(15 de març) Detecció de contaminació per micoplasma

Es poden utilitzar tècniques de PCR. En aquest cas es van utilitzar dos grups
de primers: EL primer grup està compost per molli1 i molli2a per detectar tots
els Micoplasma i Spiroplasma, i un altre que es el Molli1 i molli2 b per
detectar un altre tipus de contaminant l’Acholeplasma. La PCR ens permet
determinar si hi ha contaminació , però no ens permet concretar quina és
l’espècie causant d’aquesta.

- Exemple de detecció per PCR:

De la columna 1 a la 4 hi ha línies cel·lulars vero contaminades per

micoplasma ja que ens apareixen bandes si usem els primers molli1 i molli2a.
De la 7 a la 9 també estan contaminades ja que no donen banda quan han
estat amplificades amb els primers molli1 i molli2b.

Les columna 5 no dona banda amb els primers molli1 i molli2a , per tant la
contaminació es per Acholeplasma. La 6 dona banda quan es amplificada amb
els primers molli1 i molli2b, per tant la contaminació es provocada per
Acholeplasma. En la columna 10 hi ha hagut una amplificació inespecífica ,
per tant es considera error experimental i no podem dir res sobre el tipus de
contaminació en aquesta columna.

Industries han desenvolupat kits amb primers prefabricats per detectar

contaminació en cultius. No hem de fabricar els primers en laboratori cada
cop que volem detectar contaminació.

Detecció de contaminats per l’activitat adenosina fosforilasa

Es basa en la transformació d’una substancia (inerta) que nosaltres introduïm

al cultiu en dos productes que maten a la cèl·lula. Aquesta transformació
només té lloc si hi ha contaminació , ja que es necessita l’enzim adenosina
fosforilasa (enzim present en els organismes contaminants).

El kit d’aquest metode consta d’una placa amb 24 pouets:

- En la columna 1,fila 1 , hi trobem controls negatius

- De la linia 2 a la 4, i de la columna 2 a la 6, hi trobem cultius de
cèl·lules infectades per micoplasma.
- Es deixen creixer les celules
- Afegim el 6-MPDR (substància inerta per el cultiu). Els pous
contaminats transformen aquesta substància en productes tòxics per el
cultiu , de manera que el pouet passa a veure’s transparent.
- En el cas de les columnes 5 i 3, també hi ha hagut una mort del cultiu
però en menor grau. Això és degut a que cada especie de micoplasma
sintetiza adenosina fosforilasa en mes o menys quantitat. En aquest no
en deuen sintetitzar gaire, ja que el cultiu només està parcialment
destruït.
- La lina 4 també es control

Detecció de micoplasma mitjançant transformació adp-atp

Es basa en que: En presència de micoplasma i d’un determinat substrat es

transforma l’adp en atp. En el substrat s’hi afegeix una mòlecula anomenada
luciferina. Aquesta molecula en presencia d’atp i O2 i de l’enzim luciferasa, es
transformada en una molecula anomenada Oxiluciferina.

Que pasa si no hi ha micoplasma? L’adp no es transformat en adp , degut a la

falta d’enzims micoplasmatics. Com a conseqüència la luciferina no pot ser
transformada a Oxiluciferina. Per tant, quan fem una lectura podem saber si
hi ha o no contaminació depenent de si llegim la fluorescència de la
oxiluciferina (presencia de micoplasma) o no la llegim (absència de
micoplasma). A major contaminació, mes intensitat ens donarà quan ho llegim
(Quantificació de contaminació). Aquest mètode ens permet determinar
(emissió o no emissió de fluorescència) i quantificar micoplasmes (major o
menor intensitat) .

És un sistema força sensible , permet detectar micoplasma en concentracions

molt baixes, i permet veure les diferencies entre quantitats diferents molt
petites.

Eliminació de la contaminació de micoplasma

El millor que es pot fer en cas de contaminació és eliminar el cultiu.

Si tenim un cultiu molt treballat, el qual se’ns contamina i no volem perdre’l,

hi ha certs mètodes que permeten eliminar la contaminació conservant el
cultiu (antibiòtics, com per exemple la Ciprofloxacina). De totes maneres el
que s’intenta fer és treballar amb diferents barrejes de antibiòtics, treballar
amb concentracions baixes de cèl·lules (la qual cosa ens facilita recuperar les
línies cel·lulars). Si aconseguim que la linia creixi, despres de fer cultius
durant 4 o 5 fases, hem de determinar si queda contaminació o no, degut a
micoplasma. Si al cap de 5 fases no detectem presencia de micoplasmes, vol
dir que els antibiòtics han funcionat.

PREVENCIÓ

Una mesura per intentar evitar contaminacions, és utilitzar sistemes que

previament al filtrat dels medis i la seva utilització, intentin destruir els
posibles organismes que pugui haver-hi.

Dos metodes (Que el Leo sapiga, encara no s’han comercialitzat):

- HTST: Alta temperatura, durant un periode de temps curt. Es fa passar

el medi per un tub que s’escalfa a uns 115 graus. El pas del medi per el
tub es de 30 segons. Rapidament es refredat en sortir del tub, i ja es pot
fer servir. Amb aixo s’aconsegueix, estar bastant segur de que no hi ha
contaminació.
- Esterilització per rajos UV: El medi es fa passar per un tub que està
envoltat d’una lampara de rajos UV (de diferent intensitat).

Els resultats indiquen que aquests metodes no son perjudicials pel medi.
Les cèl·lules cultivades poden créixer pràcticament igual.
CONTAMINACIÓ PER BACTERIS I FONGS

Sobretot llevats. L’ideal seria utilitzar medis sense antibiòtics, perquè si algun
dia hi ha contaminació de seguida la veuríem. Això no es fa gaire, ja que
normalment s’afegeix penicil·lina i estreptomicina. Si treballem en laboratoris
on hi ha molta gent val la pena fer això.

Contaminació de llevats i fongs s’observa molt facilment. El primer que veiem

es que el color del medi vira cap al groc, degut a canvis de pH (es torna més
àcid). Això es degut a l’alt ritme de creixement de bacteris i llevats. També
veiem que el medi deixa de ser translúcid, es torna tèrbol (llevats i bacteris que
viuen en suspensió).

Si tenim una contaminació d’aquest tipus, s’ha d’eliminar el cultiu i intentar

esbrinar si algun dels elements que hem utilitzat en el procés està contaminat.
Això ho podem fer incubant alíquotes dels diferents elements que hem emprat
en el procés i observant si hi ha creixement en algun d’ells.

En cas d’haver-ho d’eliminar podem fer el que fèiem amb micoplasmes:

utilitzar barreges de antibiòtics per intentar salvar el nostre cultiu i eliminar la
contaminació.

Els llevats es visualitzen mes fàcilment que els bacteris.

CONTAMINACIÓ PER VIRUS

Freqüents quant utilitzem especies que poden contenir virus endògens.

Els virus provoquen un cicle citopatogènic, que modifica la morfologia cel·lular

( A l’esquerra cèl·lules sanes. A la dreta celules infectades pel virus de la
rubèola ).

Quan veiem que la morfologia varia, podem sospitar que hi ha contaminació

per virus. Identificar virus es complicat, el més normal es eliminar el cultiu
sense poder salvar-lo.

En alguns zones del cultius infectats per virus poden apareixer calbes.
8- Quantificació cel·lular, tests de citotoxicitat i mort
cel·lular
Hi ha força varietat de metodes per quantificar, nosaltres ens centrarem en els
de color negre:

Els 2 primers ens serveixen per fer un recompte cel·lular. Mitjançant un

hemocitometre, o també recomptadors automatics.

Els ultims metodes, son metodes indirectes que ens permet visualitzar el
nombre de celules viables que hi ha en un cultiu.

HEMOCITOMETRE

Molt comú. Es basa en un portaobjectes que té un entramat de línies gravat,

en el qual en el quadrat central hi cap un volum de 1x10-4 mil·lilitres. Si
nosaltres tenim una alíquota de cèl·lules, ho aboquem i contem totes les
cèl·lules que hi ha dins. Si sabem que en 1x10-4 mililitres hi ha X celules,
podem extrapolar el nombre de celules que tenim en el volum del cultiu,
mitjançant una regla de 3.
També podem aplicar tests de (tinció) supravital que ens permet diferenciar
cèls. Vives de cèls. Mortes.

L’hemocitometre es un mètode simple i util.

També es poden utilitzar recomptadors automatics que son capaços de

detectar i quantificar celules automàticament. Fins i tot n’hi ha que poden
diferenciar tipus cel·lulars segons mida.

És important que poguem identifciar el nombre de duplicacions que s’han

produït en el cultiu. Algunes linies tenen un nombre de divisions finit, per
tant ens interessa saber-ho. Això es pot calcular a partir de la següent
formula:

També ens pot interessar coneixer el temps mig de generació, quan triga
una agrupació celular en cultiu en duplicar-se. Això es important per
coneixer la durada del cicle cel·lular. Això ens permetrà testar substancies
en determinats moments del cicle. Es calcula aixi:
Es interessant també saber, si totes les cèl·lules d’un cultiu son capaces de
dividir-se (Normalment quan treballem amb linies celulars es aixi, pero quan
treballem amb cultius primaris pot no ser aixi). Per saber-ho el que fem es
introduir durant un periode llarg de cultiu un element (com per exemple
nucleotids marcats amb fluorocrom) que ens permeti diferenciar si el DNA al
replicar-se l’ha incorporat. Si totes les celules del cultiu mostren el marcatge
d’aquest element, vol dir que totes les celules son proliferants.

Com podem determinar les fases cel cicle cel·lular i la seva durada?

- Tenim un cultiu cel·lular en creixement exponencial exposat a un pols

de timidina o nucleòtid marcat amb fluorocrom (substancia que
s’incorpora durant la replicació) durant 30 minuts
- Només les cèl·lules que durant aquests 30 minuts estaven en la fase S
ho hauran incorporat.
- Al cap de 30 minuts traiem el pols
- Cada X temps es van traient mostres i s’analitzen les mitosis marcades
- Les mitosis marcades comencen a aparèixer poc a poc, perquè les
cèl·lules necessiten un cert temps per arribar a la mitosis. Cada vegada
més cèl·lules que estaven en fase S van entrant en mitosis
- A partir d’un determinat punt comença a decréixer.
- Després d’un cert temps hi ha un altre pic de creixement , son cèl·lules
que han entrat un altre cop en mitosis
- El temps que passa entre el punt on tenim el 50% de mitosis marcades
del primer pic i el punt on tenim el 50% del segon pic, correspon a la
mitjana de la durada del cicle cel·lular per aquest cultiu
- Podem establir la durada de la fase S amb les següents formules:

Per saber la durada de la mitosis, nosaltres agafem un camp i contem. De

totes aquestes cèl·lules quantes estan en mitosis? Si un 5% estan en mitosis,
vol dir que la mitosis dura un 5% de la durada del cicle, si 10% estan en
mitosis, la mitosis dura un 10% del cicle, etc.

METODE INDIRECTE PER QUANTIFICAR: ASSAIG MTT

Aquest mètode es basa en la capacitat que tenen les deshidrogenases

mitocondrials per convertir un substrat groc,soluble en aigua,(MTT=3-(4,5-
dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide ) en formazan,de color
blau fosc i insoluble en aigua. Aquest substrat insoluble el podem solubilitzar
i analitzar-lo amb un espectrofotòmetre. Si les celules estan vives transformen
el substrat groc en formazan, i per tant la quantitat de producte blau format
es proporcional al nombre de celules vives que tenim. Es poden establir corbes
dosi/resposta que ens donen una relació celules vives/intensitat color blau.
Amb una recta patró podem comparar el nostre cultiu i analitzar quantes
cèl·lules vives tenim.

Aquest es un exemple d’experiment per determinar l’efecte d’una droga sobre

un cultiu. A cada pouet hi ha la mateixa quantitat de cèl·lules en cultiu. Quan
les cèl·lules estan en fase exponencial es treu el medi i s’afegeix la droga
(figura de l’esquerra). Es deixa actuar la droga durant un cert temps, s’elimina
i es torna a afegir medi. Un cop s’ha recuperat el cultiu s’afegeix el MTT (figura
dreta). Podem veure les columnes dels extrems (controls) i comparar amb els
altres pouets. Observem que la quantitat de formazan produït va disminuint a
mesura que avancem cap a l’esquerra. Com més a l’esquerra més cèl·lules
mortes hi ha. Veiem també que les cèl·lules B son mes resistents a aquesta
droga. EL IC50 del tipus B esta més cap a l’esquerra que el de A.

Aquest mètode es molt bo i precis, força utilitzat

ASSAIG AMB NEUTRAL RED

Semblant al assaig MTT. EL neutral red es un colorant supravital que

s’acumula als lisosomes de les cèl·lules vives. Podem llegir la quantitat de
neutral red amb un espectrofotòmetre per saber el nombre de cèl·lules vives.

ASSAIG DE LACTAT DESHIDROGENASA (LDH)

El LDH es un enzim que les cèl·lules secreten quan es moren i resta en el medi
de cultiu. Mesurant la quantitat de LDH podem saber el nombre de cèl·lules
que s’han mort. Podem agafar una mostra del medi per fer aquest assaig (no
cal “gastar” cultiu). EL que fem es posar piruvat i NADH en una mostra de
medi. SI hi ha LDH te lloc la següent reacció:

Podem fer lectures amb espectrofotòmetre de la quantitat de NADH i el NAD

transformats. Si no hi ha LDH, la reacció no es dona, i per tant podem dir que
totes les cèl·lules son viables, ja que no han mort (no han secretat el LDH al
medi). Es necessiten corbes patró per comparar la viabilitat de les celules. A
més s’ha de tenir present que l’activitat del LDH va disminuint amb el temps.
El més destacat d’aquest mètode és que la mostra que agafem es de medi i no
de cultiu.