Penentuan Kadar Protein Metode Bradford

Posted by SEKAR ARUMSARI on June 18, 2010 in  Academic  |

Subscribe

Pendahuluan
Pendahuluan
Manusia memerlukan energi untuk melakukan kegiatan dan aktivitas seharihari, energi
tersebut dapat diperoleh dari berbagai bahan makanan. Secara umum, bahan makanan
tersebut mengandung karbohidrat, protein, dan lemak. Protein merupakan biopolymer
polipeptida yang tersusun dari sejumlah asam amino yang dihubungkan oleh ikatan
peptida. Protein merupakan biopolymer yang multifungsi, yaitu sebagai struktural pada sel
maupun jaringan dan organ, sebagai enzim suatu biokatalis, sebagai pengemban atau
pembawa senyawa atau zat ketika melalui biomembran sel, dan sebagai zat pengatur.
(Hawab, 2004).
Protein juga merupakan makromolekul yang paling berlimpah di dalam sel dan menyusun
lebih dari setengah berat kering pada hampir semua organisme. Protein merupakan
instrumen yang mengekspresikan informasi genetik. Protein mempunyai fungsi unik bagi
tubuh, antara lain menyediakan bahan-bahan yang penting peranannya untuk
pertumbuhan dan memelihara jaringan tubuh, mengatur kelangsungan proses di dalam
tubuh, dan memberi tenaga jika keperluannya tidak dapat dipenuhi oleh karbohidrat dan
lemak. Protein ada yang reaktif karena asam amino penyusunnya mengandung gugus
fungsi yang reaktif, seperti SH, -OH, NH2, dan –COOH. Contoh protein aktif adalah enzim,
hormon, antibodi, dan protein transport. (Fessenden, 1986)
Ada berbagai cara dalam penentuan kadar protein. Refraktori (menyelupkan refraktomer
menurut Pulrich) dengan standar kadar protein ∆n = 0,002/ 1% protein, sangat cepat
pelaksanaannya dan hanya memerlukan sedikit bahan, namun tidak spesifik jadi hanya
baik untuk pengenalan protein. Uji biuret, metode ini untuk penentuan konsentrasi dengan
cara meneteskan protein ke dalam larutan CuSO4dari berbagai macam konsentrasi.
Penentuan kekeruhan dengan Nephelometer yaitu penentuan intensitas kekeruhan dengan
memberikan standar sulfosalsilat pada larutan protein, namun metode ini jarang
digunakan.  Fotometri (reaksi warna), yaitu dengan meneteskan biuret atau fenol ke dalm
larutan protein, reaksi warna akan menjadi biru dari reagenisa biuret dan reduksi asam
heteropoli. Penyisaan basah menurut Kjeldahl merupakan metode analitik klasik sehingga
perlu persiapan lama dan N dari non protein ikut dalam perhitungan. Selain itu, penentuan
kadar protein yang menggunakan dengan metode Lowry akan memberikan warna biru
yang intensitasnya bergantung pada konsentrasi protein yang ditera. Dalam percobaan kali
ini akan digunakan metode Bradford yang menggunakan suatu pereaksi pewarna yang
mampu mengikat protein di dalam sampel. Pereaksi yang digunakan dalam metode
Bradford adalah Coomassie Brilliant Blue G-250. Konsentrasi protein diukur berdasarkan
optikal density pada panjang gelombang 600 nm. Untuk mengetahui banyaknya protein
dalam larutan, terlebih dahulu dibuat kurva standar  yang melukiskan hubungan antara
konsentrasi danoptical dencity (OD). (Kusnawidjaja, 2007)
Tujuan
Percobaan ini bertujuan untuk menentukan kadar protein suatu sampel hayati dengan
metode spektrofotometri menggunakan kurva standar.
Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam praktikum yaitu tabung reaksi, dan pipet Mohr, dan tabung
Erlenmeyer. Spektrofotometer UV-Vis yang digunakan yaitu spectronic J20 dan kuvet.
Campuran dari larutan BSA, reagen Bardford, dan larutan NaCl merupakan bahan utama
yang digunakan pada percobaan untuk menentukan kadar protein. Selain itu, larutan
akuades juga digunakan untuk membantu pada proses pembacaan absorban di
spektrofometer.
Prosedur Percobaan
Konsentrasi protein diukur dengan menggunakan standar protein Bovine Serum
Albumin (BSA) dengan konsentrasi 0,1 hingga 1 mg/ml. Pembuatan kurva standar diawali
dengan mempersiapkan enam buah tabung reaksi. Pada tabung pertama, diisi dengan 100
µl NaCl. Tabung kedua diisi 90 µl NaCl dan 10 µl larutan BSA. Tabung ketiga diisi dengan
80 µl NaCl dan 20 µl larutan BSA. Tabung keempat diisi dengan 70 µl NaCl dan 30 µl
larutan BSA. Tabung kelima diisi dengan 50 µl NaCl dan 50 µl larutan BSA, serta tabung
terakhir diisi dengan 100 µl larutan BSA. Keenam tabung tersebut ditambahkan dengan
reagen Bradford sebanyak 5 ml. Selanjutnya tabung reaksi tersebut didiamkan selama 5
menit pada suhu ruangan agar campuran tersebut homogen. Kemudian diukur
absorbansinya dengan spektrofotometer pada 595 nm. Tabung pertama digunakan sebagai
blanko dan tidak dimasukkan dalam penentuan kurva standar.
Sebanyak 100 µl larutan sampel dimasukkan dalam tabung reaksi yang bersih. Kemudian
ditambahkan dengan reagen Bradford sebanyak 5 ml, dikocok dan didiamkan selama 5
menit. isi tabung tersebut diukur absorbansinya dengan panjang gelombang yang sama.
Konsentrasi protein dihitung dengan menarik garis absorbansi rata-rata pada kurva
standar yang telah dibuat.
Hasil Percobaan
Tabel 1 Data kurva standarisasi BSA
Konsentrasi BSA (mg/ml) Absorbansi
Blanko 0.535
0.1 0.690
0.2 0.794
0.3 0.863
0.5 1.051
1.0 1.284
Contoh perhitungan:
MBSA = M1 = 1 mg/ml
VBSA = V1 = 0.01 ml; V2 = 0.1 ml
V1 . M2 = V2 . M2
0.01 ml . 1 mg/ml = 0.1 ml . M2
M2 = 0.1 mg/ml
Tabel 2 Data konsentrasi sampel
Ulangan A Konsentrasi (mg/ml)
1 0.712 0.071
2 0.884 0.318
3 0.815 0.219
Rataan 0.804 0.203
Persamaan garis linier yang diperoleh:
y = 0.694x + 0.663
r2 = 0.971
r  =
= 0.985
= 98.5%
Keterangan: y = absorbansi, x = konsentrasi larutan
Diketahui absorbansi sampel
0.712   = 0.694x + 0.663
0.694x = 0.712 – 0.663
x=
= 0.071 mg/ml
Jadi, konsentrasi protein dalam sampel 0.071 mg/ml.
Pembahasan
Metode Bradford menekankan bahwa absorbsi spektrum dilakukan dalam dua bentuk
pengujian secara bersamaan. Hal ini menyebakan respon yang tidak linear pada kurva
standar. Banyak pengguna metode Bradford dan peneliti menganggap bahwa respon yang
dihasilkan adalah linear. Meskipun demikian, saat kurva standar digambarkan akan lebih
mirip dengan kurva linier. Metode ini hanya akan linier jika konsentrasi larutan standar
maupun sampel yang digunakan kecil. (Rosenberg, 2004)
Reagen Bradford yang digunakan pada percobaan ini dibuat dengan cara melarutkan 100
mg Coomassie Brilliant Blue G-250 dalam 50 ml etanol 95% dan 100 ml 85% (w / v) asam
fosfat. Kemudian diencerkan sampai 1 L dengan akuades. Reagen harus disaring melalui
Whatman no. 1 filter kertas dan kemudian disimpan dalam botol kuning pada suhu
kamar. Reagen yang disimpan harus disaring terlebih dahulu sebelum digunakan.
(Rosenberg, 2004)
Dari hasil penelitian Bradford (1976), pereaksi pewarna yang digunakan dalam percobaan
ini adalah Coomassie Brilliant Blue G-250. Coomassie Brilliant Blue G-250 (CBBG) akan
mengikat asam amino spesifik yang terdapat pada bagian permukaan protein. Molekul
pewarna ini memiliki 6 gugus fenil dan 2 gugus sulfonat yang menyebabkan interaksi yang
nonkovalen dan lemah terhadap asam amino hidrofob dan asam amino elektrostatik. CBBG
mengikat asam amino dalam bentuk anionik dengan absoransi maksimal pada 595 nm.
Pewarna bebasnya (tidak mengikat molekul lain) berada dalam bentuk kationik yang
memiliki absorbansi maksimal 465 nm. Oleh karena itu, perlu ditentukan larutan standar
protein, panjang gelombang yang digunakan adalah pada saat CBBG berbentuk anionik
yaitu sebesar 595 nm.
Metode umum untuk menyiapkan sebuah kurva standar mempersiapkan protein dengan
berbagai konsentrasi. Volume sampel standar adalah akhir konsentrasi yang tidak
diketahui secara langsung dan dihitung dari garis kuadrat-terkecil dari kurva standar.
Sebuah kurva standar pada metode Bradford adalah grafik hubungan absorbansi
konsentrasi BSA. Larutan standar BSA dicampur dengan NaCl tidak menimbulkan warna.
Namun setelah diberi pewarna maka akan berubah menjadi waena biru kehitaman.
Penggunaan NaCl di sini untuk memudahkan BSA agar dapat larut di dalam pewarna serta
sebagai katalis agar reaksi cepat berjalan.
Sebelum menggunakan kurva standar, praktikan harus yakin bahwa absorbansi adalah
fungsi linear dari konsentrasi larutan, seperti yang disebutkan pada Hukum Beer-
Lambert. Hukum Beer yang diterapkan pada metode spektrofotometri ini tidak memiliki
konsentrasi tinggi karena menipisnya salah satu reagen yang diperlukan untuk produksi
warna. Absorbansi tinggi berarti sedikit cahaya yang dapat tembus melalui
sampel. Pembacaan kurva standar selalu harus diambil di wilayah di mana semua reagen
melewati batas kurva hubungan absorbansi dan konsentrasi larutan BSA. Persamaan garis
yang diperoleh yaitu sebesar y = 0.694x + 0.663 dengan r = 98.5%. Diketahui rataan
absorbansi sampel sebesar 0.804, maka konsentrasi protein sampel rata-rata adalah 0.203
µg/µl. Percobaan ini tidak memerlukan pengenceran sampel karena absorbansi sampel
masih berada pada rentang ansorbansi larutan standar. Koefisian relasi atau r adalah
bilangan yang menujukkan banyaknya titik yang dapat diwakili oleh model regresi linier
yang dibut. Koefisien relasi yang bernilai 98.5% berarti keseluruhan titik pada model
regresi, 98.5%nya dapat diwakili oleh model tersebut.
Uji Bradford sangat cepat dibandingkan dengan uji Lowry. Hal ini cukup akurat dan sampel
dapat diuji ulang dalam beberapa menit. Metode Bradford direkomendasikan untuk
penggunaan umum dalam menentukan kadar protein, terutama untuk menentukan kadar
protein dari fraksi sel dan menilai konsentrasi protein untuk elektroforesis gel. Akan tetapi,
metode Bradford akan membentuk non linier korelasi ketika rentang konsentrasi protein
semakin besar. Pewarna yang digunakan akan tertinggal di permukaan kuvet sehingga
kurva kalibrasi perlu dilakukan setiap saat.  Tinggi konsentrasi larutan dapat mengganggu
proses standarisasi.
Simpulan
Metode Bradford memanfaatkan perekasi pewarna untuk mengetahui kadar protein suatu
sampel. Pereaksi pewarna Coomassie Brilliant Blue G-250 akan mengikat protein dan
memiliki panjang gelombang maksimal 595 nm. Persamaan garis yang didapat yaitu y =
0.694x + 0.663 dengan r = 98.5%. konsentrasi protein sampel adalah 0.203 µg/µl.
Daftar Pustaka
Bradford, MM. A rapid and sensitive for the quantitation of microgram quantitites of
protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry 72:248-254.
1976. [terhubung berkala]
Fessenden. 1986. Kimia Organik Jilid 2. Jakarta : Erlangga.
Hawab, HM. 2004. Pengantar Biokimia. Jakarta : Bayu Media Publishing.
Kusnawidjaja, K. 2007. Petunjuk Praktikum Biokimia. Universitas Negeri Yogyakarta:
Yograkarta.
Stoscheck, CM. Quantitation of Protein. Methods in Enzymology 182: 50-69 (1990).
[terhubung berkala]
Rosenberg, I.M. 2004. Protein Analysis and Purification: Benchtop techniques .
Massachusetts General Hospital: Boston.