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CROMATOGRAFIA
• Tipos de cromatografia:
– Adsorção, partição, troca iônica, filtração molecular, etc.
• Técnicas de cromatografia:
– Cromatografia em papel, camada fina, cromatografia em
coluna, cromatografia em fase gasosa (GC),
cromatografia líquida de alta resolução (HPLC), entre
outras.
TIPOS DE CROMATOGRAFIA
1 - CROMATOGRAFIA DE ADSORÇÃO (líquido – sólido)
• O mecanismo de retenção da amostra por adsorção é a competição
entre soluto e FM pelos sítios ativos da FE.
• Método útil para solutos de baixa ou média polaridade com PM 5000.
1 - CROMATOGRAFIA DE ADSORÇÃO (líquido – sólido)
a) Fase Ligada:
Superfície polar
Fase móvel apolar
Amostra com
ou de pouca
Sílica polaridade de
polaridade.
baixa a média
Ex:
Hexano/isopropanol
Heptano/clorofórmio
Ex: Sílica
Amino
Ciano Grau de retenção
Diol depende da polarização
de cada molécula
1 - CROMATOGRAFIA DE ADSORÇÃO (líquido – sólido)
FASE REVERSA
Superfície Apolar
Fase móvel polar
Amostra com
Sílica Ex:
polaridade de
MeOH/H2O
alta a média
CH3CN/H2O
Ex: ODS(C18)
C2, C6,C8
Ciclohexil
Fenil, diol
1 - CROMATOGRAFIA DE ADSORÇÃO (líquido – sólido)
Estrutura das Fases Ligadas à Sílica para CLAE
Amino Ciano, CN, Nitrila
R R
O Si (CH2)3NH2 O Si (CH2)3CN
R R
Fenil
R
O Si (CH2)3
R
1 - CROMATOGRAFIA DE ADSORÇÃO (líquido – sólido)
b) Fase quiral
- Separação de enantiômeros
Ex:
Si C H2 S O3-
3 - CROMATOGRAFIA DE TROCA IÔNICA (líquido – sólido)
a) Temperatura:
• Temperaturas elevadas das colunas são utilizadas para aumentar a
velocidade e a resolução da análise cromatográfica.
• Em cromatografia de T.I. são usadas temperaturas de 25° a 80 °C.
b) pH:
• A retenção relativa e o tamanho máximo da amostra, em cromatografia de
T.I., aumentam com a capacidade de troca-iônica da coluna.
• Esta capacidade é proporcional a concentração de grupos iônicos R (+/-)
dentro da partícula, PORÉM, VARIA EM FUNÇÃO DO pH.
• Em pH baixo, trocadores de cátions são neutralizados pela adição de
próton:
R- + H+ ↔ R-H+
• Em pH alto, trocadores de ânions são neutralizados por bases:
R+ + OH- ↔ R+OH-
Capacidade de troca 1- A capacidade tende a zero em
Trocador catiônico forte 1 pH baixo – não podem ser
usados em pH ≤ 1.
Trocador aniônico forte 2 2 – A capacidade tende a zero
em pH ≥ 10. Podem ser
empregados apenas abaixo de
pH 11.
2 4 6 8 10 12 14
pH
3- Devem ser usados acima de
3 Trocador catiônico fraco pH 6.
Capacidade de troca
4 4- Estão limitados a pH ≤ 8.
Trocador aniônico fraco
• Estes efeitos são resultado do
aumento da competição nos
extremos de pH, tanto do íon
H+ quanto do OH-, pelos sítios
de troca iônica, resultando na
exclusão de íons da amostra
destes mesmos sítios.
2 4 6 8 10 12 14
pH
3 - CROMATOGRAFIA DE TROCA IÔNICA (líquido – sólido)
√ Análise de biopolímeros:
Ex: proteínas, ácidos nucleicos, oligossacarídeos,
peptídeos, açúcares e glicóis
Sistema de solventes tipicamente usados
Hexano, diclorometano,
ADSORÇÃO clorofórmio, metanol,
acetonitrila
Metanol/água
FASE REVERSA Acetonitrila/água
Polaridade
Insolúvel em água Solúvel em água
Apolar Iônico
Polar não-iônico
Partição
10 2
Adsorção Troca
FR FN Iônica
Peso Molecular
103
104
Exclusão
105 Permeação Filtração
em gel em gel
106
Modalidade FE
CLS Sílica
Apolar
Propriedades CLFL-FR C-18
Peso Molecular
CLFL-FR
Insolúvel em C-8
Moderadamente
água polar
CLFL-FN CN
Amostra CLFL-FR C-8
Solúvel em Não-iônico
água CLFL-FR C-18
Trocador
Base Forte CTI de cátions
CLFL-FR
Base Fraca C-18
Iônico Pares de íons
Trocador
Ácido Forte CTI de ânions
CLFL-FR
Ácido Fraco C-18
Pares de íons
Modalidade FE
> 2000
CE Gel de
Não-iônico
Dextrano
Solúvel em água
Vantagens: Limitações:
Amostra Solvente
- Baixo custo -Análise Lenta
-Método simples - Baixa Resolução
Separação
Coluna dos
- Bom método componentes - Dificuldade de
de vidro da amostra
Preparativo quantificação
HPLC OU CLAE
FILTRAÇÃO DO SOLVENTE:
FILTRAÇÃO DA AMOSTRA
Fase Móvel
- Deve ser degaseificada;
- Velocidade de fluxo entre 0,1 – 10 mL / min.
- Bomba de alta pressão ( 6-10.000 psi)
Injeção da amostra
- Alça (loop) de amostragem / Válvula de Injeção
- Volume de Injeção: 5 – 500 µ L
RESERVATÓRIO DE
SOLVENTE
para a
coluna
Alça de
amostragem
Seringa
Detectores utilizados em CLAE
1- Características gerais:
2- Detector UV/Vis
DETETOR UV
cromatograma
LUZ
+
UV
prisma
HPLC/UV do Extrato Metanólico
de Hypericum brasiliense
HPLV/UV/MS/NMR
HPLC/UV/MS/RMN de Extratos de
Gentianaceae
OUTROS DETECTORES
Detector de IV
• Absorção de luz IV → movimentos vibracionais das moléculas;
• Universal e não destrutivo;
• Pouca sensibilidade e necessidade de evaporação do solvente.
Fluorescência:
Alta sensibilidade, porém restritos às substâncias fluorescentes (muito
seletivo).
Índíce de Refração:
Detetor universal. Altamente instável (pulsações, temperatura,
eletricidade). Não se pode usar gradiente.
ANÁLISE QUALITATIVA
Exemplo
Álcool
desconhecido
A análise qualitativa
pode ser realizada
através da correlação
entre os TR de
substâncias
desconhecidas com
padrões analisados
sob as mesmas
Padrão
condições
experimentais
O Coeficiente de Partição (K)
• Permite quantificar a distribuição da substância entre a fase
estacionária e a fase móvel
K= SFE / SFM
↑K = A substância permanece na FE por mais tempo
A substância permanece na coluna por mais tempo
Comportamento de Retenção
Logo, a eficiência da coluna pode ser relacionada a altura do prato teórico (H);
-Como aumentar o N?
Otimizando a velocidade de vazão da FM
Aumentando o comprimento da coluna (L)
Análise Direta:
Exemplo:
Sx/Spi X Cx/Cpi
PADRONIZAÇÃO EXTERNA
• Preparação de padrões (substância de referência) de concentração
semelhante ao analita na amostra, e o ensaio cromatográfico de ambos
nas mesmas condições de operação.