Cultura de celule – reprezinta menţinerea în afara organismului a celulelor neorganizate in tesuturi, dar

capabile sa se divida si sa exprime in vitro metabolisme si functii specifice.

Prima etapa pentru izolarea unui tip particular de celule dintr-un tesut care contine un amestec de
celule de diferite tipuri, este de a distruge matricea extracelulara si jonctiunile celulare care leaga
celulele intre ele. Daca aceste celule sunt destinate culturilor celulare, ele trebuie sa ramana
viabile.
Disocierea celulelor consta din:
◦ “digerarea” matricei extracelulare cu enzime proteolitice (tripsina, colageneza),
◦ tratamentul fragmentelor de tesut cu anumiti agenti chelatori (EDTA) care leaga ionii de calciu, de care
depinde foarte mult adeziunea intercelulara.
Separarea unui tip anume de celule aflate intr-o suspensie mixta:
◦ diferentele intre proprietatile fizice ale celulelor. De exemplu, celulele mici pot fi separate de cele mari
prin centrifugare.
◦ proprietatile celulelor de a adera mai intens la un substrat decat cele cu care se afla in amestec

Parametrii cuantificaţi
Volumul si complexitatea morfologicã a celulelor
. Pigmenþii celulari precum clorofila sau ficoeritrina
. ADN (analiza ciclului celular, cinetica celulelor, proliferarea)
. ARN
. Analiza ºi sortarea cromozomilor
. Expresia ºi localizarea proteinelor
. Antigene de suprafaþã celularã (CD – Cluster of differentiation)
. Antigene intracelulare (citokine, mediatori secunzi)
. Antigene nucleare
. Activitatea enzimaticã
. pH, calciul ionizat intracelular, magneziul, potenþialul de membranã
. Fluiditatea membranarã
. Apoptoza (gradul apoptozei, cuantificarea degradãrii ADN, potenþialului membranei
mitocondriale, modificarea permeabilitãþii, activitatea caspazei)
. Viabilitatea celularã
. Arderile oxidative (oxidative burst)
. Caracterizarea rezistenþei la chimioterapice a celulelor canceroase (multidrug resistance
-MDR)
Culturi celulare:
◦ In suspensie – bacterii, limfocite
◦ In monostrat – suport: suprafata vasului de cultura, in anumite cazuri acoperita cu componente ale MEC
Multiplicarea celulelor de un anumit tip se poate realiza in culturi celulare
O caracteristica importanta a majoritatii celulelor este aceea ca o singura celula poate creste si se
poate divide in conditii experimentale, proces numit clonare. O populatie de celule pure dpdv genetic,
perfect identice intre ele si care provin din diviziunea unei singure celule mama, formeaza o clona celulara
Celulele cultivate, cu originea dintr-o singura celula formeaza colonii vizibile, atasate pe suportul de cultura
(sticla sau plastic), dupa 10-14 zile. Exista insa si celule care cresc in suspensie, acestea oferind avantaje
experimentale considerabile.
Celulele animale, pentru a creşte in cultura, au anumite necesitati bine definite aminoacizii esentiali
(arginina, histidina, izoleucina, lizina, metionina, fenilalanina, treonina, triptofanul si valina) din mediul in
care traiesc deoarece nu si-i pot sintetiza
 cisteina, glutamina si tirozina, deoarece acesti aminoacizi pot fi sintetizati doar de celule specializate din
organismul animal (tirozina – ficat, glutamina – ficat si rinichi)
Alte componente esenţiale pentru mediile de cultura sunt:
◦ vitaminele
◦ sarurile
◦ glucoza
◦ serul (componenta necelulara a sangelui, o solutie formata din diverse proteine). Rolul serului este de a
suplimenta mediile nutritive cu factori proteici de crestere.
Culturi primare si culturi de celule
Transformate
Culturile celulare primare - deriva direct dintr-un tesut animal normal, cel mai frecvent provin din piele sau
din embrion. Celulele din asemenea culturi sunt predominant fibroblaste, care se gasesc in tesuturile
conjunctive din orice parte a organismului. Fibroblastele produc colagen, precum si materiale care formeaza
substanta fundamentala a tesutului conjunctiv
Culturi primare
Ele cresc bine cand sunt plasate in flacoane de cultura, multiplicandu-se timp de 50-100 de generatii, dupa
care intra in “criza”, cand isi incetinesc cresterea, pentru ca in cele din urma sa se opreasca din diviziune si
sa moara. Fibroblastele provenite de la organisme tinere rezista in cultura mai multe generatii decat cele
provenite de la un organism adult.
Celulele epiteliale produc in cultura celule in general mult mai specializate decat fibroblastele; ele se cultiva
mult mai dificil şi, de asemenea, nu pot creste nelimitat. Culturile primare se efectueaza din suspensii de
celule disociate din tesuturi. In cultura, celulele isi pot pastra unele proprietati particulare ale
tesutului din care provin:
. fibroblastele continua sa secrete colagen,
. celulele derivate din muschiul scheletic embrionar fuzioneaza pentru a forma fibrele musculare care se
contracta spontan in flacoanele de cultura,
. celulele nervoase isi extind axonii care isi pastreaza excitabilitatea electrica si intra in sinapsa cu celulele
vecine.
. celulele epiteliale formeaza un strat cu proprietati similare epiteliului intact
Culturi transformate
Toate celulele de mamifere care sunt capabile de creºtere nelimitata in cultura, sunt derivate ori din
celule tumorale, ori din culturi de celule care au suferit unele modificari care le aseamana cu celulele
tumorale. Culturile de celule care cresc un timp indefinit se numesc culturi transformate; acest
termen este utilizat pentru a desemna orice celula care este nemuritoare. Majoritatea celulelor
transformate si-au pierdut diferenţierea functiilor celulare normale, cum ar fi producţia unor proteine
specifice sau capacitatea organizarii in tesuturi. Aceste culturi sunt frecvent utilizate pentru studiul unor
elemente structurale sau procese celulare comune tuturor celulelor.
 Culturile de celule transformate se folosesc frecvent ca mediu de infectie virala.
Celulele stem adulte
Celulele stem adulte pluripotente sunt rare si prezente in numar redus: sunt intalnite in special la nivelul
cordonului ombilical. Majoritatea celuleler stem adulte sunt multipotente: mezenchimale, adipoase,
endoteliale

Culturi de celule embrionare in monostrat

Principiu
. Culturile celulare in monostrat constau din cultivarea in mediu nutritiv a unor celule care provin
dintr-o suspensie celulara obtinuta prin dilacerarea unui tesut cu enzime proteolitice, celule care in
conditiile de cultura se multiplica pe un suport solid reprezentat de peretii flaconului de cultura sau
de alte suporturi pregatite special.
. Tesuturi embrionare sau adulte . digerarea materailului intercelular cu tripsina sau colagenaza
. Suspensia celulelor in mediu nutritiv, in flacon special de cultura -> monostrat
. Dupa formarea monostratului . celulele sunt desprinse de pe suport, diluate cu mediu de cultura si
repartizate in 2 flacoane . subcultivarea (pasajul) celulelor. Transform.ri suferite de celule in culturile
in monostrat:
. Ata.area . primele 1-3 ore de la punerea in cultura.
Este determinata de interactiunea dintre suprafata celulelor si suportul de cultura
. Aplatizarea . modificarea morfologiei celulelor . turtite, aplatizate, emit prelungiri sub forma
pseudopodelor.
Dupa aplatizare celulele stabilesc jonctiuni cu celulele vecine
. Faza logaritmic. de cre.tere . initierea proceselor metabolice celulare care determina celulele sa intre
in
diviziune celulara. Celulele realizeaza iun ciclu celular la 15-20 de ore. Monostratul se formeaza dupa
3-4 zile de la punerea in cultura.
. Faza sta.ionar. . inhibi.ia de contact . consta in inhibitia diviziunii si miscarilor celulare ca urmare a
stabilirii unui grad de atingere intima a membranelor celulelor vecine
Cultivarea liniilor celulare Stabilizate
Principiu
◦ Liniile celulare stabilizate sunt reprezentate de culturi celulare provenite din culturile primare, care au
suferit procesul de transformare, fiind capabile sa suporte un numar nelimitat de subcultivari.
◦ Avantaj: pot fi conservate la temp azotului lichid (- 190oC), eliminand necesitatea transferului serial
continuu al culturilor.
Controlul cineticii si evolutiei culturilor in vitro
Fazele precoce: ex microscopic
 Fazele tardive:
◦ Numărători de celule
◦ Teste de viabilitate: coloranţi vitali – eozină, albastru tripan
◦ Determinarea indicelui mitotic – I – raportul intre numarul celulelor aflate in mitoza (n) si numarul total de
celule pe suprafata respective (N)
◦ Determinarea densităţii celulare pe suprafaţa suportului - nr de celule pe cm2 de suport

Initierea unei culturi de limfocite

Principiu
◦ Cultivarea limfocitelor care provin din sangele periferic este posibila doar daca aceste celule sunt stimulate
blastic prin introducerea in mediul de cultura a unor substante numite lectine (fitohemaglutinina). In starea
de blasti, limfocitele intra in diviziuni succesive, ceea ce permite multiplicarea lor in cultura.