SEPARACIÓN DE AMINOÁCIDOS DEL HIDROLIZADO DE LA GELATINA POR
EL MÉTODO DE CROMATOGRAFÍA DE CAPA FINA
L. Bermúdez, K. Galindo, Y. Vargas, J. Ojeda, F. Triviño
Facultad de Ciencias Básicas
Programa de Química
Fecha de entrega: Septiembre 27 de 2010
RESUMEN.
En el siguiente estudio se ejecuto la
separación de los aminoácidos: arginina,
fenilalanina, glicina, metionina, tirosina,
triptófano y aspartico, presentes en un
hidrolizado de gelatina (Gelhada®) por
medio del método de cromatografía de
capa fina, usando como fase estacionaria
Silica gel HF254, y las fases móviles:
butanol, agua, acido acético glacial
(4:1:1) y fenol, agua (3:1). Utilizando
como agente revelador la Ninhidrina, ya
que este presenta una reacción de
coloración con los aminoácidos, con la
cual se pudo determinar la presencia de
los mismos en la muestra.
INTRODUCCIÓN.
La cromatografía de capa fina (TLC) es
uno de los métodos más ampliamente
utilizados para separar, identificar y, en
algunos casos hacer el seguimiento de
una reacción química. El principio de la
Cromatografía capa fina
cromatografía de capa fina es sencillo. Se
produce una capa uniforme de absorbente
sólido adecuado (fase estacionaria)
sostenida sobre una placa de aluminio o
vidrio. Se coloca con un capilar en el
origen de la placa una mancha de
solución de compuesto orgánico o mezcla
en estudio, se deja que un solvente
adecuado (eluyente o fase móvil)
ascienda por la capa del absorbente por
capilaridad. Dependiendo de la naturaleza
del solido extendido sobre la capa, existen
distintos tipos de TLC:
De partición, en la que el sólido es el
soporte inerte de la fase estacionaria
liquida, que normalmente es de naturaleza
polar. Con este fin suele utilizarse Silica
gel hidratada, celulosa o tierra de
diatomeas.
De absorción, en la que la capa extendida
es el sólido absorbente (alúmina, etc.).
Página 1
De intercambio iónico, en la que se PROCEDIMIENTO.
utiliza un cambiador de iones finamente Para la elaboración del hidrolizado se
dividido extendido sobre la capa (resinas agregaron 30g de gelatina a la cual se le
o celulosa tratada). adicionó ácido sulfúrico al 80% y se llevo
a reflujo por 4 horas aproximadamente.
De exclusión, donde se utiliza material Se preparo una serie de placas de vidrio
poroso muy pulverizado que origina de 10 por 20 cm con Silica gel HF 254. Con
fenómenos de exclusión según el tamaño ayuda de un lápiz cuidadosamente se
molecular del analito (Sephadex® o gel traza la zona de aplicación. Se aplican
dextrano). sobre la placa (con ayuda de un tubo
capilar) las soluciones patrón en una
O O placa en las columnas 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8 y
O
Si
O
Si OH solución problema (hidrolizado de
O O gelatina) en las columnas 1 y 9 de la
misma placa. Se secan las manchas.

Figura 1. Esqueleto de Silica gel

Una cantidad conocida como factor de

retención (Rf) es en forma general un
poco más útil que la distancia recorrida
por la muestra.

longitud recorrida por la muestra

Rf :
longitud recorrida por el frente del solvente

Los valores de Rf son muy sensibles a la

temperatura, y son propios de cada
sustancia, pero dependiendo del sistema
cromatografico (fase móvil y fase
estacionaria). Los valores de Rf pueden
ser útiles al estimar lo que podría ser una
muestra desconocida e identificarla.
Figura 2. Esquema de TLC
La placa se sumergió en una cubeta con la
fase móvil (como indica la figura 2), se
procedió a tapar la cubeta para que esta se
saturara con los vapores desprendidos por
nuestro eluyente. Se dejo desarrollar hasta
la línea límite de recorrido (¾ de la
longitud), después se saco la placa y se

Cromatografía capa fina Página 2

seco con ayuda de un secador. Para
después rociarla con el revelador
Ninhidrina con un espray, y así observar
las manchas de cada aminoácido, después
se midió la longitud recorrida para cada
aminoácido y la del frente del solvente.
Para calcular sus respectivos valores de Rf
en los dos sistemas cromatografico.

Fase móvil #1
20 mL CH3CH2CH2CH2-OH

5 mL CH3COOH glacial

5 mL H2O

Fase móvil #2
75 g Ph-OH (fenol)

25 mL H2O Figura 3. Montaje para el

hidrolizado

Fase estacionaria ANALISIS Y RESULTADOS.

Silica gel GF- 254
A continuación se expondrán los
resultados obtenidos a manera de tabla
para una mayor comprensión e
Agente revelador interpretación de los mismos.
3.5 g Ninhidrina
Tabla 1. Rf obtenidos con la
95 mL CH3CH2CH2CH2-OH fase móvil 1: Agua, butanol y
5 mL CH3COOH al 10% ácido acético glacial (1:4:1)

Distan
N Aminoác cia
Rf
° ido recorri
da
0.2
1 Arginina 2.9 cm
0
0.5
2 Aspartico 7.3 cm
Figura 2. Estructura de la 1
Ninhidrina 3 Fenilalani 8.0 cm 0.5

Cromatografía capa fina Página 3

 na 6 8
0.6 0.4
4 Glicina 8.7 cm 5 Metionina 8.2 cm
1 9
0.6 0.4
5 Metionina 8.5 cm 6 Tirosina 8.0 cm
0 8
0.6 Triptófan 10.4 0.6
6 Tirosina 9.3 cm 7
5 o cm 2
Triptófan No
7 revelo
-
o Distancia desde la zona de aplicación
hasta el frente de la fase móvil 16.8 cm
Distancia desde la zona de aplicación
hasta el frente de la fase móvil 14.2 cm

Figura 5. Revelado (fase móvil

2)
Figura 4. Revelado (fase móvil DISCUSIÓN.
1)
Los aminoácidos con cadenas laterales
apolares como la glicina y la fenilalanina
Tabla 2. Rf obtenidos con la no tienen una alta afinada con la Silica
fase móvil 2: gel, originando como resultado unos
Agua y fenol (1:3) valores menores de Rf sobre todo en la
fase móvil 2 de naturaleza acida. Y en
Distan
aquellos con cadenas laterales polares
N Aminoác cia
Rf como la tirosina o el triptófano
° ido recorri
da ascenderán más rápidos que los otros.
0.2
1 Arginina 4.5 cm
7
0.0
2 Aspartico 1.0 cm
6
Fenilalani 0.5
3 8.6 cm
na 1
4 Glicina 4.7 cm 0.2

Cromatografía capa fina Página 4


Figura 6. Esquema de la
reacción de la Ninhidrina con
los Aminoácidos
La Ninhidrina es un reactivo usado para
ver las manchas de bandas de
aminoácidos separados por croma-
tografía. La Ninhidrina reacciona con el
aminoácido dando como producto un
anión color violeta intenso, llamado
púrpura de Ruhemann, que se estabiliza
por resonancia. En esta reacción se
pierde la cadena lateral en forma de
aldehído.
Al determinar los factores de retención se
pudo observar que el triptófano es el que
mayor factor de retención obtuvo, esto se
debe a que el sustituyente de este
aminoácido es de una alta polaridad, lo
cual demuestra tener una gran afinidad
con la fase estacionaria, y el de menor
fue el ácido aspartico, utilizando como
Cromatografía capa fina
solvente la fase móvil #2. En cuanto a los
valores obtenidos en la fase móvil #1 la
arginina fu la que presento menor factor
de retención y el mayor Rf fue el de la
tirosina.
Hay que tener en cuenta el carácter acido
de la fase móvil 2 que le aporta el fenol,
ya que el factor de pH incide en la
afinidad de un componente con la Silica
gel, ya que si esta es de carácter básico
reaccionaria con el eluyente
disminuyendo las partículas que
posiblemente ascenderían por la capa.
La celulosa es actualmente el mejor
material que se puede usar en la fase
estacionaria para la separación por
cromatografía en capa fina de los
aminoácidos.
CONCLUSIONES.
La cromatografía de capa fina (TLC)
evidenció que es una técnica eficiente a la
hora de separar aminoácidos.
Los aminoácidos incoloros pueden ser
separados e identificados por medio de
esta técnica, mediante el uso de un
revelador (Ninhidrina) que los transforma
en manchas coloreadas sobre la capa;
pero parece ser que la Silica gel no es el
mejor material para los aminoácidos
porque produce manchas difusas y menos
satisfactorias.
Página 5
A manera de recomendación para obtener
H
unos resultados más exactos, hay que
tener más en cuenta los siguientes HOOC CH2 C COOH
parámetros: NH2
ÁCIDO ASPÁRTICO
Un buen espacio en el lugar de trabajo y
una buena organización de él, es decir
buena ubicación de los reactivos y
materiales con los cuales vamos a
trabajar. Buscar las condiciones ideales a
H
la hora de realizar la práctica
(temperatura, humedad, presión, etc.). CH2 C COOH
Una buena limpieza por parte de los NH2
materiales, y alta pureza por parte de los FENILALANINA
reactivos, para así obtener resultados
precisos y reproducibles.

FUENTES DE INFORMACIÓN

H
[1] RUBINSON, Kenneth. Análisis
Instrumental. 1ª ediciòn. Madrid: CH3 S CH2CH2 C COOH
Pentice Hall, 2001. p. 325-327. NH2

[2] VALCÀRCEL CASES, M. Técnicas METIONINA

Analíticas de Separaciòn. 1ª edición
Barcelona: Revertè, 1988. p. 405-408.

Fecha de 26 ANEXOS.

abril 2010

H2N C NH CH2CH2CH2 C COOH

NH NH2 H

ARGININA HO CH2 C COOH

NH2

TIROSINA

Cromatografía capa fina Página 6

 H

CH2 C COOH

NH2
N

H
TRIPTOFANO

CH2 COOH

NH2
GLICINA

Cromatografía capa fina Página 7