TUGAS TEKNOLOGI ENZIM

EKSPLORASI, ISOLASI, IDENTIFIKASI SERTA PEMURNIAN

ENZIM KOLESTEROL-OKSIDASE SEBAGAI REAGENSIA DIAGNOSIS

Oleh :
I Gede Dwija Bawa Temaja (0808505031)

JURUSAN FARMASI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS UDAYANA

2010
 BAB I
PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Kolesterol adalah suatu molekul lemak yang merupakan salah satu zat gizi yang
sangat diperlukan oleh tubuh kita disamping zat gizi lain seperti karbohidrat, protein,
vitamin dan mineral. Lemak merupakan salah satu sumber energi yang memberikan kalori
paling tinggi. Disamping sebagai salah satu sumber energi, sebenarnya lemak atau
khususnya kolesterol memang merupakan zat yang sangat dibutuhkan oleh tubuh kita
terutama untuk membentuk dinding sel-sel dalam tubuh. Kolesterol juga merupakan bahan
dasar pembentukan hormon-hormon steroid. Kolesterol yang kita butuhkan tersebut, secara
normal diproduksi sendiri oleh tubuh dalam jumlah yang tepat. Tetapi ia bisa meningkat
jumlahnya karena asupan makanan yang berasal dari lemak hewani, telur dan yang disebut
sebagai makanan sampah (junkfood). Kolesterol dalam tubuh yang berlebihan akan
tertimbun di dalam dinding pembuluh darah dan menimbulkan suatu kondisi yang disebut
aterosklerosis yaitu penyempitan atau pengerasan pembuluh darah. Kondisi ini merupakan
cikal bakal terjadinya penyakit jantung dan stroke.
Melihat akibat yang ditimbulkan oleh kelebihan kolesterol tersebut maka jumlah
kolesterol yang ada di dalam tubuh harus terkontrol secara pasti. Untuk itulah diperlukan
suatu metode yang dapat digunakan untuk mendeteksi atau mengukur kadar kolesterol
dalam tubuh. Beranjak dari permasalahan tersebut, sifat enzim yang dapat digunakan
sebagai suatu reagensia diagnosis dapat digunakan untuk menjawab masalah tersebut.
Sebagai reagensia diagnosis, enzim dimanfaatkan menjadi bahan untuk mencari
petanda (marker) suatu senyawa. Dengan memanfaatkan enzim, keberadaan suatu senyawa
petanda yang dicari dapat diketahui dan diukur berapa jumlahnya. Kelebihan penggunaan
enzim sebagai suatu reagensia adalah pengukuran yang dihasilkan sangat khas dan lebih
spesifik dibandingkan dengan pengukuran secara kimia, mampu digunakan untuk mengukur
kadar senyawa yang jumlahnya sangat sedikit, serta praktis karena kemudahan dan
ketepatannya dalam mengukur. Kelebihan kolesterol tadi dapat dideteksi dengan
menggunakan enzim kolesterol-oksidase yang dihasilkan oleh bakteri Pseudomonas sp.
 Dengan fungsinya sebagai reagensia diagnosis hiperkolesterol, maka enzim perlu
dilakukan pemurnian terhadap enzim kolesterol-oksidase yang akan digunakan. Tujuan
dilakukannya pemurnian tersebut adalah untuk mengisolasi enzim spesifikasi dan ekstrak
sel “mentah” (crude) yang mengandung banyak komponen lain. Molekul-molekul kecil
dapat disingkirkan lewat dialisis atau filtrasi gel, asam nukleat melalui pengendapan dengan
antibiotik streptomisin, dan lainnya.

1.2 Rumusan Masalah

1.2.1 Apa sajakah peranan enzim kolesterol-oksidase khususnya di bidang kefarmasian?
1.2.2 Bagaimanakah cara enzim kolesterol-oksidase dieksplorasi, diisolasi, diidentifikasi,
atau dimurnikan?
1.2.3 Bagaimanakah hasil yang diperoleh dari proses eksplorasi, isolasi, identifikasi, atau
pemurnian enzim kolesterol-oksidase?

1.3 Tujuan
1.3.1 Untuk mengetahui peranan enzim kolesterol-oksidase khususnya di bidang
kefarmasian.
1.3.2 Untuk mengetahui cara enzim kolesterol- dieksplorasi, diisolasi, diidentifikasi, atau
dimurnikan.
1.3.3 Untuk mengetahui hasil yang diperoleh dari proses eksplorasi, isolasi, identifikasi,
atau pemurnian enzim kolesterol-oksidase.
 BAB II
PEMBAHASAN

2.1 Peranan Enzim Kolesterol-Oksidase.

Enzim kolesterol-oksidase memiliki banyak aplikasi dalam bidang kedokteran,
pertanian, industri, farmasi dan bidang lainnya. Sebagai contoh aplikasinya adalah dapat
digunakan untuk diagnostik kit yang digunakan untuk mendeteksi kolesterol darah,
insektisida biologis dan prekursor untuk hormon steroid. 
Enzim merupakan suatu protein fungsional yang dapat mengkatalisis suatu reaksi
kimia dalam makhluk hidup. Karakteristik tersebut juga dimiliki oleh kolesterol-oksidase
yang merupakan suatu protein fungsional (enzim). Kolesterol-oksidase juga mengkatalisis
suatu reaksi kimia di dalam tubuh makhluk hidup. Enzim kolesterol-oksidase mampu
mengkatalisis oksidasi kolesterol (5-cholesten-3-ol) menjadi 4-cholesten-3-one dengan
mereduksi oksigen menjadi hidrogen peroksida.
Penentuan tingkat kolesterol dalam darah sangat penting dalam diagnosis medis
pengelolaan penyakit jantung seperti aterosklerosis, nephrosis, diabetes mellitus, myxedema
ikterus obstruktif dan cholelithiasis. Diantara berbagai metode yang tersedia untuk
penentuan kolesterol serum, metode kolorimetri enzymic yang menggunakan kolesterol-
oksidase (COD) merupakan metode yang relatif sederhana, sensitif, spesifik dan cepat,
sehingga cocok digunakan untuk pengujian rutin.
Kolesterol merupakan senyawa penting dari membran sel dan prekursor untuk
sintesis garam empedu dan hormon steroid. Kolesterol disintesis di hati dan diangkut dalam
darah terutama dalam bentuk LDL dan HDL. Dalam darah, kolesterol berada dalam bentuk
bebasnya serta dalam bentuk teresterifikasi.
Adapun prinsip metode kolesterol-oksidase dalam penentuan kolesterol adalah
kolesterol ester yang terdapat dalam serum darah dihidrolisis oleh kolesterol
esterase. Selanjutnya kolesterol bebas kemudian dioksidasi oleh  kolesterol-oksidase dan
bersama keton membebaskan hidrogen peroksida, yang kemudian diubah menjadi air dan
oksigen oleh enzim peroksidase. Para aminophenazone (4 aminophenazone) kemudian
mengambil oksigen dan bersama-sama dengan salah satu bentuk fenol, pewarna 
 quinoneimine  yang berwarna pink. Selanjutnya dapat diukur pada panjang gelombang 515
nm dengan menggunakan spektrofotometer.

2.2 Proses Eksplorasi, Isolasi, Identifikasi, serta Pemurnian Kolesterol-Oksidase

2.2.1 Proses Eksplorasi, Isolasi dan Identifikasi Enzim Kolesterol-Oksidase.
Banyak bakteri yang dapat memproduksi enzim kolesterol-oksidase, termasuk
didalamnya adalah bakteri dari jenis Arthrobacter, Brevibacterium, Pseudomonas,
Nocardia, Rhodococcus, Sterptomyces, Corynebacterium dan Shizophylum.

Mikroorganisme yang memproduksi kolesterol-oksidase diisolasi dengan

prosedur sebagai berikut. Suspensi tanah disebarkan kedalam plat agar-agar yang
 berisi media isolasi, yang tersusun dari gliserol 1,0%, 0,5% larutan curam jagung,
0,1% KH2PO4, NaNO3 0,1% dan 0,05% MgSO4 (pH 7.3) dan dipadatkan dengan agar-
agar 1,5%. Pelat diinkubasi pada suhu 30° C selama 24 jam dan koloni bakteri yang
muncul direplikasi dengan menggunakan tusuk gigi kedalam plat medium isolasi. Plat
replika selanjutnya diinkubasi pada suhu 30° C selama 24 jam. Untuk mengidentifikasi
kolesterol-oksidase, digunakan metode pewarnaan koloni pada plat agar. Filter kertas
dicelupkan ke dalam kolesterol 0,5%, 1,76% 4-aminoantipyrine, 6% fenol dan 3000
unit/1 horseradish peroksidase dalam 100 mM buffer kalium fosfat, pH 7,0 (KPB),
ditempatkan pada koloni yang tumbuh pada media agar dan diinkubasi pada 30 ° C.
Aktivitas kolesterol oksidase dalam koloni uji ditunjukkan dengan adanya warna
merah karena pembentukan pewarna quinoneimine.
Strain yang mampu menghasilkan warna merah dipilih dan dibudidayakan pada
suhu 30° C dalam 5 ml media isolasi cair dengan pengocokan konstan. Sel-sel
dikumpulkan dengan sentrifugasi dan culture broth diuji untuk aktivitas ekstraselular
kolesterol-oksidase. Media yang digunakan untuk pemurnian enzim adalah medium
nutrisi (1,0% pepton, 0,4% ekstrak ragi, 0,1% glukosa, 0,5% NaC1, pH 7,2) dan sel
ditumbuhkan pada suhu 30° C selama 24 jam dengan pengocokan timbal balik dalam
erlenmeyer flask 3-1 yang mengandung 1000 ml media.
Satu unit aktivitas kolesterol oksidase didefinisikan sebagai jumlah enzim yang
mengkatalis pembentukan 1mol hidrogen peroksida/menit pada suhu 37° C.

2.2.2 Proses Pemurnian Enzim Kolesterol-oksidase

Pemurnian protein dilakukan untuk mengisolasi enzim spesifikasi dan ekstrak
sel “mentah” (crude) yang mengandung banyak komponen lain. Banyak kegunaan
yang didapatkan dengan menggunakan protein yang telah dimurnikan. Protein murni
dapat digunakan untuk menentukan urutan asam amino. Urutan asam amino tersebut
kemudian dapat digunakan sebagai probe untuk membantu dalam isolasi gen.
Protein murni juga dapat digunakan untuk memproduksi antibodi yang dapat
digunakan sebagai probe untuk membantu dalam isolasi gen. Penggunaan protein
murni juga diperlukan dalam mempelajari fungsi enzim.
 Pemurnian enzim kolesterol-oksidase dilakukan pada suhu 00 – 50 C, kecuali
dinyatakan khusus. Proses pemurnian kolesterol-oksidase dilakukan dalam tiga tahap
yaitu tahap persiapan larutan enzim kasar, tahap kromatografi kolom DEAE-selulosa,
serta tahap kromatografi kolom afinitas kolesterol.
Pada tahap persiapan larutan enzim kasar, culture broth (10 1) di sentrifugasi
pada 10000 rpm selama 10 menit. Kemudian supernatan bersih yang didapatkan
selanjutnya digunakan untuk pemurnian enzim.
Setelah selesai tahap preparasi, maka akan dilakukan pemurnian dengan
menggunakan kromatografi kolom. Adapun prinsip penggunaan kromatografi kolom
dalam pemurnian enzim adalah:
a. Campuran protein (enzim) dimasukkan ke dalam kolom kromatografi.
b. Protein target yang akan dimurnikan akan terikat pada resin di dalam kolom.
c. Pencucian kolom dilakukan untuk menghapus protein lain yang bukan
merupakan target.
d. Mengelusi protein target dengan fase gerak.
Pada tahap kedua yaitu kromatografi kolom DEAE-selulosa, culture broth
(10200 mg protein, 10 1) secara langsung diload pada kolom DEAE-selulosa yang
diequilibrasi dengan 10 mM KPB. Kolom dicuci secara ekstensif dengan 500 ml
larutan buffer yang sama. Enzim kolesterol-oksidase tidak akan mampu diserap pada
kolom di bawah kondisi yg ditetapkan. Selanjutnya fraksi aktif dikumpulkan dan
kemudian dipekatkan melalui ultrafiltrasi pada sebuah Pellicon Membran PTGC OLC
M2.
Pada tahap ketiga yaitu tahap kromatografi kolom afinitas kolesterol, kolesterol
komersial direkristalisasi dengan menggunakan etanol 50%. Selanjutnya kolesterol
yang telah direkristalisasi tersebut digunakan sebagai adsorben enzim. Kolesterol-
oksidase yang berkonsentrasi (508 mg protein, 100 ml) diload ke dalam kolom afinitas
kolesterol (1,2 × 30 cm) yang diequilibrasi dengan 10 mM KPB. Setelah kolom
tersebut dicuci dengan 100 ml 10 mM KPB, kolesterol-oksidase kemudian dielusi
dengan 0,1% Triton X-100 dalam 10 mM KPB. Untuk menghapus kolesterol dan
Triton X-100 dari dalam larutan enzim, eluat dilewatkan pada kolom-G 150 Sephadex
(1,6 x 90 cm) yang diequilibrasi dengan 10 mM KBP. Fraksi aktif digabungkan, dan
 dipekatkan seperti tahap sebelumnya dan dapat digunakan untuk karakterisasi
kolesterol-oksidase.

2.3 Hasil Eksplorasi, Isolasi, Identifikasi dan Pemurnian Kolesterol-oksidase.

Mikroorganisme yang digunakan untuk memproduksi kolesterol-oksidase yaitu
Pseudomonas sp, diisolasi dari tanah. Prosedur untuk pemurnian enzim
diringkas dalam Tabel 1 dan Gambar. 2. 

Kolesterol-oksidase ini dimurnikan sekitar 2400 lipat dari culture broth dengan
aktivitas hasil 60% (Tabel 1). Enzim kolesterol-oksidase yang telah dimurnikan tampak
homogen sebagaimana dinilai oleh SDS-PAGE (Gambar 2, jalur C).
 Adapun berat molekul dari enzim kolesterol-oksidase yang diperoleh berdasarkan
filtrasi gel dalam kolom Sephadex G-150 (1.6 x90 cm) adalah sebesar 56000. Pada
SDS-PAGE, enzim kolesterol-oksidase yang bermigrasi sebagai band tunggal protein
dengan berat molekul 56 000 (Gambar 2, jalur C), menunjukkan bahwa kolesterol-oksidase
dari Pseudomonas sp.  terdiri dari polipeptida rantai tunggal dengan berat molekul sekitar
56000.
Enzim murni kolesterol-oksidase paling aktif bekerja pada pH  7,0, saat aktivitasnya
diuji dalam 100 mM buffer kalium fosfat pada suhu 37° C. Di sisi lain, aktivitas
enzim akan dengan cepat hilang pada pH 5,0 dan pH 9,0 dimana aktivitasnya berkurang
menjadi sepertiga dari aktivitasnya pada pH 7,0. Untuk menentukan stabilitas pH enzim,
2,5 g enzim dalam 0,5 ml 10 mM buffer Trismalate diinkubasi pada berbagai pH selama 1
 menit pada suhu 60 ° C dan aktivitas sisanya diuji pada kondisi standar. Tidak ada
kehilangan aktivitas yang cukup besar ditemukan antara pH 5,0 dan pH 8,0. Dua puluh lima
persen kehilangan aktivitas diamati pada pH 10.
Laju oksidasi relatif berbagai tingkat steroid oleh enzim
diukur dengan pembentukan hidrogen peroksida. Enzim murni secara khusus
mengoksidasi gugus 3-hidroksi dalam steroid (kolesterol, dihydrocholesterol, ergosterol,
stigmasterol, stigmastanol, 7-dehydrocholesterol) (Tabel 2).

Karakteristik dari enzim kolesterol-oksidase ditandai dengan stabilitasnya pada

kondisi ekstrim seperti suhu tinggi dan agak pH agak asam dan basa. Stabilitas terhadap
panas dari enzim ini memberikan suatu keuntungan besar untuk keperluan klinis.

BAB III
PENUTUP

3.1 Kesimpulan
3.1.1 Enzim kolesterol-oksidase memiliki banyak aplikasi dalam kedokteran,
pertanian, industri, farmasi dan bidang lainnya misalnya dapat digunakan untuk
 diagnostik kit yang digunakan untuk mendeteksi kolesterol darah, insektisida biologis
dan prekursor untuk hormon steroid.
3.1.2 Enzim kolesterol-oksidase diekplorasi dan diisolasi dari bakteri jenis Pseudomonas sp.
Selanjutnya dilakukan pemurnian yang bertujuan untuk mengisolasi enzim spesifikasi
dan ekstrak sel “mentah” (crude) yang mengandung banyak komponen lain.
Pemurnian dilakukan dalam tiga tahap yaitu tahap persiapan larutan enzim kasar,
tahap kromatografi kolom DEAE-selulosa, serta tahap kromatografi kolom afinitas
kolesterol.
3.1.3 Hasil yang diperoleh setelah proses ekplorasi, isolasi, identifikasi dan pemurnian
enzim adalah kolesterol-oksidase ini dimurnikan sekitar 2400 lipat dari culture broth
dengan aktivitas hasil 60%, terlihat homogen sebagaimana dinilai oleh SDS-PAGE,
serta memiliki karakteristik yaitu memiliki berat molekul 56000, paling aktif bekerja
pada pH  7,0 serta stabil pada kondisi ekstrim seperti suhu tinggi dan agak pH agak
asam dan basa.

DAFTAR PUSTAKA

Anonim a. 2010. Cholesterol–cholesterol Oxidase Method. (cited 4 Desember 2010). Available

at: http://www.searo.who.int/en/Section10/Section17/.../Section481_1756.htm.
Anonim b. 2010. Peran Enzim Dalam Metabolisme dan Pemanfaatannya Di Bidang Diagnosis
dan Pengobatan. (cited 2 Desember 2010). Available at:
http://www.sectiocadaveris.wordpress.com/.../peran-enzim-dalam-metabolisme-dan-
pemanfaatannya di-bidang-diagnosis-dan-pengobatan/

Anonim c. 2010. Kolesterol. (cited 2 Desember 2010). Available at:

http://www.farmasiku.com/index.php?target=categories&category_id=194

Bhatia, Deepak., Suman, Pundir CS. 2004.  Preparation of A Reusable Enzyme Strip For
Determination of Serum Cholesterol. Indian Journal of Biotechnology Vol 4, October
2005: India.

Lashkarian,H. E., Raheb, Shahzamani, Shahbani, Shamsara, Hajipour1. 2010. Isolation and
Identification of A Native Rhodococcus Strain Producing Cholesterol Oxidase From Soil.
International Journal of Biotechnology and Biochemistry Vol 6 No 2 (2010): India.

Lee, Sang-young ., Hae-ik Rhee, Weon-chan Tae, Jeong-chul Shin, Boo-kii Park. 1989.
Purification and Characterization of Cholesterol Oxidase From Pseudomonas sp. and
Taxonomic Study of The Strain. Appl Microbiol Biotechnol (1989): Chuncheon.

Wirajana, Nengah. 2010. Pemurnian Enzim (Slide Matakuliah Teknologi Enzim). Jurusan
Farmasi Universitas Udayana: Bukit Jimbaran.