I .

CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC VẬT Ở VIỆT NAM

1.Qúa trình hình thành và phát triển
Hai mục tiêu chính của công nghệ thực vật của Việt Nam là:
a. Tạo ra giống mới
b. Nhân nhanh các giống đã lựa chọn
Trong khi mục tiêu thứ nhất cố gắng tạo ra tính đa dạng sinh học thì mục tiêu
thứ hai tìm đến tính dồng nhất cao.
Để thực hiện hai mục tiêu này, từ năm 1976 nước ta đã bắt đầu chương trình
đào tạo cán bộ xây dựng nhiều phòng thí nghiệm từ Bắc đến Nam để làm chủ kĩ
thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật, kĩ thuật chủ yếu của công nghệ sinh học tế bào
thực vật.
Mặc dù chưa được sử dụng rộng rãi, công nghệ tế bào đến nay đã được ngành
nông nghiệp thừa nhận là một biện pháp hữu hiệu trong công tác giống. Các mô
hình tổng kết và nghiệm thu trên một số ít các đối tượng cây trồng khác nhau cho
thấy triển vọng có thể nhanh chóng mở rộng việc ứng dụng công nghệ sinh học tế
bao thực vật – không chỉ ở các viện nghiên cứu mà còn ở các danh nghiệp, các địa
phương...
II. CÁC PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT
1. Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng.
Một phương thức dễ dàng nhất đạt được mục tiêu trong nuôi cấy mô tế bào
thực vật là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (bao gồm nuôi cấy chóp đỉnh và chồi bên).
Sau khi vô trùng mẫu, mẫu được nuôi cấy trên môi trường thích hợp. Môi trường
thích hợp thay đổi theo từng loại cây trồng được đưa vào nuôi cấy nhưng cơ bản,
môi trường chứa đầy đủ chất dinh dưỡng khoáng vô cơ, hữu cơ và được bổ sung
chất kích thích sinh trưởng thích hợp. Từ một đỉnh sinh trưởng sau một thời gian
nuôi cấy nhất định phát triển thành một chồi hoặc nhiều chồi. Sau đó chồi tiếp tục
phát triển vươn thân, ra lá, ra rễ và trở thành một cây hoàn chỉnh. Cây con được
chuyển ra đất có điều kiện phát triển bình thường. Đây là một chu trình ngắn nhất
và tiện lợi hơn các phương thức nhân giống thông thường được thực hiện bằng kĩ
thuật nhân giống vô tính in vitro thông qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng.
2. Nuôi cấy mô sẹo
Trong điều kiện sự cân bằng các chất kích thích sinh trưởng trong thực vật
thay đổi, cụ thể trong tế bào đỉnh sinh trưởng hay nhu mô được tách ra nuôi cấy
riêng rẽ trên môi trường giàu auxin, thì mô sẹo được hình thành. Mô sẹo là một
khối tế bào phát triển vô tổ chức và có màu trắng. Khối mô sẹo có khả năng tái
sinh thành cây hoàn chỉnh trong điều kiện môi trường không có chất kích thích
sinh trưởng tạo mô sẹo. Nuôi cấy mô sẹo được thực hiện đối với các loài thực vật
không có khả năng nhân giống qua muôi cấy đỉnh sinh trưởng. Cây tái sinh từ mô
sẹo có đặc tính giống như cây mẹ và từ một cum tế bào mô sẹo có thể tái sinh
cùng một lúc cho nhiều chồi hơn là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, tuy nhiên mức độ
biến dị tế bào soma là cao hơn.
 3. Nuôi cấy tế bào đơn và thu nhận các chất có hoạt tính sinh học
Khối mô sẹo được nuôi cấy trong môi trường lỏng và được đặc trên máy lắc
có tốc độ được điều chỉnh thích hợp. Khối mô sẹo dưới tác dụng cơ học và các hóa
chất hổ trợ tách ra thành nhiều tế bào riêng rẽ gọi là tế bào đơn. Tế bào đơn được
lọc và nuôi cấy trong môi trường đặc biệt và tăng sinh khối. Hệ thống nuôi cấy tế
bào đơn giống hệ thống nuôi cấy vi sinh vật. Với các cơ chất thích hợp được bổ
sung vào trong môi trường, tế bào có khả năng sản xuất các chất có hoạt tính sinh
học (alkaloid, steroid…). Sau một thời gian nuôi cấy kéo dai trong môi trường
lỏng, tế bào đơn được tách ra và trải trên môi trường thạch, tế bào đơn phát triển
thành tùng cụm tế bào mô sẹo khi môi trường có auxin, hay tế bào đơn có khả
năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh trên môi trường co tỉ lệ cytokynin/auxin thích
hợp. Ngoài ra, tế bào đơn được xử lý đột biến bằng tia phóng xạ hay bằng hóa
chất, có ý nghĩa trong tạo giống cây trồng.
4. Nuôi cấy protoplast – chuyển gen
Protoplast (tế bào trần) thực chất là tế bào đơn được tách lớp vỏ cellulese, có
sức sống và duy trì đầy đủ các chức năng sẳn có. Protoplast có thể tách trực tiếp từ
các bộ phận của thực vật (lá, rễ…) bằng cơ học (nghiền mẫu + enzym) hay từ tế
bào đơn sẵn có (enzym). Trong điều kiện nuôi cấy thích hợp, protoplast có khả
năng tái sinh màng tế bào, tiếp tục phân chia và tái sinh thành cây hoàn chỉnh (tính
toàn thế ở thực vật). Khi mất thành tế bào, hai protoplast có khả năng dung hợp
với nhau tạo ra tế bào lai, đặc tính này cho phép cải thiện cây trồng. Qúa trình
dung hợp protoplast có thể thực hiện trên hai đối tượng cùng loài (lúa) hay khác
loài (khoai tây, cà chua). Và ở trạng thái không có màng tế bào bào bọc, protoplast
dễ dàng hấp thu các DNA ngoại lai cải thiện đặc tính kháng bệnh, năng suất và
chất lượng cây trồng. Hiện nay kĩ thuật tách và nuôi cấy protoplast vẫn còn đang
được nghiên cứu va hoàn thiện.
5. Nuôi cấy hạt phấn đơn bội
Hạt phấn của thực vật được nuôi cấy trên những môi trường thích hợp tạo
thành mô sẹo. Mô sẹo này được tái sinh thành cây hoàn chỉnh có 1n được gọi là
cây đơn bội. Trong quá trình nuôi cấy mô sẹo hay tái sinh tế bào đơn bội được sử
lí hóa chất (colchincin…) để tạo cây đơn bội kép sử dụng trong quá trình lai tạo.
III. NUÔI CẤY ĐỈNH SINH TRƯỞNG
1. Đặc điểm sinh học đỉnh sinh trưởng
Mô phân sinh đỉnh chứa những tế bào đỉnh sinh trưởng, được bao bọc bởi
một lớp vỏ bề mặt có cấu tạo cutin hạn chế thấp nhất quá trình mất nước và lớp
cutin này bao bọc cả chồi đỉnh.
Ở thực vật, sự hình thành mới các cơ quan bắt đầu trong các mô phân sinh
đỉnh, các mô này phân hóa ngay từ những giai đoạn phát triển đầu của phôi và giữ
lại trong suốt đời sống của cây. Điều này xảy ra la do mô phân sinh có sự phân hóa
của những tế bào khởi sinh. Tất cả các tế bào còn lai đều xuất phát từ các tế bào
khởi sinh.
 Vì mô phân sinh có thể tích tương đối ổn định nên các tế bào sinh ra từ các tế
bào khởi sinh sau một vài lần phân chia sẽ rời khỏi mô phân sinh.
Qúa trình sinh trưởng của cơ quan diễn ra theo 3 giai đoạn:
-Giai đoạn thứ nhất: thường được gọi là giai đoạn phôi sinh. Trong các điểm
sinh trưởng (trong các mô phân sinh đỉnh) xảy ra sự hình thành mầm cơ quan và
sự phân chia đầu tiên của nó thành các mô riêng biệt.
-Giai đoạn thứ hai: giai đoạn dài ra do sự sinh trượng nhanh chóng, mầm cơ
quan đạt đến kích thước tối đa và trở nên có hình dạng nhất định.
-Giai đoạn thứ ba: giai đoạn kết thúc sự phân hóa tế bào, bắt đầu hóa gỗ các
thành tế bào, xuất hiện ở trên đó những chổ dầy lên có cấu tạo và kết quả là không
còn khả năng tiếp tục sinh trưởng. Trước hết, các u lồi dần dần được tạo thành và
người ta gọi là các u lá. Thể tích các u lá lớn rất nhanh và kéo theo nó một phần
lớn của đỉnh sinh trưởng. Dần dần u lồi chuyển thành mầm lá (thể nguyên thủy).
Mầm lá phát triển nhanh theo chiều dài. Sự sinh trưởng tiến hành không đều cho
nên lá mầm tự cong lên phía đỉnh. Sau khi lá được tách ra lại xảy ra sự phân phối
lại sự phân chia tế bào, kết quả là thể tích của đỉnh sinh trưởng được khôi phục
nhanh chóng và sự hình thành lá mới lại bắt đầu.
Ở mỗi nách lá đều có chồi nách. Chồi nách thực chất có cấu tạo không khác
đỉnh sinh trưởng của thân. Do hiện tượng ưu thế ngọn, chòi nách không phát triển,
nhưng khi được đánh thức và bắt đầu sinh trưởng, chúng có cấu tạo lá đầy đủ như
thân chính.
Qúa trình sinh tổng hợp DNA của virus thực vật không xảy ra trong tế bào
đỉnh sinh trưởng do một cơ chế hiện nay không rõ. Vì vậy mô đỉnh sinh trưởng là
mô duy nhất sạch virus. Do đó trong kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào, mô đỉnh sinh
trưởng được sử dụng là vật liệu nuôi cấy mô tế bào nhằm tạo các cây không nhiễm
virus và các loại vi khuẩn hay nấm gây bệnh.
Phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng sử dụng phần nhỏ nhất ở chồi đỉnh
của thân làm mẫu nuôi cấy. Phần này gồm mô phân sinh và vài phác thề lá. Việc
tách và nuôi cấy đỉnh sinh trưởng nhằm tạo các cây sạch bệnh. Mẫu cấy càng nhỏ
khả năng tạo cây sạch bệnh càng cao. Ví dụ, mô phân sinh từ 0.1 đến 0.15 mm có
thể có 100% sạch virus. Tuy nhiên mẫu càng nhỏ khả năng sống sót càng thấp.
Người ta thường sử dụng mẫu cấy từ 0.25 đến 1 mm. Xử lý nhiệt (từ 35 đến 40 Oc
tùy loài) trước khi tách đỉnh sinh trưởng là một biện pháp nhằm tăng cường khả
năng sạch virus.
2. Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng khoai tây
Lấy một củ khoai tây trồng vào một chậu đất trong điều kiện nhiệt độ và ánh
sáng bình thường. Khi mầm cao khoảng 15 cm, lấy phần ngọn dài 6 đến 8 cm, cắt
bỏ hai lá dưới, cắm vào một cái ly đựng đất mùn đã vô trùng, đậy một ly khác để
tránh bị héo trong vòng 10 ngày cho ra rễ. Sau 3 đến 4 tuần, chuyển ly có cây vào
điều kiện chiếu sáng 3000 đến 4000 lux, chế độ chiếu sáng 16 giờ/ngày, nhiệt độ
không khí khoảng 36oC ban ngày và 33oC ban đêm. Sau đó hai tuần cắt bỏ ngọn
mầm để thúc các chồi nách phát triển.
 Sau khi xử lý nhiệt 6 tuần, lấy phần ngọn chồi nách để tách đỉnh sinh trưởng.
Cắt bỏ bớt lá và đặt chồi trên một tờ giấy lọc ẩm trong một đĩa petri để tránh bị
héo. Không cần thiết phải vô trùng chồi nách trước khi làm thao tác tách đỉnh sinh
trưởng, nhưng cần tách trong điều kiện vô trùng và dụng cụ tách cần phải được vô
trùng bằng cồn và nước cất vô trùng. Dưới kính lúp có độ phóng đại X25, dùng
kim nhọn để gạt bỏ các lá ngoài, để lọ đỉnh sinh trưởng với hai lá nguyên thủy.
Dùng dao mổ có lưỡi nhọn cắt lấy mô đỉnh sinh trưởng có chiều dài khoảng 0.6
mm. Dùng kim nhọn đưa đỉnh sinh trưởng lên mặt môi trường thạch, giữ ở 23oC
trong điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày.
Sau vài tuần khi cây đã lớn được 3 cm và có rễ có thể chuyển qua môi trường
mới. Khi cây có nhiều lá, cắt đoạn và nhân lên nhiều cây, đồng thời đưa chuẩn
đoán virus.
Môi trường dùng để cấy đỉnh sinh trưởng của khoai tây là môi trường MS
chất sinh trưởng cần thêm IAA 0.5 mg/lít, GA 0.1 mg/lít và inositon 100 mg/lít.
Nếu thấy cây khoai tây khó có rễ, cần thêm 10 mg than hoạt tính vào một ống
nghiệm trước khi vô trùng. Dùng ống nghiệm nhỏ 12x100 mm, mỗi ống nghiệm
3.5 ml môi trường.
Sau khi chắc chắn không còn virus trong cây khoai tây, các ống nghiệm được
đưa vào nhân giống và bảo quản.
3. Môi trường MS
Pha stock khoáng đa lượng môi trường MS nồng độ đậm đặc 20 lân (x20)
Cân chính xác bằng cân phân tích các muối khoáng đa lượng. Dùng ống
đong, đong khoảng 400 ml nước cất hai lần vào becher 1000 ml. Cho lần lược các
muối đa lượng theo trình tự nhất định sau:

Tên hóa chất Nồng độ môi Nồng độ dung dịch

trường nuôi cấy stock (x20) (mg/lít)
-MgSO4.7H2O 370 7.400
-KH2PO4 170 3.400
-KNO3 1.900 38.000

-NH4NO3 1.650 33.000

-CaCL2.2H2O 440 8.800