c
Y 


 
     


      
 


 !
" 
 





 !   #
$  
 ! %  

 Y  !  

     
  Y &  !
      

  



 

'()&*

  + !  +
!!+ 
   ,!"   - !!% 
  
!.


 

   


U
 
 
31 Tháng 1



ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) hay EIA (Enzyme ImmunoAssay) là mӝt kӻ

thuұt sinh hóa đӇ phát hiӋn kháng thӇ hay kháng nguyên trong mүu xét nghiӋm. HiӋn nay ELISA
đưӧc sӱ dөng rӝng rãi trong nhiӅu lĩnh vӵc nghiên cӭu như y hӑc, nông nghiӋp và đһc biӋt là
trong các quy trình kiӇm tra an toàn chҩt lưӧng các sҧn phҭm sinh hӑc. Nguyên lý cӫa ELISA
chính là dӵa vào tính đһc hiӋu kháng nguyên ± kháng thӇ và gӗm các bưӟc cơ bҧn như sau:

(1) Kháng nguyên ± antigen (KN) chưa biӃt đưӧc gҳn trên mӝt bӅ mһt;

(2) Kháng thӇ ± antibody (KT) biӃt trưӟc đưӧc ³rӱa´ qua bӅ mһt đó. Kháng thӇ này đưӧc gҳn kӃt
vӟi enzyme;

(3) Thêm vào mӝt cơ chҩt (substance); enzyme sӁ biӃn đәi cơ chҩt này và tҥo tín hiӋu có thӇ xác
đӏnh đưӧc.

Đӕi vӟi các ELISA phát quang, ánh sáng sӁ đưӧc phát ra tӯ mүu chӭa KN-KT. Sӵ hiӋn diӋn cӫa
phӭc hӧp KN-KT sӁ quyӃt đӏnh cưӡng đӝ sáng phát ra.

Vӟi nguyên lý trên, ELISA giúp xác đӏnh sӵ có mһt hay không có mһt cũng như lưӧng KN trong
mүu nghiên cӭu.

ĐӇ tiӃn hành ELISA cҫn phҧi có ít nhҩt mӝt KT đһc hiӋu cho KN chưa biӃt. Thông thưӡng KN
đưӧc cӕ đӏnh tҥi các giӃng cӫa vi phiӃm (polystyrene microtiter plate).

- Phương thӭc cӕ đinh không đһc hiӋu: KN gҳn trӵc tiӃp vào bӅ mһt cӫa đĩa;

- Phương thӭc gҳn đһc hiӋu (³sandwich´ ELISA): KN đưӧc gҳn vӟi mӝt kháng thӇ đһc hiӋu cho
cùng kháng nguyên cҫn kiӇm tra
KT đһc hiӋu sӁ đưӧc thêm vào, phҧn ӭng tҥo phӭc hӧp KT-KN có thӇ sҧy ra.

NӃu KT đưӧc gҳn trӵc tiӃp vӟi enzyme, tín hiӋu quang hӑc do enzyme làm biӃn đәi cơ chҩt sӁ
giúp phát hiӋn KN cҫn kiӇm tra. Trong trưӡng hӧp sӱ dөng KT thӭ cҩp (secondary antibody)
đưӧc gҳn vӟi enzyme thông qua các liên kӃt cӝng hóa trӏ giӳa các phân tӱ sinh hӑc
(bioconjugation), KN cҫn xác đӏnh sӁ đưӧc nhұn biӃt qua KT thӭ cҩp này.

Giӳa các bưӟc cӫa ELISA, các protein và các KT không đһc hiӋu, KT không gҳn vӟi KN sӁ
đưӧc lҩy đi nhӡ các loҥi dӏch có tác dөng ³rӱa´. Sau bưӟc ³rӱa´ cuӕi cùng, chӍ còn KT liên kӃt
vӟi KN đưӧc giӳ lҥi. Sau khi đưӧc thêm vào, cơ chҩt sӁ chӏu tác dөng cӫa enzyme liên kӃt vӟi
KT trong phӭc hӧp KT-KN. Phҧn ӭng phát quang (biӃn đәi cơ chҩt) sӁ sҧy ra.

Trưӟc đây các cơ chҩt tҥo màu sҳc đưӧc sӱ dөng trong ELISA nhưng ngày nay các chҩt phát
quang đưӧc dùng rӝng rãi làm tăng tính đһc hiӋu và đӝ chính xác cӫa ELISA.
Lӏch sӱ phát triӇn

Vào năm 1960, Rosalyn Sussman Yalow và Solomon Berson Prior mô tҧ phương pháp miӉn
dӏch có gҳn chҩt phóng xҥ (radioimmunoassay) dùng đӇ xác đӏnh KN, KT 1. Trong phương pháp
này, KT hay HN có gҳn chҩt đánh dҩu phóng xҥ và sӵ hiӋn diӋn cӫa chúng đưӧc xác đӏnh thông
qua tín hiӋu phóng xҥ. Tuy vұy, các chҩt phóng xҥ lҥi tiӅm ҭn mӕi nguy hiӇm vì vұy ngưӡi ta
nghĩ đӃn mӝt phương pháp mӟi trong đó tín hiӋu đưӧc phát ra không phҧi nhӡ phóng xҥ. Khi đó
ngưӡi ta đã biӃt rҵng mӝt sӕ loҥi enzyme như các peroxidase phҧn ӭng vӟi mӝt sӕ cơ chҩt nhҩt
đӏnh như Tetramethylbenzidine hay 3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid sӁ phát màu. Màu
sinh ra tӯ các phҧn ӭng này có thӇ đưӧc sӱ dөng làm tín hiӋu nhұn biӃt (tín hiӋu chӍ thӏ).

Tuy nhiên, đӇ tín hiӋu này đưӧc sӱ dөng như chҩt phóng xҥ trong radioimmunoassay, tín hiӋu
màu phát ra phҧi đӗng nghĩa vӟi sӵ có mһt cӫa KT hay KN. Chính vì vұy, giҧi pháp đưӧc đưa ra
là enzyme sӁ đưӧc gҳn vӟi KN hay KT. Kӻ thuұt gҳn kӃt enzyme vӟi KN hay KT đưӧc phát triӇn
bӣi Stratis Avrameas và G.B. Pierce 2. TiӃp sau đó, vào năm 1966, Wide và Porath phát triӇn
phương pháp gҳn KN và KT trên bӅ mһt rҳn (bӅ mһt cӫa các vi phiӃm hay các đĩa) nhӡ đó mà
KN hay KT không đưӧc gҳn kӃt sӁ dӉ dàng đưӧc rӱa trôi 3.

Peter Perlmann và Eva Engvall (Thөy ĐiӇn) cùng vӟi nhóm Anton Schuurs và Bauke van
Weemen (Hà Lan) công bӕ phương pháp đưӧc đһt tên ELISA (EIA) dӵa trên tҩt cҧ nhӳng bưӟc
phát triӇn nói trên. Phương pháp chính thӭc ra đӡi vào năm 1971 4,5.
Ӭng dөng

Mӝt sӕ ӭng dөng cӫa ELISA:

- Xác đӏnh nӗng đӝ cӫa KT trong huyӃt thanh;

- KiӇm tra sӵ có mһt cӫa KN;

- Phát hiӋn các yӃu tӕ có khҧ năng gây dӏ ӭng trong thӵc phҭm;

- Xác đӏnh sӵ có mһt cӫa dưӧc phҭm;

- Xác đӏnh hoҥt tính cӫa mӝt hӧp chҩt sinh hӑc

«
Các phương pháp ELISA

1. ELISA gián tiӃp (indirect ELISA) gӗm các bưӟc chính:

- ChuyӇn KN đã biӃt lên bӅ mһt cӭng ( đưӧc gӑi chung là các đĩa). KN sӁ đưӧc cӕ đӏnh trên bӅ
mһt. Nӗng đӝ cӫa các mүu kháng nguyên này dùng đӇ thiӃt lұp đưӡng chuҭn cho viӋc tính nӗng
đӝ cӫa kháng nguyên trong các mүu chưa biӃt.
- ChuyӇn các mүu KN chưa biӃt vào các giӃng khác. KN chưa biӃt đưӧc hòa tan trong cùng mӝt
loҥi dung dӏch đӋm giӕng các mүu KN chuҭn.
Đĩa 96 giӃng (microtiter) thưӡng đưӧc dùng cho ELISA

- Thêm dung dӏch protein không tương tác (non-interacting protein) như albumin huyӃt thanh bê
(bovine serum albumin) hay casein vào tҩt cҧ các mүu (kӇ cҧ mүu chuҭn). Bưӟc này đưӧc gӑi là
³blockin´ do protein huyӃt thanh có tác dөng ngăn cҧn sӵ hҩp phө cӫa các protein khác lên bӅ
mһt cӫa đĩa.

- Rӱa bӅ mһt đĩa sau đó chuyӇn kháng thӇ (biӃt trưӟc) vào tҩt cҧ các giӃng cӫa đĩa. KT sӁ kӃt hӧp
vӟi các KN đã đưӧc cӕ đӏnh mà không kӃt hӧp vӟi protein cӫa huyӃt thanh.

- Thêm KT thӭ cҩp (secondary antibody), KT thӭ cҩp sӁ kӃt hӧp vӟi bҩt kǤ mӝt KT còn dư
(bưӟc này có thӇ đưӧc bӓ qua nӃu kháng thӇ dùng đӇ phát hiӋn KN đã gҳn vӟi enzyme).

- Rӱa đĩa, các kháng nguyên gҳn enzyme còn dư sӁ đưӧc loҥi bӓ.

- Thêm cơ chҩt. Enzyme sӁ làm biӃn đәi cơ chҩt làm sҧn sinh tín hiӋu huǤnh quang hay tín hiӋu
điӋn hóa hӑc (enzyme có tác dөng như yӃu tӕ khuyӃch đҥi).

Nhưӧc điӇm cơ bҧn: Bưӟc cӕ đӏnh KN không có tính đһc hiӋu nên bҩt kǤ protein nào cũng gҳn
vӟi bӅ mһt đĩa vì vұy KT (có nӗng đӝ thҩp) phҧi cҥnh tranh vӟi các protein khác trong huyӃt
thanh khi gҳn kӃt vӟi bӅ mһt cӫa điwax. Sandwich ELISA hҥn chӃ đưӧc nhưӧc điӇm này.

2. Sandwich ELISA: Phương pháp đưӧc sӱ dөng đӇ phát hiӋn KN trong mүu nghiên cӭu và bao
gӗm các bưӟc cơ bҧn sau (quy trình có thӇ đưӧc thay đәi trong nhiӅu trưӡng hӧp):

(1) Chuҭn bӏ bӅ mһt (microtiter) có gҳn KT

(2) Khóa tҩt cҧ nhӳng vӏ trí gҳn kӃt không đһc hiӋu trên bӅ mһt.

(3) Phӫ mүu chӭa kháng KN cҫn xác đӏnh

(4) Rӱa đĩa, kháng KN không đưӧc gҳn kӃt sӁ bӏ rӱa trôi

(5) Thêm các KT đһc hiӋu cho KN cҫn chҭn đoán

(6) Thêm KT thӭ cҩp đã đưӧc gҳn vӟi enzym (KT thӭ cҩp đһc hiӋu cho KT sơ cҩp ӣ bưӟc 5)

(7) Rӱa đĩa, phҫn không gҳn kӃt sӁ bӏ rӱa trôi.

(8) Thêm cơ chҩt. Enzym sӁ biӃn đәi cơ chҩt tҥo màu, phát quang hay tín hiӋu hóa điӋn.

(9) Đo cưӡng đӝ ánh sáng, tín hiӋu huǤng quang, tín hiӋu điӋn hóa« qua đó xác đӏnh sӵ có mһt
và hàm lưӧng KT.
Các bưӟc trong Sandwich ELISA. (1) Phӫ đĩa bҵng KT (2) Thêm mүu cҫn xác đӏnh KN. KN
(nӃu có) sӁ gҳn vӟi KT; (3) kháng thӇ dùng đӇ phát hiӋn đưӧc thêm vào và kӃt hӧp vӟi KN; (4)
Thêm KT thӭ cҩp liên kӃt vӟi enzyme. KT thӭ cҩp sӁ gҳn vӟi KT dùng đӇ phát hiӋn; (5) Thêm
cơ chҩt. Enzym sӁ làm biӃn đәi cơ chҩt và phát tín hiӋu có thӇ phát hiӋn và đo đưӧc.
Các bưӟc trong Sandwich ELISA. (1) Phӫ đĩa bҵng KT (2) Thêm mүu cҫn xác đӏnh KN. KN
(nӃu có) sӁ gҳn vӟi KT; (3) kháng thӇ dùng đӇ phát hiӋn đưӧc thêm vào và kӃt hӧp vӟi KN; (4)
Thêm KT thӭ cҩp liên kӃt vӟi enzyme. KT thӭ cҩp sӁ gҳn vӟi KT dùng đӇ phát hiӋn; (5) Thêm
cơ chҩt. Enzym sӁ làm biӃn đәi cơ chҩt và phát tín hiӋu có thӇ phát hiӋn và đo đưӧc.

3. ELISA cҥnh tranh:

(1) ³Ӫ´ KT không đưӧc đánh dҩu vӟi KN.

(2) Đưa hӛn hӧp này vào các giӃng cӫa vi phiӃm có chӭa KN.

(3) Rӱa đĩa, KT không đưӧc gҳn kӃt sӁ bӏ rӱa trôi. Lưӧng KN càng lӟn, lưӧng KT gҳn thành
công vӟi KN trong đĩa càng thҩp do ³cҥnh tranh´.

(4) Thêm KT thӭ cҩp (KT cӫa KT ӣ bưӟc 1). KT thӭ cҩp gҳn vӟi enzym.

(5) Thêm cơ chҩt. Lưӧng enzym còn dư sӁ giҧi phóng tín hiӋu hǤnh quang hay tín hiӋu màu.

Trong phương pháp này, hàm lưӧng KN gӕc càng cao, tín hiӋu sҧn sinh càng yӃu.

Mӝt sӕ trưӡng hӧp, enzym đưӧc gҳn vӟi KN chӭ không phҧi KT.
Tài liӋu tham khҧo

1. Yalow R, Beón S (1960). ³Immunoassay of endogenous plasma insulin in man´. Journal of

Clinical Investigation 39: 1157±75.

2. Lequin R (2005). ³Enzyme immunoassay (EIA)/enzyme-linked immunosorbent assay

(ELISA).´ Clinical Chemistry 51 (12): 2415±8.

3. Wide L, Porath J. Radioimmunoassay of proteins with the use of Sephadex-coupled

antibodies. Biochem Biophys Acta 1966;30:257-260

4. Engvall E, Perlman P (1971). ³Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative

assay of immunoglobulin G´. Immunochemistry 8 (9): 871±4.
5. Van Weemen BK, Schuurs AH (1971). ³Immunoassay using antigen-enzyme conjugates.´.
FEBS Letters 15 (3): 232±6
Nguӗn: ĐHNL HuӃ