].
Término de Consumo de Oxigeno.

dXv
rc = K 1 ⋅ + K2 ⋅ X v (21)
dt
Donde: dXv / dt es el cambio en la concentración de células vegetativas presentes en
el medio que consumen oxígeno, X v es la concentración de células vegetativas, K1 es la
constante de consumo de oxígeno por crecimiento y K 2 es la constante de consumo de
oxígeno para mantenimiento.
1
La duración del cultivo por lotes es limitada y depende de las condiciones iniciales del cultivo. Una vez inoculado
el medio, la concentración de biomasa aumenta a expensas de los nutrientes y cuando el sustrato que limita el
crecimiento se agota, finaliza el lote.

En la Tabla 1 se presenta un resumen de la dinámica de OD.

Tabla 1. Dinámica del Oxígeno Disuelto
Tipo de cultivo Modelo propuesto para la dinámica de (OD)
Continuo dCOD K1 dXv K

V⋅ = F ⋅ (CODen − COD) + V ⋅ [K3 ⋅ QA ⋅ (COD * − COD)] − [ ⋅( ) + 2 ⋅ Xv ]
dt Yx / O2 dt Yx / O2
FedBatch d (V ⋅ COD) K dXv K

= Fen ⋅ CODen + V ⋅ [K3 ⋅ QA ⋅ (COD * − COD)] − [( 1 ) + 2 ⋅ Xv ]
dt Yx / O2 dt Yx / O2
Batch d ( C OD ) K 1 dX
= [( K 3 ⋅ Q A ( C OD * − C OD ))] − [ v
+ K 2 ⋅ X v]
dt Y x / O 2 dt
Simulación y Experimentación: Modelo de OD. Se presentan resultados de

simulación y su validación con datos experimentales reales del proceso. Las
fermentaciones realizadas fueron todas batch para distintas condiciones iniciales de
sustrato. Se consideró C OD* = 0.0074 [g.litro-1] (concentración de OD en agua a 30
C o ), tomándose como hipótesis que los demás componentes disueltos en el agua del
sustrato no afectan significativamente la solubilidad del oxígeno. Q A = 22 [litro.min-1].
La densidad se considera constante. El coeficiente Y X / O 2 es parte integrante de los
parámetros K1 y K 2 . Los datos experimentales de COD fueron filtrados de forma de
eliminar las altas frecuencias y luego a la señal filtrada se le realizó una aproximación
polinómica de manera de obtener una señal derivable, ver Fig. 3.
x 10
-3 Filtrado de la señal original -3
Aproximación polinómica de la señal filtrada
8 x 10
7
7
Concentraciones [gr/lt]
6
6
5
5
4 4
3
3
2
Datos Originales 2 Aproximación polinómica
1
Datos Filtrados Concentración Original Filtrada
0 1
0 5 10 15 20 25 30 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
(a) Tiempo
Tiempo[hr]
[h] (b) Tiempo [h][hr]
Tiempo
Fig. 3. (a) COD Experimental y filtrada. (b) COD Filtrada y aproximación polinómica
(sin datos de comienzo y fin). Ambas figuras para la Fermentación 1.

En la Fig.4 (a) se observa un ejemplo de la señal de COD preprocesada con que se
efectuará la estimación de parámetros del modelo, en contraste con los datos originales
(el mismo procedimiento se usó en todas las fermentaciones). Por otro lado, se posee un
dato experimental de biomasa X v por hora. Se completó el vector de biomasa de
manera de poseer uno de igual dimensión al de COD . Se realizó una aproximación
polinómica de X v y se eliminaron los datos correspondientes al periodo de latencia (el
mismo no es modelado).Ver Fig. 4 (b).

x 10
-3 Aproximación polinómica Aproximación polinómica y señal Xv original
7 18
16
14
5
12
4
10
3 8
6
2
4
1 Aproximacion polinómica Aproximación polinómica
2
Datos Originales Señal Xv Original
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
(a) Tiempo [hr] [h]
Tiempo (b) Tiempo
Tiempo[h]
[hr]
Fig. 4. (a) COD experimental y aproximación polinómica para la fermentación 1.

(b) X v experimental y después del procesamiento para la fermentación 2.
Se estimaron, por mínimos cuadrados los valores para los

parámetros: K1 = 7.6293e − 004 , K 2 = 1.5499e − 005 , K 3 = 5.8712e − 005 .La aproximación lograda
por el modelo propuesto y la verificación experimental puede verse en la Fig. 5.

x 10
-3 Aproximación de Modelo Propuesto -3
x 10 Aproximación del Modelo Propuesto
8 4.5
7
Datos Experimentales 4
Salida del Modelo 3.5

6
3
5
2.5
4
2
3
1.5
2
1
1
0.5 Datos Experimentales
0
0 5 10 15 0 Salida del Modelo
0 2 4 6 8 10 12 14 16
(a) Tiempo
Tiempo [hr]
[h] (b) Tiempo [h]
Tiempo [hr]
Fig. 5. (a) COD experimental y salida del modelo para la Fermentación 2,

(b) COD experimental y salida del modelo para la Fermentación 3.

Los resultados presentados en la Fig. 5 muestran que el modelo predice

adecuadamente el comportamiento general de la dinámica (caídas bruscas y
recuperaciones) de acuerdo al consumo de O2 para crecimiento y mantenimiento de
microorganismos y a la aireación utilizada en el biorreactor. Los errores de modelado se
deben a que el consumo o desaparición de oxígeno disuelto en el medio no sólo se debió
al crecimiento de microorganismos sino también al agregado de antiespumante, o el de
ácido, o base para control de pH, estos factores que no se tienen en cuenta en el modelo.
El modelo aporta información desde su estructura, indicando relaciones entre variables y
comportamientos en los estados. Este tipo de información no asociada directamente con la
salida del modelo es la que pocas veces se ha considerado en la literatura, sin embargo, es
muy valiosa e importante tanto en la etapa de diseño como en la de control de este tipo de
bioprocesos. Para más detalles y resultados experimentales remitirse a (Amicarelli A., 2006)
3.2 Diseño de un Observador Basado en la Dinámica del Oxígeno Disuelto

(OBOD)
Tomando de la ecuación para el sistema tipo Batch:

d(COD) k dXv
= [(K3 ⋅ QA (COD * −COD))]−[ 1 + K2 ⋅ X v ] (22)
dt Yx / O2 dt
k1
Considerando: K 1 = (23)
Yx / O2
Despejando:
dX v d (C OD )
K1 + K2 ⋅ X v = − + [( K 3 ⋅ Q A (C OD * − COD )] (24)
dt dt
Discretizando:
K1 ⋅
[Xv (k) − Xv (k −1)] + K ⋅ X (k) = −COD (k) + COD (k −1) + K ⋅Q ⋅[C −COD(k)] (25)
2 v 3 A OD*
to to to
Despejando:
⎡ K1 ⎤
⎢ to + K 2 ⎥ ⋅ X v (k ) = to ⋅ X v (k − 1) − to (k ) + to (k − 1) + K 3 ⋅ Q A ⋅ [COD* − COD (k )]
K1 COD COD
⎣ ⎦

Finalmente:
1 ⎧K ⋅ ⎫
⋅ ⎨ 1 X (k − 1) − OD (k ) + OD (k − 1) + K 3 ⋅ QA ⋅ [COD* − COD (k )]⎬ (26)
C C
X (k ) =
⎡ K1 ⎤ ⎩ to to to ⎭
⎢ to + K 2 ⎥
⎣ ⎦
Donde to es el tiempo de muestreo.
A partir de la ec. 26 puede estimarse la biomasa a partir de datos de concentración de
OD (COD ) y de X v (k − 1) , todas las demás constantes o parámetros son conocidos para
el modelo. El valor de X v (k − 1) al inicio es el valor inicial del inóculo. Se denominará al
observador OBOD (observador basado en la dinámica de oxígeno disuelto).
Resultados de simulación y experimentación: Observador de Estado: OBOD.

La entrada al observador son datos experimentales de concentración de OD ( COD ). Éstos
fueron filtrados mediante un filtro pasa bajos de forma de eliminar las altas frecuencias.
La concentración de microorganismos inicial es conocida para todas las fermentaciones.
Como se observa en las Fig.6, el observador brinda una estima adecuada de la biomasa.
(a) (b)
Fig. 6. (a) X v estimada por el Observador OBOD para la Fermentación 3. (b) X v

estimada por el Observador OBOD para la Fermentación 4.
Con el fin de mejorar la estima brindada por este observador, se incorpora

información del balance de sustrato primario. Para las condiciones iniciales de inóculo y
sustrato establecidas, el sustrato primario se consume prácticamente por completo a las
cinco horas de comenzado el proceso. Una vez que se agota el sustrato los
microorganismos dejan de crecer y comienzan esporular, razón por la que el sustrato

presente en las primeras horas está relacionado con la concentración de X v y no con la
de X s . La información brindada por el balance de sustrato, se incorpora a la obtenida a
partir del balance de OD promediándose con esta última durante las primeras horas y
luego el observador basa su predicción en información de la concentración de OD.
Biomasa obtenida del balance de Sp:
( Sp (k ) − Sp (k − 1)) / to
X (k ) = (27)
(− μ / Y XS ) − ms
Con las ecuaciones 26 y 27 el observador de estado llamado en este caso OSpOD,
muestra un comportamiento mejorado en las primeras horas del batch respecto al
OBOD, esto puede apreciarse en la Fig. 7.
(a) (b)
Fig. 7. (a) X v estimada por el Observador OSpOD para la Fermentación 3 y

(b) X v estimada por el Observador OSpOD para la Fermentación 4.
En la Tabla 2. se presenta una comparación en base a los errores de estimación.
Tabal 2. Errores finales para el OBOD y OSpOD
Error Error máximo de Error Porcentual Error Acumulado
Lectura [g/l] [%] [g/l]
OBOD3 1.0104 7.3150 348.2623
OSpOD3 0.9891 4.7712 283.5414
OBOD4 3.8477 24.8454 1.9527e+003
OSpOD4 2.6510 19.8058 1.6763e+003
El Subíndice 3 y 4 representan las fermentaciones 3 y 4 respectivamente.

( XvDeseada − XvEstimada ) 2 * 100

ErrorPorcentual =
XvDeseada
ErrorMáximoDeLectura = max (abs ( XvDeseada − XvEstimada ))
ErrorAcumulado = sum(abs ( XvDeseada − XvEstimada ))

Donde: sum es la función suma, max es el máximo de una función y abs el valor
absoluto de una función.
3.3 Diseño de un observador basado en RNA (OBRNA)
Configuración de la RNA empleada. Las variables elegidas como entradas de la

RNA, en base a su relación con la variable a estimar y a la disponibilidad de datos
experimentales fueron: pares de datos de [ Sp, C OD ] y dos retardos de la biomasa
estimada por la red. La salida de la red es Xvk. Se dispone de mediciones experimentales

en el tiempo de diferentes fermentaciones tipo batch del proceso de producción de δ-
endotoxinas de Bacillus thuringiensis (Bt), las fermentaciones se efectuaron para
diferentes condiciones iniciales de sustrato: 32 g/l, 31 g/l.y 6 g/l. La RNA utilizada es
del tipo Perceptrón multicapa con una capa oculta de 30 neuronas y una de salida. Para
el entrenamiento se uso el algoritmo de Retropropagación (Back-Propagation) con
momento (Haykin S., 1999). Se entrenó la red con datos de una fermentación
identificada como “Fermentación 1” y se generalizo la misma con el otro conjunto de
datos de otras fermentaciones. Se fijaron las funciones de activación de la capa oculta
del tipo tangentes hiperbólicas y la de salida como lineal. Ver Fig.8 y Fig. 9.
Mediciones
Experimentales
de Sustrato
Vector
Primario (SP) X(k)
de
RNA
Mediciones
Entrada
Experimentales a la red
de Oxígeno
Disuelto (OD)
X(k-1) X(k-2)
Fig. 8. Esquema de Entradas/Salidas del observador basado en RNA

SP[1,1889]
OD[1,1889] X (k)
X(k-1), X (k-2)
X(k-1), X(k-2) ...
Nodos de Entrada Capa Oculta (30 neuronas) Capa o Neurona de Salida
Fig. 9. Configuración de la RNA recurrente.
Simulación y Experimentación: Observador de estado OBRNA. Para validar la

RNA se utilizaron datos correspondientes a otras fermentaciones con condiciones
iniciales diferentes a las de entrenamiento. Todas las entradas a la RNA deben estar en
el rango de (-1,1), razón por la cual fueron normalizadas utilizando la siguiente
expresión:
2 Ereal − ( max( Ereal ) + min( Ereal ) )
Enor =
max( Ereal ) − min( Ereal )
Donde: Enor es la entrada normalizada. Ereal , son los datos originales sin normalizar
y min,max son respectivamente el mínimo y máximo de la señal.
En la Fig.10 se observan resultados del entrenamiento de la RNA La tasa de
aprendizaje se fijó en η = 0.7 y el momento α = 0.3 . El error porcentual final de
entrenamiento fue de 0, 16 %.
(a) (b)
Fig. 10. (a)Entrenamiento de la RNA (error 1,5 %).(b) Entrenamiento de la RNA

hasta alcanzar un error porcentual igual a 0,16 %. Ambas con la Fermentación 1

En las Fig. 11 se observan los resultados de generalización o validación de la RNA

El error porcentual de generalización máximo hallado en la validación fue de 0.71 %
(a) (b)
Fig. 11. (a) Validación de la RNA con la Fermentación 3. (error = 0,25 %) b)

Validación de la RNA con la Fermentación 4 (error = 0,71 %)
En la Tabla 3. se presenta una comparación en base a los errores de estimación.

Tabal 3. Errores finales para el entrenamiento y validación de la RNA
Lectura [g/l] [%] [g/l]
Entrenamiento 0.4741 0,1637 132.7253
Validación 1 0.4601 0.2512 222.8743
Validación 2 0.5515 0.7152 99.4980
4. Análisis de la fusión sensorial a través de un filtro de Kalman Descentralizado
4.1 Desarrollo de un Filtro de Kalman Descentralizado para la estimación de

Biomasa en el proceso de Bt.
Se considerará que la RNA fue entrenada hasta un error de generalización de un 12%

para que su salida sea comparable a la del OSpOD. Se fusionan las señales obtenidas
del OSpOD y las de la RNA tal como se mencionó en la sección 2.4. Los resultados de
la fusión pueden apreciarse en la figura 12.

(a) (b)
Fig. 12. a) Fusión de datos a través de un filtro de Kalman de Descentralizado.

b) Evolución del error de estimación a lo largo de la fermentación.
Tabla 4. Análisis de errores estimación de los distintos observadores

Lectura
OBRNA 2.8964 12.3336 1.1636e+003
OSpOD 2.9414 21.9486 1.7219e+003
Fusión 2.4214 9.9394 1.0690e+003
5. Conclusiones
En este trabajo se realizó el modelado de la dinámica del oxígeno disuelto (OD) para
el proceso de producción de ∂- endotoxinas de Bt con el propósito de diseñar un
observador de estados derivado de esta dinámica (OBOD). El observador resultante
brinda una estima adecuada de la biomasa basándose sólo en información proveniente
del balance de OD. Se mejora la estima entregada por OBOD al incorporarse
información del balance de sustrato primario durante las primeras horas de la
fermentación (OSpOD). Se propuso también un segundo estimador (OBRNA) basado
en una red neuronal artificial (RNA), cuyos resultados brindan una estima muy
satisfactoria y finalmente se comparó el resultado brindado por los observadores
propuestos con el entregado al realizar la fusión sensorial de los observadores a través

de un Filtro de Kalman Descentralizado. Los resultados muestran que la fusión brinda

la mejor estima de la variable cuando las señales que se fusionan son comparables.
Agradecimientos
Este trabajo fue parcialmente financiado por el Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET).
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Estimación de Biomasa en Un Proceso Batch: Aplicación A La Producción de - Endotoxinas de BT

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Estimación de Biomasa en Un Proceso Batch: Aplicación A La Producción de - Endotoxinas de BT

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XXII IACChE (CIIQ) 2006 / V CAIQ

ESTIMACIÓN DE BIOMASA EN UN PROCESO BATCH:

A. N. Amicarelli *, F. A. di Sciascio *, H. D. Álvarez§ y O. Ortiz +.

Resumen: La biomasa es una variable fundamental en los procesos biológicos,

Palabras claves: Observación de Estados, Procesos por Lotes, Modelado en

AAIQ Asociación Argentina de Ingenieros Químicos

La estimación de la biomasa en bioprocesos es un problema vigente debido a la

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abordaron el problema del desarrollo de modelos inferenciales para la predicción de

(dSs / dt ) (primario y eventualmente secundarios) y variación de la concentración de

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generalmente producen un decaimiento bacteriano. Por otro lado, un bajo porcentaje de

2.1 Características del microorganismo y la planta

El proceso biotecnológico de interés corresponde a la producción de δ-endotoxinas

agregado de antiespumante. El flujo de aire se fija en 22 [litros.min-1]. Los valores de

2.2 Modelo del Proceso

Se presenta un modelo fenomenológico disponible del proceso propuesto por

dX s ⎛ FR ⎞ ⎛ Fen + Fmedio. fresco + FR ⎞

Donde: F es flujo volumétrico, Sp es la concentración de sustrato primario, Ss es la

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2.3 Herramientas de modelado empleadas y fundamentos

En la práctica se utiliza el concepto de concentración crítica (Cc) de OD:

Datos Experimentales de Fermentación de Bt

0.3 Concentración de Células: X

Fig. 1. Datos experimentales de OD y biomasa en fermentación de Bt

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Tanto el modelado de la dinámica del OD para el proceso como el primer observador

2.4 Herramienta empleada para estimación de estados

Redes Neuronales Artificiales. Las redes neuronales artificiales (RNA) son un

Fusión Sensorial a través de un Filtro de Kalman Descentralizado.

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Donde v i es una variable aleatoria de media cero y covarianza R i . Con el propósito

Fig.2. Esquema de operación de fusión mediante un Filtro de Kalman Descentralizado

La media y covarianza para cada secuencia de mediciones son calculadas

Donde X̂ vi es el valor medio de la secuencia X vi y 0 < μ < 1 es una constante de

Las actualizaciones para cada iteración están dadas por:

3.1 Modelado de la Dinámica del Oxígeno Disuelto (OD) para el proceso de

Se comienza a partir del balance general de este componente en el medio de cultivo.

Donde: rg es la velocidad de transferencia de O2 a la fase gaseosa y rc es la velocidad

de consumo de O2 en el biorreactor. Por otra parte el volumen de cultivo variará en el

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rg = K3 ⋅ QA ⋅ (COD * − COD ) (20)

Donde: K 3 es la constante de aireación [litro-1, COD es la concentración de OD en el

caudal de aire que ingresa al biorreactor [litro.min-1].

Término de Consumo de Oxigeno.

constante de consumo de oxígeno por crecimiento y K 2 es la constante de consumo de

oxígeno para mantenimiento.

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En la Tabla 1 se presenta un resumen de la dinámica de OD.

Continuo dCOD K1 dXv K

FedBatch d (V ⋅ COD) K dXv K

Simulación y Experimentación: Modelo de OD. Se presentan resultados de

La densidad se considera constante. El coeficiente Y X / O 2 es parte integrante de los

parámetros K1 y K 2 . Los datos experimentales de COD fueron filtrados de forma de

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En la Fig.4 (a) se observa un ejemplo de la señal de COD preprocesada con que se

manera de poseer uno de igual dimensión al de COD . Se realizó una aproximación

polinómica de X v y se eliminaron los datos correspondientes al periodo de latencia (el

mismo no es modelado).Ver Fig. 4 (b).

Fig. 4. (a) COD experimental y aproximación polinómica para la fermentación 1.

Se estimaron, por mínimos cuadrados los valores para los

por el modelo propuesto y la verificación experimental puede verse en la Fig. 5.

Salida del Modelo 3.5

A. N. Amicarelli , F. A. di Sciascio , H. D. Álvarez§ y O. Ortiz +.