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Introducción

Significa "Escribir en Colores“.

Los componentes de una mezcla pueden
Cromatografía presentar una tendencia diferente a
permanecer en cualquiera de las fases
involucradas.
Es la separación de dos o más
compuestos químicos en un medio.

Aspectos históricos de la
cromatografía

La técnica de cromatografía aparece en

1850.
 El químico F.F.Runge, que trabajaba con
tintas, descubre que los cationes orgánicos se
podían separar por migración cuando se
colocaba una solución que los contenía sobre
un material poroso, como papel.

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Aspectos históricos de la Aspectos históricos de la

cromatografía cromatografía

 En 1906 el botánico ruso Tswett utilizó la
cromatografía de columna para separar
extractos vegetales coloreados.
Por primera vez se utiliza el nombre de cromatografía.
 En 1930 Lederer consigue separar los
colorantes de la yema de huevo.
 Los químicos Khun, Kamer y Ruzucca
desarrollan la cromatografía en el campo de la
química orgánica e inorgánica.
Obtienen el premio Nóbel por sus trabajos en 1937,
1938, 1939 respectivamente.
 A partir de 1940 los métodos cromatográficos
adquieren extensión mundial.
En 1940 Tiselius divide los métodos cromatográficos en
cromatografía por análisis frontal, desarrollo por elusión
y desarrollo por desplazamiento, obtuvo el premio Nóbel
por sus trabajos en 1948.
 Para el mismo tiempo la cromatografía
comienza a aplicarse en el campo de la
bioquímica.
Martin consigue separar algunos aminoácidos
acetilados.

Conceptos generales Tipos de cromatografía

 La cromatografía se basa en un conjunto de técnicas  Cromatografía plana: La fase estacionaria se
asociadas al principio de retención selectiva. sitúa sobre una placa plana o sobre un papel.
 Permite separar los distintos componentes de una mezcla,
permitiendo identificar y determinar las cantidades de dichos Las principales técnicas son:
componentes. Cromatografía en papel
 Posee: Cromatografía en capa fina
 Fase móvil: consiste en un fluido (gas, líquido o fluido  Cromatografía en columna: La fase estacionaria
supercrítico).
 Fase estacionaria: se trata de un sólido o un líquido fijado en se sitúa dentro de una columna.
un sólido. Según el fluido empleado como fase móvil se
 Los componentes de la mezcla interaccionan en forma distinguen:
diferente con la fase estacionaria y con la fase móvil. Cromatografía de líquidos
 Los componentes atraviesan la fase estacionaria a distintas Cromatografía de gases
velocidades y se van separando. Cromatografía de fluidos supercríticos`

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Aspectos históricos de los distintos
tipos de cromatografía
 Cromatografía en papel
Fue desarrolla por Martin.
Tiene como soporte un papel de celulosa.
Es una técnica sencilla y presenta la ventaja de
poder utilizar cantidades pequeñas de muestra
(miligramos y microgramos).
Cromatografía de columna
 Consiste en la aplicación de una muestra
compleja a una columna de cristal.
Contiene una matriz sólida porosa que está inmersa en
el solvente.
Se bombea una gran cantidad de solvente a través de
la columna.
 Las diferentes mezclas se van retrasando de manera
distinta según sus interacciones con la matriz.
 Se pueden separar de acuerdo a su carga, su
hidrofobicidad, su tamaño o su capacidad de unirse a
grupos químicos particulares.
 La pureza de las fracciones obtenidas se suele comprobar
mediante la electroforesis en geles de poliacrilamida.
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Aspectos históricos de los distintos
tipos de cromatografía
Cromatografía en capa fina
Fue originada en 1938 por los trabajos de los
investigadores rusos Izmailov y Schraiberen.
Lograron separar mezclas de tinturas farmacéuticas.
En este tipo de cromatografía la fase
estacionaria se extiende sobre un soporte
inerte (silica).
Stahl estandarizó el método para elaborar
capas finas por métodos mecánicos.
Términos relacionados con el proceso
Matriz de la columna
Longitud de la columna
Volumen de la columna: volumen total
de gel.
‘Run Throught’: volumen de muestra mas
solvente.
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Cromatografía de intercambio iónico
 Se realiza sobre matrices que tienen una carga
neta.
 Carga negativa: intercambio de cationes
 Carga positiva: intercambio de aniones
 La carga de la matriz de la columna así como la
carga de la muestra dependerá del pH del
solvente y de su fuerza iónica (proporcional a la
concentración de iones).
 Se usa en la separación de moléculas grandes
(proteínas y ácidos nucleicos).
Cuando las separaciones exigen condiciones químicas
fuertes se emplean intercambiadores iónicos
inorgánicos.
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Aspectos históricos de los distintos
tipos de cromatografía
Cromatografía de intercambio iónico
Esta técnica apareció durante la II Guerra
Mundial.
Tenía la finalidad de separar los elementos
alcalinotérreos y los elementos de transición.
En 1938 Taylor y Urey utilizan este método
para separar isótopos de Litio y Potasio
utilizando resinas de zeolita.
En 1939 Samuel logra sintetizar resinas de
intercambio iónico.
Cromatografía de intercambio iónico
Funcionamiento
En unas condiciones determinadas serán retenidas
en la columna las muestras que tengan una carga
complementaria a la de la matriz de la gel, siendo
eluidas las restantes.
Para eluir las muestras retenidas se puede variar la
carga iónica del solvente o su pH de forma que se
alcance el punto isoeléctrico de la muestra de
interés o el de la matriz, neutralizando de este
modo la fuerza que retiene a la muestra en la
columna.
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Aspectos históricos de los distintos
tipos de cromatografía
 Cromatografía de gel-filtración
Fodin y Porath en 1958 descubren que usando como
fase estacionaria geles se puede separar polímeros
sintéticos de alto peso molecular.
 Cromatografía de afinidad.
Porath en 1967 utiliza un péptido o proteína unida
covalentemente a un ligando y la utiliza para la
separación de moléculas proteicas.
 Cromatografía de gas.
Es una de las técnicas más utilizadas e importantes.
 Ha revolucionado el campo de la química analítica.
Cromatografía de exclusión
 Hay diferentes tamaños de partícula para
un gel:
a menor tamaño mayor resolución y menor
gasto en la columna.
 Este técnica se emplea en la separación
de proteínas de alimentos, determinación
de glucosa y fructosa en zumos de fruta,
etc.
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Cromatografía de exclusión
 La cromatografía de exclusión molecular o de filtración
en gel, separa las muestras en base a su tamaño.
 La matriz de la columna esta formada por un polímero
entrecruzado con poros de tamaños determinados.
 Las muestras de mayor tamaño migran a lo largo de la
columna con mayor velocidad que las de tamaño
pequeño.
 Las muestras de menor tamaño, entran en los poros y
se mueven a lo largo de la columna lentamente porque
tienen que atravesar los laberintos que se encuentran en
el interior de las bolas de polímero en su marcha a lo
largo de la columna.
Características de las matrices
Deben ser estables.
Tener bajo contenido en grupos iónicos.
Uniformidad de poro y tamaño.
Los compuestos utilizados pueden ser
derivados de:
Dextranos (Sephadex)
Agarosa (Sepharosa)
Acrilamidas (Biogel P)
Esferas de vidrio
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Cromatografía de afinidad
 Permite la separación de mezclas por su afinidad o
capacidad de unión a un determinado ligando.
 Las muestras que se retienen en la columna son
aquellas que se unen específicamente a un ligando que
previamente se ha unido covalentemente a la matriz de
la columna.
 Después de que las muestra que no se unen al ligando
son lavadas o eluídas a través de la columna, la muestra
de interés que ha quedado retenida en la columna se
eluye (se libera) mediante el empleo de una solución
que contiene bien ligando libre u otro compuesto que
rompa la interacción entre el ligando y la proteína
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Ligandos de afinidad
 Son las moléculas bioquímicas que se encuentran
ancladas químicamente sobre el soporte sólido
inerte, y son las responsables de la adsorción
específica de los solutos-analitos.
 Se clasifican según su:
 Naturaleza - pueden ser macromoléculas biológicas o bien
moléculas de bajo peso molecular.
 Actuación - se fundamenta en la selectividad de la retención
que condiciona las características de la cromatografía de
afinidad. Se distinguen dos grandes grupos:
 Ligandos específicos , como los anticuerpos , que se enlazan
reversiblemente a un solo soluto.
 Ligandos generales enlazados con un determinado grupo de
compuestos bioquímicos, como las lectinas y nucleótidos.
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Electroforesis

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Introducción
 La electroforesis fue desarrollada por primera vez por el
químico sueco Arne Tiselius.
 Gana el Premio Nóbel en 1948 por los trabajos realizados.
 La electroforesis es una técnica analítica de separación
de fundamento cinético basada en el movimiento o
migración de las macromoléculas disueltas en un
determinado medio a través de una matriz o soporte
reticulado como resultado de la aplicación de un campo
eléctrico.
 El comportamiento de la molécula viene dado por su
movilidad electroforética:
 La movilidad depende de la carga, tamaño y forma.
 Cuanto mayor es la relación carga/tamaño más rápido migra
un ión.
Conceptos generales
La fricción con el solvente dificultaran este movimiento originando
una fuerza que se opone , por otro lado, las moléculas tienen que
moverse en forma aleatoria o movimiento browniano debido a que
poseen energía cinética propia denominado difusión.
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Conceptos generales
 La electroforesis es un proceso que se utiliza
para separar macromoléculas en una solución.
Cuando una mezcla de moléculas ionizadas y con carga
neta son colocadas en un campo eléctrico, estas
experimentan una fuerza de atracción hacia el polo que
posee carga opuesta.
 Las moléculas cargadas positivamente se desplazarán
hacia el cátodo (el polo negativo) y aquellas cargadas
positivamente se desplazarán hacia el ánodo (el polo
positivo).
Conceptos generales
 Los iones comenzarán a moverse formando
un frente cuya anchura aumentará con el
tiempo.
Para reducir la anchura de este frente podemos
reducir el movimiento de las moléculas empleando
un medio que oponga mas resistencia a dicho
movimiento.
Una forma común de hacer esto es formar un gel.
 El gel consiste de un polímero soluble de muy alto
peso molecular que atrapa moléculas de agua y forma
un tamiz que dificulta el movimiento de los solutos.
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Conceptos generales

 La velocidad de migración (v) de la

partícula es directamente proporcional al
producto de su carga efectiva (q) y el
gradiente de potencial eléctrico (E) e
inversamente proporcional al coeficiente
de fricción (f) relativo a la talla y forma de
la molécula, o sea, a la resistencia que le
ofrece el medio.
V = q E / f

Métodos electroforéticos zonales Tipos de soportes

 Son los más comunes, dada su alta papel (celulosa)
aplicabilidad en diferentes campos.
 Son útiles para lograr la separación de almidón
mezclas complejas.
poliacrilamida
 Se aplican pequeñas cantidades de la
muestra a un soporte sólido. agarosa
 Los soportes son en general polímeros y acetato de celulosa
forman un gel poroso que restringe el
movimiento de las moléculas a través del
medio durante la electroforesis y disminuyen
los flujos de convección del solvente.

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Electroforesis de gel Electroforesis de gel

 La electroforesis en gel se utiliza en la
detección, control de pureza, caracterización,
cuantificación (por comparación con controles), Los geles más comunes son agarosa y
preparación y purificación (por extracción de poliacrilamida.
bandas desde el gel) de diferentes moléculas. La electroforesis en gel tiene dos
 Esta técnica tiene como ventaja su capacidad mecanismos de separación:
de separar macromoléculas de interés en la
industria biotecnológica y química. por la relación carga/tamaño
Ha sido un método muy útil para la separación de por tamaño
proteínas (enzimas, hormonas) y ácidos nucleicos (DNA
y RNA) con gran resolución.

Electroforesis de agarosa Electroforesis de poliacrilamida

 Permite separar moléculas de DNA, cuando
éstas son sometidas a un campo eléctrico y
atraídas hacia el polo opuesto a su carga neta.
 La agarosa es un polisacárido (originalmente
obtenido de algas, como el agar-agar, pero de
composición homogénea), cuyas disoluciones
(típicamente de 0.5 a 2 %) poseen la propiedad
de permanecer liquidas por encima de 50
grados C y formar un gel, semisólido al
enfriarse.
Los geles de poliacrilamida se forman por
la polimerización de la acrilamida por
acción de:
Agente entrecruzador ('cross-linking'): bis-
acrilamida
Catalizador: TEMED (N,N,N,N'-
tetrametilnediamina)
Iniciador: ión persulfato que se añade en forma
de persulfato amónico

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Clasificación
 Electroforesis desnaturalizante
La más común: somete a las proteínas a migración
asegurando la completa desnaturalización (pérdida de
la estructura tridimensional).
La migración es proporcional a la carga y al tamaño de
la molécula pero no a su forma.
El agente desnaturalizante más empleado es el
sodiododecilsulfato o SDS, un detergente.
 Electroforesis nativa
Es la que somete a las proteínas a migración sin
desnaturalización.
Las proteínas migran en función de su carga, de su
tamaño y de su forma.

SDS-PAGE Electroforesis capilar

 Es una técnica alterna a la electroforesis convencional.
 Surge debido a que la velocidad de separación y
resolución de los compuestos mejora a medida que
aumenta el campo eléctrico aplicado.
 Se realiza la electroforesis en un tubo capilar con un
diámetro interno inferior a 0.1 mm y una longitud de 50
cm a 1 m.
 El mecanismo de separación está basado en las
relaciones carga/masa de los analitos.
 Su utilidad está en la separación de proteínas y péptidos
entre otras sustancias.

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