IngenieraGenticaI 2010

IngenieraGentica
Qu significaclonar ungenyobtenerDNA recombinante encomparacinconclonarporej. unaplantaylarecombinacinhomloga? Diferenciasentrerecombinacinhomlogay recombinacinilegtima Herramientasoriginales:endonucleasas de restriccin(+ligasas)yretrotranscriptasas;luego PCR

Hay4clasesderecombinacin
Recombinacin homloga: intercambio de material gentico entre dos molculas de ADN que comparten una alta identidad entre s. Es lo que ocurre durante la meiosis (crossing-over), la recombinacin entre fagos o la conjugacin bacteriana por ejemplo (lo recuerdan?) Recombinacin sitio especfica: implica el intercambio de material gentico en sitios muy especficos (con una secuencia determinada); son ejemplos la integracin del fago Lambda para generar el profago y los rearreglos cromosomales que general la diversidad de anticuerpos. Transposicin: Lo veremos en una clase dedicada Recombinacin ilegtima: un nmero importante de casos de intercambio de ADN que no pueden incluirse en alguna de las categoras anteriores.

Plsmidos

a) Sin plsmido

Dilucin y seleccin Diluci selecci b) plsmidos en = clula pl c La proporcin de proporci bacterias que incorporan un plsmido es baja pl Hay incompatibilidad

Se produciran 4 tipos de clulas que tenemos que diferenciar: a)Sin plsmido b)Varios plsmidos en = clula c)Recombinantes (distintas) d)No recombinantes

c) Muchos recombinantes distintos

b) plsmidos en = clula vs colonias superpuestas

d) Cmo eliminar los plsmidos vacos (no recombinantes)?

Vectores plasmdicos Antiguos (pBR322)

Vectores plasmdicos modernos

d) Cmo eliminar los plsmidos vacos (no recombinantes)?

Clonar un gen significa aislarlo y amplificarlo

Clulas/tejido ARNm (clonoteca) cDNA(metilacin; adicin de linkers, etc.) ADN (genoteca) Restriccin Completa o parcial

Vectores (cDNA: plsmidos, fago Genmico: fago , csmido, BAC, PAC, YAC, TAC)

Genomic Libraries Genotecas Se parte de ADN genmico frec. postivos indep. expresin puede contener promotores e intrones problema para expresar en sistemas heterlogos

cDNA Libraries clonotecas Retrotranscripcin del ARN Dependiente sin promotores o intrones

Fraccionamiento

Restriccin

posible expresar si se coloca promotor adecuado usos: estudios de regiones codificantes, anlisis de funciones gnicas

Ligacin Transformacin, empacado in vitro, etc screening de las colonias buscadas Amplificacin y conservacin a largo plazo

usos: anlisis genmico, clonado posicional, estudios sobre promotores, etc

Representacin en una genoteca Q = (1 1/n)N P=1Q P = 1 (1 1/n)N Q: probabilidad de que un clon no est representado P: probabilidad de incluir una dada secuencia N: nmero de clones analizados (screened) n: relacin entre el tamao del genoma y el del clon promedio

Genomic Libraries Genotecas N = ln (1-P) / ln (1-1/n) P: probabilidad de incluir una dada secuencia N: nmero de clones analizados (screened) n: relacin entre el tamao del genoma y el del clon promedio (Nmero total de clones necesarios para cubrir el genoma sin superposicin )

cDNA Libraries clonotecas N = ln (1 P) / ln (1 m/T) P: probabilidad de que cada ARN est representado N: nmero de clones independientes analizados m: nmero de molculas de un ARNm raro en una clula T: nmero total de molculas de ARNm por clula

(1 1/n)N = 1 P ln (1 1/n)N = ln (1 P) N = ln (1-P) / ln (1-1/n)

Vectores para genotecas

Vector
YAC (yeast artificial chromosome)

Vectores para genotecas

Vector
BAC (bacterial artificial chromosome)

Tamao inserto
230 - 1700 kb (largo de un cromosoma de levadura) Promedio: 400-700 kb

comentarios
Se propaga en Saccharomyces cerevisiae

Tamao inserto
Hasta 300 kb Promedio:100 kb

comentarios
Plsmido conteniendo el origen de replicacin del F; Una copia por bacteria Versin reducida de genoma de fago genoma de P1 de 110 kb empaquetamiento eficiente sitio PAC de reconocimiento y clivaje replicn de P1 y replicn ltico inducible sitio loxP para Cre Combinacin de caractersticas de BAC y PAC Con origen P1 (copia nica en E. coli) y origen Ri (copia nica en Agrobacterium tumefaciens)

Elementos esenciales: centrmero; telmeros que marcan el final del cromosoma; origen de replicacin que funciona durante la replicacin del ADN Fue una importante herramienta para mapear genomas complejos

Bacteriofago P1 PAC (P1derived artificial chromosome) TAC (Transformable artificial chromosome)

Mximo cerca de 100 kb

Similar al BAC

Problemas: quimeras, inestabilidad (rearreglos)

Similar al P1 Con los bordes del T-DNA, para transformar plantas

Vectores para genotecas

Vector Tamao inserto comentarios
Genoma del fago ~ 48kb empaquetamiento eficiente, puede llevar 78105% del genoma del fago En general se usa el vector de reemplazo Brazos predigeridos se pueden comprar Bueno para estudiar genes individuales Plsmido contiene sitio cos del ; usa el empaquetamiento de ste Se propaga en E. coli como un plsmido; til para subclonar insertos de YAC, BAC, PAC, etc. Contiene sitio cos del y el origen de replicacin del plsmido F; Bajo nro de copia, ms estable Plsmidos bacterianos

Vectores para clonotecas

Vector Tamao inserto comentarios
Capacidad mxima no limita a ARNm (8kb) empaquetamiento eficiente Bueno para estudiar genes individuales En general se usa el vector de insercin Ms representativo que clonotecas de plsmidos Subclonados y pasos siguientes ms complicados que con clonotecas de plsmidos

Fago lambda

Hasta 20-30 kb

Fago lambda

20-30 kb (reemplazo) 10-15 kb (insercin)

Csmido

35-45 kb

10-15kb

Fsmido

Similar al csmido

Fcil de transformar E coli, pero no tan eficiente como lambda a gran escala Menos representativo que clonotecas de fagos Subclonados y pasos siguientes se simplifican

ZAP Library (Stratagene)

Escisin del plsmido pBluescript

Primer husped: cepa XL1-Blue MRF: plsmido F provee el pili del F, el receptor del fago f1; esta cepa es supresora de forma tal que los fagos helper f1 que llevan una mutacin ambar pueden empaquetar DNA El ZAP contiene las seales de iniciacin y terminacin para el empaquetamiento por el f1 flanqueando al pBluescript Segundo husped: SOLR, cepa no supresora, fago f1 no se propaga; cepa resistente al fago previene la propagacin del mismo.

Csmidos

BACmidos oBAC

El fago P1 como vector

Cromosomas artificialesde levaduras (YAC)

AislamientoyAmplificacininvivo (clonando)ein vitro (PCR)

Conozco los vectores Qu hay de los insertos?
Puedo preparar insertos especficos utilizando PCR y primers cuando la secuencia es conocida o utilizar regiones conservadas y primers degenerados. Puedo agregarle sitios de restriccin a los primers o emplear vectores T. Ventajas? Desventajas/cuidados?

05_02.jpg

05_02_2.jpg

05_02_3.jpg
RNAm

Construccin de Clonotecas
Sntesis de la primer cadena

AAAAAAAA TTTTTTTTGAGCTC CH3 CH3

Primer cadena de cDNA
+ Linker-primer, transcriptasa reversa + 5-methyl dCTP, dATP, dGTP, dTTP

CH3

linker-primer: transcripcin reversa, sitio de restriccin (XhoI) 5-methyl dCTP: proteje sitios internos

Sntesis de la segunda cadena

Segunda cadena de cDNA

Agregamos adaptadores
AATTC... G... CH3 CH3 CH3 AAAAAAAACTCGAT...G TTTTTTTTGAGCTC...CTTA

AAAAAAAACTCGAT TTTTTTTTGAGCTC CH3 CH3

Primer cadena de cDNA + RNase H + DNA polymerase I; dNTPs
RNase H: remueve mRNA en hbridos DNA-RNA DNA Polymerase I: sintetiza 2da cadena Al degradar el ARN, la RNAsa H deja residuos de ARN que funcionan como primers para iniciar la sntesis de ADN DNA Polymerase 1 rellena los gaps por nick translation

CH3

+XhoI
AATTC... G... CH3 CH3 CH3 AAAAAAAAC TTTTTTTTGAGCT

Adaptador EcoRI y linker XhoI: clonado direccional

Tambin puedo combinar cDNA y PCR 3) Diseo de iniciadores (primers) especficos PCR

Hoy en da, esta parte, se hace por PCR

Construccin de genotecas de insertos grandes en vectores lambda

Vector Charon 40 (capacidad: 9 - 23 kb)
cos

Screening de los clones de inters

Cmo clonar una aguja en un pajar (un gen entre 30.000 o 103 nucletidos entre 109) ?

L arm
BamHI

Polystuffer
BamHI

R arm

cos

SOURCE DNA FOR CLONING

Grow cell (e.g. hybrid cells: J640-51) J640Isolate chromosomes by flow-sorting flowPurify chromosomes using described protocol Partial digest with MboI / dephosphorylate

BamHI

(1) Nae 1 (2) PEG precipitation (3) Phenol, chloroform extraction (4) Ethanol precipitation (5) BamHI

Por abundancia relativa Por su producto de expresin: clonotecas de cDNA de expresin Por PCR o hibridizacin si hay informacin sobre la secuencia del gen blanco, o hay genes homlogos o tenemos informacin sobre la secuencia proteica. Por hibridizacin si contamos con fragmentos del gen o de los homlogos Por ensayos funcionales: Complementacin funcional en levaduras

cos

L arm

Polystuffer

R arm

cos

BamHI

BamHI

Plaqueo y screening defagos conteniendo fragmentos de inters

Ligar

Ba

Ba

Empacar y amplificar en E. Coli K802 (rec A-)

Microinjeccin

Screening por complementacin funcional en levaduras

Screening por complementacin funcional en levaduras

Mutante de levadura deficiente en una funcin de inters

Saccharomyces cerevisiae es un sistema eucariota simple Fcil de cultivar y manipular genticamente Contamos con mutantes, vectores de expresin, protocolos de transformacin, etc

Una clonoteca del organismo de inters en un vector apto para levaduras

cDNA se expresa por un promotor de levaduras, inducible

Screening por complementacin funcional en levaduras

Necesitamos de un vector apropiado

El mutante se complementa cuando el gen se expresa

Ejemplo: clonado de un canal de potasio

Mutante

transformante Medio no inductor Medio inductor

Medio rico en potasio

Medio pobre en potasio

Cmo clonaronel centrmero?

Identificacin: Hibridacin diferencial

Por su producto de expresin: clonotecas de cDNA de expresin

Si se dispone de anticuerpos: El producto de expresin se identifica por reconocimiento antgeno-anticuerpo

Tambien podramos producir protena recombinante, aunque probablemente necesite ser optimizado para mxima produccin

Screening con sondas marcadas

El resultado de un screening secundario

Tcnicas de reemplazo allico = Knock out Cmo llego del cDNA al clon genmico?

Marco el cDNA

Gen X Insercin al azar es ms frecuente que reemplazo allico por recombinacin homloga

neoR resistencia a geneticina (G418) tk del virus herpes simplex convierte el anlogo de T ganciclovir en un inhibidor de la replicacin del ADN

Selecc +

Selecc -

Tcnicas de evaluacin funcional = knock down

Herramienta

Dnde estn?

PCR con AttB

AttB

Seleccionar recombinantes

Reemplazo allico por integrasa/clonasa reemplaza las ER en los clonados modernos

CcdA and CcdB, which contribute to the plasmid's high stability by postsegregational killing of plasmid-free bacteria. Like the quinolones, the CcdB protein is a poison of the DNA-topoisomerase II complexes, while CcdA acts as an antidote against CcdB