Professional Documents
Culture Documents
Thuc Tap KTCB
Thuc Tap KTCB
Mục đích nhằm tách protein Bromelain tinh sạch trên cây Dứa. Enzyme Bromelain là
một hỗn hợp được chiết từ quả dứa và qua nhiều nghiên cứu, giới khoahọc đã phát hiện
ra đây là loại enzyme tiêu hoá có chứa nhiều protein tiềm ẩn (thường được gọi là
cysteine proteinases). Loại enzyme này có tác dụng tăng cường sức khoẻ cho hệ tiêu hoá,
chống viêm nhiễm, tắc nghẽn thành mạch máu, giảm thiểu phát triển các khối u trong cơ
thể.
I. Cơ sở lý thuyết
1. Sắc ký
a. Khái niệm
Sắc ký là tên gọi chung của phương pháp tách các chất.
Năm 1903, Svet nhà khao học người Nga lần đầu tiên dụng cột sắc ký hấp phụ (than hoạt
tính) để tách các sắc tố thực vật từ hỗn hợp dịch chiết thành các lớp có màu khác nhau. Do vậy
mà nó được đặt tên là phương pháp Sắc ký – Chromatography (hay ghi màu). Tên gọi này được
giữ tới bây giờ dù có nhiều chất phân tách không phải chất màu.
b. Nguyên tắc
Dựa trên sự phân bố các chất giữa hai pha : pha cố định và pha di động.
c. Phân loại
Dựa trên hiện tượng hóa lý trong quá trình tiến hành chia thành 3 nhóm:
Sắc ký phân bố
Sắc ký khí
Tương tác ion – cơ sở của việc tách và tinh chế protein bằng IEC đã được ứng dụng thành
công từ cuối những năm 1940.
IEC hiện tại là kỹ thuật tách protein phổ biến nhất, được sử dụng nhiều nhất trong các quy
trình tinh chế và tinh sạch protein.
IEC: 75%
b. Nguyên tắc
Trước tiên protein sẽ gắn thuận nghịch với các chất trao đổi bằng tương tác ion giữa các
nhóm mang điện tích trái dấu.
Sau đó protein được chiết rút riêng biệt nhờ việc tăng dần lực ion làm cho tương tác ion
bị bẻ gãy thông thường dùng gradient muối NaCl hay gradient pH.
Cơ sở của IEC là sự cạnh tranh các nhóm tích điện trái dấu trên chất trao đổi giữa các ion
của chất cần tách với các ion khác. Tương tác giữa các phân tử nhỏ và chất trao đổi phụ thuộc
vào điện tích phân tử và lực ion môi trường. Khi nồng độ ion cạnh tranh thấp các ion cần tách sẽ
lien kết với chất trao đổi ion. Khi nồng độ ion cạnh tranh cao các ion cần tách sẽ rời ra.
Tương tác giữa protein và chất trao đổi còn phụ thuộc vào:
o pH dịch đệm
c. Giá thể
Giá thể có chứa các nhóm tích điện có thể là tích điện âm hoặc tích điện dương. Nếu tích
điện dương gọi là “trao đổi anion”, còn tích điện âm gọi là “trao đổi cation”.
Một số máy móc: máy xay sinh tố, máy ly tâm, máy đo OD…
Đệm chạy sắc ký Tris-HCl 50mM, pH 0.8, NaCl 50mM (đệm A).
1. Chuẩn bị mẫu
Cân 50g chồi dứa, dùng dao thái nhỏ và nghiền trong
50ml đệm A bằng máy xay sinh tố. Sau khi chồi dứa được
nghiền thành dạng đồng nhất tiến hành li tâm 10000 vòng/15
phút/4°C, tiếp đến thu lấy dịch trong rồi lọc bằng giấy lọc để
thu dịch trong.
I.
Các Kỹ Thuật Mới Trong Công Nghệ Sinh Học
Tráng qua cột bằng đệm A rồi đóng khóa phía dưới cột
Khuấy nhẹ hòa đều gel rrooif dùng pipet bơm từ từ vào cột (cần chú ý tránh tạo bọt trong
gel và gel phân lớp không đồng nhất), để gel lắng một lúc.
Mở khóa để đệm chảy ra và để gel lắng dưới tác dụng của áp suất trong cột.
Tiếp tục đổ gel vào cột cho đến khi gel trong cột được khoảng 10ml.
6. Rửa mẫu
Nhằm loại sạch những còn dính lại trong cột nhưng không gắn với giá thể, loại bỏ những
protein gắn yếu…
Cho đệm A chảy qua từ từ tốc độ khoảng 25ml/h trong khoảng 3h đến khi OD280 của
dịch rửa khoảng 0.1 thì không phải rửa nữa.
7. Chiết mẫu
Rửa chiết mẫu bằng gradient NaCl từ 50mM1M với thể tích 80ml. Sử dụng thiết bị tạo
gradient gồm 2 lỗ: một lỗ chứa 40ml NaCl 0.05M và 1 lỗ chứa 40ml NaCl 1M, thông với
nhau và có ống dẫn ra ngoài. Cho dịch muối chảy từ từ vào cột gel.
Thu liên tục dịch chảy ra từng phân đoạn vào 80 ống nghiệm nhỏ mỗi ống thu 1ml.
Tiến hành đo OD280 các ống thu được, đo các ống chẵn theo thứ tự: 2,4,6….80
Dịch chiết thô sau lọc có thể tích V = 33ml, OD280 = 1.321
Độ tải của gel là 10mg protein/1ml mẫu. Vậy 10ml gel tải được 100mg proteinGel thừa
tải
Trên sơ đồ đỉnh cao nhất là đỉnh số 11 hay là OD280 của ống số 22 và có giá trị OD280 =
3.59
o Ta có khối lượng protein chế phẩm thu được là: = 5.44 (mg)