La cellula II BIOLOGIA MOLECOLARE Lezione V

Per studiare i geni è necessario isolarli
‡ Una volta che un gene è isolato è possibile:
± Sequenziarlo ± Vedere dove e quando è espresso ± Farlo esprimere ectopicamente ± Abrogarlo

‡ Tuttavia una molecola di DNA da sola non serve a nulla. C¶è bisogno di averne molte e che siano tutte uguali.

Attualmente ci sono 2 tecniche base
DNA ricombinante e PCR ‡ Le due tecniche non sono alternative ma complementari ‡ La seconda è basata su reazioni totalmente in vitro ‡ Entrambe le tecnologie sono estremamente versatili e permettono innumerevoli applicazioni differenti

Le tecnologie connesse al DNA ricombinante .

Alcuni dei passi fondamentali che hanno portato alle tecnologie del DNA ricombinante 1944 Avery dimostra che è il DNA l¶agente trasformante dei batteri 1953 Watson e Crick propongono la struttura del DNA 1962 Arber scopre le endonucleasi di restrizione che vengono poi purificate e usate da Nathans e Smith per la caratterizzazione del DNA 1967 Gellert scopre la DNA ligasi 1972 Boyer Cohen Berg e colleghi sviluppano le strategie di clonaggio .

Altri passi fondamentali per la messa a frutto delle tecniche del DNA ricombinante e per lo studio degli acidi nucleici 1961 Marmur e Doty caratterizzano la rinaturazione sequenza-specifica dei filamenti di DNA 1975 Southern sviluppa la tecnica di trasferimento su membrana di acidi nucleici separati per elettroforesi e l¶ibridazione con sonde radioattive 1975-77 Maxam e Gilbert e Sanger sviluppano le tecniche di sequenziamento 1985 Mullis inventa la PCR .

Le tecnologie basate sul DNA ricombinante si avvalgono di elementi genetici extracromosomiali batterici tipicamente i plasmidi .

Cosa è un plasmide 1)Un¶ origine di replicazione BamHI EcoRI 2)Un marcatore genetico dominante selezionabile (es resistenza ad un farmaco) 3)almeno un sito di taglio per un enzima di restrizione .

permettono l¶impaccamento di molecole più grandi DNA(45Kb) Cromosomi artificiali batterici (BAC)-200kb Cromosomi artificiali di lievito(YAC)-500kb .molecole di DNA 5-10 Kb Vettori basati sul fago P.Altri vettori Vettori plasmidici.molecole di DNA 3752 Kb Vettori cosmidici artificiali.

Enzimi di restrizione .

Altri esempi di enzimi di restrizione .

. prima di esso va tagliato con una opportuna endonucleasi di restrizione (nell¶esempio EcoR I) .TAGCTACCTTAAGGCATAGCTA..ATCGATGGAATTCCGTATCGAT. ... ...Per clonare un frammento in un plasmide...

.Poi il frammento di interesse. ottenuto tagliando la sorgente con lo stesso enzima deve essere incubato con il plasmide tagliato precedentemente e con la LIGASI AATTCCGTATCGAT.TAGCTACCTTAA G CTTAA . AATTC G ..ATCGATGG ....... GGCATAGCTA.

Non è difficile trovare il sito più appropriato per le proprie necessità in un vettore di clonaggio moderno che ospita un polylinker Bluescript KS .

Piastrazione in un terreno selettivo opportuno (nell¶esempio con ampicillina) .

coli si replica sotto selezione ogni circa 40 minuti.Perché usare i batteri? E. .

Il vecchio modo per riconoscere quali plasmidi hanno preso l¶inserto e chi no .

Come identificare le cellule batteriche trasformate che hanno acquisito i plasmidi con gli inserti .

Colonie batteriche su capsule di petri .

Vettore di clonazione: cromosoma artificiale di lievito (YAC) .

Genoteche Costruzione e screening .

Come isolare singoli frammenti di DNA .

Costruzione di Genoteche/Banche Genoteca: collezione di cloni che raccoglie tutte le informazioni genetiche di un organismo. Dimensione 1.7 kb frammenti plasmidici  8.106 cloni!! YAC   3000 cloni Contenuto -genoma -1 singolo cromosoma -I geni espressi in un determinato tipo cellulare .

Figure 8-41 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) .

BANCHE DI VARIA NATURA ‡ Banca genomica:una collezione di cloni contenenti almeno una copia di ogni sequenza di DNA del genoma ‡ Banca cromosomica: una collezione di cloni di frammenti di singoli cromosomi ‡ Banca di DNA complementare (cDNA): una collezione di cloni contenenti almeno una copia di ogni sequenza di DNA espressa (mRNA)* .

L¶ mRNA si puo¶ purificare dall¶RNA totale mRNA purificato .

Sintesi di cDNA .

Costruzione di una libreria di cDNA 1) Lisi delle cell. 2) Estrazione RNA 3) Purificaz mRNA Cellule derivate da uno specifico tessuto o stadio dello sviluppo mRNA Trascrittasi inversa Eteroduplex RNA/DNA cDNA singolo filamento cDNA doppio filamento Aggiunta di linkers con il sito di EcoRI Digestione con EcoRI .

.

Vantaggi delle librerie di cDNA ‡ Dalla sequenza dei cloni si puo¶ derivare direttamente la sequenza della proteina codificata ‡ Ogni libreria contiene solo quelle specie di mRNA (trascritte in cDNA) che sono espresse in un dato tessuto e in una data condizione .

Identificazione di specifiche sequenze di DNA clonate 1 Le genoteche sono però biblioteche«senza catalogo! Necessità di tecniche di screening per ricerca analitica dei cloni DNA ricombinante« .

Sonda molecolare Molecola di acido nucleico marcato per pescare una regione a sequenza complementare in un frammento di DNA clonato .

Sonda a DNA .

Figure 8-34c Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) .

Figure 8-35 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) .

Identificazione di specifiche sequenze di DNA clonate L¶identificazione di specifiche sequenze di DNA clonate in una libreria è un¶operazione che può essere paragonata a cercare un ago in un pagliaio Isolare e identificare un frammento di 10kb dal genoma umano (6x109 coppie di nucleotidi) equivale a cercare un ago di 1g in un pagliaio di 600 kg .

ossia come trovare un ago in un pagliaio .Screening di una library.

Screening di una library. ossia come trovare un ago in un pagliaio .

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful