La Cromatografía en Fase Reversa.

Fundamentos.
La cromatografía en fase reversa (RPC) permite separar moléculas en base a su polaridad. El
principio de la cromatografía en fase reversa es semejante al de la cromatografía en capa fina. Sin
embargo, aquí la fase estacionaria es de patículas de sílica químicamente modificadas con
hidrocarburos saturados, insaturados o aromáticos de diferentes tipos. Esto convierte a la fase
estacionaria en una matríz apolar. Por lo tanto, para este tipo de cromatografías se emplean
mezclas de solventes polares, tales como agua, acetonitrilo, acetato de etilo, acetona y alcoles
alifáticos.

En virtud de lo anterior, este tipo de cromatografía ha sido también llamada como cromatografía de
interacción hidrofóbica (HIC). En general, este  último término se ha empleado para referirse a las
aplicaciones en las que se emplean substituyentes y matrices compatibles con fluidos biológicos.
Por tanto, el termino HIC es común cuando se habla de purificación de proteínas y carbohidratos,
en tanto que RPC es más empleado para referirse a la separación de moléculas en sistemas que
son inadecuados para la separación de macromoléculas biológicas.

Las moléculas se retienen en la columna en virtud de las interacciones hidrofóbicas que establecen
con la sílica modificada. Aunque, las interacciones hidrofóbicas son en general bastante débiles,
son también a menudo muy numerosas y para eluír las moléculas es casi siempre necesario
disminuir la polaridad del disolvente; para ello se puede substituir el agua de la fase móvil con un
solvente orgánico cuya concentración se va aumentando gradualmente.

Debido a diversas limitaciones prácticas de la cromatografía de capa fina en fase reversa, entre las
que destaca el costo de usar placas no reutilizables de una matríz difícil de sintetizar, la
cromatografía en fase reversa ha sido adaptada para el uso de columnas. La versatilidad y
eficiencia  de este tipo de cromatografía se ha visto incrementada con el uso de sistemas de alto
desempeño (HPLC, del inglés "High Performance Liquid Chromatography") que utilizan alta presión
para mejorar la resolución y reducir los tiempos de separación.

Los sistemas de alto desempeño pueden también emplearse en otros tipos de cromatografías, de
manera que para referirse a la cromatografía en fase reversa en sistemas de alto desempeño se
emplea la abreviatura HPLC-RPC.  También

Separación e identificación de Péptidos y aminoácidos.

En la separación de aminoácidos y péptidos mediante fase reversa la resina más comúnmente

empleada posee una cadena lineal de 18 carbonos y se denomina como C 18.

|SiO2|-(CH2)17-CH3

Dado que la resolución de los aminoáciodos mediente RPC requiere de sistemas de HPLC, es
frecuente referirse al sistema como C18-HPLC.

La muestra se aplica a la columna en solución acuosa acidificada con ácido trifluoroacético, un

ácido orgánico volátil y que se requiere muy puro. Para mejorar la solubilidad de los péptidos

formados por aminoácidos muy apolares se añade al solvente un 10 a 20% de acetonitrilo. Aunque
se han reportado otros sistemas de solventes, este último sigue siende en más empleado a pesar
de la toxicidad del acetonitrilo.
A fin de eluír de la columna los aminoácidos más apolares es necesario aumentar la concentración
de acetonitrilo en el sistema . Esto se hace en forma gradual durante la elución, lo cual permite una
gran resolución en la separación de las moléculas.

El sistema C18-HPLC completo requiere una mezcladora de solventes, un inyector, y una bomba que
inyectan líquido a la columna. Generalmente las columnas de sílica requieren alta presión para que
el flujo de líquido sea adecuado, la mzcladora se requiere para variar la proporción de solvente en la
fase móvil y el inyector permite la aplicación de la muestra.

A la salida de la columna se coloca un detector (generalmente de absorción ultravioleta  o de

fluorescencia) y si se desea recuperar las moléculas que eluyen de la columna, se requiere un
colector. En el análisis y la cuantificación de aminoácidos, la recuperación de la muestra es
innecesaria; pero cuando se separan péptidos producto de la fragmentación de una proteína para
propósitos de secuenciación, el colector es indispensable.

En los sistemas modernos la formación del gradiente de acetonitrilo y el analisis de la información

obtenida se realizan mediante una computadora acoplada al equipo; lo que permite estandarizar la
cromatografía, identificar  la naturaleza los picos eluídos y cuantificar su contenido.

Un cromatograma típico luce como sigue:

Los picos se relacionan según su "tiempo de

retención" con estándares, que permiten identificar
los aminoácidos presentes en la mezcla. La
cantidad relativa de cada uno de ellos se determina
calculando el área la curva del pico correspondiente.

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