AMOSTRAS FECAIS

Exame macroscópico

As amostras de fezes não preservadas devem ser examinadas macroscopicamente

para determinar a consistência, o odor, a cor, a presença ou ausência de sangue,
de muco, de proglotes e de vermes adultos ou outras condições anormais.
Consequentemente, o exame macroscópico deve sempre anteceder o exame
microscópico. O material fecal varia quanto a sua consistência, e geralmente é
classificado em fezes formadas, semiformadas, pastosas ou líquidas diarreicas.

Os trofozoítas são usualmente encontrados nas fezes líquidas, nas pastosas ou nas
mucosanguinolentas, enquanto que os cistos são diagnosticados nas fezes
formadas ou semiformadas. Ovos e larvas de helmintos podem estar presentes em
todos os tipos de amostras fecais; entretanto, eles podem ser mais dificilmente
encontrados em espécimes líquidos e, se presentes, em pequeno número. As
formas móveis de protozoários se degeneram mais rapidamente do que as formas
císticas; por esta razão, é de extrema importância que o estudo de espécimes
fecais seja realizado o mais rápido possível. A consistência das fezes não interfere
na distribuição dos ovos e das larvas de helmintos, apesar de nas amostras líquidas
haver uma distribuição relativa do número de ovos, devido ao fator de diluição. As
fezes devem ser distribuídas no laboratório quanto a sua consistência. O material
fecal líquido ou pastoso deve ser examinado primeiro, sendo seguido pelos
espécimes semiformados e formados. Registrar a presença de sangue e muco nas
amostras fecais, os quais podem indicar manifestações patológicas do trato
gastrointestinal. O sangue oculto nas fezes pode estar relacionado com uma
infecção parasitária, ou ser um resultado de outras condições anormais (FIG. 1).

A ingestão de diferentes produtos químicos, medicamentos ou alimentos pode

atribuir às fezes colorações variadas. O exame macroscópico pode ser realizado
pela simples observação ou pela tamização, as quais, em muitos casos, são
suficientes para estabelecer um diagnóstico final.

Simples Observação

Examinar e revolver todo o material fecal com bastão de vidro. Anotar todas as
características observadas e coletar os vermes adultos ou proglótides de tênias
dejetadas.
FiG 1. Distribuição de cistos e trofozoitas em relação à consistência do material
fecal.

Tamisação

Emulsionar as fezes com água. Coar a emulsão através de peneira metálica. Este
procedimento deve ser realizado em uma pia, servindo-se de um jato de água
corrente. Vermes adultos como o Ascaris lumbricoides e Enterobius vermicularis são
encontrados frequentemente misturados ou na superfície das fezes, como também
as proglótides de tenias. Outros helmintos como o Trichiuris trichiura,
ancilostomídeos e Hyminolepis nana são depositados no bolo fecal após o início do
tratamento. Frequentemente poderão ser encontrados helmintos adultos nas
amostras fecais e ausência dos ovos. Esses processos macroscópicos são
vantajosos para a demonstração e coleta de pequenos helmintos, de proglotes e de
escólices.

Identificação de Proglótides de Taenia

Dois métodos são indicados para a identificação de proglótes de Taenia: o àcido

acético e o de CAMPOS (AMATO NETO & CORREA, 1980).

Método do Ácido Acético Glacial:

1. Colocar em uma placa de Petri, contendo ácido acético glacial, a proglote a

ser identificada, durante 15 a 20 minutos.

2. Após o período, comprimi-la entre lâminas.

3. Examinar sob iluminação intensa.

Método de CAMPOS:

1. Dissolver três comprimidos de metoquina em 5 ml de água destilada-

deionizada.

2. Mergulhar nesta solução, durante 15 minutos, a proglote a ser identificada.

3. Após este período, comprimi-la entre lâminas.

4. Examinar sob iluminação intensa.

Exame Microscópico

O exame de esfregaço a fresco pelos métodos diretos é o método mais fácil e,

talvez, o mais usado na rotina do laboratório, permitindo visualizar os estágios de
diagnóstico dos protozoários (trofozoítas e cistos) e dos helmintos (ovos, larvas e
pequenos adultos). Para uma diagnose absoluta é necessário observar o parasita
em um de seus estágios de evolução. O simples exame microscópico é, em muitos
casos, suficientemente para o diagnóstico. Entretanto, para a obtenção de melhores
resultados será necessário o uso de técnicas de concentração, ou seja, processos
mecânicos e/ou biológicos.

Exame Direto a Fresco

O exame direto a fresco é um procedimento simples e eficiente para o estudo das

fezes, permitindo observar as formas trofozoíticas vivas dos protozoários. Este
procedimento coprológico jamais deve ser omitido. As preparações a fresco são
obtidas diretamente dos espécimes fecais e requerem o mínimo de material (2 mg)
para cada método de exame . Todos os estágios de diagnóstico dos organismos,
pelo uso de diferentes soluções, podem ser determinados e identificados. Os
esfregaços com fezes frescas e não fixadas são rotineiramente preparados com as
soluções salina a 0,85% e de iodo. Entretanto, se o número de organismos for
pequeno, o exame de pequena quantidade de fezes usadas para a preparação de
esfregaços a fresco pode ser insuficiente para revelar a presença de parasitas. Os
esfregaços deverão ser sistemática e completamente examinados através da
objetiva do microscópio de pequeno aumento (10x) e com pequena intensidade de
luz. A confirmação dos parasitas deve ser realizada com a objetiva de grande
aumento (40x).

Exame Direto para a Pesquisa de Ovos de Helmintos (KATO & MIURA,

1954).

Método:

1. Colocar 60 a 70 mg de fezes (tamanho de um grão de feijão preto) em uma

lâmina de microscopia.

2. Cobrir as fezes com lamínula e celofane (embebida em solução aquosa de

verde de malaquita a 3%), após a remoção do excesso do corante.

3. Comprimir a lamínula, com uma folha de borracha macia, e espalhar o

material com uniformidade até as margens da cobertura de celofane.
Examinar ao microscópio.
 TÉCNICA DE CONCENTRAÇÃO

TÉCNICA DE FLUTUAÇÃO

FLUTUAÇÃO SIMPLES

Flutuação em Solução Saturada de Cloreto de Sódio (WILLIS, 1921)

1. Colocar uma quantidade de fezes de aproximadamente 1 a 2 g. coletada de

várias partes do bolo fecal, em pequena cuba de vidro de 3 cm de diâmetro
com capacidade aproximada de 20 ml. Completar ¼ da capacidade do
recipiente com solução saturada de cloreto de sódio.

2. Suspender as fezes na solução saturada salina até haver uma total

homogeneização.

3. A lamínula deve ficar em contato com o menisco durante 30 a 45 minutos;

não deverá haver formação de bolhas de ar entra a lamínula e a superfície
do líquido. A gota contendo os ovos se adere à face inferior da lamínula .

4. Remover a lamínula e inverter rapidamente a sua posição sobre uma lâmina.

5. Examinar ao microscópio com objetiva de pequeno aumento.

Observações: Os ovos não flutuam na superfície do reagente quando a

homogeneização do material fecal é incompleta, havendo uma imperfeita separação
dos ovos e dos detritos fecais. A flutuação é muito curto ( menos de 30 minutos )
ou muito longo ( mais de 60 minutos ). Nesse caso os ovos que flutuam na
superfície podem descer para o fundo da pequena cuba ( Suzuki, 1980 ).

CENTRÍFUGO-FLUTUAÇÃO

Centrifugo - Flutuação em solução de Sulfato de Zinco (FAUST et al. 1938).

A: Material fecal fresco

1. Colocar 1 ou 2 g de fezes coletadas de várias partes do bolo fecal

em frasco contendo 10 ml de água corrente . Filtrar a suspensão
através de gazes dobrado em quatro vezes , e receber o filtrado em
um tubo cônico de centrífuga de 15 ml.

2. Adicionar água corrente até completar 2/3 da capacidade do tubo.

Centrifugar ( 650 x g por 1 minuto ).

3. Decantar o sobrenadante e adicionar 1 a 2 ml de água corrente ao

sedimento , ante de ressuspendê-lo. Completar com água corrente
2/3 do volume do tubo, agitar e centrifugar.

4. Repetir a etapa 3, até que o sobrenadante apresente-se

relativamente claro.
 5. Depois que o último sobrenadante é decantado, adicionar 1 a 2 ml
do reagente , e ressuspender o sedimento: completar com sulfato de
zinco até 0,5 cm da borda do tubo e centrifugar (650 x g por 1 min ).

6. Cuidadosamente, remover o tubo da centrifuga e, sem agitação

Coloca-lo em uma estante em posição vertical.

7. Com uma alça de arame (diâmetro de 5 a 7 mm) tocar no centro

da membrana formada na superfície, transferido várias alçadas para
uma lâmina de microscopia. Examinar ovos larvas e cistos.

8. Alguns pesquisadores preferem a sobreposição de uma lamínula

na borda do tubo à remoção da película com alça de arame
(BURROWS, 1965: MELVIN & BROOKE, l982).

Depois de concluída a etapa 4, com auxílio de pipeta, encher o tubo

até a borda com solução de sulfato de zinco. Colocar uma lamínula
(22 x 22 mm) na superfície do tubo. Deixando-a em contato com o
líquido durante 8 a 10 minutos. Remover a lamínula, invertendo a
sua posição, e colocar a face com a gota sobre uma lâmina. Examinar
para larvas e cistos.

B: Material Fecal Preservado pela Solução de Formaldeido:

1. A suspensão fecal formolizada deverá ser aproximadamente uma parte de

fezes para duas a três partes de solução de formoldeido. Se a suspensão for
muito espessa, diluir com solução de formaldeido a 10 % para se aproximar
da proporção.

2. Filtrar a suspensão fecal fomolizada, através de gazes umedecida. De

modo a obter ¾ de um tubo de 13 x 100 mm. Adicionar, se necessário, ao
tubo água corrente.

3. Seguir as etapas de 2 a 8 , como foi descrito para o material fecal não

preservado, usando sulfato de zinco de densidade 1.20 g/ml.

Observação: Alguns ovos de trematódeos e de cestóides podem estar presentes

nas superfície da membrana , em densidade alta de 1,20 g/ml. Entretanto, para um
exame completo, deverão ser examinados a membrana e o sedimento uma
permanecia prolongada da suspensão de fezes na solução de sulfato de zinco, de
alta densidade especifica, pode resultar em colapso e distorção dos cistos e dos
ovos de nematoídes com parede fina. Examinar a preparação após 20 minutos
( ASH & ORIHEL, 1987 ).

TÉCNICAS DE SEDIMENTAÇÃ0

SEDIMENTAÇÃO SIMPLES:

Sedimentação Espontânea em água (LUTZ, 1919; HOFFMANN, PONS E

JANER, 1934).

1. Colocar cerca de 5g de fezes, coletados de várias partes do bolo fecal, em

copo graduado ou Becker de 250 ml. Completar o volume de 50 a 60 ml de
água corrente e misturar vigorosamente.
 2. Preparar a suspensão juntando 100 ml de água corrente.

3. Filtrar essa suspensão através de gaze dobrado 4 vezes, recolhendo-a em

copo de sedimentação de capacidade de 125 ml.

4. Se necessário, adicionar água corrente, até completar aproximadamente ¾

do volume do copo cônico. Deixar a suspensão em repouso durante 1 a 2
horas.

5. Com uma longa pipeta capilar, fixada a um bulbo de borracha, colher uma
pequena porção do sedimento na camada inferior, depositando sobre uma
lâmina. Se a preparação estiver muito espessa, diluir com uma gota de
solução salina a 0,85% ou água corrente. Colher amostra adicionais do
centro e do fundo do sedimento.

6. Examinar ao microscópio, a presença de ovos, larvas e cistos.

Observação: MELVIN & BROOKE, (1982) e ASH & ORIHEL (1987) apresentaram a
seguinte conduta depois de concluída a etapa 4 (1) decantar com cuidado 2/3 do
líquido sobrenadante sem perder nenhuma porção do seguimento; (2)
ressuspender o sedimento em água corrente, e deixar a suspensão em repouso por
mais 1 h; (3) esse procedimento de lavagem pode ser repetido até o líquido
sobrenadante fique relativamente claro. Após seguir as etapas 5 e 6 na técnica
acima descrita.

CENTRÍFUGO-SEDIMENTAÇÃO

Centrífugo - Sedimentação pela Formalina-Éter, (RITCHIE, 1948).

A. Material Fecal a Fresco

1. Colocar 1 ou 2g de fezes coletadas de várias partes do bolo fecal em frasco

contendo 10ml de água corrente ou solução salina a 0,85%;

2. Filtrar a suspensão através de gaze dobrada quatro vezes, e receber o filtrado

em um tubo cônico de centrífuga de 15 ml.

3. Centrifugar (650 x g por minuto);

4. Decantar o sobrenadante e adicionar 1 a 2 ml de água corrente ou solução salina

a 0,85% ao sedimento antes de ressuspendê-lo. Completar com água corrente (ou
solução salina a 0,85%) 2/3 do volume do tubo. Agitar e centrifugar (650 x g por 1
min).

5. Repita a etapa 4, até que o sobrenadante se apresente relativamente claro.

6. Depois que o último sobrenadante é decantado, ressuspender o sedimento com 1

a 2 ml de formalina a 10% (dar preferência à solução tamponada de formalina a
10% , pH. Neutro). Completar o volume da suspensão em 10 ml com formalina a
10%. Deixar em repouso em repouso durante 5 minutos.

7. Adicionar 3ml de éter ou acetado de etila, fechar o tubo e agitar vigorosamente,

na posição invertida, por 30 minutos. Remover a tampa com cuidado.
8. Centrifugar (500 x g por 1 min). Quatro camadas se formarão: (1) sedimento no
fundo do tubo contendo os parasitas, (2) camada de formalina, (3) tampão de
detritos fecais, e (4) camada de éter na superfície.

9. Afrouxar e separar o tampão de detritos das paredes do tubo com um estilete

fino,e com cuidado decantar as três camadas superiores. Limpar com swab de
algodão as paredes do tubo, removendo os detritos remanescentes.

10. Uma pequena quantidade de líquido que permanece nas paredes do tubo
escorre para o fundo junto ao sedimento. Misturar o líquido e o sedimento,
preparando as lâminas para a pesquisa de ovos, lavas e cistos.

MÉTODOS QUANTITATIVOS

Método Modificado de KATO-KATZ (KATO,1960; KATZ, CHAVES E

PELLEGRINO, 1972)

1. Colocar a amostra fecal sobre o papel absorvente.

2. Comprimir a tela metálica ou de náilon sobre as fezes, fazendo com que

parte passe através das malhas.

3. Remover as fezes que passam através das malhas e transferi-las para o

orifício do cartão, colocado sobre a lâmina.

4. Depois de encher o orifício central, remover com cuidado o cartão, deixando

as fezes com a lamínula.

5. Cobrir as fezes com a lamínula de celofane, invertendo e pressionando a

lâmina sobre o papel absorvente.

6. Deixar a preparação em repouso (clarificação) durante 30 minutos a 34-

40°C ou à temperatura ambiente por 1-2 horas.

7. Examinar a preparação ao microscópio

MÉTODOS PARA O ISOLAMENTO DE LARVAS

MÉTODO DE BAERMANN (1917) E MORAES (1948)

1. Encher o funil com água corrente, aquecida a 40-45ºC.

2. Abrir a pinça de Mohr, deixando escorrer uma pequena quantidade de água

para evitar a formação de bolhas de ar na haste e no tubo de látex.

3. Colocar 8 a 10 g de fezes, recentemente emitidas, sobre gaze dobrada

quatro vezes e, se necessário, juntar mais água, até que as fezes fiquem
submersas.

4. Deixar em repouso durante 60 minutos.

5. Abrir a pinça e coletar parte do líquido em vidro de reógio; examinar ao

microscópio estereoscópio (aumentos 20 a 30 x). Deixar em repouso
 durante alguns minutos, pois desta forma as larvas migrarão para o centro
do vidro de relógio, ou proceder de acordo com o item 6.

6. Coletar em tubo cônico de centrífuga. Centrifugar (500 x g por 1 min), e

exarminar o sedimento entre lâmina e lamínula. Corar a preparação com
solução de Lugol, para a identificação das características morfológicas das
larvas, e examinar ao microscópio com aumento de 20x.

Nota: Esse método é baseado no hidro e termotropismo das larvas que saem do
material, migrando para a água quente; por densidade, se depositam no fundo do
funil. Para maior comunidade, costuma-se construir um pequeno suporte de tábua,
com vários furos circulares para receberem os funis, facilitando o trabalho. Algumas
vezes, para examinar larvas de helmintos há necessidade de matá-las, e para isso
coloca-se gotas de lugol (estando imóveis, permitem a visualização dos detalhes no
diagnóstico específico).

MÉTODO DE RUGAI, MATTOS & BRISOLA (1954).

1. Estender, sobre a abertura de um recipiente contendo fezes, gaze dobrada

quatro vezes, e repuxar as extremidades para trás;

2. Encher, com aproximadamente 70 a 100 ml de água corrente aquecida a

40-45°C, um copo cônico de sedimentação (capacidade de 125ml);

3. Transferir o recipiente com as fezes para o interior do copo cônico de

sedimentação, de modo que o líquido alcance toda a extensão da abertura
do recipiente, cuidando para não formar bolhas de ar;

4. Deixar em repouso durante 60 minutos.

5. Colher o sedimento, no fundo do copo cônico, com pipeta capilar longa.

Alguns autores recomendam retirar o recipiente do copo Cônico antes da
colheita do sedimento. Entretanto, outros preferem manter o recipiente,
para evitar o revolvimento do líquido;

6. Examinar o sedimento entre lâmina e lamínula. Corar a preparação com

solução de lugol.

Observação: Este método é indicado para a pesquisa de larvas de S. Stercoralis.

IDENTIFICAÇÃO DE OOCISTOS DE Cryptosporidium

Preparação e Armazenamento dos Espécimes Fecais Contendo Oocistos.

1. Preservação dos Espécimes

A detecção e identificação dos oocistos está em relação direta com a

quantidade da amostra entregue ao laboratório. São recomendados certos
princípios básicos que asseguram uma coleta correta. As fezes poderão ser
examinadas frescas ou após a fixação em solução salina de formaldeído a
10%, ou no fixador acetato de sódio - ácido acético-formaldeído (SAF). A
solução salina de formaldeído a 10% apresenta a vantagem de fixar os
oocistos e destruir o seu poder patogênico e inativar outros agentes
infecciosos (CENAC et al ., 1984). Entretanto, o material preservado na
 solução fixadora álcool polivinílico (fixador APV) não apresenta bons
resultados quando é corado pelos métodos derivados da fuscsina fenicada.

2. Armazenamento dos Espécimes

A solução de bicromato de potássio a 2 ou 2,5% (m/v) é usada na rotina

como meio para preservar a viabilidade dos oocistos. Essa solução não é
fixadora. Quando os oocistos são armazenados a temperatura de 4°C em
solução de bicromato de potássio, eles permanecem viáveis durante 3
meses, e alguns podem manter a sua infectibilidade por mais de 12 meses
(CURRENT, 1990)

EXAME DIRETO

EXAME MACROSCÓPICO DE PREPARAÇÕES A FRESCO

O diagnóstico é realizado pela observação microscópica dos oocistos entre lâminas

e lamínulas. O exame direto a fresco é realizado diretamente das fezes diarreicas,
ou após a diluição das fezes pastosas, em solução salina a 0,85% (1:5). Examinar
com objetiva de imersão. A microscopia de contraste de fase facilita a observação
dos parasitas.

Observações: O oocisto no exame direto aparece maior que aqueles observados

nos esfregaços fixados e corados. Os oocistos apresentam-se como elemento
esféricos de 5 a 6 µm de diâmetro, com membrana externa fina, com um
citoplasma finalmente granulado, e com mancha negra proeminente, central ou
lateral, quer representa os corpos residuais. Os quatro esporozoítos livres
aparecem como pequenas manchas dispostas na periferia em forma de "C". O
núcleo é visto no centro do organismo (GARCIA et al., 1983; LEMETEIL, 1987;
MEHLHORN, 1988).

Métodos de Coloração Derivados de Ziehl – Neelsen

As colorações recomendadas para oocistos de C. parvum não são indicadas para

amostras fecais preservadas pelo fixador álcool - polivinílico ( fixador APV). As
colorações de rotina, com tricrômio e hematoxilina férrica, não apresentam bons
resultados na identificação desse coccídio. A coloração de Ziehl-Neelsen e suas
variações são os procedimentos que oferecem os melhores resultados.

Coloração da Amostra

1. Preparar o esfregaço com fezes frescas ou preservadas.

2. Deixar secar à temperatura ambiente.

3. Fixar com álcool metílico por 5 minutos e deixar secar à temperatura

ambiente.

4. Corar com o corante de Kinyoun ( a frio) durante 1 hora.

5. Lavar com água corrente.

 6. Diferenciar com solução aquosa de ácido sulfúrico a 2%.

7. Lavar com água corrente.

8. Corar o fundo com solução de verde de malaquita a 5% por 8 minutos.

9. Lavar com água corrente e secar.

Observações: A diferenciação depende do corante, de ensaios preliminares sobre

fezes positivas para adaptar a concentração do ácido a ser utilizada, e da definição
dos tempos de diferenciação. Current (1990) usa a solução aquosa de ácido
sulfúrico a 10% na etapa 6 e os corantes light green SF yellowish (CI 42095) ou
azul-de-metileno a 0,3% (CI 42780) diluídos em água destilada - deionizada na
etapa 8. Outros autores preferem lavar o esfregaço na etapa 7 com álcool etílico a
50% (v/v). Alguns procedimentos usam o método a quente. Entretanto, a coloração
a frio apresenta os melhores resultados. O escarro deverá ser tratado com solução
de formaldeído a 10% e processado como as amostras fecais.

Centrífugo - Sedimentação pelo Formaldeído-Éter (Técnica de Ritchie, 1948;

Modificada por Allen & Ridley, 1970).

A técnica de Ritchie, modificada por Allen & Ridley, é a que apresenta os melhores
resultados. A concentração pode ser realizada a partir de fezes frescas ou
formolizadas. Sendo a amostra mucosa, ela deverá ser fluidificada, sob agitação,
com algumas gotas de hidróxido de potássio a 10%.

Técnica

1. Diluir 1 ou 2g de fezes frescas ou formolizadas em 7ml de solução de

formaldeído a 10%.

2. Filtrar em gaze dobrada quatro vezes e receber o filtrado em tubo cônico de

centrífuga de 15 ml.

3. Adicionar 3 ml de éter, fechar o tubo e agitar vigorosamente, na posição

invertida, por 30 segundos. Remover a tampa com todo cuidado.

4. Centrifugar ( 500xg por 2 min). Quatro camadas se formarão: (1) sedimento

no fundo do tubo contendo os parasitas; (2) camada de forrmalina; (3)
tampão de detritos fecais, e (4) camada de éter na superfície .

5. Afrouxar e separar o tampão de detritos das paredes do tubo com estilete

fino, e com cuidado decantar as três camadas superiores. Limpar com swab
de algodão as paredes do tubo, removendo os detritos remanescentes.

6. Uma pequena quantidade de líquido permanece nas paredes do tubo,

escorrendo para o fundo junto ao sedimento. Misturar o líquido e o
sedimento e preparar as lâminas para a pesquisa de ovos, larvas e cistos.

7. Corar o sedimento pelos métodos de Giemsa ou de Henriksen e Pohlenz.

Observação : Adicionar 10 gotas de solução de hidróxido de sódio ( NaOH) a 10%
ao sedimento, quando este se apresentar mucóide ( RITCHIE, 1948; DELUOL et al.,
1984; LEMETEIL, 1987).

Pesquisa de Sangue Oculto Nas Fezes

Técnica:

Espalhar pequena quantidade de fezes sobre o papel de filtro limpo e colocar duas
gotas de água oxigenada sobre o esfregaço. Adicionar duas gotas de solução de
benzidina.

Observar imediatamente a cor.

Leitura:

A reação de benzidina é sensível, mas as gorduras podem torna-la positiva.

Nenhuma mudança de cor: Negativo

Cor esverdeada: Traços

Cor verde claro: +

Cor vede escuro: ++

Cor verde azulado: +++

Azul intenso: ++++

Métodos de Coloração Derivados de Ziehl – Neelsen (Pesquisa de

Coccídeos)

Coloração da Amostra

1. Preparar o esfregaço com fezes frescas ou preservadas.

2. Deixar secar à temperatura ambiente.

3. Fixar com álcool metílico por 5 minutos e deixar secar à temperatura

ambiente.

4. Corar com o corante de Kinyoun ( a frio) durante 1 hora.

5. Lavar com água corrente.

6. Diferenciar com solução aquosa de ácido sulfúrico a 2%.

7. Lavar com água corrente.

8. Corar o fundo com solução de verde de malaquita a 5% por 8 minutos.

 9. Lavar com água corrente e secar.

Observações: A diferenciação depende do corante, de ensaios preliminares sobre

fezes positivas para adaptar a concentração do ácido a ser utilizada, e da definição
dos tempos de diferenciação. Current (1990) usa a solução aquosa de ácido
sulfúrico a 10% na etapa 6 e os corantes light green SF yellowish (CI 42095) ou
azul-de-metileno a 0,3% (CI 42780) diluídos em água destilada - deionizada na
etapa 8. Outros autores preferem lavar o esfregaço na etapa 7 com álcool etílico a
50% (v/v). Alguns procedimentos usam o método a quente. Entretanto, a coloração
a frio apresenta os melhores resultados. O escarro deverá ser tratado com solução
de formaldeído a 10% e processado como as amostras fecais.