Professional Documents
Culture Documents
Deney Iyon Degistirici Kromotografisi
Deney Iyon Degistirici Kromotografisi
Giriş:
Çeşitli kaynaklardan alınan protein, karbohidrat, nükleik asit ve lipitleri ayrıştırmak için kullanılan biyokimyasal bir tekniktir.
Temel prensibi, ayrıştırılacak moleküllerin, hareketli bir faz içinde, hareketsiz (durgun) faz üzerindeki akışına dayanır. Hareketli
faz ise bir tampon ya da elektrolit çözeltisidir. Durgun fazın kimyasal ve fiziksel özelliği ayrışmayı sağlar. Başlıca kolon
kromatografisi tipleri şunlardır:
1. Jel Elemesi
Proteinleri büyüklük ve bir ölçüde biçimlerine göre ayırır. Jel kovalent bağlar ile birleştirilmiş polisakkarit zincirlerinden
yapılmış küreciklerden oluşan inaktif bir polimerdir. Durgun fazı (jeli) oluşturan moleküller için genellikle dekstranın epiklorhidrin
ile çaprazlaştırılmış polimerleri olan klorohidroksipropil dekstran (Sephadex) kullanılır. Jel şiştiğinde içi labirent şeklinde ve belli
genişlikte kanallardan oluşan kürecikler halini alır. Kürelerin çapı 0.1mm’den küçüktür. Kürecik içinde çapraz bağlanma sonucu
oluşan kanallar filtre görevini üstlenir. Çapraz bağlanmanın derecesi kanal boyutlarını değiştirir. Jellerin tipleri ve ayrıştırma
kapasitesi bu kürelerin çapına ve içlerindeki kanalların genişliğine bağlıdır. Küreciklere girebilecek büyüklükteki moleküller,
giremeyen büyük moleküllere göre kolondan daha geç çıkarlar. Böylece jel fitrasyon kolonuna uygulanan karışımdaki
moleküllerden büyük olanlar kolondan daha önce çıkarlar. Belli bir kolona uygulanan proteinlerin elüsyon (çıkış) hacmi ile
molekül ağırlığı arasında logaritmik bir ilişki vardır. Jel elemesinde kullanılan sephadex-G jellerin globüler protein resolusyon
aralıkları aşağıda verilmiştir.
Sephadex G-serisi Ayrıştırma Kapasitesi (Dalton)
G-10 200-2.500
G-25 1.000-5.000
G-50 1.500-30.000
G-75 3.000-70.000
G-100 4.000-100.000
G-150 5.000-150.000
G-200 5.000-250.000
2. Affinite Kromatografisi
Çok kompleks bir karışım içinde bulunan bazı proteinler affinite kromatografisi sayesinde tek basamakta oldukça saf halde elde
edilirler. Affinite kromatografisi için polisakkarit yapısındaki agaroz taneciklerine kimyasal bir reaksiyon ile bir enzimin koenzimi
bağlanır. Üzerine koenzim bağlanmış olan agaroz tanecikleri kolon dolgu maddesi olarak kullanılır. Proetin karışımı bu kolona
uygulandığı zaman yalnız ilgilendiğimiz enzim proteinleri koenzimin serbest ucuna spesifik olarak bağlanmaktadır. Bu bağlanma
kovalent bir bağlanma değildir. Diğer proteinler koenzimin serbest ucuna bağlanma özelliğine sahip olmadıkları için kolondan
ayrılırlar. Daha sonra serbest koenzim içeren çözelti kolona ilave edildiğinde, agaroz taneciklerine bağlı koenzime bağlanmış olan
enzim molekülleri bu defa rekabetten dolayı çözelti ile birlikte gelen serbest koenzime bağlanarak kolondan çıkar. Böylece
koenzime spesifik olarak enzim proteini diğer yüzlerce proteinden affinite kromatografisi ile tek basamakta saflaştırılmış
olmaktadır.
Her protein için net yükün (-) den (+) ya, (+) den (-) ye geçtiği pH değişiktir ve proteinlerin izoelektrik noktasına
bağlıdır. Proteinler izoelektrik noktanın üzerindeki pH’larda (-), altındaki pH’larda ise (+) yük kazanırlar.
Örnek uygulanmadan önce, çıkış tüpü kapatılır. Jel yüzeyindeki tamponun fazlası Pasteur pipeti ile alınır. Bu işlem
esnasında jel yüzeyinin bozulmamasına ve kurumamasına dikkat edilmelidir.
Örnek Pasteur pipeti ile kolonun iç kenarında süzdürülerek tüm jel yüzeyine homojen bir şekilde uygulanır ve çıkış tüpü
açılarak örneğin jelin içine girmesi sağlanır. Jel yüzeyinin kurumamasına dikkat edilmelidir. Örnek jelin içine girdikten sonra
Pateur pipeti ile jel yüzeyinden 4-5cm yukarıya kadar tampon doldurulur. Tampon rezervi bağlanarak uygulama başlatılır. Bir
fraksiyon toplayıcısı yardımıyla, 3-4ml’lik fraksiyonlar toplanır ve fraksiyonlarda örnek analizi yapılır.
Deney :
Katyon Değiştirici Kromatografi Yöntemi ile Prolin ve Arjinin Amino Asitlerinin Ayrılması
Yapılacak deneyde katyon değiştirici dolgu maddesi olarak Dowex 50-SO3 sülfonik asit kullanılarak hazırlanacak kolona
Arg (pI= 10.7) ve Pro (pI= 6.3) amino asitlerinden oluşan karışım uygulanacak ve karışımdaki amino asitlerin birbirinden
ayrılması sağlanacaktır.