TECNICAS EN

BIOLOGIA
MOLECULAR

Dr. Daniel Alarcón Cano

 CONCEPTOS
• GENÓMICA: Es la ciencia o conjunto de
ciencias y técnicas dedicadas al estudio
integral del funcionamiento, la evolución y
el origen del Genoma.
• PROTEÓMICA: Puede definirse como
genómica funcional a nivel de proteínas,
estudia la correlación entre las proteínas y
sus genes.
¿Qué moléculas hay en una célula?

Proteína

ción
d uc
Tra
ón ci

ARN
rip
nsc
Tr a

ADN
Estudio del ADN

Proteína

ARN

ADN
 Ingeniería genética
(tecnología del ADN recombinante)
Conjunto de técnicas y tecnologías que
permiten manipular la información
genética de distintos organismos

Permite aislar un gen de un organismo para

su posterior manipulación e inserción en
otro ADN diferente, logrando que un
organismo produzca una proteína nueva
para el. (Ejemplo: Insulina)
 Hibridación
Puentes
hidrógeno
1M Urea (desnaturalización química)
90ºC (desnaturalización térmica)
Renaturalización (Hibridación)
Diálisis
Descenso lento de la temp.

ADN o ARN
desnaturalizado

Híbrido

Zona no
complementaria
 Astringencia

• Es una característica del medio que hace

que 2 cadenas de ácido nucléico necesiten
una mayor homología para poder hibridizar

Es mayor cuanto mayor es:

• Temperatura
• Concentración salina (NaCl)
• pH
 Enzimas de Restricción
•70’s descubrimiento de las Enzimas de
restricción (Werner Arber, Daniel Nathans
y Hamilton Smith- 1978 premio Novel)
• Sistema bacteriano de defensa antiviral?
• Endonucleasas de DNA que reconocen y
cortan dentro de zonas palindrómicas
específicas de 4 o 10 nt. (la mayoría)
• palíndrome: (dábale arroz a la zorra el
abad), (La ruta nos aporto otro paso natural)
 Tipos de fragmentos de restricción
EcoRI EcoRI
Sticky ends 5’ protruyentes 5’ G AATTC
5’ G AATTC
3’
Ext.cohesivos 5’ protruyentes 3’ CTTAA G
3’ CTTAA G
5’

HhaI HhaI
Sticky ends 3’ protruyentes 5’ 5’GCG C C GCG C3’
GCG
Ext.cohesivos 3’ protruyentes 3’ 3’C GCG
GCG C C GCG5’

HpaI HpaI
Blunt ends 5’ 5’GTTAAC
AAC GTT AAC
GTT 3’
extremos romos 3’ 3’CAATTG
TTG CAA TTG
CAA 5’
Ligación
nick
G AATTC
GAATTC

CTTAAGG
CTTAA
nick
 Clonado de genes
Vectores
plásmido
Restricción parcial
(cond. Subóptimas)

AATTC G
G CTTAA
AATTC G
G CTTAA Restricción completa
AATTC G (cond. óptimas)
G CTTAA
AATTC G
G CTTAA AATT
AATTC G TTAA
G CTTAA
AATTC G
G CTTAA

Hibridación y ligación

Inserto
 Clonado de genes
Transformación de bacterias
Bacterias
Competentes

LB-agar+antibiótico

Incubación
ON a 37oC
Heat Shock
5’ 42oC
inoculación

LB-agar+antibiótico

Inoculación en
Incubación medio selectivo
ON a 37oC

LB sin
antibiótico
Vectores de expresión eucariotas
origen de replicación bacteriana

Marcador de selección eucariota Sitio de reconocimiento de

muchas enzimas de restricción

Proteina Verde Fluorescente

Proteína de fusión
Señal de fin de transcripción eucariota

Marcador de selección procariota

 Transfección
Método utilizado para introducir genes en células eucariotas superiores.
Puede ser:
• Transient (transitoria): el vector queda como elemento episomal
• Estable: El vector se integra en algún cromosoma (evento aleatorio
y poco frecuente => Requiere de marcador de selección)

Métodos más usados

• CaCl2 se tratan las células con una mezcla de ADN y CaCl2. Baja
eficiencia, pero muy barato
• Lipofección: Se incuban las células con un complejo ADN-Lípido
catiónico. El más usado. Buena eficiencia, pero los lípidos son caros.
• Electroporación: Se someten las células a un campo eléctrico que les
genera poros por donde puede entrar el ADN. Para las células que lo
resisten tiene muy buenas eficiencia, pero es caro porque necesita un
equipo especial.
• FuGene 6: Lo último!! Es un reactivo de composición secreta que tiene
muy buena eficiencia de transfección.
 Ensayos de Gene-reporters

CRE
rL
UC

1 2 3 4 5

Lumin-O-meter CMV
ACME fL
UC
 Separación de moléculas
Cromatografía
• Partición: sólo para moléculas pequeñas. Se basa en la disolución
diferencial en distintos solventes. Se hace en capa delgada (TLC) o en
papel.
migración

• En columna:
•Filtración en gel => Sephadex
•Intercambio iónico (aniónico o catiónico)
•Afinidad: Acs, Hormona / Receptor,

Fracciones
Separación de moléculas
Electroforesis en gel.
 Southern blot
E. M. Southern, 1975, J. Mol. Biol. 98:508

El ADN se corta con

enzimas de restricción
Lisis celular y
purificación ADN
Los fragmentos de restricción
son sometidos a electrólisis
en gel, se ordenan por tamaño

El ADN se
desnaturaoliza y
transfiere a una
membrana de
nylon

La memb. se incuba Se realiza una

con un fragmento autoradiografía: la
de ADN radioactivo radioactividad
complementario al impacta una placa
buscado (sonda) fotográfica que al
revelar muestra una
 Secuenciación de ADN
AACCGTAT
TTGGCATA
dATP, dTTP, dATP, dTTP, dATP, dTTP, dATP, dTTP,
dCTP, dGTP dCTP, dGTP dCTP, dGTP dCTP, dGTP
ddATP* ddTTP * ddCTP * ddGTP *
DNAPol DNAPol DNAPol DNAPol
AACCGTA
AACCGTA AACCGTA AACCGTA

TTGGCAT
TTGGCAT TTGGCAT TTGGCAT

A T C G

Gel de secuencia => Poliacrilamida =>Mayor resolución

EMSA (Gel Shift Assay)
FISH
FISH
PCR Reacción en cadena de
Polimerasa
PCR: Reacción en cadena de la polimerasa
Cadena desnaturalizada

Primers
específicos

Síntesis de ADN
ChIP
Microarrays
Microarrays
 Normal
Basal like Her2+ Breast like Luminal C Luminal B Luminal A

Sorlie Proc Natl Acad Sci USA 2001, 98:10869

Sorlie et al (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98: 10869 Sorlie et al (2003) 100: 8418
Mammaprint
Estudio del ARN

ARN

ADN
 Northern blot

Gel tenido con BrEt 28 S

y mirado con UV
18 S

Membrana
 Retrotranscripcion

• Se utiliza la enzima Transcriptasa Reversa

de las retrovirus que permite convertir ARN
en ADN (llamado ADN copia o cDNA)
• Se le pueden hacer todas las técnicas
basadas en ADN
• Nos da mayor información
Estudio de las Proteinas

Proteína

ARN

ADN
 Western blot
Mezcla de prots de
Lisis <> tamaño y Se incuba la
abundancia membrana con Acs
celular relativa específicos contra
Anticuerpos la prot de interés
Separación (Acs)
electroforética
en gel
Los Acs
reconocen y
Las proteínas se unen a la
se disponen proteína
de acuerdo a su
tamaño de
forma
descendente

Transferencia a
membrana y Los Acs se
tinción Se puede ver una detectan por
banda a la altura incubación con
donde quedó cada un 2º Ac
una de las proteinas. acoplado a una
El espesor de la enzima.
banda es dirigido contra
directamente el primero
proporcional a la
abundancia de esa
proteína en el lisado
original
Citometría de flujo
Citometría de flujo
Inmunofluorescencia
IHQ
Tissue microarray
Tissue microarray
Tissue microarray
• Single marker on
4

C-erbB2
CK8/18

CK 5/6
Mcm2
c-myc
Positivity score (0-4)

cyc D

MIB1

cyc E
Bcl2

p27

p53
ER

PR
2

many samples
0

• Measurement of
protein expression
(also RNA in situ and
FISH)
• New classification
2
using supervised and
unsupervised
methods
Proteomics
Proteomics
 Proyecto CMAP del NCI
(Cancer Molecular Analysis Project)

• Facilitar la identificación y evaluación de blancos

moleculares

• Definir las secuencias de alteraciones genéticas/

epigenéticas que adquieren los tumores

• Manejar e integrar todos los datos disponibles

• Definir los agentes terapéuticos de utilidad para

esos blancos