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BLOT
Prsent par:
La technique de Southern blot est une mthode dhybridation molculaire. Baptise du nom de son inventeur, le biologiste britannique Edwin Southern. Permet de visualiser nimporte quelle fraction du gnome condition davoir une sonde squence hybridant spcifiquement avec la squence analyser.
OBJECTIF
PRINCIPE DE LA TECHNIQUE
1-Prparation
de l'ADN tudier - Digestion ou fragmentation de lADN. - Sparation des fragments. - Dnaturation et neutralisation de l'ADN - Transfert de l'ADN sur une membrane - Fixation covalente de l'ADN sur la membrane
1- Digestion ou fragmentation de lADN Couper l'ADN en fragments de diffrents tailles enzymes de restrictions environ 106 fragments Ceci facilite lidentification des squences spcifiques Les fragments sont maintenant facilement spars par l'lectrophorse sur gel.
2-Sparation des fragments par lectrophorse sur gel Agarose ou polyacrylamide Sparation des fragments en fonction de leur tailles La coloration au B.E.T permet - contrler la qualit de lADN - contrler la migration - contrler la digestion enzymatique Visualisation sous UV.
3-Dnaturation
et neutralisation de l'ADN
1- Dnaturation
Le gel dlectrophorse est tremp dans une solution alcaline (NaOH) permettre la dnaturation de lADN bicatnaire. Le gel est immerg dans une solution neutralisante empcher la renaturation de lADN avant dajouter la sonde.
2- Neutralisation
fixation de l'ADN sur la membrane par : - Cuisson ou chauffage 80C (mb. nitrocellulose). - Exposition au UV (mb. nylon) fixer de manire permanente l'ADN sur la membrane.
2- PRHYBRIDATION
Saturer les sites de fixation de la membrane restes libres. - Pr incuber la membrane avec un ADN htrologue ( ADN de sperme de saumon).
3- HYBRIDATION
La membrane est mise en contact avec une sonde spcifique de la squence d'ADN recherche. La sonde doit tre marque (incorporation de radio-isotopes, par "tiquetage" de la molcule avec un fluorophore ) et dnature. La temprature d'hybridation soit ~65C.
4- LAVAGES
5- AUTORADIOGRAPHIE
Aprs dveloppement, il y aura les taches fonces sur le film partout o la sonde lie.
5- AUTORADIOGRAPHIE
Identification des mutation, dltions, et rarrangements des gnes. Prvision de certains cancers. Diagnostic de HIV-1 et des maladies infectieuses Tests paternit et en mdecine lgale.
RFRENCES
http://www.univrouen.fr/ABISS/L1/WEB/empreinte/southernblot. html http://www.chups.jussieu.fr/polys/biochimie/BGbi och/POLY.Chp.9.9.html http://highered.mcgrawhill.com/olcweb/cgi/pluginpop.cgi?it=swf::535::535 ::/sites/dl/free/0072437316/120078/bio_g.swf::Sout hern%20Blot Biochimie gntique, biologie molculaire