UNIVERSIDAD DE CHILE

ESCUELA DE TECNOLOGIA MEDICA

MECESUP UCH0003
ASIGNATURA BIOQUIMICA APLICADA

CINETICA ENZIMATICA EN HOJA DE CALCULO

Autor: Teresita Castillo

1 INTRODUCCIÓN

La cinética enzimática es uno de los tópicos Fisicoquímico que tiene muchas

aplicaciones en las ciencias médicas. Las enzimas son agentes químicos que
ayudan a que los procesos bioquímicos del organismos se lleven a cabo a un
velocidad compatible con la vida. Estos niveles enzimáticos en plasma se
analizan para detectar la enfermedad y llegar al diagnóstico diferencial y
pronóstico de la misma. Para lograr determinar la actividad de las enzimas
presente en el plasma se debe conocer los parámetros físicos y químicos de
las enzimas. El estudio de la cinética requiere la aplicación de conocimientos
matemáticos, los cuáles se pueden expresar en modelos gráficos interactivos,
para lo cuál se usará el programa de hoja de cálculo Excel. lo que permitirá
observar directamente los efecto de la manipulación de los valores de
sustrato, velocidades y constante cinéticas como Km y Vm.

2 OBJETIVOS DE APRENDIZAJES

1.- Adquirir una mayor comprensión del efecto del sustrato sobre la velocidad
de una reacción enzimática.
2.- Visualizador los cambios de la Km y Vm al manipular las concentraciones
de sustrato.
3.- Analizar en los gráficos de Linewaever -Burk los efectos de los inhibidores
competitivos y no competitivos.

3 ACTIVIDADES DE APRENDIZAJES

1.- Cada grupo de estudiantes deberá construir en el programa excel una hoja
para automatizar el cálculo de los parámetros Vm y Km mediante el gráfico
Linewaever- Burk
2.- Graficar la curva de Mickaelis Menten y Curva de Progreso
4 DESARROLLO

4.1 Curva de Fenol

La lectura Do y la concentración de Fenol presenta un comportamiento lineal

entre ambos, con lo cual, conociendo la ecuación que los une, es posible
calcular la concentración de fenol a partir de la lectura Do conocida.

Tabla #1. Lecturas Fenol

Lect Do
0.043
Curva de Fenol

0.056
y = 1.1921x
2
R = 0.9985
1.5
Optica, Do
Densidad

1
0.5
0
0 0.5
0.119
mM Fenol, Sustrato
1 1.5

0.264
0.371
4.2 Actidadad Enzimática

Lectura Ensayo en Do: se multiplica x factor obtenido curva de fenol

0.495
DO x Factor = mM /min

0.608
4.3 Curva de Michaelis-Menten

Ecuación de M-M

Vm ⋅ S
V =
Km + S

La ecuación de M- M explica la curva que se obtiene cuando los datos de

velocidad se representan frente a la concentración de sustrato. La curva
resultante es una hipérbola rectangular donde es difícil determinar las
constantes cinéticas Vm y Km.

Tabla #2:Velocidad en función del Sustrato

S, mM Sustrato
0.0001
Curva de Michaelis

0.078
Velocidad mmoles/min/ml

0.00009
0.00008
0.00007

0.117
0.00006
0.00005
0.00004
0.00003
0.00002
0.00001
0

0.195
0 1 2 3 4
Sustrato mM

0.39
4.4 Gráfico de Lineweaver – Burk

Para determinar las constantes Vm y Km se representa la curva de Michaelis

en forma lineal, la cual se realiza linealizando la expresión de M-M de la
siguiente forma:

Vm ⋅ S 1 Km + S 1 Km 1 1
V = ⇒ = ⇒ = ⋅ +
Km + S V Vm ⋅ S V Vm S Vm

De esta forma, la ultima expresión representa una línea de tipo Y =mx+C,

donde:

Y = 1/V : Variable en eje y

m = Km/Vm : Pendiente de la recta
x = 1/S : Variable en eje x
b = 1/Vm : Punto intersección eje y

Así, graficando 1/V v/s 1/S y determinando la ecuación de la recta (m y b) se

encuentran los valores para las constantes cinéticas Vm y Km.

Tabla #3. Valores linealización de ecuación M-M

1/S
60000
40000
12.8205128
Linewaever-Burk

8.54700855
1/V

20000
0
-5 -20000 0 5 10 15
y = 2936.2x + 8779.5

5.12820513
1/S
R2 = 0.9337

Igualando términos...

2.56410256
1/Vm = 8779.5 ⇒ Vm = 0.0001139 mmoles/min

Km/Vm = 2936.2 ⇒ Km = 2936.2*Vm 0.334mM

4.5 Curva de Progreso

Utilizando las expresiones ya determinadas, es posible estimar la hidrólisis del

sustrato y/o las velocidades de inicio para cada tiempo.

Tabla #4: Lecturas Do para distintos tiempos

Tiempo
Realizar:
⇓
(min)
5
a.- Cálculo de Fenol Producido
b.- Determinar el fenol producido( mmoles)

Pendiente curva Do v/s

10Tiempo
15(min)
5
Curva de progreso

20 15
1.5
10
Fenol Producido

1
m m oles

0.5

30 20
0
0 20 40 60
Tiempo (min)

30