Professional Documents
Culture Documents
ANDIKA SAPUTRA
ANDIKA SAPUTRA
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Program Studi Biokimia
Disetujui
Diketahui
Tanggal lulus :
PRAKATA
Bismillahirrahmaanirrahim
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT yang telah
memberikan rahmat dan nikmat-Nya yang tiada terkira sehingga penulis dapat
menyelesaikan penulisan hasil penelitian ini. Bertempat di Laboratorium Biologi
Mikroba Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI-Cibinong Bogor, penulis telah
melaksanakan penelitian yang berjudul Analisis Ukuran Kromosom dan Pola
Restriksi Bacillus thuringiensis dengan Elektroforesis Gel Medan Berpulsa.
Penulis pada kesempatan ini ingin mengucapkan terimakasih dan
penghargaan kepada Drs. Eddy Jusuf DES dan Dr. I Made Artika M. App. Sc
selaku dosen pembimbing yang telah memberikan saran dan pengarahan sehingga
penulis dapat melaksanakan penelitiannya dengan baik dan menyelesaikan karya
ilmiah ini. Ucapan terimakasih juga penulis sampaikan untuk keluarga penulis,
dan sahabat-sahabat penulis yang telah banyak memberi support, teman satu lab,
Wisnu, Tutu, Wurian, dan Isra yang telah menemani penulis bekerja juga tak lupa
untuk Yanti yang membantu mengecek ulang hasil tulisan penulis dan memberi
dukungan moril bagi penulis.
Penulis menyadari dalam penulisan hasil penelitian ini masih jauh dari
sempurna, oleh karena itu penulis mengharapkan kritik dan saran yang bersifat
membangun dari berbagai pihak. Semoga hasil penelitian ini dapat memberikan
manfaat bagi kita semua.
Andika Saputra
RIWAYAT HIDUP
Halaman
DAFTAR GAMBAR........................………………………………………….....viii
DAFTAR LAMPIRAN..........................................................................................viii
PENDAHULUAN........…………………………………………………….......... 1
TINJAUAN PUSTAKA
Bacillus thuringiensis ......…………………………………………......... 1
Gen dan Genom…………………………………………………............. 2
Kromosom…………………………………………………...................... 3
DNA sebagai Materi Genetik ......………………………………………. 3
Analisis Total DNA Genom ......………………………………………... 4
Enzim Retriksi Endonuklease ......………………………………………. 4
Elektroforesis Medan Berpulsa atau Pulsed-field Gel Electrophoresis
(PFGE).………………………................................................................... 5
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat ..……………………………………………………....... 6
Metode .……………………………………………………………......... 6
HASIL DAN PEMBAHASAN
Induksi Antibiotik....................................................................................... 7
Isolasi DNA Genom................................................................................... 7
Enzim Restriksi Sma I................................................................................ 8
Kondisi Optimal Elektroforesis.................................................................. 9
Analisis Hasil Elektroforesis...................................................................... 10
SIMPULAN DAN SARAN................................................................................... 12
DAFTAR PUSTAKA ...……………………………………………………....... 12
LAMPIRAN ......................................................................................................... 15
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Visualisasi Bacillus thuringiensis melalui mikroskop fase kontras .............. 1
2 Diagram skematik yang menunjukkan hubungan gen dengan struktur-
heliks ganda DNA dan sebuah kromosom...................................................... 2
3 Sebuah kromosom eukariot dalam keadaan terkondensasi............................. 3
4 Tipe pemotongan ”blunt end” dan tipe pemotongan ”sticky end” ................ 5
5 Hasil restriksi B. thuringiensis subsp. kurstaki dengan proses isolasi DNA
berbeda............................................................................................................ 8
6 Hasil restriksi 12 galur bakteri oleh Sma I pada tegangan 7,1 volt, 20 jam.... 9
7 Hasil restriksi 12 galur bakteri oleh Sma I pada tegangan 6 volt, 20 jam....... 9
8 Hasil restriksi 12 galur bakteri oleh Sma I pada tegangan 6 volt, 17 jam....... 9
9 Hasil elektroforesis galur-galur bakteri standar dan lokal yang tidak di
restriksi............................................................................................................ 11
10 Hasil elektroforesis galur-galur bakteri standar dan lokal yang direstriksi
dengan Sma I................................................................................................... 12
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Asal Isolat bakteri Bacillus thuringiensis yang digunakan............................ 16
2 Tahapan kerja analisis DNA Genom ............................................................ 17
3 Peremajaan bakteri pada media antibiotik………………………………... 18
4 Proses penyiapan DNA total …..………………………………………... 19
5 Proses fragmentasi DNA genom dengan enzim restriksi Sma I ................... 20
6 Proses elektroforesis dengan PFGE ............................................................. 20
PENDAHULUAN TINJAUAN PUSTAKA
Bakteri Bacillus thuringiensis (BT) sudah Bacillus thuringiensis
sejak lama dikenal sebagai bahan aktif paling Seorang ahli biologi dari Jepang, Shigetane
umum yang digunakan dalam pembuatan Ishiwatari pertama kali mengisolasi bakteri
pestisida hayati maupun sebagai sumber gen Bacillus thuringiensis (BT) pada tahun 1901
dalam proses rekayasa tanaman transgenik ketika menyelidiki penyebab penyakit sotto
tahan hama. B. thuringiensis memiliki yang membunuh sebagian besar populasi ulat
keistimewaan karena dapat mensintesis protein sutra. Sepuluh tahun kemudian, Ernst Berliner
δ-endotoksin yang spesifik terhadap serangga mengisolasi bakteri yang telah membunuh larva
dan nematoda. Jenis bakteri ini memiliki lebih Mediterranean flour moth pada tahun 1911 dan
dari 70 subspesies atau varietas yang berbeda, menemukan tipe bakteri yang sama dengan
yang dibedakan oleh perbedaan sifat serologi sebelumnya kemudian dinamakannya B.
dari antigen flagelanya, dan menghasilkan lebih thuringiensis (Gambar 1), mengambil nama
dari 300 tipe protein Cry. sebuah kota Jerman Thuringia tempat serangga
Studi genom di Indonesia masih jauh tersebut ditemukan. Ishiwatari telah menamakan
tertinggal dari negara-negara tetangga. Oleh bakteri ini B. sotto pada tahun 1901 namun
karena itu, karakterisasi dari organisasi nama itu kemudian dinyatakan tidak sah lagi.
keseluruhan genom bakteri ini dapat Pada tahun 1915, Berliner melaporkan
memberikan pendekatan yang baik untuk keberadaan kristal di dalam BT, namun aktivitas
mempelajari jenis-jenis, varietas, dan galur BT kristal ini belum diketahui hingga beberapa
lokal secara akurat dan memungkinkan tahun berikutnya.
pemberdayaan galur-galur lokal lebih lanjut. Tahun 1956, beberapa peneliti, Hannay,
Elektroforesis medan berpulsa atau dikenal Fitz-James dan Angus menemukan bahwa
sebagai Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) aktivitas antiserangga terhadap serangga dari
merupakan teknik paling baik untuk jenis Lepidoptera (ngengat) yang paling besar
mempelajari ukuran dan organisasi genom- adalah pada saat pembentukan parasporal kristal
genom bakteri. Proses identifikasi spesies yang mengandung δ-endotoksin. Penemuan ini
dicoba dengan menggunakan enzim pemotong menyebabkan munculnya ketertarikan terhadap
jarang yang diikuti oleh pemisahan fragmen- struktur kristal, reaksi biokimia dan aktivitas
fragmen menggunakan PFGE. Teknik ini telah kristal dari BT. Penelitian-penelitian baru
berhasil diterapkan pada penetapan galur-galur mengenai bakteri BT dimulai dengan cepat dan
virulen Pseudomonas sp. pesat sehingga penggunaan bakteri sebagai
Penelitian bertujuan untuk mengukur ukuran pestisida hayati mengalami peningkatan.
molekul DNA genom galur-galur bakteri Bakteri BT tergolong dalam bakteri Gram
Bacillus thuringiensis dan membandingkan pola positif yang terdapat di permukaan tanah. B.
restriksi yang dihasilkan untuk lebih memahami thuringiensis adalah bakteri berbentuk batang
hubungan filogenetik antara galur lokal yang berspora, bersifat anaerob, dan menghasilkan
diisolasi dari berbagai tempat di sekitar Bogor protein kristal selama masa sporulasi yang
dengan galur bakteri standar yang ada dalam bersifat toksik terhadap larva serangga serta
koleksi Puslit Bioteknologi LIPI. mempunyai suhu pertumbuhan minimum 10-15
o
Penggunaan PFGE dalam identifikasi semua C, suhu maksimum 40-45 oC dan suhu
molekul DNA dalam berbagai ukuran hasil optimum 28-30 oC.
pemotongan enzim restriksi lebih baik dari
teknik elektroforesis konvensional. Probabilitas
terdapatnya isolat-isolat lokal yang saling
identik cukup besar dan diharapkan terdapat
hubungan filogenetik yang erat dengan
beberapa galur standar yang tersedia.
Penelitian bermanfaat untuk menetapkan
kesamaan maupun perbedaan genotip BT hasil
pengucilan dari tanah di wilayah Bogor dengan
galu-galur standar yang telah diketahui
fenotipnya. Hal ini dilakukan untuk memastikan
bahwa isolat-isolat yang didapat memiliki
identitas. Sehingga pemberdayaan isolat-isolat
galur lokal sebagai salah satu kekayaan Gambar 1 Visualisasi Bacillus thuringiensis
mikrobial Indonesia dapat terwujud. melalui mikroskop fase kontras
11
Hingga 1977, hanya tiga belas galur bakteri tidak menyandi (non-coding) pada DNA. Istilah
ini yang telah dideskripsikan. Ketiga belas ini ditemukan pada tahun 1920 oleh Hans
subspesies hanya bersifat toksik kepada Winkler, seorang profesor botani dari
beberapa jenis spesies dari larva Lepidoptera. Universitas Hamburg, Jerman, sebagai sebuah
Tahun 1977 subspesies pertama yang bersifat penghubung kata gen dan kromosom
racun (toksik) terhadap spesies serangga Diptera (Lederberg J & McCray AT 2001). Secara
(lalat) ditemukan dan diikuti oleh penemuan lebih tepat genom dari sebuah organisme adalah
strain toksik pertama untuk spesies Coleoptera sebuah sekuen DNA lengkap dari satu set
(kumbang) pada tahun 1983. kromosom. Kebanyakan mahluk hidup yang
lebih kompleks dari virus terkadang atau selalu
Gen dan Genom membawa material genetik tambahan yang
Gen adalah sebuah segmen polinukleotida berada dalam kromosom-kromosom mereka.
yang mengandung informasi yang diperlukan Dalam beberapa konteks, seperti sekuensing
untuk sintesis satu rantai polipeptida. Gen dapat genom dari mikroba patogen, ”genom” berarti
di artikan sebagai unit-unit warisan. Gen-gen melibatkan material tambahan yang dibawa
tersebut mengandung bagian regulasi yang pada plasmid-plasmid. Sehingga pada keadaan
mengatur pada kondisi seperti apa produk dari seperti itu, maka genom dijelaskan sebagai
gen tersebut diproduksi, bagian-bagian semua gen dan DNA yang tidak mengkode yang
tertranskripsi yang mengatur struktur dari memiliki potensi untuk ada.
produk, dan/atau bagian-bagian sekuen Ukuran genom pada sebuah organisme
fungsional (Pearson H 2006). Gen-gen tergantung pada kerumitan organisme tersebut,
berinteraksi satu sama lain untuk mempengaruhi prokariot seperti bakteri dan arkea secara umum
perkembangan fisik dan tingkah laku. Gen memiliki genom yang lebih kecil, baik pada
terdiri dari sebuah pita panjang DNA (RNA pasangan basanya maupun jumlah gennya, dari
pada beberapa virus) yang mengandung sebuah sebuah sel eukariot. Namun demikian, genom
promotor, pengkontrol aktivitas gen-gen, dan terbesar yang diketahui merupakan sebuah sel
sebuah sekuen penyandi, yang menentukan mikroba Amoeba dubia, dengan lebih dari 6
produk dari gen tersebut. Sekuen penyandi akan milyar pasang basa (Cavalier-Smith T 1985).
digandakan saat gen pada keadaan aktif dalam Densitas dari gen pada sebuah genom diukur
sebuah proses yang disebut transkripsi, dari jumlah gen per sejuta pasang basa (disebut
menghasilkan RNA yang mengandung sebagai megabase, Mb); genom prokariot
informasi dari gen tersebut. RNA tersebut memiliki densitas gen lebih tinggi dari eukariot.
kemudian mengarahkan proses sintesis protein Ilmu yang mempelajari keseluruhan genom
via kode genetik. RNA juga dapat digunakan dari suatu organisme dikenal dengan istilah
secara langsung, misalnya sebagai bagian dari genomik. Genomik dapat dikatakan telah
ribosom. Molekul-molekul yang dihasilkan dari muncul sejak tahun 1980-an dan baru
proses ekspresi gen, RNA atau protein, dikenal menghasilkan pada tahun 1990-an bersamaan
sebagai produk gen. dengan munculnya Proyek Genom .
Kebanyakan gen mengandung daerah non-
coding yang tidak menyandi produk-produk
gen, namun meregulasi proses ekspresi gen.
Gen dari organisme eukariot (Gambar 2) dapat
mengandung daerah non-coding yang disebut
intron, yang akan dihilangkan dari mRNA
melalui sebuah proses yang dikenal sebagai
splicing (penggabungan). Bagian yang
sesungguhnya menyandi produk gen dikenal
sebagai ekson. Sepotong gen dapat
menyebabkan sintesis beberapa protein melalui
pengaturan yang berbeda dari ekson-ekson oleh
proses penggabungan alternatif.
Total dari keseluruhan gen pada sebuah
organisme atau sel dikenal sebagai genom.
Dalam biologi genom dari sebuah organisme
adalah keseluruhan informasi turunan yang Gambar 2 Diagram skematik menunjukkan
dimilikinya dan disandikan dalam DNA (atau hubungan gen dengan struktur
RNA pada beberapa virus). Keseluruhan genom heliks ganda DNA dan sebuah
ini termasuk gen-gen dan sekuen-sekuen yang kromosom eukariot.
12
Kromosom
Kromosom adalah sebuah makromolekul
besar DNA, dan membangun bentuk fisik
terorganisasi dari DNA di dalam sel. Kromosom
merupakan bagian DNA (satu molekul DNA)
yang kontinyu dan sangat panjang, yang
mengandung banyak gen, elemen-elemen
regulator, dan sekuen-sekuen nukleotida lain
yang terkait. Definisi kromosom lebih luasnya
juga termasuk protein-protein pengikat DNA
yang bekerja untuk mengatur dan melindungi
DNA. Kata kromosom sendiri berasal dari Gambar 3 Sebuah kromosom eukariot dalam
Yunani yaitu χρῶμα (chroma, warna) dan σῶμα keadaan terkondensasi.
(soma, tubuh) karena kemampuannya untuk
dapat dengan kuat diwarnai oleh pewarna vital DNA Sebagai Materi Genetik
dan supravital. Materi genetik mahluk hidup terletak pada
Kromosom sangat bermacam-macam pada kromosom. Kromosom tersusun atas dua tipe
organisme-organisme yang berbeda. Molekul molekul besar, yaitu protein dan asam nukleat.
DNA yang dimiliki dapat berbentuk melingkar Asam nukleat adalah molekul pembina
(circular) atau lurus (linear), dan dapat kehidupan yang terdiri dari DNA (Deoxyribosa
mengandung berapapun dari puluhan kilo Nucleic Acid) dan RNA (Ribonucleic Acid).
pasang basa hingga ratusan mega pasang basa. DNA merupakan unit struktural gen dan
Pada kebanyakan eukariot, sel memiliki terdapat di dalam inti sel. Gen merupakan utas
kromosom-kromosom besar yang linear dan sel molekul DNA yang membawa sandi untuk
prokariot memiliki kromosom melingkar yang pembentukan satu molekul protein. Keseluruhan
lebih kecil, walaupun banyak sekali gen-gen dalam suatu organisme disebut juga
pengecualian pada aturan ini. Sel-sel dapat sebagai genom. DNA merupakan gudang
memiliki lebih dari satu tipe kromosom; sebagai informasi dari suatu mahluk hidup dan
contoh mitokondria pada kebanyakan eukariot informasi-informasi ini akan diturunkan oleh
dan kloroplast pada tanaman juga memiliki mahluk hidup tersebut dari satu generasi ke
kromosom sendiri sebagai tambahan dari generasi berikutnya dan akan terus diturunkan
kromosom inti sel eukariot (Gambar 3). pada generasi selanjutnya.
Kromosom pada prokariot (Bakteri) DNA dan RNA terbentuk dari bersatunya
biasanya berupa sebuah rantai DNA tunggal beberapa monomer nukleotida. Nukeotida
berbentuk melingkar dan tidak terikat dengan sendiri merupakan ester dari nukleosida dengan
protein sepertihalnya pada eukariot, tapi banyak asam fosfat. Neukleosida merupakan suatu N-
variasi yang ada. DNA bakteri juga hadir glikosida (dalam bentuk ribosa ataupun
sebagai plasmid-plasmid, miniatur kromosom, deoksiribosa) dan basa purin maupun pirimidin.
yang berupa DNA melingkar kecil dan siap Watson dan Crick pada tahun 1953
berpindah diantara bakteri. Perbedaan antara mengemukakan struktur tiga dimensi dari DNA
plasmid dan kromosom masih kurang yaitu berupa rantai heliks ganda. Ciri utama
dijelaskan, walaupun ukuran dan tingkat model DNA menurut Watson dan Crick yaitu,
kebutuhan penggunaan keduanya telah DNA terdiri dari dua untai polinukleotida yang
diperhitungkan. Kromosom prokariot pada berpilin untuk menghasilkan bentuk heliks
umumnya memiliki sebuah titik awal dimana ganda dua, kemudian kedua untaian DNA
replikasi berawal, titik ini disebut sebagai titik tersebut memiliki arah yang berlawanan (5' - 3'
ori ( origin of replication ). Gen-gen pada dengan 3' - 5'), lalu DNA juga memiliki tulang
prokariot terorganisasi dalam operon-operon punggung gula-fosfat dengan ikatan fosfodiester
dan tidak mengandung intron seperti pada dan pada bagian tengahnya terdapat pasangan-
eukariot. Kromosom bakteri sepertinya terikat pasangan basa A-T dan C-G yang terikat oleh
pada membran plasma dari bakteri. Dalam ikatan hidrogen, dupleks DNA berdiameter 20
aplikasi biologi molekuler, kromosom dapat Ao dan pasangan basa tersusun pada jarak 3,4 o
diisolasi dengan sentrifugasi bakteri yang lisis. antara satu dengan lainnya, serta yang terakhir
13
satu putaran heliks berjarak 34 Ao dan prosedur-prosedur rekayasa genetik dan biologi
mengandung 10 basa. molekuler bergantung pada kemampuan enzim-
Bakteri memiliki keistimewaan karena enzim restriksi. Istilah dari restriction sendiri
memiliki DNA tidak hanya di kromosom berasal dari fakta bahwa enzim ini pertama kali
namun juga terdapat pada plasmid yang umum ditemukan pada strain E. coli yang tampaknya
disebut sebagai minikromosom. Satu sel bakteri berfungsi membatasi (restricting) infeksi oleh
Bacillus thuringiensis dapat memiliki 1-12 bakteriofage tertentu sehingga enzim restriksi
plasmid dan diantaranya berukuran 30-70 MDa dipercaya sebagai suatu mekanisme pertahanan
yang membawa gen cry (Gonzales & Carlton diri hasil evolusi pada bakteri untuk bertahan
1980). Jumlah plasmid tiap bakteri berbeda- dari serangan virus dan untuk membantu
beda, bergantung pada jenis subspesies dan menghilangkan sekuen DNA atau RNA dari
galurnya. virus yang menempel.
Enzim restriksi tidak memotong DNA
Analisis Total DNA Genom secara acak, namun hanya memotong segmen
Schizotyping DNA genom merupakan salah heliks ganda yang mengandung sekuen
satu cara yang dapat digunakan untuk nukleotida tertentu, dan hanya akan melakukan
mempelajari keragaman genetika. Schizotyping pemotongan diantara sekuen tersebut
adalah analisis profil DNA genom total (recognition sequence, sekuen pengenalan)
berdasarkan pola pita DNA yang dihasilkan selalu dengan cara yang sama. Beberapa enzim
setelah DNA genom utuh dipotong dengan melakukan pemotongan untai segera menuju
enzim restriksi yang memotong dengan jarak bagian berlawanan dari untai dihadapannya,
situs pemotongan tidak berdekatan (rare-cutting membentuk “blunt end” atau ujung tumpul
endonuclease) dan dipisahkan dengan fragmen DNA. Kebanyakan enzim membuat
elektroforesis gel medan berpulsa. Keuntungan pemotongan yang sedikit menjorok ke dalam,
teknik ini ialah cara pengerjaannya yang relatif menghasilkan “sticky ends” atau ujung lengket,
mudah dan sangat akurat karena pita-pita DNA modus pemotongan fragmen DNA “blunt end”
yang dihasilkan membentuk pola yang khas dan dilakukan oleh enzim restriksi endonuklease
unik sehingga merupakan schizotype, yaitu Sma I (Gambar 4).
suatu bentuk sidik jari dari DNA organisme Enzim restriksi diklasifikasikan menjadi
yang bersangkutan (Suwanto et al. 1995). empat tipe secara biokimia, yaitu tipe I, tipe II,
Metode schizotyping terdiri atas tiga tahapan tipe III, dan tipe IV. Sistem tipe I dan III, pada
yaitu isolasi DNA genom utuh dalam matriks sistem ini aktivitas metilase dan restriksi
agarosa, pemotongan DNA genom utuh dengan dilakukan oleh sebuah kompleks besar enzim.
enzim restriksi endonuklease dalam matriks Walaupun enzim ini mengenali sekuen-sekuen
agarosa dan pemisahan molekul DNA dengan DNA spesifik, namun situs pemotongan yang
elektroforesis sehingga menghasilkan pita-pita sebenarnya berada pada jarak yang bervariasi
DNA yang jelas setelah pewarnaan dengan dari situs-situs pengenalan (recognition sites),
ethidium bromida dan diamati di bawah sinar dan bisa berjarak ratusan basa. Keduanya butuh
UV. Pemisahan yang dilakukan pada tahap ATP untuk menjalankan fungsi pemotongan.
akhir dengan elektroforesis pada medan Sistem tipe II, pada sistem ini enzim restriksi
berpulsa menurut Suwanto (1994) akan berada terpisah dari metilase, dan pemotongan
memberikan gambaran profil DNA yang terjadi pada situs yang sangat spesifik yang
menyeluruh, menampilkan peta fisik genom dan terdapat di dalam atau dekat dari sekuen
hasil elektroforesis dapat langsung dianalisis. pengenalan. Kebanyakan dari enzim restriksi
yang diketahui adalah tipe II, dan enzim tipe ini
Enzim Restriksi Endonuklease yang paling banyak kegunaannya sebagai
Enzim restriksi (atau restriksi endonuklease) pembantu kegiatan laboratorium sedangkan
adalah enzim yang dapat memotong utas ganda untuk sistem tipe IV, diklasifikasikan bagi
DNA pada daerah sekuen khusus yang khas. enzim restriksi yang mempunyai target hanya
Enzim ini membuat dua bukaan, satu ke setiap DNA termetilasi.
tulang punggung fosfat dari heliks ganda tanpa Enzim restriksi dinamai berdasarkan bakteri
merusak basanya. Ikatan kimia yang dibuka asalnya, tempat enzim tersebut diisolasi dengan
oleh enzim restriksi endonuklease dapat ketentuan sebagai berikut, sebagai contoh EcoR
dibentuk kembali oleh enzim lain yang dikenal I berdasarkan E, Escherichia untuk genusnya,
sebagai enzim ligase, sehingga fragmen restriksi co, coli untuk speciesnya, R dari RY13 untuk
DNA yang didapat dari kromosom atau gen lain strainnya dan I yang berarti pertama kali
dapat digabungkan bersama jika ujung-ujung diidentifikasi untuk keterangan urutan
untainya saling komplementer. Kebanyakan dari penemuan enzim dalam bakteri tersebut.
14
keterkaitan harus digunakan sebagai petunjuk kemudian pelet ditambahkan dengan 0,5 mL
dan bukan ukuran filogenetik sesungguhnya. PIV 0,5 M, divorteks dan diinkubasi pada 37
o
C. Selanjutnya suspensi pelet ditambahkan 0,5
mL larutan agarosa 0,8 % dalam 0,5 M PIV.
BAHAN DAN METODE Campuran agarosa dan biakan dicetak pada
cetakan balok agarosa (Bio-Rad, Richmond,
Bahan dan Alat Calif) menggunakan syringe, cetakan kemudian
Mikroorganisme yang digunakan adalah dibiarkan membeku membentuk blok gel
berbagai galur bakteri Bacillus thuringensis. agarosa (250 µL/blok).
Bahan-bahan kimia yang digunakan adalah agar Blok gel yang telah beku dikeluarkan dan
(Sigma), agarosa (Sep RateTM-DNA, dimasukkan ke dalam erlenmeyer yang berisi 5
Amersham), asam borat (Merck), BSA mL larutan pelisis (6 mM Tris HCl pH 7,5;
(Biolabs), bufer EC, bufer ESP, bufer restriksi, 1mM NaCl; 100 mM EDTA pH 7,5; 0,5% Brij-
bufer TBE 0,5X, enzim restriksi Sma I 58; 0,22% deoxycholate; 0,5% sarkosyl; 2
(Biolabs), mid range PFG marker (New mg/mL lisozim dan 20 µg/mL RNA-ase) dan
England Biolabs), dan Yeast Chromosomes, dinkubasi semalam pada suhu 37 oC, kemudian
Saccharomyces cereviseae, Strain YNN295, blok gel dicuci 2 kali dengan 10 mL larutan
EDTA, ethidium bromida, larutan BSA, larutan TE10/1 (10 mM Tris.HCl pH 8,0 dan 1 mM
PIV, lisozim (Nacolai Tesque-Japan), media EDTA), lalu gel direndam pada 5 mL larutan
sintetik Luria Bertani, PMSF 1,5 mM, deproteinase (100 mM EDTA pH 9,5; 0,5%
Proteinase-K (Boehringer Mannheim), RNA- sarkosyl dan 200 µg/mL proteinae-K) dishaker
ase (Boehringer Mannheim), T10E1, dan T10E100. pada inkubator shaker selama 48-72 jam pada
Alat-alat yang digunakan adalah tabung suhu 55 oC dan 60 rpm. Blok agar kemudian di
reaksi, labu takar, gelas piala, labu erlenmeyer, cuci dengan T10E100 dan larutan PMSF 1 mM
cawan petri, botol Schott, autoklaf, cetakan dan diinkubasi selama 1 jam pada temperatur
Agarosa (Bio-Rad), Inkubator statis (Heraeus, ruang. Gel kemudian dicuci 2 kali dengan
Germany), inkubator shaker (series 25, New larutan T10E1, gel lalu dimasukkan ke dalam
Jersey-USA), kamera digital, lampu spritus, mikrotube yang berisi 1 mL larutan penyimpan
mikropipet, microtube, microwave (National (EDTA 0,5 M, pH 8,0) dan disimpan pada 4 oC.
NN-9835, Osaka-Japan), neraca analitik, ose,
parafilm, penangas air (Cambridge-England), Fragmentasi Molekul DNA dengan Enzim
pH meter, pinset, pipet volumetrik, pisau Retriksi Endonuklease
scapel, sarung tangan, CHEF-DR® III Pulse Enzim restriksi yang digunakan adalah Sma
Field Electrophoresis System (Bio-Rad), I, sepertiga blok gel dipotong tipis dan dicuci
biofuge dengan rotor tetap #3324 dan r sebesar dua kali dengan TE10/1 selama 30 menit
5,55 cm (fresco, Haraeus Germany), syringe kemudian dimasukkan ke dalam mikrotube
(Terumo, Tokyo-Japan), spektrofotometer, yang berisi 200 µl bufer restriksi lalu dibiarkan
sudip, UV Transilluminator, Vaccum selama 2 jam pada suhu 25 oC. Blok agar
Milliphore (Nalgene), dan kertas Miliphore 0,22 kemudian dimasukkan kedalam bufer restriksi
µm (Nalgene). baru yang telah tersedia dengan enzim 10 s.d.
20 unit Sma I lalu diinkubasi pada suhu 25 oC
Metode selama satu malam. Kemudian blok agar di cuci
T10E1 sebelum elektroforesis.
Kondisi Kultur dan Galur Bakteri
Galur bakteri yang digunakan pada Elektroforesis pada Medan Berpulsa
penelitian ini terdiri dari isolat lokal dan galur Elektroforesis dilakukan menggunakan
standar (Lampiran 1). Bakteri ditumbuhkan sistem Bio-Rad CHEF-DRII. Untuk running
secara aerob pada media Luria Bertani cair gel, digunakan agarosa dengan konsentrasi 1%
dengan antibiotik pada suhu 37oC hingga (w/v). Potongan-potongan blok gel dimasukkan
dicapai nilai OD 0,4-0,6 pada λ 610 nm. ke dalam sumur-sumur running gel dan ditutup
dengan 0,5% agarosa. Running gel selanjutnya
Penyiapan DNA pada Blok Agarosa dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis yang
Sebanyak 1,5 mL suspensi bakteri telah diisi dengan bufer TBE 0,5x untuk
dipindahkan ke dalam mikrotube lalu dilakukan proses elektroforesis dengan alat
disentrifugasi selama 10 menit pada suhu 4 oC PFGE pada suhu 14 oC, waktu pulsa 5 detik,
dan 7000 rpm. Supernatan dibuang, sedangkan tegangan listrik 6 Volt/cm, dan voltase sebesar
pelet dicuci dengan 1,5 mL larutan PIV (10 mM 180 Volt selama 24 jam. Marker yang
Tris.HCl pH7,5 dan 1 M NaCl) tiga kali, digunakan ialah mid range PFG marker, dan
16
Uji coba ketiga menghasilkan pita yang genom yang lebih besar dari seharusnya
berada di area tengah matriks gel agaros (Beverley & Cantor 1988).
sehingga memudahkan proses analisis. Pada Hasil elektroforesis dari proses restriksi
umumnya peningkatan waktu pulsa akan yang dilakukan pada penelitian ini tidak dapat
meningkatkan pemisahan DNA di bawah 1 Mb. dianalisis seperti yang dikehendaki. Namun ada
Namun DNA yang berukuran 1 Mb ke atas akan beberapa hal yang masih dapat menjadi bahan
mengalami smear pada saat di-running dengan pembahasan pada penelitian ini. Hasil restriksi
waktu pulsa yang tinggi. oleh enzim Sma I memberikan pita smear yang
Elektroforesis dilakukan pada kondisi suhu tidak dapat diketahui ukurannya secara tepat
yang sama yaitu 14 oC, pada suhu ini saat dibandingkan dengan marker kromosom S.
diharapkan menginaktifasi kerja enzim-enzim cerevisiae dan mid range PFG marker, sehingga
pada DNA. Suhu juga memiliki pengaruh yang hampir tidak mungkin untuk menentukkan nilai
sama pada semua sistem elektroforesis, total genom DNA yang diinginkan. Walaupun
peningkatan suhu juga diikuti dengan kenaikan demikian hasil elektroforesis ini dapat
mobilitas DNA dalam sistem, oleh karena itu memberikan kisaran ukuran genom DNA yang
sangat penting untuk menjaga suhu dalam sitem telah diujikan dan masih dapat menunjukkan
elektroforesis tetap atau konstan (Cantor 1988). adanya proses restriksi yang berbeda pada DNA
BT yang berbeda. Kedua hal tersebut dapat
Analisis Hasil Elektroforesis memberikan sedikit petunjuk adanya perbedaan
Ukuran DNA genom total dari PFGE dapat ataupun kemiripan antara isolat-isolat BT lokal
diketahui dengan mengukur panjang setiap dan pembandingnya yaitu galur-galur BT
potongan DNA hasil elektrforesis dengan standar.
membandingkan pada marker yang di gunakan Elektroforesis di bagi menjadi dua bagian
yaitu Midrange PFG marker dan Yeast yaitu yang pertama merupakan elektroforesis
chromosomes marker sebagai standar ukuran DNA isolat-isolat lokal maupun galur-galur
DNA yang digunakan, kemudian panjang setiap standar tanpa proses restriksi oleh enzim Sma I
pita DNA hasil elektroforesis tersebut dan elektroforesis isolat-isolat lokal dan galur-
dijumlahkan sehingga didapat nilai keseluruhan. galur standar dengan melakukan proses restriksi
Setiap potongan yang dihasilkan oleh restriksi oleh enzim Sma I terlebih dahulu. Dari hasil
enzim yang berbeda pada DNA genom yang elektroforesis dapat dapat dilihat bahwa proses
sama akan memberikan nilai total yang kurang restriksi yang dilakukan oleh enzim Sma I tidak
lebih sama. Sehingga terkadang digunakan sempurna sehingga yang dihasilkan adalah pita
beberapa enzim yang berbeda untuk mengetahui yang smear.
nilai total genom yang lebih baik. Gambar 9A menunjukkan hasil
Tanskanen et al. Menyebutkan bahwa ada elektroforesis dari 12 galur standar yang tidak
beberapa kemungkinan yang bisa menjadi direstriksi oleh enzim Sma I. Hasil
sumber kesalahan dalam penentuan ukuran elektroforesis menunjukkan bahwa pita-pita
genom dari hasil fragmen DNA yang DNA kedua belas galur standar berada pada
dielektroforesis. Pertama, kesalahan yang kisaran nilai 1800- 2500 kbp (kilobase pair).
terjadi dalam mengukur ukuran fragmen DNA Hal yang sama juga ditunjukkan pada gambar
dari pergerakannya dalam gel dengan 9B, yaitu hasil elektroforesis dari DNA galur
membandingkan pada pergerakan standar BT lokal yang tidak mengalami perlakuan
ukuran molekuler. Kedua, fragmen DNA yang restriksi oleh enzim Sma I. Pita-pita isolat-isolat
berukuran lebih kecil dari 8 kbp seringkali tidak lokal tersebut juga berada pada kisaran yang
terdeteksi setelah proses PFGE, namun sumber hampir sama dengan galur-galur standar kecuali
kesalahn kedua ini masih bisa diabaikan karena pada DNA nomer 15 yaitu isolat 3n yang
tidak mempengaruhi nilai total genom secara menghasilkan pita berada pada 1100 kbp (Tabel
signifikan. Ketiga, kesalahan yang disebabkan 2). Namun nilai yang didapatkan tanpa proses
oleh kehadiran plasmid yang tidak memiliki pemotongan ini tidak akurat sehingga tidak
situs pemotongan Sma I, karena mobilitas dapat dijadikan sebagai acuan nilai total genom
plasmid yang tidak terestriksi berbeda dengan DNA dari bakteri BT. Gunderson dan Chu
mobilitas molekul DNA linear yang memiliki melaporkan bahwa hambatan utama dalam
ukuran molekul yang sama. Biasanya sebuah memisahkan DNA berukuran besar adalah
plasmid sirkular terbuka tidak meninggalkan adanya proses entrapment (penjebakan) dalam
sumur setelah elektroforesis (Beverley SM satu bentuk maupun bentuk lain. Fenomena ini
1988), namun kehadiran lebih dari satu plasmid semakin signifikan saat ukuran DNA yang
yang bergerak dengan pergerakan yang berbeda dipisahkan jauh lebih besar dari karakter
dapat menyebabkan penghitungan ukuran dimensi yang diciptakan oleh matriks gel.
20
A B
Gambar 9 Hasil elektroforesis galur standar dan lokal pada kondisi: 1% MP agaros, 0.5 X larutan
penyangga TBE, suhu 14 oC, waktu pulsa (Pt) 1-20 detik, waktu running (RT) 17 jam,
tegangan sebesar 6 volt/cm, menggunakan marker Saccharomyces cerevisiae (M Sc) dan
Mid range PFG marker (M Mid). (A) galur-galur standar tidak direstriksi. (B) galur-galur
lokal tanpa melalui proses restriksi. Nomor urut bakteri-bakteri sesuai dengan nomor urut
pada tabel.
Bentuk pertama penjebakan terjadi di dari jenis yang sama. Masih banyak hal yang
sumur-sumur tempat DNA dimasukkan dan dapat dioptimalkan dari penelitian ini, masih
terjadi saat kekuatan medannya terlalu besar. banyak yang bisa diperbaiki, namun peneliti
Hambatan ini dapat diperkecil dengan yakin bahwa analisis genom total merupakan
melakukan prerun dengan menggunakan waktu metode yang sangat tepat untuk menganalisis
pulsa yang lebih pendek maupun dengan kekerabatan antar spesies.
menggunakan medan berkekuatan rendah.
Bentuk kedua dari penjebakan terjadi setelah Tabel 2 Perkiraan ukuran pita DNA yang
DNA masuk kedalam matriks gel agaros. belum direstriksi
Kenaikan lebih lanjut dari kekuatan medan Ukuran
pertama-tama akan menyebabkan DNA No. B. thuringiensis
pita (Kb)
membentuk pita smear, diikuti dengan DNA
yang bergerak sangat pelan dari tiap pitanya, 1. daendrolinus HD-7 2250
hingga kegagalan total untuk bermigrasi. 2. kurstaki 2200
Sedangkan pada gambar 10A dan 10 B 3. entomocidus HD-973 2350
dapat dilihat hasil elektroforesis dari galur-galur 4. aizawai HD-137 1750
standar maupun dari isolat-isolat lokal yang 5. tolworthi HD-537 1800
telah mengalami proses restriksi oleh enzim 6. darmstadiensis T 495 2450
7. dakota HD-511 2455
Sma I. Pita-pita yang dihasilkan tidak dapat
dianalisis lebih dalam karena berbentuk pita 8. israeliensis HD-500 2550
smear, sehingga tidak dapat diketahui secara 9. finitimus HD-3 2500
10. entomocidus HD 937 2455
pasti ukuran dan pola pemotongan dari enzim
11. aizawai san 415-2 1900
restriksi Sma I terhadap DNA tiap isolat dan
12. kurstaki HD-1 s 1855
galur yang diisolasi. Tidak terdapatnya pola
potongan pita dan ukuran genom dari isolat 13. Isolat 3a 2200
maupun standar yang digunakan menyebabkan 14. Isolat 3l 2500
proses analisis kekerabatan antar isolat dan 15. Isolat 3n 1100
galur tidak mungkin dilakukan. Namun 16. Isolat 4q 2350
demikian hasil pemotongan oleh enzim restriksi 17. Isolat 5k 2455
18. Isolat 6c 2550
Sma I ini secara kasat mata memberikan profil
yang berbeda untuk tiap DNA yang berbeda 19. Isolat 6l 2600
yang dapat menjadi sebuah awal pembuktian 20. Isolat 7e 2600
bahwa isolat-isolat yang diujikan bukan berasal 21. Isolat Dd 2550
21
A B
Gambar 10 Hasil elektroforesis galur standar dan galur lokal pada kondisi: 1% MP agaros, 0.5 X
larutan penyangga TBE, suhu 14 oC, waktu pulsa (Pt) 1-20 detik, waktu running (RT) 17
jam, tegangan sebesar 6 volt/cm, menggunakan marker S. cerevisiae (M Sc) dan Mid
range PFG marker (M Mid). (A) galur-galur standar yang telah di restriksi Sma I. (B)
galur-galur lokal direstriksi dengan menggunakan enzim Sma I. Nomor urut bakteri
sesuai dengan nomor urut pada tabel.
size. pada Cavalier-Smith T, ed. The Matthew et al. 1988. High resolution and
Evolution of Genome Size. Chichester: John accurate size determination in PFGE of
Wiley. DNA. Biochemistry 27: 9210-9226.
Chu G, Gunderson. 1989. Pulsed field Pearson H. 2006. "Genetics: what is a gene?".
electrophoresis in contour-clamped Nature 441 (7092): 398-401.
homogeneous electric fields for the
resolution of DNA by size or topology. Sambrook J et al. 1989. Molecular Cloning: A
Electrophoresis 10: 290-295. Laboratory Manual, Ed ke-3. New York:
Cold-Spring Harbor Laboratory Press.
Colton, L., Clark JB. 2001. Comparison of
DNA isolation methods and storage Shaheduzzaman SM, Akimoto S, Kuwuhara T,
conditions for successful amplification of Kinouchi T, Ohnishi Y. 2000. Genome
Drosophila genes using PCR. Dros Inf Ser analysis of Bacteroides by pulsed field gel
84: 180-182. electrophoresis : chromosome sizes and
restrictrion petterns. DNA research 4: 19-
Deacon J. 2000. Microbial World: Bacillus 25.
thuringiensis. Edinburgh: Institute of Cell
and Molecular Biology. Skov MN, Pedersen K, Larsen JL. 1995.
Comparison of pulsed-field gel
Glare TR, M O'Callaghan. 2006. Bacillus electrophoresis, ribotyping, and plasmid
thuringiensis: animal safety.[terhubung profiling for typing Vibrio anguillarum
berkala]. http://www.bt.ucsd.edu/bt_safety. serovar O1. J Bacteriol 61: 1540-1545.
html [25 sep 2006].
Smith CL, Condemine G. 1990. Mini review:
Glare TR, M O'Callaghan. 2006. Bacillus new approach for physical mapping of
thuringiensis: history of Bt.[terhubung small genome. J Bacteriol 172: 1167-1172.
berkala]. http://www.bt.ucsd.edu/bt_history
.html [25 sep 2006]. Suwanto A, Rosana L, Budi T, Edi G. 1995.
Analisis DNA genom Xanthomonas
Gunderson K, Chu G. 1991. Pulsed-field campestris menggunakan pulsed field gel
electrophoresis of mega base-sized DNA. electrophoresis. [thesis] Bogor: Pusat Antar
Mol. Cell. Biol 11: 3348-3354. Universitas Bioteknologi, Institut Pertanian
Bogor.
LAMPIRAN
25
Resistensi
No. B. thuringiensis Asal
Antibiotik
1. daendrolinus HD-7 Ap National Center for Agricultural
Utilization Reasearch
2. kurstaki Ap American Type Culture Collection, USA
3. entomocidus HD- Ap, Tc National Center for Agricultural
973 Utilization Reasearch
4. aizawai HD-137 Ap National Center for Agricultural
Utilization Reasearch
5. tolworthi HD-537 Ap National Center for Agricultural
Utilization Reasearch
6. darmstadiensis T Ap Thailand Institute for Science and
495 Technology, Bangkok
7. dakota HD-511 Ap National Center for Agricultural
Utilization Reasearch
8. israeliensis HD-500 Ap, Sm Lausanne University
9. finitimus HD-3 Ap National Center for Agricultural
Utilization Reasearch
10. entomocidus HD Ap National Center for Agricultural
937 Utilization Reasearch
11. aizawai san 415-2 Ap Lausanne University
12. kurstaki HD-1 s Ap Thailand Institute for Science and
Technology, Bangkok
13. Isolat 3a Ap Tanah rerumputan-Cibining, Bogor
14. Isolat 3l Ap, Tc Tanah rerumputan-Cibinong, Bogor
15. Isolat 3n Ap, Tc Tanah rerumputan-Cibinong, Bogor
16. Isolat 4q Ap Tanah di bawah pohon jambu-Cibinong,
Bogor
17. Isolat 5k Ap Tanah di bawah pohon jambu-Cibinong,
Bogor
18. Isolat 6c Ap Lumpur air selokan-Cibinong, Bogor
19. Isolat 6l Ap Lumpur air selokan-Cibinong, Bogor
20. Isolat 7e Ap Bangkai larva-Cibinong, Bogor
21. Isolat Dd Ap Tanah pinggir jalan-Pamijahan, Bogor
26
Peremajaan Bakteri
Analisis Data
27
Dengan antibiotik
Dengan antibiotik
28
5 ml
29