PRACTICA N1

1) Explicar el diseo experimental. Como el objetivo de nuestra practica es demostrar la actividad enzimtica determinando para ello la actividad de la ureasa, por conocimiento sabemos que las enzimas son biocatalizadores especficos de naturaleza proteica que actan acelerando las rea cciones qumicas en este caso uno de los factores que afectan esta actividad enzimtica es el tiempo de incubacin en los tubos 1 y 2 ( con los componentes indicados en cada uno de ellos) que nos permiti expresar esta actividad en trminos de velocidad; es decir, la cantidad de producto formado por unidad de tiempo que generalmente se determina en micromoles de producto formado por minuto, teniendo en cuenta un pH optimo de 7.2 y un temperatura de 37C.

Una vez obtenidos los tubos 1 y 2 por sistema de incubacin procedemos a la valoracin de la actividad de la ureasa por el mtodo de productos formados. Primero lo haremos por reaccin de neutralizacin donde tomamos 1 mL de cada tubo para colocarlos en los tubos 1(B) y 2(B) donde luego aadimos 1 gota de rojo de metilo al 0.04% y lo titulamos con HCL 0.05N observando como punto final un rosa plido que indicara por finalizada la titulacin. En el tubo (B) observamos que necesito mas acido para lograr neutralizarse. Con los datos obtenidos en esta experiencia se precedio a calcular los resultados en trminos de velocidad de reaccin o actividad enzimtica expresados como micromoles de urea desdoblados por minuto a 37C (unidades de ureasa) con un pH optimo de 7.2.

Segundo por reaccin de Nessler donde haremos tres tubos: Blanco, 1 y 2 de acuerdo a los componentes indicados, dejaremos en reposo por 10 minutos y lo leeremos en l fotocolormetro con filtro verde, o un espectrofotmetro a 540 nm. Lo cual nos permiti hacer clculos en correccin de lecturas y hallar la velocidad de reaccin o actividad de ureasa.

Cul es el propsito de cada tubo?

Observar en cada uno de ellos como se da, que factores afectan y a qu velocidad se da la actividad enzimtica.

Cul es el tubo control?

El tubo control es una solucin que contiene una cantidad conocida de sustancia que se va a cuantificar y sirve para tomarla de referencia en el momento en que se mida la muestra real. En este caso actuaron como tubos control: 1, 1 (B) y blanco (como referencia para las tres experiencias) ya que en estos no se formo ninguna base

Es necesario ms de un tubo control?

No, ya que solo se necesita como referencia.

2) Observe las reacciones en los tubos de titulacin y anotar sus observaciones. Despus del sistema de incubacin de los tubos 1 y 2; agregamos en los tubos 1(B) y 2(B) 2mL de estos para agregarles rojo de metilo al 0.04 % se observo q en ambos la solucin torno amarillenta procedimos a titular con HCl hasta que torne en ambos una coloracin rosa plido que dar por finalizada esta. Las observaciones en el tubo 1(B) fueron que con solo 0.15 mL se torno al color rosa plido lo que se indico como tubo control, en el tubo 2(B) para que se torne rosa plido en la titulacin de HCl requiri 2.40 mL lo que se indico como un tubo problema que requiere de ms acido para poder neutralizar se.

- Se concluye que el el primer tubo 1 (B) se indico como un tubo control ya que solo contiene una cantidad sustancia que se proceder a cuantificar para tomarla de referencia cuando se mida la muestra real. En el segundo tubo 2(B) se indico como tubo problema porque se formo una base requiri de mas acido ya que en este existe una cantidad de sustancia que servir para la cuantificacin de la velocidad de reaccin.

3) Calcule las unidades de la ureasa a partir sus resultados.

vol. Hcl gastado TUBO 1 = 0.15 m l

vol. Hcl gastado TUBO 2 = 2.40 m l

NEUTRALIZACION

VELOCIDAD = (volumen Hcl gastado (problema) vol Hcl (blanco) )(molaridad) (1000)(4)

(15 minutos ) (2)(2)

VELOCIDAD = (2.40 m l 0.15 ml ) (0.05 N) (1000)(4)

= 7.5 mM/ min NH3 ( PH 7.2 -37 C)

(15)(2) (2)

COLORIMETRIA

Lecturas en el fotocolormetro

Tubo blanco= 0.02

Tubo 1 = 0.05

Tubo 2 = 0.59

>Tubo blanco tubo 1 = 0.02 -0.05 = -0.03

(x)

>Tubo blanco tubo 2 = 0.02 0.59 = -0.57

.(y)

Restamos x-y

-0.03- (- 0.57) = 0.54

VELOCIDAD = (LECTURA TUBO 2) (FACTOR DE CALIBRACION)

VELOCIDAD = (0.54)(837 mg) ]= 19.98 mg NH3 / ml

4) Cul es la funcin del HgCl2 en este ensayo? La funcin del Hg CL2 en experimentacin del sistema de incubacin es detener la actividad enzimtica de la ureasa.

5) Disear una tabla de resultados.

| | |Cuantificacin de producto formado : REACCION DE NEUTRALIZACION | | | | | |tubo 1B | |tubo 2B | |actividad ureasica |volumen (Hcl ) gastado

| |

| | |color del medio

|negativa

|0.15ml

|rosado palido

|positiva

|2.40 ml

|rosado palido

| |

| |

|Cuantificacin de producto formado : METODO COLORIMETRICO REACCION DE NESSLER | | | | |actividad ureasica espectrocolorimetro | |c olor del medio | | |lecturas en el

|tubo blanco | |Tubo 1 A | |Tubo 2 A |

|negativa

|0.02

|negativa

|0.05

|positiva

|amarillo intenso (ambar)

|0.59

6) A que datos experimentales puede remitirse para afirmar que las enzimas son de naturaleza proteica? Segn ello. Qu precauciones se deben tomar para manipular las enzimas? La naturaleza proteica de la enzima se demuestra al usar una solucion HCl para la titulacin de los tubos en la VALORACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA DE UREASA POE EL METODO DE LOS PRODUCTOS FORMADOS. De no ser usada dicha 'sustancia' y los indicadores respectivos la toma de datos no sera al correcta devido a la desnaturalizacin de la enzima a causa del pH.

La precauciones necesarias seria control del pH con indicadores u otros mtodos cuantitativos y cualitativos.

7) Explique el fundamento de la valoracin de la actividad de ureasa mediante el mtodo de los productos formados utilizando la reaccin de neutralizacin.

En este proceso el fundamento de la valoracin es poder neutralizar a la sustancia bsica que contienen el problema mediante un acido, para ello utilizamos el HCL (a mayor gasto de acido mayor producto). Por eso se observo un gran diferencia en valor del gasto entre el tubo 1(B) y 2(B).

8) Explique el fundamento de la valoracin de la actividad de ureasa por los productos formados utilizando el mtodo de colorimetra, reaccin de Nessler

Utilizamos el mtodo colorimtrico para determinar que el NH3 es un producto liberado por la urea.

El fundamento de la valorizacin d e la ureasa utilizando el mtodo de reaccin de Nessler es directamente proporcional a mayor intensidad mayor producto formado.

9) Cmo se denomina las sustancias sobre las cuales actan las enzimas? Explique los mecanismos.

Las enzimas catalizan un solo tipo de reaccin y siempre acta sobre un nico sustrato o sobre un grupo muy reducido de ellos.

E+S

[ES]

E+P

E: Enzima

S: sustrato

[ES]: complejo enzima sustrato

P: Producto

PRACTICA N2

1) Cual es el significado de Km?

El km es la afinidad de una enzima por su sustrato, tambin se denomina km cuando la cantidad de sustrato se hace igual a la mitad de la velocidad mxima (Vmax).

2) Todas las enzimas presentan el mismo valor numrico de Km?

El valor de km para cada enzima es diferente, depende de cada sustrato y de factores ambientales tales como pH, temperatura y fuerza inica

3) Cual es el significado de un km alto y un km bajo?

Un km alto indica poca afinidad de la enzima por su sustrato mientras que un km bajo significa alta afinidad de la enzima por su sustrato.

4) A que se denomina velocidad mxima de una reaccin enzimtica? Vmax: Es aquella que revela o da el numero de recambio de una enzima, que es el numero de molculas de sustrato convertidas en productos por unidad de tiempo x una molcula de enzima cuando este est totalmente saturado de sustrato

5) A que se denomina velocidad inicial de una reaccin enzimtica? Se denomina velocidad inicial (V0) como la velocidad de incremento de producto en funcin del tiempo cuando [P] es baja.

6) Utilizando la ecuacin final obtenida por Michaelis-Menten; a) Despejar el valor de Km en funcin de las otras variables. [pic] luego de los arreglos respectivos: [pic]

b) Despejar el valor de [S] en funcin de las otras variables.

[pic] luego de los arreglos respectivos: [pic]

c) Despejar el valor de Vmax en funcin de las otras variables. [pic] luego de los arreglos respectivos:

[pic]

7) En que unidades se expresa el Km? La unidad de Km es: micromoles ( M)

8) Qu importancia tiene la determinacin del Km de una enzima? Es importante para determinar cunto sustrato abra que agregar cuando se desea medir una enzima y para determinar cuan efectivamente una enzima esta funcionando en los tejidos de un organismo vivo.

9) Qu parmetros deben conocerse para determinar el Km de una enzima? Enzima Sustrato Temperatura (T) Ph Tiempo Cofactor

10) Cmo deben tabularse los datos para calcular la Km por el mtodo de Lineweaver-Burk?

Para este mtodo se necesita tabular de la siguiente manera:

|tubos |#1 |#2 |#3 |#4

|1/Sutrato (mM) |[S]1 |[S]2 |[S]3 |[S]4 |V1 |V2 |V3 |V4

|1/Velocidad | | | |

Para la grafica en el eje de las x va la inversa de la concentracin de sustrato y el eje de las y la inversa de la velocidad.