c



Tujuan dari praktikum ini adalah mengerti prinsip dasar penggunaan

HPLC, mengetahui kadar antioksidan yang ada di dalam sampel teh berkemasan,
dan mengetahui faktor-faktor yang mempengaruhi kestablian antioksidan dalam
teh.

HPLC merupakan suatu teknik pengembangan dari kromatografi kolom

(Clark 2007). Prinsip HPLC adalah pemisahan campuran berdasarkan perbedaan
kepolaran senyawa tersebut dengan kolom kromatografi dan dengan pelarutnya
(Kazakevich 2007). HPLC dapat memisahkan dan menganalisis senyawa dalam
campuran dengan ketelitian yang sangat tinggi (Linde 2008). Perangkat HPLC
terdiri atas i
 
 pompa,  ii kolom, detektor, dan komputer
(Linde 2008; Tissue 1996). Kolom yang digunakan berfungsi sebagai fase diam,
sedangkan fase geraknya berupa pelarut. Molekul yang dianalisis digerakkan
dengan tekanan tinggi di sepanjang kolom dan akan mengalami pemisahan.
Lamanya suatu molekul berada dalam kolom disebut waktu retensi. Hasil
pemisahan ini kemudian dideteksi oleh detektor dan diterjemahkan ke dalam
bentuk kromatogram. Berdasarkan sifat kepolaran pelarut dan kolomnya, HPLC
dibagi menjadi dua jenis, yaitu  
 i dan i i Pada HPLC
 
 i digunakan kolom yang diisi dengan partikel silika yang bersifat
polar, sedangkan pelarut yang digunakan sifatnya nonpolar. HPLC ii
merupakan kebalikan dari HPLC  
 i kolomnya bersifat nonpolar dan
pelarutnya polar. Kolom ini dibuat menjadi nonpolar dengan cara menambahkan
senyawa hidrokarbon berantai panjang (Clark 2007).

Antioksidan adalah senyawa-senyawa yang di dalam tubuh dapat berperan

sebagai pencegah kerusakan sel atau pemulih kerusakan yang telah terjadi.
Antioksidan bekerja dengan cara menghentikan proses oksidasi sel yang
dilakukan oleh molekul-molekul radikal bebas. Contoh antioksidan adalah beta-
karoten, vitamin C, vitamin E, dan selenium ([American Dietetic Assosiation]
2006).
 £


 

Bahan-bahan yang digunakan pada praktikum ini adalah sampel teh (Frestea
botol green tea no flavour, Frestea kotak green tea no flavor, Pokka botol green
tea, Pokka botol oolong tea, Pokka kaleng green tea, Pokka kaleng oolong tea, dan
Pokka kaleng white tea), pelarut TFA dan metanol, akuades, dan aluminium foil.
Sedangkan alat-alat yang digunakan adalah seperangkat HPLC, syringe 40[ ,
tabung eppendorf, pipet mikro dan tips.
Prosedur kerja pada praktikum analisis antioksidan dengan HPLC dilakukan
sebagai berikut.
1.? Pengenceran standar

Dibuat pengenceran larutan standar EGCG 3 mg/mL dengan komposisi

sebagai berikut.

Volume Volume
Konsentrasi
Sampel Akuabides
(mg/mL)
(mL) (mL)
1 0.5 1
0.8 1.2 0.3
0.4 0.75 0.75
0.2 0.75 0.75
0.1 0.75 0.75
0.05 0.75 0.75

2.? Preparasi Sampel

Diambil sampel teh sebanyak 1.5 ml dan dimasukkan ke dalam tabung vial
yang telah dibungkus aluminium foil.

Sampel disentrifusi pada kecepatan 10000 rpm selama 10 menit.

Diambil 1 ml supernatan dan dimasukkan ke dalam tabung vial baru,

kemudian dibungkus lagi dengan aluminium foil.
 3.? Analisis Sampel

Digunakan HPLC iidengan fase gerak berupa campuran 75%

TFA dan 25% metanol.

Micro syringe dibilas dengan akuabides 2 kali

Diambil ± 40 [L sampel dengan syringe (tidak boleh ada gelembung)


Injector diputar ke posisi ³load´


Sampel diinjeksikan


Injector diputar ke posisi ³inject´


Syringe dibilas dengan akuabides 2 kali




Ditunggu selama 10 menit lalu hasilnya akan terlihat di komputer dalam
bentuk kromatogram.


 
 

Tabel 1 Data Pengamatan

Waktu
Konsentrasi
Kelompok Sampel Retensi
(mg/mL)
(menit)
8 Pokka Kaleng White Tea 2.709 0.022

9 Pokka Kaleng Green Tea 3.259 0.021

10 Pokka Kaleng Oolong Tea 3.232 0.022
11 Pokka Botol Green Tea 3.213 0.018

12 Pooka Botol Oolong Tea 3.538 0.019

13 Fres Tea Green Botol 3.187 0.030

14 Fres Tea Green Kotak 3.206 0.030



Gambar 1 Kromatogram EGCG.

Gambar 2 Hasil Perbesaran cEGCG.

Gambar 3 Kurva Standar EGCG. 

 c £


 Dari hasil kromatogram tampak beberapa  yang menunjukkan

macam-macam senyawa yang terkandung dalam sampel Fres tea green kotak.
Salah satu senyawa tersebut adalah EGCG. EGCG memiliki waktu retensi 3.206
menit. Penentuan waktu retensi ini didasarkan pada estimasi waktu dari hasil
analisis larutan standar EGCG, yaitu 3.077 menit. Perbedaan waktu retensi
tersebut masih dapat ditoleransi dan tidak ada kesalahan pada proses analisis.
Karena waktu retensinya 3.206 maka EGCG pasti memiliki nilai absorbansi
sebesar 3.206 pada panjang gelombang 280 nm. Jika nilai absorbansi ini
dimasukkan ke persamaan kurva standar maka akan diperoleh konsentrasi EGCG
dalam sampel, yaitu sebesar 0.030 mg/ml.

Hasil analisis sampel teh Pokka kaleng jenis 

 
   dan
  menunjukkan bahwa tidak terdapat perbedaan kadar EGCG yang
signifikan antara ketiga jenis teh tersebut. 
dan
  mengandung
EGCG sebanyak 0.022 mg/ml dan   0.021 mg/ml. Hal ini tidak sesuai
dengan literatur yang menyebutkan bahwa kandungan EGCG tertinggi dimiliki
oleh 
kemudian dan yang terendah adalah
 (Wilson
dan Temple 2004; Heneberry 2006; Mitscher, Dolby, Toews 1997).

Secara umum hasil percobaan menunjukkan bahwa kadar EGCG pada teh
kemasan kaleng lebih tinggi daripada teh kemasan botol. Pada Pokka kaleng
diperoleh kadar EGCG sebesar 0.021 mg/ml, sedangkan untuk kemasan
botolnya hanya 0.018 mg/ml. Demikian pula pada Pokka
   kemasan
kaleng diperolah kadar EGCG sebesar 0.022 mg/ml, sedangkan pada kemasan
botol 0.019 mg/ml. Hasil ini juga tidak sesuai dengan literatur. Berdasarkan
literatur diketahui bahwa EGCG merupakan senyawa yang dapat menjadi tidak
stabil bila terkena panas atau paparan cahaya langsung (Istiadi 2009; [UNPAD]
2003). Teh kemasan botol tidak terpapar cahaya langsung karena seluruh
permukaan botol tertutup label yang tidak transparan. Teh kemasan kaleng juga
tidak terpapar cahaya langsung, tetapi bahan kaleng (logam) merupakan bahan
yang dapat menyerap panas. Dengan demikian seharusnya kadar EGCG pada teh
kemasan botol lebih tinggi daripada teh kemasan kaleng.

Berdasarkan percobaan kandungan EGCG pada Fres tea green botol dan
Fres tea green kotak sama, yaitu 0.030 mg/ml. Seharusnya ditemukan lebih
banyak EGCG pada Fres tea green kotak karena kemasannya tidak transparan dan
bahan kertas tidak menyerap panas. Sedangkan bahan botol plastik, meskipun
tidak menyerap panas, tetapi hanya separuh yang tertutup label sementara yang
lainnya tembus cahaya dan memungkinkan EGCG di dalamnya mengalami
oksidasi.

Di antara ketiga jenis kemasan (kaleng, botol, dan kotak) yang paling baik
adalah kemasan kotak. Hal ini disebabkan karena kotak tidak tembus cahaya dan
tidak menyerap panas (konduktivitas termalnya hanya 0.21 W/m.K). Sedangkan
kemasan botol adalah kemasan yang tembus cahaya dan memiliki konduktivitas
termal lebih tinggi daripada karton (0.24 W/m.K). Bahan kaleng juga tidak
tembus cahaya, tetapi bahan ini memiliki kemampuan menyerap panas yang jauh
lebih tinggi dibandingkan kedua bahan lainnya, yaitu sebesar 66.8 W/m.K,
sehingga dapat dikatakan bahan kaleng tidak baik digunakan untuk kemasan
karena akan merusak isinya.

Kestabilan EGCG dipengaruhi oleh beberapa faktor, misalnya pH, suhu,

lama penyimpanan, dan adanya ion-ion logam. EGCG mudah teroksidasi dan
terurai pada suhu tinggi. Hasil penguraiannya adalah pemutusan gugus fenol dan
digantikan oleh gugus keton. Hal yang sama terjadi bila EGCG bereaksi dengan
oksigen atau terpapar cahaya (Kim, Kim, Yoon 2005). Meskipun demikian,
literatur lain menyebutkan bahwa jumlah EGCG yang dapat diekstrak dari teh
hijau akan bertambah bila dilakukan pada suhu tinggi, sedangkan pada teh hitam
suhu tidak mempengaruhi banyaknya EGCG yang diekstrak (Lee dan Lee 2008).
Lamanya penyimpanan juga mempengaruhi stabilitas EGCG. Semakin lama
disimpan maka kandungan senyawa 
 akan semakin berkurang, khususnya
kandungan EGCG dan ECG (Friedman 2009).
 EGCG lebih stabil pada suasana asam daripada basa. Secara umum
senyawa-senyawa 
pada teh hijau stabil pada pH 1.8 sampai 6.4. EGCG
sendiri akan terdegradasi secara cepat pada pH di atas 7.4 (Litwack 2001). Sebuah
penelitian juga menyebutkan bahwa EGCG yang disimpan dalam larutan 1 mM
HCl pada suhu -20°C dapat tetap stabil selama seminggu. Sedangkan bila EGCG
tersebut disimpan dalam larutan basa maka akan terjadi kerusakan sebanyak 25%
hingga 90% dalam waktu tiga atau empat hari (Zhou Q  
 2003). Berikut ini
grafik perbandingan jumlah EGCG pada kondisi asam dan basa.

Gambar 4 Perbandingan Jumlah EGCG pada Suasana Asam dan Basa (Zhou Q 

2003).

Walaupun pada umumnya EGCG lebih stabil pada kondisi asam, tetapi
apabila terdapat ion-ion logam tertentu maka kestabilannya dapat menurun. Ion
yang paling cepat mengkatalis degradasi EGCG adalah Cu2+. Ion ini biasanya
secara tidak sengaja bercampur dengan sampel EGCG melalui jarum syringe atau
detektor HPLC. Salah satu cara untuk melindungi EGCG dari ion Cu2+ ini adalah
dengan menambahkan EDTA dan asam askorbat (Zhou Q 
2003).

EGCG 



 

 merupakan salah satu dari empat jenis
senyawa bioaktif 
yang terdapat dalam teh, khususnya teh hijau (Hartoyo
2008). Rumus kimia EGCG adalah C 22 H18O11, dan berat molekulnya 458.4.
Senyawa ini memiliki kelarutan yang tinggi dalam air, yaitu sekitar 5mg/ml, dan
mudah rusak oleh paparan cahaya langsung atau suhu tinggi ([Zhejiang Yixin
Pharmaceutical] 2009). Struktur EGCG adalah sebagai berikut.

Gambar 5 Struktur EGCG ([Zhejiang Yixin Pharmaceutical] 2009).

EGCG memiliki manfaat kesehatan karena kemampuannya mencegah

berbagai penyakit dan menigkatkan fungsi imun tubuh. Misalnya, EGCG dapat
menghambat proses penuaan sel-sel otak sehingga dapat mencegah munculnya
gejala demensia, parkinson dan alzheimer. Manfaat lainnya adalah mengurangi
pembengkakan (penyempitan) pembuluh darah dan menurunan risiko
arterosklerosis (penyumbatan pembuluh darah karena timbunan lemak). Selain itu
senyawa ini juga dapat membantu mengatur kadar gula darah dan mengatur
keseimbangan kolesterol (Julian 2010; Hartoyo 2008).

EGCG dikenal sebagai senyawa yang bersifat antioksidan. Antioksidan

artinya suatu senyawa yang dapat menghambat terjadinya reaksi oksidasi di dalam
tubuh sehingga mencegah kerusakan sel oleh senyawa-senyawa radikal bebas
(Halliwell dan Gutreridge 1989; [Green Tea Lovers] 2005). Mekanisme
perlawanan antioksidan terhadap radikal bebas adalah dengan menangkap dan
memakan (atau bereaksi) dengan senyawa radikal bebas tersebut ([UMMC]
2009). Jika senyawa radikal bebas telah terlanjur menyebabkan kerusakan sel dan
menjadi kanker, maka EGCG berperan memperlambat perkembangan sel kanker
tersebut dengan cara memproduksi senyawa hidrogen peroksida atau H2 O2
(Sugisawa dan Umegaki 2002). Senyawa 
dapat menempel pada protein
membran sel dan menyelubunginya sehingga mencegah bakteri atau virus masuk
ke dalam sel. Apabila bakteri tersebut mengeluarkan racun maka 
 akan
mengikat racun tersebut. Selain itu 
 juga dapat mengikat logam-logam
berbahaya seperti timah, raksa, cadmium, dan krom ([Green Tea Lovers] 2005).

Selain detektor VWD dan RID yang digunakan pada praktikum ini,
terdapat beberapa jenis detektor lain seperti 

 
 i
  dan  


i
    

  
adalah detektor yang biasa digunakan pada analisis lipid dan fosfolipid. Hal-hal
yang harus diperhatikan jika menggunakan detektor jenis ini adalah temperatur
dan kompisisi fase geraknya konstan, karenanya 

   hanya
dapat digunakanuntuk pemisahan isokratik. Ketelitian detektor ini adalah 0.1
hingga 1µg.


 i   memiliki prinsip dan komponen yang serupa

dengan detektor UV. Namun, 
 i   memiliki dua
monocronometer, yang satu berfungsi untuk mengeksitasi panjang gelombang dan
yang lainnya untuk mengemisi panjang gelombang. 
 i banyak
digunakan untuk analisis lipid yang berwarna dan dapat berpendar seperti klorofil
dan jenis pigmen-pigmen lainnya. Jika digunakan untuk analisis lipid tidak
berwarna, maka sampel tersebut perlu ditambahkan dengan senyawa 
   

 


i
    merupakan jenis detektor yang
bersifat destruktif karena bekerja dengan cara memecah senyawa analit seperti
yang terjadi pada spektrometer massa. Prinsip kerjanya adalah menguapkan fase
gerak yang volatil dengan alat nebulasi dan menyisakan analitnya. Analit ini
kemudian dilewatkan pada sumber cahaya sehingga cahaya tersebut berpendar.
Derajat pemendaran cahay tersebut sebanding dengan massa analit.  



i
  sangat baik digunakan untuk analisis lipid dengan pelarut
organik atau pun pelarut nonorganik. Akan tetapi detektor ini tidak cocok
digunakan untuk asam, basa, dan garam nonorganik.  


i
 
  juga dapat digunakan untuk pemisahan gradien karena sifatnya yang
tidak sensitif terhadap komposisi pelarut.
 Antioksidan lain yang terdapat pada teh hijau adalah vitamin C dan
vitamin E. Vitamin C bermanfaat sebagai penangkal radikal bebas, pencegah
kanker dan penuaan. Selain itu vitamin C juga dapat mencegah terjadinya demam
yang diakibatkan oleh infeksi virus atau bakteri. Vitamin C juga penting sebagai
penyusun kolagen sehingga dapat memberi efek halus pada kulit. Vitamin C lebih
banyak terdapat pada teh hijau (250 mg/100g) daripada teh yang difermentasi
seperti teh hitam dan teh oolong. Hal ini disebabkan karena proses fermentasi
dapat melarutkan vitamin C. Faktor lain yang mempengaruhi banyaknya jumlah
vitamin C dalam teh adalah tempat tanaman teh tersebut ditanam. Teh yang
ditanam di tempat teduh mengandung lebih sedikit vitamin C daripada teh yang
ditanam di tempat terbuka. Vitamin E dikenal juga dengan nama   

Senyawa antioksidan ini berguna untuk menangkal radikal bebas, meningkatkan
kesuburan, menghambat penuaan, serta mencegah penyakit jantung, pembuluh
darah, dan kanker. Vitamin E banyak terdapat pada tanaman teh, terutama yang
tumbuh di tempat terbuka ([Green Tea Lovers] 2005).

Gambar 6 Struktur Vitamin E (kiri) dan Vitamin C (kanan) ([Green Tea Lovers]
2005).

Meskipun memiliki banyak manfaat, EGCG juga dapat menimbulkan

beberapa efek samping. Konsumsi EGCG yang berlebihan dapat mengakibatkan
keracunan hati dan kerusakan ginjal. Efek samping lainnya adalah kerusakan

   yang biasa terjadi pada bayi dalam kandungan. Hal ini disebabkan
karena EGCG menghambat kerja enzim dihidrofolat reduktase yang berfungsi
dalam pembentukan 
   Oleh karena itu minuman yang mengandung
EGCG sebaiknya tidak diminum pada masa kehamilan. Selain itu, EGCG juga
dapat mengaktifkan sekresi asam lambung yang berlebihan dan meninmbulkan
rasa kembung atau mual. Hal ini dapat diatasi dengan menambahkan susu atau
gula ke dalam teh (Julian 2010).

Sala satu aplikasi HPLC adalah pada bidang ekologi kelautan. Teknik
HPLC digunakan untuk menganalisis konsentrasi pigmen klorofil dan karoten
dalam rangka menghitung kelimpahan jenis-jenis fitoplankton yang ada. Metode
ini khususnya diterapkan untuk menghitung banyaknya fitoplankton jenis
 
  karena fitoplankton jenis ini sangat besar populasinya dan sulit
dihitung dengan metode konvensional. Jika jenis fitoplankton yang ingin
dianalisis adalah jenis yang tidak dapat berfotosintesis, maka marker klorofil dan
karoten dapat diganti dengan asam lemak, sterol, asam amino, dan senyawa-
senyawa hidrokarbon (Mackey 1996).

Teh merupakan minuman dari hasil olahan tanaman teh atau 



i
i
i (Wilson dan Temple 2004). Ada berbagai jenis teh, yaitu  

  
  dan 
  Teh hijau adalah jenis teh yang banyak
dikonsumsi di daerah Asia, Afrika Utara, dan Timur Tengah (Heneberry 2006).
Jenis teh ini merupakan yang paling murni karena paling sedikit mengalami
pemrosesan dan tidak melalui proses oksidasi. Itulah sebabnya mengapa teh hijau
memiliki sifat antioksidan yang terbaik dibandingkan jenis teh lainnya (Cohan
2008; Heneberry 2006). Senyawa-senyawa yang terkandung dalam teh hijau
adalah kafein,  


,   
senyawa alkaloid, asam galat, 
,
dan asam fenolat. Banyaknya kafein dalam teh hijau kira-kira 3-6%. Senyawa

 terbanyak pada teh hijau adalah EGCG, jumlahnya mencapai 25-40%
dari total senyawa 
yang ada.

Teh oolong merupakan teh yang khas dari Cina, Taiwan, dan sekitarnya.
Jika dibandingkan dengan teh hijau, kandungan senyawa polifenol pada teh
oolong lebih sedikit. Hal ini disebabkan karena teh oolong merupakan hasil
fermentasi sebagian dari daun teh yang telah dilayukan. Pada proses
pembuatannya, teh oolong seringkali dicampur dengan bunga dan tanaman herba
untuk menguatkan rasa dan aromanya. Pada teh oolong terkandung berbagai
senyawa, yaitu monomer 




dan kafein (Heneberry
2006; Wilson dan Temple 2004).

Teh hitam merupakan jenih teh yang paling populer, produksi teh ini
mencapai 80% dari total produksi teh di seluruh dunia. Lain halnya dengan teh
oolong yang difermentasi sebagian, teh hitam difermentasi secara keseluruhan.
Karena itu, jumlah senyawa polifenol pada teh hitam paling sedikit dibandingkan
teh oolong dan teh hijau. Selain 
teh hitam juga mengandung senyawa




 dan kafein. Banyaknya kafein dalam teh hitam adalah 2-
4%, sedikit lebih kecil daripada kafein dalam teh hijau (Heneberry 2006; Wilson
dan Temple 2004).

Teh putih tidak terlalu banyak dikenal masyarakat, walaupun sebenarnya

teh ini telah dikenal di Cina sejak ratusan tahun yang lalu. Sama seperti teh hijau,
teh putih juga tidak mengalami proses fermentasi, bedanya bahan baku teh putih
bukan berasak dari daun teh melainkan dari pucuk daun yang belum mekar
(Cohan 2008). Pucuk daun dikenal sebagai bagian dari tanaman teh yang paling
banyak mengandung 
 asam galat, dan polifenol, sedangkan kandungan
kafeinnya hanya 75% dari kandungan kafein teh hijau. Inilah yang menyebabkan
teh putih memiliki sifat antioksidan yang sangat baik, kira-kira 3 kali lebih baik
daripada teh hijau ([Suara Merdeka] 2010; Tjhin dan Tjayadi 2002).

Teh hijau dapat membantu menurunkan berat badan. Senyawa EGCG pada
teh hijau dapat membantu meningkatkan metabolisme, membakar lemak, dan
mengurangi penyimpanan lemak dalam tubuh ([Amazing Green Tea] 2008).
Senyawa lain yang juga berperan adalah 
 
 dan kafein. Ketiga
senyawa ini secara bersama-sama menurunkan konsentrasi trigliserida dan asam
lemak bebas di dalam darah (Zheng  
 2004). Selain itu senyawa dalam teh
hijau juga dapat mengaktifkan hormon leptin, suatu hormon pengontrol nafsu
makan yang menyebabkan perasaan kenyang (Cohan 2008).
 c


 Prinsip kerja alat HPLC adalah pemisahan komponen-komponen suatu

senyawa berdasarkan perbedaan kepolaran/afinitas antara sampel dengan
kolomnya.

Dari hasil analisis EGCG pada berbagai macam sampel teh diperoleh hasil
sebagai berikut. Teh yang memiliki kandungan EGCG terbanyak adalah teh putih
dan teh oolong, yaitusebesar 0.022 mg/ml. Sedangkan jenis kemasan yang paling
baik untuk mempertahankan kestabilan EGCG adalah kaleng. Hasil tersebut tidak
sesuai dengan literatur. Seharusnya teh yang memiliki kandungan EGCG tertinggi
adalah teh putih dan kemasan yang paling baik untuk mempertahankan kestabilan
EGCG adalah kemasan kotak.

Faktor-faktor yang mempengaruhi kestabilan EGCG adalah pH, suhu,

lama penyimpanan, dan adanya ion logam. Semakin tinggi pH maka EGCG akan
semakin tidak stabil. Demikian pula dengan suhu dan lama penyimpanan.
Semakin lama sampel EGCG disimpan pada suhu tinggi, senyawa tersebut akan
menjadi lebih tidak stabil. Adanya ion logam Cu2+ dapat mempercepat
pendegradasian EGCG. Untuk mengatasinya dapat dilakukan penambahan EDTA
dan asam askorbat.

 
 c 



1.? Fungsi-fungsi bagian HPLC, dan skema kerja alat HPLC.

Solvent cabinet : wadah pelarut
Pompa : memompa pelarut ke dalam degasser
Degasser : menghilangkan gelembung-gelembung udara
Mixer : mencampur dan mengatur komposisi pelarut
Pre-column : menghilangkan senyawa pengganggu pada pelarut
Injektor : tempat penginjeksian sampel
Analytical column : memisahkan komponen sampel berdasarkan
kepolaran
Detektor : mendeteksi analit yang keluar dari kolom

2.? Bagaimana cara pengenceran sampel standar dengan konsentrasi 1-0,8-

0,4-0,2-0,1-0,05 mg/ml secara bertahap? (Total volume masing-masing
larutan 2 mL, konsentrasi awal sampel standar 5mg/ml)
V1.M1= V2.M2 V4.M4= V5.M5
V1.5=2.1 V4.0,4=2.0,2
V1=0,4 ml V4=1 ml
 V2.M2= V3.M3 V5.M5= V6.M6
V2.1=2.0,8 V5.0,2=2.0,1
V2=1,6 ml V5=1 ml?

V3.M3= V4.M4 V6.M6= V7.M7

V3.0,8=2.04 V6.0,1=2.0,05
V3=1 ml V6=1 ml

3.? Apa yang dimaksud dengan posisi Load dan Inject

Posisi load adalah posisi saat sampel akan diinjeksikan. Sampel kemudian
disimpan dalam loop dan jika berlebih akan dibuang.
Posisi inject adalah posisi saat sampel akan dimasukkan ke dalam kolom.
Pada posisi ini loop akan tersambung dengan kolom dan pompa. Pompa
ini berfungsi untuk mendorong sampel masuk ke kolom.

4.? Jenis HPLC apa yang digunakan untuk EGCG dan mengapa menggunakan
jenis itu?
Jenis HPLC yang digunakan untuk analisis EGCG adalah HPLC fase
balik. Pada HPLC fase balik digunakan fase gerak yang bersifat polar
sehingga cocok untuk melarutkan senyawa EGCG. 
   c 

[ADA] American Dietetic Assosiation. 2006. What is an antioxidant [terhubung

berkala].
http://www.eatright.org/Public/content.aspx?id=3813&terms=what+is+an
+antioxidant [18 Mei 2010].

[Amazing Green Tea]. 2008. EGCG health benefits

6 discoveries you can't ignore [terhubung berkala] http://www.amazing-
green-tea.com/egcg-health-benefits.html [19 Mei 2010].

Clark J. 2007. High performance liquid chromatography - HPLC [terhubung

berkala]. http://www.chemguide.co.uk/analysis/chromatography/hplc.html
[20 Mei 2010].

Cohan P. 2008. m !
 "   # . New Jersey: John Wiley &
Sons.

Friedman M 
2009. Stability of green tea catechins in commercial tea leaves

during storage for 6 months. $ 
  %
74:146-151.
[Green Tea Lovers]. 2005. What¶s in green tea? [terhubung berkala].
http://greentealovers.com/greenteahealthcatechin.htm [18 Mei 2010].

Hartoyo A. 2008. Menjelajahi khasiat teh [terhubung berkala]

http://www.kulinologi.biz/preview.php?view&id=209 [21 Mei 2010].

Heneberry M. 2006. m



  &ii

 
 


 i
. New York: Peter Pauper Press.

Istiadi. 2009. Hindari simpan stok antioksidan berlama-lama [terhubung berkala]

http://tekim.undip.ac.id/staf/istadi/2009/04/hindari-simpan-stok-
antioksidan-berlama-lama/ [18 Mei 2010].

Julian. 2010. EGCG side effect [terhubung berkala]. http://www.amazing-green-

tea.com/egcg-side-effects.html [19 Mei 2010].
Kazakevich Y, LoBrutto R. 2007. "c    

 i

i. New
Jersey: John Wiley & Sons.
Kim CH, Kim KH, Yoon HN. 2005. Composition for stabilizing epigallocatechin
gallate (EGCG) in water phase and preparation method [terhubung
berkala]. http://www.sumobrain.com/patents/wipo/Composition-
stabilizing-epigallocatechin-gallate-egcg/WO2005087224.html [20 Mei
2010].

Lee KJ, Lee SH. 2008. Extraction behavior of caffeine and EGCG from green and
black tea m '  % 
   (

  (


 
13:646-649.
Linde. 2008. High performance liquid chromatography (HPLC) [terhubung
berkala].
http://hiq.lindegas.com/international/web/lg/spg/like35lgspg.nsf/docbyalia
s/anal_hplc [19 Mei 2010].

Litwack G. 2001. )

i  i. California: Academic Press.

Mackey MD 
1996. CHEMTAX- a program for estimating class abundances

from chemical markers: application to HPLC measurements of
phytoplankton. #
c %144:265-283.

Mitscher LA, Dolby V, Toews VD. 1997. m  &

*i 
 
 . USA: Avery.

Shibamoto T. 1994.

  
i
iNew York: Marcel Dekker.

[Suara Merdeka]. 2010. White tea mengandung antioksidan tinggi [terhubung

berkala].
http://suaramerdeka.com/v1/index.php/read/cetak/2010/01/15/95240/Whit
e-Tea-Mengandung-Antioksidan-Tinggi [21 Mei 2010].

Sugisawa A, Umegaki K. 2002. Physiological concentrations of (-)-

Epigallocatechin-3-+-Gallate (EGCG) prevent chromosomal damage
induced by reactive oxygen species in WIL2-NS cells. $!132:1836-
1839.
Tissue BM. 1996. High-performance liquid chromatography (HPLC) [terhubung
berkala]. http://elchem.kaist.ac.kr/vt/chem-ed/sep/lc/hplc.htm [19 Mei
2010].

Tjhin L, Tjayadi S. 2002 Informasi teknis gorgeous amazing white tea.

[terhubung berkala].
http://www.850goavanza.com/gorgeous/Informasi%20Teknis%20Gorgeou
s%20Amazing%20White%20Tea.pdf [21 Mei 2010].

[UMMC] University of Maryland Medical Center. 2009. Green tea [terhubung

berkala] http://www.umm.edu/altmed/articles/green-tea-000255.htm [19
Mei 2010]

Vennix R. 2009. Carboard [terhubung berkala].

http://www.matbase.com/material/other/cardboard/properties [21 Mei
2010].
______________ . 2009. PET bottle grade [terhubung berkala].
http://www.matbase.com/material/polymers/engineering/pet-bottle-
grade/properties [21 Mei 2010].
______________ . 2009. Tin [terhubung berkala].
http://www.matbase.com/material/polymers/engineering/tin/properties [21
Mei 2010].
Wilson T, Temple NJ. 2004. ( i
 

  
. New Jersey:
Humana Press. 

Zheng G 
. 2004. Anti-obesity effects of three major components of green tea,
catechins, caffeine and theanine, in mice. ,)
 18:55-62.
[ZYPC] Zhejiang Yixin Pharmaceutical. 2005. Epigallocatechin gallate (EGCG)
[terhubung berkala]. http://www.herbs-tech.com/product/egcg.asp [20 Mei
2010].
Zhou Q  
 2003. Investigating the stability of EGCG in aqueous m edia.
$ 
 (



%i20:83-86.

 
 

c 


 
c 

 

 cc


High performance liquid chromatography is basically a highly improved form of column
chromatography. Instead of a solvent being allowed to drip through a column under gravity, it
is forced through under high pressures of up to 400 atmospheres. That makes it much faster.
Normal phase HPLC
The column is filled with tiny silica particles, and the solvent is non-polar - hexane, for
example. A typical column has an internal diameter of 4.6 mm (and may be less than that), and
a length of 150 to 250 mm.
Polar compounds in the mixture being passed through the column will stick longer to the polar
silica than non-polar compounds will. The non-polar ones will therefore pass more quickly
through the column.
Reversed phase HPLC
In this case, the column size is the same, but the silica is modified to make it non-polar by
attaching long hydrocarbon chains to its surface - typically with either 8 or 18 carbon atoms in
them. A polar solvent is used - for example, a mixture of water and an alcohol such as
methanol.
Non-polar compounds in the mixture will tend to form attractions with the hydrocarbon groups
because of van der Waals dispersion forces. They will also be less soluble in the solvent
Retention time
The time taken for a particular compound to travel through the column to the detector is known
as its retention time. This time is measured from the time at which the sample is injected to the
point at which the display shows a maximum peak height for that compound.
http://www.chemguide.co.uk/analysis/chromatography/hplc.html

Thus, itself is oxidized and easily decomposed by reacting sensitively with external
environment such as air, oxygen, heat, light etc. The oxidation reaction of EGCG may
generally be carried out by reaction with an oxidant. As a result of the reaction, a
phenol group of EGCG decomposes and converts into ketone group, thus a phenyl ring
of the EGCG is cutted.
Kim C H, Kim K H, Yoon H N. 2005. Composition For Stabilizing
Epigallocatechin Gallate (Egcg) In Water Phase And Preparation Method
Thereof [terhubung berkala].
http://www.sumobrain.com/patents/wipo/Composition -stabilizing-
epigallocatechin-gallate-egcg/WO2005087224.html [12 Mei 2010].
Litwack G. 2001. Vitamins and Hormones. Academic Press : California.

Zhou Q  
2003. Investigating the Stability of EGCG in Aqueous

Media.$ 
  (




%i-.&/0/1

Mitscher LA, Dolby V, Toews VD. 1997. m2m( & 
*i 

3 . USA: Avery.

White Tea Selain itu, kita juga mengenal white tea (teh putih), teh yang paling sedikit
melalui proses dan white tea memiliki tingkat antioxidan tertinggi, sehingga membuat
white tea dikenal sebagai minuman kesehatan paling unggul. Teh putih ini mengandung
antioxsidan 3 kali lebih banyak dari teh hijau. Selain itu, teh putih mengandung caffein
lebih sedikit dari teh hijau, yaitu sekitar 15 mg perporsi dibanding 20 mg caffein per
porsi teh hijau.
 !"#$%$&'(' )!"
http://suaramerdeka.com/v1/index.php/read/cetak/2010/01/15/95240/White-Tea-
Mengandung-Antioksidan-Tinggi#%#$%$!"

*+' ,&
Komponen bioaktif utama dalam teh yang berperan dalam memberikan efek
fisiologis disebut katekin. Katekin ini terdiri dari 4 jenis yaitu epicatechin (EC),
epigallocatechin (EGC), epicatechin gallate (ECG) dan epigallocatechin gallate
(EGCG). Komponen katekin ini lebih banyak terdapat dalam teh hijau
dibandingkan teh hitam. Dalam teh hitam, sebagian besar katekin dioksidasi
menjadi teaflavin dan tearubigin.
(- (,
Studi epidemiologi yang terbaru pada manusia dan studi pada hewan percobaan
menunjukkan bahwa minum teh dapat melindungi otak yang berkaitan dengan
proses penuaan. Komponen teh terutama EGCG dapat mengurangi risiko
terjadinya penyakit demensia, Alzheimer dan Parkinson. Mekanismenya diduga
berkaitan dengan kemampuan EGCG untuk mengikat Fe, menangkap radikal
bebas dan sifat anti-inflamasi.
Meningkatkan imunitas tubuh
Teh bisa membantu meningkatkan sistem pertahanan tubuh karena teh
mempunyai sifat:
O? Antioksidan (mencegah penyakit kronik karena serangan radikal bebas)
O? Anti virus (misal virus influenza)
O? Anti bakteri (misal bakteri penyebab diare atau penyebab infeksi lainnya)
 O? Meningkatkan kerja sel imun dalam tubuh (imunomodulator)
Hartoyo A.2008. Œenjelajahi Khasiat Teh &'( ' )!
http://www.kulinologi.biz/preview.php?view&id=209 [13 Mei 2010]

./ +())&()). /

  c 

0

Our product, EGCG is a kind of component

extracted from the Chinese green tea. It is
the mainly active and water-soluble
component from green tea, whose content is
the highest in the tea catechins. It accounts
for 9-13% of green tea in net weight. By
virtue of its peculiar stereochemical
structure, EGCG possesses much stronger
anti-oxidant activities and plays an
important role in preventing from cancer
and cardiovascular diseases. In addition,it is
potently used as the reversal agent of MDR (Multidrug Resistance), which may
improve the sensitivity of the cancer cell to the chemotherapy drug and reduce the
toxicity on the heart.

c,*0

Molecular Formula: C22H18O11

Molecular Weight: 458.4
Solubility: Clear colorless solution at 5Mg/Ml in water.
Zhejiang Yixin Pharmaceutical.2009. 



 

 2 2
[terhubung berkala] http://www.herbs-tech.com/product/egcg.asp [13 Mei 2010]

Stability of green tea catechins in commercial tea leaves during storage for 6 months.
'-
total catechin levels as a function of storage time indicate a progressive decrease
in the content in the total levels, most of which is due to losses in the most
abundant catechins, EGCG and ECG.

Friedman M  
2009. Stability of Green Tea Catechins in Commercial Tea

Leaves during Storage for 6 Months. $ 
  i
45&651676

PET Bottle Grade

Thermal conductivity0.24 - 0.24W/m.K
Vennix R.2009.PET Bottle Grade[terhubung berkala].
http://www.matbase.com/material/polymers/engineering/pet-bottle-
grade/properties [15 Mei 2010].
Tin
Thermal conductivity 66.8W/m.K
Vennix R.2009.Tin[terhubung berkala].
http://www.matbase.com/material/polymers/engineering/tin/properties [15
Mei 2010].
Cardboard
Thermal conductivity 0.21W/m.K
Vennix R.2009.Carboard[terhubung berkala].
http://www.matbase.com/material/other/cardboard/properties [15 Mei
2010].

Connie juga menyarankan jika para konsumen mulai memillih makan kemasan
tak tembus pandang untuk melindungi antioksidan, vitamin dan minal dari
kemungkinan terpapar matahari. Hal itu berkaitan dengan tulisan para peneliti
Italia yang secara khusus menyatakan jika minyak zaitun ektra-virgin seharusnya
disimpan dalam botol gelas kecil di tempat gelap dalam temperatur ruang berkisar
20 hingga 25 derajat Celsius.

 |
  



 


  





   

 

  
Kemasan tahan cahaya yaitu kemasan yang tidak dapat dimasuki
cahaya (tidak transparan) : logam, kertas, kaca
UNPAD.2003 #8!8$,8  ',89%8"88! :, (,:8!2 #8!8$#!
c+:9'%,
((8%,% '#8%8! c+:9' ; c8 '82,!2 [terhubung berkala]
http://resources.unpad.ac.id/unpad-
content/uploads/publikasi_dosen/PKM13%20paper-diklat-packaging-
Diklat%20KUKM.pdf [15 Mei 2010]

 )& £,- 1%0

2-))&

EGCG has been found to decrease the risk of developing atherosclerosis. It has
strong anti-inflammatory properties and thereby decreases arterial inflammation
which decreases the chances of sticky build up on the artery walls.

This could also lower blood pressure as it eases the heart¶s task of pumping blood
through less inflamed arteries.

In addition, if you have high cholesterol, EGCG has been shown in Japanese
studies to lower LDL (bad cholesterol) and raise HDL (good cholesterol).
  )& £,- 1#0
3(&--

Obesity has risen to epidemic proportions in many Western countries. EGCG may
help you lose weight via three main mechanisms:

!? Higher Metabolism.

!? Higher Fat Burning.

!? Reduced Fat Storage

 )& £, 140

'-

If you have type I or type II diabetes, you should know that EGCG can help in
many areas.

For one, it is thought that EGCG may help regulate ')()-)2)-.

Amazing Green Tea.2008. 2 2 "
 (

i
1 :
i 
i 3  * ,   [terhubung berkala] http://www.amazing-green-
tea.com/egcg-health-benefits.html [13 Mei 2010]

Julian. 2010. EGCG Side Effect [terhubung berkala]. http://www.amazing-green-

tea.com/egcg-side-effects.html [11 Mei 2010
There are three main varieties of tea -- green, black, and oolong. The difference
between the teas is in their processing. Green tea is made from unfermented
leaves and reportedly contains the highest concentration of powerful antioxidants
called polyphenols. Antioxidants are substances that scavenge free radicals --
damaging compounds in the body that alter cells, tamper with DNA (genetic
material), and even cause cell death. Many scientists believe that free radicals
contribute to the aging process as well as the development of a number of health
problems, including cancer and heart disease. Antioxidants such as polyphenols in
green tea can neutralize free radicals and may reduce or even help prevent some
of the damage they cause.
UMMC.2009. 2  [terhubung berkala]
http://www.umm.edu/altmed/articles/green-tea-000255.htm [13 Mei 2010]
£&*)))-,
-

c

      è  

c
   
  
 !  "#$
%!

5 (-67*(  %

EGCg itself induced chromosomal damage at 100 µmol/L. This damage was due to the
production of H2O2 by EGCg. In contrast, EGCg at < 10 µmol/L did not induce
chromosomal damage and did not produce H2O2. In addition, EGCg at < 10 µmol/L dose-
dependently prevented chromosomal damage induced by H2O2,

Sugisawa A, Umegaki K.2002. Physiological Concentrations of (-)-

Epigallocatechin-3-+-Gallate (EGCg) Prevent Chromosomal Damage
Induced by Reactive Oxygen Species in WIL2-NS Cells. $ !
60-&6/016/0<

£)(),,-0

Many studies indicate EGCG plays a role, which protects aganist free-radical DNA
damage, protects damage DNA. As a free radicals scavenger, EGCG combats the effects
of pollution, sunlight and smoking, helps skin from wrinkling and aging.

[ZYPC] Zhejiang Yixin Pharmaceutical Co.,Ltd.2005. Epigallocatechin gallate

(EGCG) [terhubung berkala]. http://www.herbs-tech.com/product/egcg.asp
[13 Mei 2010].



 


8
3  Disusun oleh:
Linda Tjhin, Shintawati Tjayadi
?
Teh putih mulai dikenal di Cina pada masa pemerintahan dinasti Song (960-1279). Teh ini
merupakan teh pilihan dan hanya disajikan untuk keluarga kekaisaran Cina.
Teh putih dibuat dari pucuk daun yang belum mekar serta diolah secara khusus. Hal ini yang
menyebabkan teh putih memiliki kelimpahan theanine, gallic acid, dan polifenol teh yang tidak
kita temukan pada jenis teh maupun tumbuh-tumbuhan lainnya. Kelimpahan theanin, gallic acid
dan polifenol teh ini merupakan faktor kunci peranan istimewa teh putih bagi kesehatan kita.
Tjhin L, Tjayadi S. 2002 , i
 
i   i =
  
 .
[terhubung berkala].
http://www.850goavanza.com/gorgeous/Informasi%20Teknis%20Gorgeous
%20Amazing%20White%20Tea.pdf [13 Mei 2010].

6(9%(# 

'- Reversedphase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC)

was used to analyze the catechins (EGCG) and alkaloids (caffeine) extracted. The
content of EGCG and caffeine in green tea extracts was in the range of 2.04; 0.30
and 10.22; 0.85 mg/g, respectively. The amount of EGCG and caffeine in black
tea extracts was in the range of 0.32; 0.24 and 5.26; 1.01 mg/g, respectively. The
amount of caffeine extracted from green and black tea was greater than the
amount of EGCG. Pure water is the best solvent for extracting EGCG and caffeine
from green tea. Although the amount of EGCG extracted from green tea increased
as the temperature increased, the amount of EGCG extracted from black tea was
not affected by temperature. The extraction of EGCG from both green and black
tea was not affected by the hydrogen ion concentration of the solvent.

Lee KJ,Lee SH.2008. Extraction behavior of caffeine and EGCG from green and
black tea m '  % 
   (

 
(


 60&15115<.

Anti-obesity effects of three major components of green tea, catechins, caffeine and
theanine, in mice.

Zheng G, Sayama K, Okubo T, Juneja LR, Oguni I.

'-
To elucidate the anti-obesity effects of three major components of green tea,
catechins, caffeine and theanine, female significantly reduced by the diets
containing green tea, caffeine, theanine, caffeine + catechins, caffeine + theanine
and caffeine + catechins + theanine. Noticeably, the IPAT weight decreased by
76.8% in the caffeine + catechins compared to the control group. Serum
concentrations of triglycerides (TG) and non-esterified fatty acids (NEFA) were
decreased by green tea, catechins and theanine. Moreover, caffeine + catechins,
caffeine + theanine and caffeine + catechins + theanine also decreased NEFA in
the serum. The TG level in the liver was significantly reduced by catechins and
catechins + theanine in comparison with the control. These results indicated that
at least caffeine and theanine were responsible for the suppressive effect of green
tea powder (GTP) on body weight increase and fat accumulation. Moreover, it
was shown that catechins and caffeine were synergistic in anti-obesity activities.

Zheng G  
.2004.Anti-obesity effects of three major components of green tea,

catechins, caffeine and theanine, in mice.,)
 6/&771-
3&-:;
Antioxidants are dietary substances including some nutrients such as beta carotene,
vitamins C and E and selenium, that can prevent damage to your body cells or repair
damage that has been done.

Antioxidants work by significantly slowing or preventing the oxidative - or damage from

oxygen - process caused by substances called free radicals that can lead to cell
dysfunction and the onset of problems like heart disease and diabetes. Antioxidants may
also improve immune function and perhaps lower your risk for infection and cancer.

American Dietetic Assosiation. 2006. What is An Antioxidant [terhubung

berkala].
http://www.eatright.org/Public/content.aspx?id=3813&terms=what+is+an+antioxi
dant [14 Mei 2010].
Green tea is manufactured from fresh, unfermented tea leaves; the oxidation of catechins is
minimal, and hence they are able to serve as antioxidants. Researchers believe that catechin is
effective because it easily sticks to proteins, blocking bacteria from adhering to cell walls and
disrupting their ability to destroy them. Viruses have hooks¶ on their surfaces and can attach
to cell walls. The catechin in green tea prevents viruses from adhering and causing harm.
Catechin reacts with toxins created by harmful bacteria (many of which belong to the protein
family) and harmful metals such as lead, mercury, chrome, and cadmium.

<*

Necessary for collagen growth, the substance that connects cells.

& contains significant amounts of Vitamin C (250mg per
100g of tea). Fermented teas (black, oolong tea) contain far
less because vitamin C dissolves in the fermentation process. Teas grown in
shaded environments, such as 5 , produce a lower amount of vitamin C
compared to none-shade grown teas.

)& £,0 Antioxidant vitamin that eliminates free radicals preventing
cancer and aging. Antiviral/antibacterial function assists in preventing colds.
Collagen growth factor cleanses skin.

+ -(<*.=*(>%$$(/
1. Guava 270
#" & #4$


 <*  +&)

This vitamin is an antioxidant known as a tocopherol. Green teas grown in

non-shaded environments contain more Vitamin E than teas grown in
shaded environments. & contains 50-70mg per 100g of
tea leaves and & and 5  contain 20-30mg per 100g. These amounts
are equal to or higher than wheat germ.

)& £,0 Antioxidant through fat eliminating free radicals. Combats
infertility. Prevents aging. Important in the prevention of cardiovascular disease
and cancer pressure.

Green Tea Lovers. 2005. What¶s in Green Tea? [terhubung berkala].

http://greentealovers.com/greenteahealthcatechin.htm [14 Mei 2010].

(&c,*?&*(+&5.c/
a variety of industrial and scientific applications, such as pharmaceutical,
environmental, forensics, and chemicals.

-*0
Main components in an HPLC system include the solvent reservoir, or multiple
reservoirs, a high-pressure pump, a column, injector system and the detector.

Linde. 2008. High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) [terhubung berkala].

http://hiq.linde-gas.com/international/web/lg/spg/like35lgspg.nsf/docbyalias/anal_hplc
[13 Mei 2010].

Kazakevich Y,LoBrutto R.2007."c    c


 %

i.New
Jersey:John Wiley&Sons,Inc.
(&c,*?&*(+&5.c/
Solvents must be degassed to eliminate formation of bubbles. The pumps provide a
steady high pressure with no pulsating, and can be programmed to vary the composition
of the solvent during the course of the separation. Detectors rely on a change in refractive
index, UV-VIS absorption, or fluorescence after excitation with a suitable wavelength.
The different types of HPLC columns are described in a separate document.

Tissue BM. 1996. High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) [terhubung

berkala]. http://elchem.kaist.ac.kr/vt/chem-ed/sep/lc/hplc.htm [13 Mei
2010].
Heneberry M. 2006. m

 (
 (   m& m ii

 2
 m  8


m
 im. Peter Pauper Press : New York.

lit aplikasi:
Mackey MD 
1996. CHEMTAX- a program for estimating class
abundances from chemical markers: application
to HPLC measurements of phytoplankton. # 
 c  % 144:265-
283.


Wilson T, Temple N J. 2004. ( i

!

"
. Humana Press:
New Jersey. 
Cohan P. 2008. m !
 "   # . John Wiley & Sons : New
Jersey.
Shibamoto T. 1994.

  
i
iMarcel Dekker: New York.