STRATEGY IN DNA

CLONING

BY:
NOVIYANTI NASUTION
408141022
 Definition of DNA Cloning

Cloning is the process of moving a

gene from the chromosome it
occurs in naturally to an
autonomously replicating vector.
 Sources of DNA for Cloning Process

 DNA Chromosomes
 cDNA (complementary DNA) that synthesized
by using mRNA as template
 DNA that produced by multiplication of PCR
Production of cDNA
To convert the RNA became
DNA, it needs enzyme (reverse
transcriptase ) for convert the m-
RNA became complementary
DNA (c-DNA).
 Multiplication of DNA by using
PCR (Polymerase Chain Reaction)
 Cont…
 STEP 1 is to first unzip the DS-DNA, also
called denaturation, into two
complementary single strands of DNA by
heating the reaction mix to 95 degrees
Celsius.
 STEP 2 isolates the target region of the
Genomic DNA by landing 2 primers (P1 &
P2) which exactly match two 20-30 unique
base pair regions that bookend the target
region. This is called annealing. Once time
is allowed for the primers to land on the
sites,
 Cont…
 STEP 3 invloves heating the mix to 72
degrees at which point a special
polymerase builds the DNA strand
starting at the primers and continuing in
the 5 prime direction. This is called
extension.
PLASMID CLONING STRATEGY

Involves Five steps:

1. DNA Isolation
2. Enzyme restriction
3. Ligation
4. Transformation
5. Transform and Recombinant
Selection.
DNA Isolation
 Cont…
Isolasi DNA diawali dengan perusakan dan atau
pembuangan dinding sel, yang dapat dilakukan baik
dengan cara mekanis seperti sonikasi, tekanan
tinggi, beku-leleh maupun dengan cara enzimatis
seperti pemberian lisozim. Langkah berikutnya
adalah lisis sel. Bahan-bahan sel yang relatif lunak
dapat dengan mudah diresuspensi di dalam medium
bufer nonosmotik, sedangkan bahan-bahan yang
lebih kasar perlu diperlakukan dengan deterjen yang
kuat seperti triton X-100 atau dengan sodium
dodesil sulfat (SDS). Pada eukariot langkah ini
harus disertai dengan perusakan membran nukleus.
 Cont…
Setelah sel mengalami lisis, remukan-remukan sel
harus dibuang. Biasanya pembuangan remukan
sel dilakukan dengan sentrifugasi. Protein yang
tersisa dipresipitasi menggunakan fenol atau
pelarut organik seperti kloroform untuk kemudian
disentrifugasi dan dihancurkan secara enzimatis
dengan proteinase. DNA yang telah dibersihkan
dari protein dan remukan sel masih tercampur
dengan RNA sehingga perlu ditambahkan RNAse
untuk membersihkan DNA dari RNA. Molekul DNA
yang telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikan
dengan penambahan amonium asetat dan alkohol
atau dengan sentrifugasi kerapatan menggunakan
CsCl
Enzyme restriction
 Cont…
In order to insert foreign DNA into a
plasmid, use is made of special enzymes
known as restriction endonucleases.
Restriction endonucleases
These enzymes cut large DNA molecules
into shorter fragments by cleavage at
specific nucleotide sequences called
regognition sites. These enzymes are
highly specific deoxyribonucleases
(DNases).
 Sticky end & Blunt end
 Sticky end : Some enzymes cut the two
helices a few base pairs apart, generating
two fragments with single-strand
protrusions called sticky end.
 Blunt end (Flush end) : Some enzymes

make a simple double-stranded cut in the

middle of the recognition sequence.
Ligation
 Cont…
Pada reaksi ligasi antara fragmen-
fragmen DNA genomik dan DNA vektor,
khususnya plasmid, dapat terjadi
peristiwa religasi atau ligasi sendiri
sehingga plasmid yang telah dilinierkan
dengan enzim restriksi akan menjadi
plasmid sirkuler kembali.
Transformation
 Transformasi Sel Inang
Memasukkan plasmid (yang
merupakan vektor yang telah disisipi
gen) ke dalam sel inang
 Transformasi (1)
 PRA-INKUBASI
Sel E. coli calon penerima plasmid
dipaparkan kepada ion positif kalsium
klorida (CaCl2). Perlakuan ini
memberikan cekaman kepada bakteri
yang mengakibatkan membran sel dan
dinding sel bakteri tersebut menjadi
permeabel terhadap plasmid donor.
Proses ini mengakibatkan E. coli menjadi
“kompeten" untuk menerima plasmid .
 Transformasi (2)
 INKUBASI
Plasmid ditambahkan ke dalam suspensi
sel E. coli kompeten.
Suspensi sel E. coli kompeten lainnya yang
tidak ditambah plasmid digunakan
sebagai kontrol.
 Transformasi (3)
 KEJUTAN PANAS (HEAT SHOCK)
Sel kompeten (baik yang diberi plasmid
maupun kontrol) dipaparkan sejenak (90
detik) kepada suhu 42 oC. Langkah ini
memaksimumkan masuknya plasmid
menembus membran dan dinding sel.
 Transformasi (4)
 PENYEMBUHAN (RECOVERY)
Sel kompeten (baik yang diberi plasmid
maupun kontrol) ditumbuhkan dalam
medium kaya nutrisi untuk memberi
kesempatan penyembuhan setelah
mengalami cekaman dan kejutan. Masa
penyembuhan biasanya berlangsung satu
waktu generasi (untuk E. coli berkisar
antara 30 hingga 45 menit)
 Transformasi (5)
 PENAPISAN (SCREENING)
Sel kompeten yang telah mengalami
penyembuhan ditapis pada medium padat
yang mengandung senyawa penapis
berdasarkan penanda yang dibawa oleh
plasmid.
Transform and Recombinant Selection.

Oleh karena DNA yang dimasukkan ke

dalam sel inang bukan hanya DNA
rekombinan, maka kita harus melakukan
seleksi untuk memilih sel inang transforman
yang membawa DNA rekombinan.
Selanjutnya, di antara sel-sel transforman
yang membawa DNA rekombinan masih
harus dilakukan seleksi untuk mendapatkan
sel yang DNA rekombinannya membawa
fragmen sisipan atau gen yang diinginkan.
 Cont…
Pada dasarnya ada tiga kemungkinan
yang dapat terjadi setelah transformasi
dilakukan, yaitu (1) sel inang tidak
dimasuki DNA apa pun atau berarti
transformasi gagal, (2) sel inang
dimasuki vektor religasi atau berarti ligasi
gagal, dan (3) sel inang dimasuki vektor
rekombinan dengan/tanpa fragmen
sisipan atau gen yang diinginkan.
 Cont…
Seleksi sel rekombinan yang membawa
fragmen yang diinginkan dilakukan
dengan mencari fragmen tersebut
menggunakan fragmen pelacak (probe),
yang pembuatannya dilakukan secara in
vitro menggunakan teknik reaksi
polimerisasi berantai atau
polymerase chain reaction (PCR).