La cellula II

BIOLOGIA MOLECOLARE

Lezione V
Per studiare i geni è necessario isolarli

• Una volta che un gene è isolato è

possibile:
– Sequenziarlo
– Vedere dove e quando è espresso
– Farlo esprimere ectopicamente
– Abrogarlo
• Tuttavia una molecola di DNA da sola non
serve a nulla. C’è bisogno di averne molte
e che siano tutte uguali.
Attualmente ci sono 2 tecniche base

DNA ricombinante e PCR

• Le due tecniche non sono alternative ma
complementari
• La seconda è basata su reazioni
totalmente in vitro
• Entrambe le tecnologie sono
estremamente versatili e permettono
innumerevoli applicazioni differenti
Le tecnologie connesse al DNA
ricombinante
 Alcuni dei passi fondamentali che hanno
portato alle tecnologie del DNA ricombinante
1944 Avery dimostra che è il DNA l’agente trasformante
dei batteri
1953 Watson e Crick propongono la struttura del DNA
1962 Arber scopre le endonucleasi di restrizione che
vengono poi purificate e usate da Nathans e Smith per
la caratterizzazione del DNA
1967 Gellert scopre la DNA ligasi
1972 Boyer Cohen Berg e colleghi sviluppano le
strategie di clonaggio
Altri passi fondamentali per la messa a frutto
delle tecniche del DNA ricombinante e per lo
studio degli acidi nucleici
1961 Marmur e Doty caratterizzano la rinaturazione
sequenza-specifica dei filamenti di DNA
1975 Southern sviluppa la tecnica di trasferimento su
membrana di acidi nucleici separati per elettroforesi e
l’ibridazione con sonde radioattive
1975-77 Maxam e Gilbert e Sanger sviluppano le
tecniche di sequenziamento
1985 Mullis inventa la PCR
 Le tecnologie basate sul DNA ricombinante si
avvalgono di elementi genetici extracromosomiali
batterici tipicamente i plasmidi
Cosa è un plasmide
1)Un’ origine di
replicazione
BamHI 2)Un marcatore genetico
dominante selezionabile
EcoRI
(es resistenza ad un
farmaco)
3)almeno un sito di taglio
per un enzima di
restrizione
 Altri vettori
Vettori plasmidici- molecole di DNA 5-10 Kb

Vettori basati sul fago - molecole di DNA 37-

52 Kb

Vettori cosmidici artificiali- permettono

l’impaccamento di molecole più grandi
DNA(45Kb)

Cromosomi artificiali batterici (BAC)-200kb

Cromosomi artificiali di lievito(YAC)-500kb
Enzimi di restrizione
Altri esempi di enzimi di restrizione
Per clonare un frammento in un plasmide, prima di
esso va tagliato con una opportuna
endonucleasi di restrizione (nell’esempio EcoR I)

...ATCGATG GAATTCCGTATCGAT...
...TAGCTAC CTTAAGGCATAGCTA...
 Poi il frammento di interesse, ottenuto tagliando la sorgente
con lo stesso enzima deve essere incubato con il plasmide
tagliato precedentemente e con la LIGASI

AATTCCGTATCGAT...
GGCATAGCTA...

AATTC G
G CTTAA

...ATCGATG G
...TAGCTAC CTTAA
 Non è difficile trovare il sito più appropriato per le proprie
necessità in un vettore di clonaggio moderno che ospita un
polylinker

Bluescript KS
 Piastrazione in un terreno
selettivo opportuno
(nell’esempio con ampicillina)
Perché usare i batteri?

E.coli si replica sotto selezione ogni circa 40 minuti.

Il vecchio modo per riconoscere quali
plasmidi hanno preso l’inserto e chi no
Come identificare le cellule batteriche trasformate che
hanno acquisito i plasmidi con gli inserti
Colonie batteriche su capsule di petri
Vettore di clonazione: cromosoma
artificiale di lievito (YAC)
 Genoteche

Costruzione e screening
Come isolare singoli frammenti di DNA
 Costruzione di Genoteche/Banche

Genoteca: collezione di cloni che raccoglie tutte le

informazioni genetiche di un organismo.
Dimensione
1,7 kb frammenti plasmidici 8.106 cloni!!
YAC  3000 cloni

Contenuto
-genoma
-1 singolo cromosoma
-I geni espressi in un determinato tipo cellulare
Figure 8-41 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
 BANCHE DI VARIA NATURA

• Banca genomica:una collezione di cloni contenenti

almeno una copia di ogni sequenza di DNA del
genoma

• Banca cromosomica: una collezione di cloni di

frammenti di singoli cromosomi
 
• Banca di DNA complementare (cDNA): una
collezione di cloni contenenti almeno una copia di
ogni sequenza di DNA espressa (mRNA)*
 
L’ mRNA si puo’ purificare dall’RNA totale

mRNA purificato
Sintesi di cDNA
 Costruzione di una libreria di cDNA

1) Lisi delle cell.

2) Estrazione RNA
Cellule derivate 3) Purificaz mRNA
da uno specifico mRNA
tessuto o stadio
dello sviluppo Trascrittasi inversa
Eteroduplex RNA/DNA

cDNA singolo filamento

cDNA doppio filamento

Aggiunta di linkers con il sito di EcoRI

Digestione con EcoRI

Vantaggi delle librerie di cDNA
• Dalla sequenza dei cloni si puo’ derivare
direttamente la sequenza della proteina
codificata

• Ogni libreria contiene solo quelle specie

di mRNA (trascritte in cDNA) che sono
espresse in un dato tessuto e in una
data condizione
 Identificazione di specifiche
sequenze di DNA clonate 1

Le genoteche sono però biblioteche…senza

catalogo!

Necessità di tecniche di screening per

ricerca analitica dei cloni DNA ricombinante…
 Sonda molecolare

Molecola di acido nucleico marcato per

pescare una regione a sequenza
complementare in un frammento di
DNA clonato
Sonda a DNA
Figure 8-34c Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Figure 8-35 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
 Identificazione di specifiche sequenze di DNA clonate

L’identificazione di specifiche sequenze

di DNA clonate in una libreria è
un’operazione che può essere
paragonata a cercare un ago in un
pagliaio
Isolare e identificare un frammento di
10kb dal genoma umano (6x109 coppie
di nucleotidi) equivale a cercare un ago
di 1g in un pagliaio di 600 kg
 Screening di una library, ossia
come trovare un ago in un pagliaio
 Screening di una library, ossia
come trovare un ago in un pagliaio