Nama/NIM: Rajini / K4307009

Teknologi DNA Rekombinan

Teknologi yang dikenal sebagai teknologi DNA rekombinan, atau dengan istilah yang lebih populer
rekayasa genetika, ini melibatkan upaya perbanyakan gen tertentu di dalam suatu sel yang bukan sel
alaminya sehingga sering pula dikatakan sebagai kloning gen. Salah satu definisi teknologi DNA
rekombinan yang paling representatif adalah pembentukan kombinasi materi genetik yang baru
dengan cara penyisipan molekul DNA ke dalam suatu vektor sehingga memungkinkannya untuk
terintegrasi dan mengalami perbanyakan di dalam suatu sel organisme lain yang berperan sebagai
sel inang.
Teknologi DNA rekombinan merupakan tulang punggung dan pemicu lahirnya bioteknologi
molekuler. DNA rekombinan dikonstruksi dengan menggabungkan materi genetik dari dua atau
lebih sumber yang berbeda atau melakukan perubahan secara terarah pada suatu materi genetik
tertentu. Beberapa contoh rekombinasi dari dua sumber atau lebih antara lain:
 Rekombinasi saat pindah silang dalam pembentukan gamet pada proses meiosis.
 Saat sperma dan ovum melebur pada proses fertilisasi.
 Saat bakteri melakukan transaksi bahan genetic melalui konjugasi transformasi atau transduksi.
Dari contoh-contoh rekombinasi tersebut dapat diketahui bahwa rekombinasi merupakan salah satu
cara untuk meningkatkan keanekaragaman hayati.

Teknologi DNA rekombinan mempunyai dua segi manfaat. Pertama, dengan mengisolasi dan
mempelajari masing-masing gen akan diperoleh pengetahuan tentang fungsi dan mekanisme
kontrolnya. Kedua, teknologi ini memungkinkan diperolehnya produk gen tertentu dalam waktu
lebih cepat dan jumlah lebih besar daripada produksi secara konvensional.
Teknologi DNA Rekombinan memiliki beberapa tahapan untuk mendapatkan produk-produk yang
diinginkan. Tahapan-tahapan tersebut yaitu mengisolasi DNA, memotong DNA, menyambung
DNA, memasukkan DNA ke sel hidup atau sel inang, transformasi sel inang menggunakan molekul
DNA rekombinan, reisolasi molekul DNA rekombinan dari sel inang, dan analisis DNA
rekombinan.
1. Isolasi DNA
Isolasi DNA diawali dengan perusakan dan atau pembuangan dinding sel, yang dapat dilakukan
baik dengan cara mekanis seperti sonikasi, tekanan tinggi, beku-leleh maupun dengan cara
enzimatis seperti pemberian lisozim. Bahan-bahan sel yang relatif lunak dapat diresuspensi di dalam
medium bufer nonosmotik, sedangkan bahan-bahan yang lebih kasar perlu diperlakukan dengan
deterjen yang kuat seperti triton X-100 atau dengan sodium dodesil sulfat (SDS).
Setelah sel mengalami lisis, remukan-remukan sel harus dibuang dengan cara sentrifugasi. Protein
yang tersisa dipresipitasi menggunakan fenol atau pelarut organik seperti kloroform untuk
kemudian disentrifugasi dan dihancurkan secara enzimatis dengan proteinase. Jika remukan sel
masih tercampur dengan RNA maka perlu ditambahkan RNAse untuk membersihkan DNA dari
RNA. Molekul DNA yang telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikan dengan penambahan
amonium asetat dan alkohol atau dengan sentrifugasi kerapatan menggunakan CsCl.
2. Pemotongan molekul DNA
Pemotongan molekul DNA, baik genomik maupun plasmid dilakukan dengan enzim restriksi. Ada
dua macam enzim restriksi yaieu enzim restriksi tipe I dan enzim restriksi tipe II. Enzim restriksi
tipe II mempunyai sifat-sifat umum yang penting sebagai berikut:
mengenali urutan tertentu sepanjang empat hingga tujuh pasang basa di dalam molekul
DNA
memotong kedua untai molekul DNA di tempat tertentu pada atau di dekat tempat
pengenalannya
menghasilkan fragmen-fragmen DNA dengan berbagai ukuran dan urutan basa.
Berdasarkan tempat hasil pemotongan, fragmen-fragmen DNA memiliki dua macam ujung yaitu:
Ujung lengket (sticky end) atau ujung kohesif, terjadi jika tempat pemotongan pada kedua
untai DNA terpisah sejauh beberapa pasang basa, sehingga menghasilkan fragmen-fragmen
dengan ujung 5’ yang runcing karena masing-masing untai tunggalnya menjadi tidak sama
panjang. Dua fragmen DNA dengan ujung yang runcing akan mudah disambungkan satu
sama lain.
Ujung tumpul (blunt end), terjadi jika tempat pemotongan DNA pada posisi yang sama.
Kedua fragmen hasil pemotongannya akan mempunyai ujung 5’ yang tumpul karena
masing-masing untai tunggalnya sama panjangnya. Penyatuan dua fragmen DNA ujung
tumpul sulit dilakukan sehingga memerlukan perlakuan tambahan, misalnya pemberian
molekul linker, molekul adaptor, atau penambahan enzim deoksinukleotidil transferase.
3. Penyambungan (ligasi) molekul DNA
Ada tiga cara yang dapat digunakan untuk meligasi fragmen-fragmen DNA secara in vitro. Pertama,
ligasi menggunakan enzim DNA ligase dari bakteri. Kedua, ligasi menggunakan DNA ligase dari
sel-sel E. coli yang telah diinfeksi dengan bakteriofag T4 atau lazim disebut sebagai enzim T4 ligase.
Ketiga yaitu pemberian enzim deoksinukleotidil transferase untuk menyintesis untai tunggal
homopolimerik 3’.
Suhu optimum bagi aktivitas DNA ligase sebenarnya 37ºC. Akan tetapi, pada suhu ini ikatan
hidrogen yang secara alami terbentuk di antara ujung-ujung lengket akan menjadi tidak stabil dan
kerusakan akibat panas akan terjadi pada tempat ikatan tersebut.  Oleh karena itu, ligasi biasanya
dilakukan pada suhu antara 4 dan 15ºC dengan waktu inkubasi (reaksi) yang diperpanjang (sering
kali hingga semalam).
4. Transformasi Sel Inang
Setelah tahap ligasi, dilakukan analisis terhadap hasil pemotongan DNA genomik dan DNA vektor
serta analisis hasil ligasi molekul-molekul DNA tersebut. menggunakan teknik elektroforesis. Jika
hasil elektroforesis menunjukkan bahwa fragmen-fragmen DNA genomik telah terligasi dengan
baik pada DNA vektor sehingga terbentuk molekul DNA rekombinan, campuran reaksi ligasi
dimasukkan ke dalam sel inang agar dapat diperbanyak dengan cepat. Tahap memasukkan
campuran reaksi ligasi ke dalam sel inang dinamakan transformasi karena sel inang diharapkan
akan mengalami perubahan sifat tertentu setelah dimasuki molekul DNA rekombinan.
5. Seleksi Transforman dan Seleksi Rekombinan
Oleh karena DNA yang dimasukkan ke dalam sel inang bukan hanya DNA rekombinan, maka kita
harus melakukan seleksi untuk memilih sel inang transforman yang membawa DNA rekombinan.
Selanjutnya, di antara sel-sel transforman yang membawa DNA rekombinan masih harus dilakukan
seleksi untuk mendapatkan sel yang DNA rekombinannya membawa fragmen sisipan atau gen yang
diinginkan. Cara seleksi sel transforman akan diuraikan lebih rinci pada penjelasan tentang plasmid.
Pada dasarnya ada tiga kemungkinan yang dapat terjadi setelah transformasi dilakukan, yaitu:
(1) sel inang tidak dimasuki DNA apa pun atau berarti transformasi gagal,
(2) sel inang dimasuki vektor religasi atau berarti ligasi gagal, dan
(3) sel inang dimasuki vektor rekombinan dengan/tanpa fragmen sisipan atau gen yang diinginkan.
Seleksi sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan dilakukan dengan mencari
fragmen tersebut menggunakan fragmen pelacak (probe), yang pembuatannya dilakukan secara in
vitro menggunakan teknik reaksi polimerisasi berantai atau polymerase chain reaction (PCR).
Pelacakan fragmen yang diinginkan antara lain dapat dilakukan melalui cara yang dinamakan
hibridisasi koloni.

Referensi:
Sajidan. 2008. Modul Pendidikan dan Pelatihan Profesi Guru (PLPG) Biologi. Surakarta: Panitia
Sertifikasi Guru Rayon 13
http://biologikubiologimu.blogspot.com/2008/09/teknologi-dna-rekombinan.html
http://biomol.wordpress.com/bahan-ajar/dasar-tek-dna-rek/
http://pustaka.ut.ac.id/puslata/online.php?menu=bmpshort_detail2&ID=209