Ê
 

     Ê  Ê Ê

   Ê
 
 

     ! "# $%!"

&'‘  

Seiring dengan berkembangnya teknologi diagnosis molekuler, kini manusia telah dapat

melakukan pemeriksaan yang jauh lebih akurat dan efektif dengan menggunakan diagnosis

DNA, baik untuk mendiagnosis penyakit genetis, untuk keperluan pribadi, misalnya

penentuan perwalian anak, bahkan untuk keperluan identifikasi resistensi pada virus misalnya

pada kasus balita yang meninggal dunia akibat HIV/AIDS yang tidak terobati akibat resistensi

virus tersebut terhadap obat. Seperti yang telah diketahui bahwa setiap mahkluk hidup

memiliki materi genetik yang terkandung dalam DNA maupun RNA, begitu pula pada virus.

Hal inilah yang menjadi salah satu dasar dari pemeriksaan materi genetik pada kasus-kasus

resistensi. Penelitian ini membutuhkan penggandaan dari kopi RNA virus yang membutuhkan

teknologi‘


‘ 


  

‘  ‘
  (RT-PCR) yang akan

dilanjutkan dengan sequencing DNA.1

&&'‘ & 

Setelah dilakukan berbagai macam teknik pengambilan sampel darah pasien akan

dilakukan ekstraksi untuk dapat memperoleh materi genetik secara murni. Jika telah diperoleh

materi genetik murni, akan dilakukan amplifikasi (perbanyakan) untuk dapat memperoleh

jumlah sampel yang cukup dari keterbatasan sampel yang ada sebelumnya. Salah satu teknik

yang paling banyak digunakan saat ini dalam melakukan amplifikasi adalah a


   Ê' Namun pada kasus amplifikasi RNA, maka dibutuhkan enzim

c
Reverse Transcriptase sehingga disebut   a

  

ÊÊ'‘

&&'&'‘ Ê

Teknik PCR merupakan suatu metode in vitro yang dapat diterapkan untuk pembuatan

cepat DNA dalam jumlah yang sangat besar. Metode ini sangat cocok untuk keperluan teknik

klinis karena memerlukan jumlah sampel yang sangat sedikit. DNA yang diperoleh dapat

berasal dari sampel darah tepi dengan menggunakan bantuan rekasi berantai enzimatik,

sekuens DNA target-yang diinginkan-dapat diperbanyak2. Teknik ini secara sederhana dapat

dijabarkan sebagai berikut:

c'‘   
(  )Ê *

Untuk menyiapkan sediaan reaksi berantai, maka diperlukan kurang lebih bahan-bahan

utama antara lain DNA sampel yang telah diisolasi dari ekstraksi sebelumnya,  
,

keempat macam deoksiribonukleosida trifosfat, dan DNA polimerase yang tahan panas

dalam jumlah besar ke dalam larutan di mana reaksi akan dimulai dengan pemanasan

terlebih dahulu.  
 adalah oligonukleotida atau sekuen DNA pendek sintetis yang

dibuat secara sengaja bersifat komplementer dengan sekuen DNA target. Namun,
 


ini tidak mencakup keseluruhan sekuen DNA target, tetapi hanya sebagian dari

permulaan DNA target yang akan direplikasi kemudian oleh DNA polimerase.  
‘

yang diperlukan ada 2 macam (


 dan 
) dan keduanya saling

melengkapi untuk dapat membentuk batas yang jelas ³dari mana dan sampai di mana´

sekuens DNA target yang dimaksud. Keempat jenis zat ini dicampurkan menjadi satu

dalam sebuah tabung reaksi. Untuk memperbanyak sampel, maka DNA sampel

sebelumnya dapat dibagi ke beberapa tabung reaksi dalam jumlah yang dinilai perlu,


 kemudi dit mbahkan keti a zat lain tersebut Perhatikan gambar 1 untuk memperoleh

gambaran lebih jelas.3


‘ ‘

‘



‘

‘‘‘

‘

‘‘



‘
 ‘0
‘
‘ ‘‘0

‘

‘ 
 ‘ 
‘)

‘‘

etelah tabung-tabung yang berisi larutan dimasukkan ke dalam mesin, maka reaksi

ampli ikasi berdasarkan PCR ini dapat dilangsungkan dalam 3 tahap utama, antara lain:

 ‘!


 ‘

!enaturasi diawali dengan pemanasan larutan sediaan sampai temperatur ±95ºC


selama 1 menit untuk meluruskan untaian ˜
   dari !
sampel yang ada di

dalam larutan. !enaturasi ini terjadi dalam bentuk lepasnya ikatan hidrogen yang

menjadi sturktur tersier dari !
, sehingga dihasilkan rantai tunggal lurus dari !

dengan basa-basa nitrogen tak berpasangan. !
yang telah terdenaturasi ini akan

menjadi aksesibel terhadap berbagai sekuens   yang sudah disediakan di dalam

·
 larutan. Namun, karena tingginnya temperatur yang ada, ikatan hidrogen antara

sekuens
 
 dan sekuens target tidak dapat terbentuk.

%'%'‘ +j


Penggabungan yang dimaksud adalah pelekatan dari kedua jenis sekuens primer ke

sekuens target yang telah terpisah. Proses ini memerlukan penurunan suhu menjadi

±60ºC selama 1 menit, sehingga hanya sekuens

 
‘ yang dapat melekat,

sedangkan ikatan hidrogen antartemplate tidak dapat terjadi. Akibatnya, terbentuklah

pisahan template dengan masing-masing sekuens

 
.

%','‘ -V  

Tahap pemanjangan ini memerlukan bantuan DNA polimerase jenis‘  (enzim

yang diisolasi secara khusus dari bakteri 
‘  )‘ yang tahan terhadap

perubahan suhu ekstem, yaitu pada temperatur ±72ºC selama 1 menit. Pemanjangan

ini pula melibatkan keempat macam deoksiribonukleosida yang telah tersedia dalam

larutan. Proses pemanjangan terjadi pada arah yang berlawanan dari kedua template

dan dimulai dari ujung  pada masing-masing

 
 yang ada.3

Tahap-tahapan di atas akan terjadi berulang kali dan tiap 3 tahap penuh yang

terselesaikan disebut sebagai 1 siklus. Pada 3 siklus pertama, mulai terbentuk rantai murni

dari sekuens DNA target yang diperlukan/DNA target. Namun, pada tahap-tahap selanjutnya

terbentuk terus kopi dari sekuens DNA target dan kopi dari rantai DNA panjang secara

eksponensial. Sampai kepada siklus 30 kemudian, jumlah DNA rantai panjang hanyalah

sekita 60 kopi, sedangkan jumlah sekuens target yang terkopi dapat mencapai milyaran.4

 

]
ðððð‘ ‘
 
‘

Ê
    (nama lain: Ê

  ˜   

   adalah suatu enzim yang menggunakan cetakan

R
untuk membuat salinan !
. Terlihat pada gambar 25.

Cetakan R
yang ditranskripsi dari !
oleh R

polimerase atau diperoleh dari sumber lain, misalnya virus

R
. alinan !
dari R
yang dihasilkan oleh 
 

   dikenal sebagai c!
. Retrovirus juga

Î
  
 
 

menggunakan 
   untuk menghasilkan !

untai ganda agar dapat terintegrasi dengan genom manusia.2

ðððððð‘
 ‘
‘‘Y
Y Y
Y
    
Y‘

Ê
     digunakan oleh virus R
untuk mengubah materi genetiknya

menjadi !
dalam proses replikasi. Virus R
seperti retrovirus menggunakan enzim ini

untuk dapat berintegrasi pada genom sel host. Tanpa 
   genom virus tidak

akan dapat berintegrasi dan tidak dapat bereplikasi.

Pada retrovirus, genom terdiri atas dua molekul sense R
rantai tunggal dengan ujung

5¶ dan ekor 3¶. Terdapat beberapa langkah pembentukan !
, yaitu:

1.‘ ebuah tR
bertindak sebagai primer dan membentuk rantai komplemen dari enom

virus yang disebut    ˜   (PB.

2.‘ !
komplemen kemudian berikatan dengan U5 (daerah non-koding dan daerah R

(daerah berulang pada ujung-ujung R
 dari virus R
.

3.‘ Bagian domain reverse transcriptase yang disebut R
se H mendegradasi ujung 5¶ dan

akan membuang baguan U5 dan R.

4.‘ Primer akan pergi ke ujung 3¶ R
dan akan mensintesis !
.

°
5.‘ Untai komplemen !
pertama disebut c!
akan

diperpanjang.

6.‘ Pembentukan komplemen !
lain pada R
virus,

dan proses berulang.6

R
retrovirus dibuat dari ujung 5¶ ke ujung 3¶. Lokasi

primer berlekatan ke R
visrus disebut PB. Ujung 5¶

disebut U5 dan ujung 3¶ disebut  ˜ . tR
primer terdiri

atas 14-22 nukleotida yang akan melekat pada PB.6

Î
 

Ê
 
 ‘
ððððððð‘ 

Y Y
Y  ‘
 ‘


‘

Ê
    secara umum digunakan dalam penelitian lanjutan proses PCR

(        Ê   untuk R
yang disebut RT-PCR. Jalur PCR konvensional

hanya dapat digunakan untuk untai !
, namun dengan bantuan
   . R

dapat diubah menjadi !
, dan memungkinkan analisis R
.

Ê
    juga digunakan untuk membentuk perpustakaan c!
yang

dibentuk dari mR
. Ê
    pun dapat dimanfaatkan untuk keperluan

komersial, selain digunakan dalam pendidikan kaarena dapat digunakan untuk meng klonik,

membentuk sekuens dan menguji karakteristik !
.6

ððððð‘  ‘

RT-PCR menggunakan sepasang primer yang berkomplemen sebagai permulaan jalur

transkripsi pada ujung-ujung untai c!
. Primer ini akan dielongasi oleh !
polimerase

dan akan menghasilkan untaian !
pada tiap siklusnya, dan akan membentuk amplifikasi

alogaritmik.1

=
 RT-PCR terdiri dari beberapa langkah, meliputi :

a.‘ ‘ Y
Y  Y
Y  R pembentukan c!
dari untai R
dengan

menggunakan reverse transcriptase dan primer. Tahap ini merupakan tahapan yang

paling penting agar proses PCR dapat berlangsung mengingat !
polimerase hanya

dapat bekerja pada template !
. Tahap RT dapat dilakukan dalam tabung yang

PCR, maupun terpisah. RT dilakukan pada suhu 40YC sampau 50YC

b.‘ !


 , ds!
didenaturasi pada suhu 95YC, agar kedua untai terpisah dan

dimulai siklus PCR. Kemudian suhu diturunkan hingga mencapai suhu annealing

(suhu bergantung pada jenis primer yang digunakan, konsentrasi primer, jenis dan

konsentrasi probe, serta konsentrasi kation.

c.‘ V 
 !
, pemanjangan sekuense !
yang dilakukan ooleh termostabil Taq

!
Polimerase, yang umumnya dilakukan pada suhu 72YC, suhu optimal enzim.


‘‘
‘ 


‘

‘

‘‘

‘

‘

‘

‘


‘ 
‘

m
 Tidak hanya pada proses amplifikasi, untuk pemeriksaan DNA pun seringkali diperlukan

teknik tertentu yang cukup rumit agar sekuens yang awalnya tidak diketahui dapat terbaca,

dan darisini pulalah seorang pemeriksa dapat mengetahui terdapat atau tidaknya kelainan atau

mutasi pada materi genetik yang diberikan.

&&'&&&'&'‘. ÊÊ

Amplifikasi exponensial dengan bantuan RT-PCR memberikan hasil yang sangat sensitif

dan hanya membutuhkan sejumlah kecil RNA. RT-PCR digunakan secara luas untuk

mendiagnosis penyakit-penyakit genetik secara semikuantitatif, dalam menentukan RNA

molekul spesifik dalam sel atau jaringan. Alanisis Nothern Blot digunakan untuk mempelajari

ekspresi gen RNA.

RT-PCR juga dapat digunakan dalam insersi gen eukariot kepada prokariot. Mengingat

hampir semua gen eukariot mengandung intron yang tidak mengekspresikan gen, dan tidak

terdapat pada mRNA, dengan melakukan RT-PCR pada mRNA kita akan mendapatkan hasil

gen spesifik tanpa intron.

RT-PCR biasanya juga dilakukan dalam berbagai penelitian genom virus RNA, seperti

Influensa, maupun retrovirus seperti HIV.

 

ï
 


ððð‘ 
  ‘!
‘

walnya, teknik    
  dikembangkan oleh

‘ 

 dan 
‘

. Teknik awal ini cukup rumit karena masih terlalu sederhana dan memiliki banyak

kelemahan, misalnya memerlukan terlalu banyak !
yang telah dipurifikasi, pembacaan

yang dapat dilakukan relatif pendek, dan tidak adanya automatisasi kimiawi. Tahap-tahapan

dari pembacaan sekuens !
dengan teknik Maxam-Gilbert dapat dilihat pada tabel dan

bagan di bawah ini.7,8,9


‘ ‘ / 
 ‘ 
‘
‘ 


‘

‘

Prinsip umum dari teknik Maxam-Gilbert ini adalah memanfaatkan degradasi kimiawi

dari basa-basa purin, di mana:

1.‘ Purin (basa
dan G akan dirusak oleh dimetilsulfat

2.‘ Metilasi dari basa-basa nitrogen

3.‘ Pemanasan yang akan melepaskan basa-basa tersebut

4.‘ Pemotongan basa G oleh alkali

5.‘
sam encer akan memotong basa
lebih banyak dari basa G.

c

 Î+#' - (*     0Î + 

Namun, disebabkan oleh banyaknya kekurangan dari metode ini, maka pada tahun 1958,

1  * (  kemudian mengembangkan metode yang lebih efesien dalam ! ‘



 , yang disebut sebagai metode Sanger, sampai saat ini masih sering digunakan.

Pada dasarnya, terdapat metode-metode lain misalnya 
‘

 , RFLP, DNA arrays,

dan sebagainya. Metode Sanger dapat diringkas menjadi skema di bawah ini.
cc


‘!‘ "

‘
 ‘ ‘
‘

ecara prinsipial, metode anger (1 mengandalkan pembuatan

kopi parsial dari fragmen-fragmen !
melalui !
polimerase, (2

Pengumpulan dari fragmen-fragmen !
yang dihentikan dengan

basa dideoksiribonucleotidatriphospate (dd TP berupa
,C,G, atau

Î
 


T, setelah itu (3 Fragmen tersebut kemudian dipisahkan dengan elektroforesis, dan (4

dilakukan pembacaan sekuens dengan secara manual ataupun terkomputerisasi. Metode ini

pun digunakan oleh  ‘
‘ #//  pada tahun 1985 untuk kegiatan forensik melalui

penemuannya akan perulangan pada basa-basa TR (panjang sekitar 9-80 pasang basa yang

sangat spesifik untuk tiap individu (     .

c
 Pembacaan sekuens dari fragmen DNA dibantu oleh basa-basa ddNTP yang telah

diberikan zat fluoresens sehingga dapat berpendar jika disinari dengan panjang gelombang

tertentu, misal sinar UV. Pembacaan dilakukan pada gel agarosa yang berada dalam medan

listrik, sehingga DNA dengan panjang molekul yang lebih pendek akan bergerak lebih jauh

(lebih ke bawah) dibandingkan DNA dengan panjang molekul yang lebih panjang.8,9

&&&'‘ .  


Dengan menggunakan teknih RT-PCR yang dilanjutkan dengan sequencing DNA, kita

daqpat mengetahui ada tidaknya sifat resistensi obat pada HIV dengan melihat dan

membandingkan HIV non-resisten sehingga dokter dapat memberikan treatment alternatif

yang dapat meningkatkan angjka harapan hidup penderita.

&2'‘  *

1.‘ Hunt M. Real Time PCR. Diunduh dari http://pathmicro.med.sc.edu/pcr/realtime-
home.htm. Diakses 06 April 2010, pkl. 00.07 WIB.
2.‘ Marks DB, Marks AD, Smith CM. Biokimia Kedokteran Dasar: Sebuah Pendekatan
Klinis: Penggunaan Teknik DNA Rekombinan dalam Dunia Kedokteran. 1st ed. Jakarta:
Penerbit EGC; 2000.p.235-255, 172.
3.‘ Anonymous. Microtubes in PCR. Diunduh dari http://schools-
wikipedia.org/images/798/79806.png. Diakses 06 April 2010, pkl. 00.12 WIB.
4.‘ DIPGRI and Cornell University. The Polymerase Chain Reaction. Diunduh dari
http://irc.igd.cornell.edu/MolecularMarkers/PCR%20basics.pdf. Diakses 06 April 2010,
pkl. 00.15 WIB.
5.‘ Yepyhardi. Important Terms Related to Microarrays. Diunduh dari
http://8e.devbio.com/images/ch04/0405fig2.jpg. Diakses pada 06 April 2010, pkl. 00.44
WIB.
6.‘ Bernstein A, Weiss R, Tooze J. Molecular Biology of Tumor Viruses : RNA tumor
viruses.2nd ed, New York: Cold Spring Harbor Laboratory. 1985.
7.‘ Biology and Science. An Overview of Forensic Typic Systems & Procedures for Forensic
DNA Analysis. Diunduh dari
http://science.kennesaw.edu/~rrascati/forensicpolymorphs.html. Diakses 23 Maret 2010,
pkl. 18.24 WIB.
8.‘ Auckland Biomedic Techniques. DNA Profilling. Diunduh dari
http://www.sbs.auckland.ac.nz/uoa/fms/default/science/about/departments/sbs/student_in
formation/schools/biotechnology/docs/dnaprofiling.pdf. Diakses 23 Maret 2010, pkl.
21.23 WIB.
9.‘ Universitas Gadjah Mada. DNA Sequencing Presentation. http://faperta.ugm.ac.id
/newbie/download/ pak_tar/genetika-molekuler/Instrument20072.ppt. Diakses 23 Maret
2010, pkl.19.33 WIB.

c·