UNIVERZITA KARLOVA

PRODOVDECK FAKULTA
KATEDRA ZOOLOGIE
Vyuit cytonuklernch genetickch marker
pi studiu mezidruhovho ken parem
(rod Barbus) v prodn populaci
Zdenk Lajbner
Diplomov prce
Vedouc prce:
Mgr. Petr Kotlk, Ph.D.
Konzultanti:
Ing. Vra lechtov, CSc.
RNDr. Vlastimil lechta, CSc.
RNDr. Miroslav vtora, CSc.
Praha 2004
Podkovn
Na tomto mst bych velmi rd podkoval Mgr. Petru Kotlkovi, Ph.D., z stavu
ivoin fyziologie a genetiky (FG) AV R za veden diplomov prce a za vestrannou
podporu pi jejm vypracovvn.
Ing. Ve lechtov, CSc., a RNDr. Vlastimilu lechtovi, CSc., dkuji za etn
konzultace, neoceniteln rady a pomoc pi vyhodnocovn dat.
Bc. Jan Pivokov, Mgr. Jitce Pospilov a slen rce Peliknov dkuji za
vekerou pomoc v laboratoi i trplivost s mou neikovnost.
Ing. M. Rbov, CSc., Ing. Petru Rbovi, DrSc., Mgr. Karlu Jankovi a Mgr. Vendule
lechtov pat mj dk za cenn rady a podporu v prbhu prce.
RNDr. Miroslavu vtorovi, CSc., dkuji za laskav zhotn se funkce katedrovho
konzultanta a cenn rady.
Mgr. Jitce Uhlkov a Mgr. Magd Rokosov dkuji za pomoc tkajc se zskn a
obhajoby grantu FRV.
Mgr. Josefu Bryjovi Ph.D., a Mgr. Pavlu Munclingerovi, Ph.D., za rady ohledn
analzy mikrosatelitu.
Nepopsateln dk pat cel m rodin a Janice Potmilov za podporu i pochopen
v prbhu prce.
Dle bych velmi rd podkoval vem, kte mi jakkoli pomohli, vetn druiny: Zlch
hoch a tch holek.
Tato prce byla financovna z grantu FRV 2264 / 2002 (nositelka Mgr. Jitka
Uhlkov) a vnitrostavnm grantem FG AVR, slo IGA 06 / 03 (nositel Zdenk
Lajbner).

Prohlauji, e jsem diplomovou prci vypracoval samostatn s pouitm citovan literatury.
V Praze, dne 20. 8. 2004 ..
SEZNAM POUITCH ZKRATEK:............................................................................. 3
1. VOD....................................................................................................................... 4
1.1. Hybridizace, introgrese a jejich role v evoluci obratlovc............................................. 5
1.2. Jednotliv ppady hybridizace zpadopalearktickch parem podrodu Barbus........ 8
1.2.1. Barbus caninus Bonaparte, 1839 x Barbus plebejus Bonaparte, 1839........................ 8
1.2.2. Barbus haasi Mertens, 1924 x Barbus meridionalis Risso, 1826.................................. 9
1.2.3. Barbus meridionalis Risso,1826 x Barbus barbus (Linnaeus, 1758).......................... 10
1.2.4. Barbus peloponnesius Valenciennes, 1842 x Barbus albanicus Steindacher, 1870....11
1.2.5. Barbus tauricus Kessler, 1877 x Barbus petenyi Heckel, 1852...................................11
1.2.6. Barbus barbus (Linnaeus, 1758) x Barbus carpathicus Kotlk, Tsigenopoulos, Rb et
Berrebi, 2002.........................................................................................................................13
1.2.6.1. Barbus carpathicus............................................................................................... 14
1.2.6.2. Barbus barbus.......................................................................................................17
1.2.6.3. Mezidruhov hybridi.............................................................................................20
2. MATERIL............................................................................................................. 23
3. METODY................................................................................................................ 25
3.1. Detekce proteinov variability........................................................................................ 25
3.1.1. Postup..........................................................................................................................27
3.1.1.1. Pprava vzork.................................................................................................... 27
3.1.1.2. Elektroforza........................................................................................................ 27
3.1.1.3. Barven................................................................................................................. 28
3.1.1.4. Nomenklatura alel................................................................................................ 28
3.2. Analza DNA.................................................................................................................... 29
3.2.1. Jadern DNA............................................................................................................... 29
3.2.1.1. Mikrosatelity........................................................................................................ 29
3.2.1.1.1. Postup............................................................................................................30
3.2.2. Mitochondriln DNA................................................................................................. 30
3.2.2.1 Vlastnosti mitochondriln DNA.......................................................................... 31
3.2.2.2. Postup...................................................................................................................31
3.3. Analza populan struktury (F statistika)....................................................................34
3.4. Detekce cytonuklern nerovnovhy.............................................................................. 36
3.5. Odvozen pvodu jedince ............................................................................................... 37
4. VSLEDKY............................................................................................................ 38
4.1. Nuklern znaky............................................................................................................... 38
4.1.1. Analza lokus kdujcch proteiny............................................................................38
4.1.1.1. Distribuce alel...................................................................................................... 38
4.1.2. Analza mikrosatelitu................................................................................................. 39
1
4.1.3. Genetick variabilita................................................................................................... 40
4.1.3.1. Prmrn poet alel v polymorfnch lokusech.....................................................42
4.1.3.2. Prmrn heterozygotnost v polymorfnch lokusech........................................... 42
4.1.3.3. Vnitropopulan variabilita.................................................................................. 42
4.1.3.4. Variabilita mezi subpopulacemi...........................................................................44
4.1.3.5. Formln test nhodnho pen mezi obma druhy............................................ 44
4.2. Mitochondriln DNA...................................................................................................... 45
4.3. Cytonuklern nerovnovhy............................................................................................46
4.3.1. Povod Popradu........................................................................................................... 46
4.3.2. Povod Dunaje.............................................................................................................48
4.3.3. Ob povod dohromady............................................................................................... 49
4.3.4. Interpretace dle Avise..................................................................................................51
4.4. Hybridn genotypy........................................................................................................... 52
5. DISKUSE............................................................................................................... 54
5.1. Populan-genetick charakteristika populac............................................................. 54
5.2. Hybridn situace u parem rodu Barbus......................................................................... 56
5.2.1. Scn hybridizace Barbus barbus a B. carpathicus.................................................... 56
5.2.1.1. Mon dvody zjitn situace............................................................................ 56
5.2.1.1.1. Etologick..................................................................................................... 56
5.2.1.1.2. Ekologick.................................................................................................... 57
5.2.1.1.3. Fyziologick.................................................................................................. 58
5.2.1.2. Porovnn s pedchozmi zjitnmi..................................................................... 59
5.2.1.3. Porovnn s ostatnmi ppady mezidruhov hybridizace v rmci podrodu Barbus.
...........................................................................................................................................60
6. ZVR .................................................................................................................. 61
7. PERSPEKTIVY...................................................................................................... 62
SEZNAM POUIT LITERATURY............................................................................ 63
SEZNAM TABULEK.................................................................................................. 75
SEZNAM OBRZK................................................................................................. 75
PLOHY................................................................................................................... 76
2
Seznam pouitch zkratek:
stupn, minuty, vteiny
; samec, samice
A ampr
BMNH Natural History Museum (dve British Museum, Natural History),
Londn, Velk Britnie
BFB bromfenolov mod
bp pry baz
CMK soukrom kolekce Maurice Kottelata
cyt b gen pro cytochrom b
D koeficient nerovnovhy
DNA deoxyribonukleov kyselina
dNTP sms deoxyribonukleotid
ds dvojvlknov (double stranded)
dsDNA dvouetzcov DNA
DT dlka tla ryby (longitudo corporis): vzdlenost od piky rypce, nebo
horn elisti po bzi kaudln ploutve (styk mezi hypurlnmi kostmi a paprsky
ocasn ploutve) (Holk et Hensel 1972)
E vchodn zempisn dlka
EDTA etylendiamintetraacett disodn
EtBr EthidiumBromid
h.,hod. hodina
H
2
O demineralizovan voda
kbp 1000 pr baz
M (mM) molrn (milimolrn) roztok
min. minuta
MNHN Musum National dHistoire Naturelle, Pa, Francie
m.n.m. metr nad hladinou moe
mtDNA mitochondriln deoxyribonukleov kyselina
MsO SRZ Miestna Organizcia Slovenskho Rybrskeho Zvzu
N severn zempisn ka
nDNA jadern DNA
NMW Naturhistorisches Museum, Vde, Rakousko
ot. otky
PAN Polska Akademia Nauk (Polsk akademie vd)
PCR Polymerasov etzov reakce (polymerase chain reaction)
RFLP dlkov polymorfismus restriknch fragment
s.,sec. sekunda
s. l. sensu lato (myleno iroce)
s. str. sensu stricto (myleno zce)
TBE Tris-borate-EDTA
TRIS Tris-(hydroxymethyl)-aminometan
tzv. takzvan
V volt
3
1. vod
Ryby a rybovit obratlovci jsou nejrozmanitj skupinou recentnch obratlovc.
V roce 1976 jich bylo znmo 18 818 druh (Nelson 1976). Roku 1994 to bylo vce ne 24 600
druh (Nelson 1994). V roce 2001 ji uvd Kottelat (stn sdlen) vce ne 26 880 druh.
V souasnosti bude toto slo jist o poznn vy.
Kaprovit (Cyprinidae) pat k druhov nejpoetnjm eledm ryb (i obratlovc
vbec) na svt. Jejich pvodn arel zahrnuje vechny kontinenty vyjma Jin Ameriky a
Austrlie (Nelson 1994). Jsou primrn sladkovodn a nemohou pekonvat moe. Dky tomu
jejich rozen reflektuje geologick vvoj pevniny (Durand et al. 2002). Parmy jsou azeny
do podeledi Cyprininae v n tvo vlastn skupinu (tzv. Barbin lineage) (Howes 1991).
Rod Barbus ustavili Cuvier a Cloquet roku 1816 pro druh Cyprinus barbus popsan Linnem.
Rod Barbus sensu lato je asto zmiovn jako monstrzn agregace (Myers 1960), a
nepli dobe prozkoumn (Berrebi 1995; Berrebi et al. 1996). Se svmi vce ne 800 druhy
(Howes 1987), ijcmi po cel Evrop, Africe i Asii, tvo dominantn sloku kaprovitch ryb
starho svta (Tsigenopoulos et Berrebi 2000) a po nomeklatorick strnce se jedn pouze o
sbrn taxon bez systematick hodnoty.
Vsledky fylogenetickch studi indikuj roztpen ve zmnho taxonu Barbus do
pti hlavnch lini: I) rod Barbus sensu stricto (evolun tetraploidn, dle lenn na podrody
Barbus a Luciobarbus; Doadrio 1990), II) hexaploidn druhy, III) Etiopsk tetraploidn druhy,
IV) Africk diploidn druhy a V) Asijsk diploidn druhy. Piazen cizch rod jako
sesterskch skupin k nkterm z tchto monofyletickch soustav (nap. rod Aulopyge k
Barbus s. str., i Varicorhinus k hexaploidnm parmm) ukazuje na polyfyletick pvod cel
takto pojman taxonomick konstrukce, tj. Barbus sensu lato (Machordom et Doadrio 2001a)
(Ploha 1.). Do podrodu Luciobarbus je zcela recentn azen i rod Capoeta (Durand et al.
2002; Berrebi et Tsigenopoulos 2003).
Vtina zstupc rodu Barbus s. str. se nachz v mediternn oblasti, kde obv
znan omezen arely (Kotlk et Berrebi 2001) .
Je zejm, e v evoluci parem hrla vznamnou roli polyploidizace. Pbuznost mezi
jednotlivmi liniemi poukazuje na homoplazick charakter genomovch duplikac, k nim
muselo dojt alespo ve tech oddlench periodch, i ve tech oddlench arelech
(Machordom et Doadrio 2001a). K polyploidizaci nejsp dochzelo procesem alopoly-
ploidizace, kdy dochz ke splynut dvou bunk za zven stupn ploidie (dky hybridizaci
dvou, i vce druh), narozdl od autopolyploidizace, kdy dochz ke zven stupn ploidie
4
v dsledku mitzy, j nensleduje bunn dlen (Dowling et Secor 1997). Oellermann et
Skelton (1990) se domnvaj, e monost potku hexaploidn linie alopolyploidizac je
pravdpodobnj. Alopolyploidizace nejsp stla rovn na potku evropsk tetraploidn
linie (Chenuil et al. 1999).
Polyploidizace napomh hybridizan speciaci. Jestlie se mezi sebou zk nap. dva
tetraploidn organismy, obsahuj jejich gamety ji dvojice homolognch chromozom, take se
pi mitze me vytvoit zcela pravideln dlic vetnko a chromosomy mohou bt rozdleny
do dceinnch bunk naprosto rovnomrn. Pedpokld se, e polyploidi jsou tolerantnj
vi ekologickm vkyvm, protoe duplikace gen pin metabolickou flexibilitu (Uyeno
et Smith 1972; Otto et Whitton 2000) a tm vznamnj evolun plasticitu.
1.1. Hybridizace, introgrese a jejich role v evoluci obratlovc
Hybridizace je definovna jako ken jedinc dvou populac nebo skupin populac,
kter jsou odliiteln dle jednoho, i vce ddinch znak (Harrison 1990). Detekce a
klasifikace hybrid pomoc tradin vyuvanch morfologickch znak jsou asto nepesn a
mohou vzt k chybnm zvrm. Prudk rozvoj modernch biochemickch a molekulrn-
genetickch metod umonil rutinn vyuit genetickch dat pi studiu hybridizace. asto
citovanmi pednostmi vyuit molekulrnch marker jsou: 1. velk poet analyzovatelnch
nezvislch znak, 2. pm genetick kontrola, 3. nzk hladina neddin variability, 4.
pedpokldan selektivn neutralita, 5. schopnost odliit mateskho rodie od otcovskho
(Rieseberg et Randall Linder 1999).
Bariry zabraujc pirozen hybridizaci lze rozdlit do dvou hlavnch kategori:
prezygotick a postzygotick (pre- a postkopulan; Mayr 1963). Prezygotick zahrnuj rzn
typy chovn v dob rozmnoovn, kter psob pedevm na vbr partnera, naasovn a
lokaci. Dleitou roli hraje i vzjemn rozpoznn gamet (Howard et al. 1998). Postzygotick
zbrany jsou zpsobeny vnitnmi genomovmi inkompatibilitami (endogenn selekce) a/nebo
okolnmi interakcemi mezi fenotypem a prostedm (exogenn selekce) (Arnold 1997).
Porozumn relativnm rolm pre- a postzygotickch proces v evoluci reprodukn izolace je
podstatnou soust vzkumu speciace (Howard et al. 1998).
5
Hybridizace je bn a asto vede k introgresi (Turner 1999). Introgrese je trvalou
inkorporac gen z jedn skupiny diferencovanch populac do jin, neboli zalenn
cizorodch variant gen do novho, reprodukn izolovanho populanho systmu
(Rieseberg et Wendel 1993). Akoliv me k inkorporaci cizorodch gen dochzet rznmi
zpsoby (napklad nsledkem vnitrobunn parazitace), budu se v nsledujcm textu
zabvat vhradn introgres v dsledku pirozen hybridizace.
Introgrese rozlinch genetickch znak obvykle bv interpretovna jako neutrln
difze. Mnostv pklad z populan genetickch analz prodnch vzork i experimen-
tlnch studi vak naznauje efekt pozitivn prodn selekce na introgresivn hybridizaci. Na
introgresivn hybridizaci a pozitivn selekci je rovn nahleno jako na ppadn
zprostedkovatele invaze do novho biotopu a prostorov expanze (Arnold 1997).
Jako hybridn taxon je mono oznait nezvisle se vyvjejc, historicky stabiln
populaci, nebo skupinu populac, obsahujc uniktn kombinaci ddinch vlastnost,
vytvoenou kenm reprezentant dvou, i vce diskrtnch taxon (nap. ras, poddruh,
druh atd.). Historick stabilita vede nutn k zvru, e mozaika vlastnost zddnch po
nezvislch linich je zachovna v populaci, penena z rodi na potomstvo (Dowling et
Secor 1997).
I v souasnosti role prodn hybridizace v evoluci zstv pedmtem spor (Plnet et
al. 2000; Seehausen 2004). Ji Anderson a Stebbins (1954) shrnuli dvody pro dleitost
hybridizace v evoluci rostlin. Domnvali se, e introgrese a hybridizace mohou penet bloky
gen mezi stabilizovanmi, adaptovanmi skupinami, umonit rychl peskupovn rznch
adaptac a komplexn modifikace systm. Tmto zpsobem me bt velmi zven poet
variant a selekce by mohla psobit pi segregaci blok genetickho materilu, odvozench
z odlinch adaptivnch systm obsahujcch jednu, i dv nov alely generovan mutac.
Tato souhra okolnost me bt sten prospn, pokud jsou zmnou prosted vytveny
nov niky. Nsledn evoluce me probhnout maximln mrou.
Jeliko je podl spnch potomk u ivoinch hybrid mnohem ni (jednotliv
stupn vvoje jsou kontrolovny komplikovanjmi a integrovanjmi komplexy gen, ne
je tomu u rostlin), zoologov evolun vznam hybridizace dlouho podceovali. Dle
Templetona (1981) nsleduje po hybridizaci inbreeding a zhroucen hybrid, peij-li vak
ivotaschopn a plodn rekombinanti, mohou se reprodukn izolovat od obou rodiovskch
forem a stt se odlinmi entitami. Ji Stebbins (1966) konstatoval, e vzcn genov
kombinace se mohou upevnit velmi rychle, tud hybridizace me hrt vt roli v evoluci
ivoich, ne se obvykle pedpokld.
6
Hybridn zny jsou vtinou omezen oblasti, kde se geneticky odlin populace, nebo
druhy setkvaj, p a produkuj hybridy (Barton et Hewitt 1985). Harrison (1990) je
nadnesen oznauje jako okna do evolunch proces, Barton et Hewitt (1985) zase jako
prodn laboratoe.
Existuj dv stanoviska, dle nich lze posuzovat vliv pirozen hybridizace z hlediska
konzervan biologie.
Prvn povauje pirozenou hybridizaci za zhoubnou pro biodiverzitu. Parentln druhy,
kter se samostatn vyvjely po miliony let a vytvoily si sv odlin lokln adaptace, je
mohou dky hybridizaci ztratit (Allendorf et al. 2001). Dle hybridizace me vst k tzv.
outbreedn depresi, snen plodnosti (fertility) a ivotaschopnosti (viability), mon kvli
chromozmovm odlinostem nebo zruen koadaptovanch genovch komplex (Templeton
et al. 1986), i genetick asimilaci, kdy poetnj taxon jednodue vsteb ten vzcnj.
Podle druhho naopak hybridizace mezi vzcnm a poetnjm taxonem me vystit
v genetick obohacen ohroen formy. Vzcn forma je rovn podporovna zvenm
fitness dky nrstu genetick variability. To podporuje prostorovou expanzi a hybridn
populace funguje jako genetick rezervor pro rekonstrukci rodiovskch genotyp/fenotyp
(Arnold 1997). Hybridizace a introgrese zvyuj genetickou diverzitu produkc novch
rekombinantnch genotyp pravdpodobn mnohem rychleji, ne mohou mutace (Dowling et
Secor 1997).
U ryb je ve srovnn s ostatnmi obratlovci (Winfield et Nelson 1991) pirozen
hybridizace relativn bnm jevem (Hubbs 1955; Schwartz 1981). Zpsobuje to
pravdpodobn souhra rznch faktor, kter zahrnuj vnj oplozen, asto nerovnomrnou
abundanci rodiovskch druh a kompetici o prostorov omezen trdlit. Mezidruhov
hybridi ryb bvaj mn asto postieni genomovmi inkompatibilitami, ne je tomu u jinch
obratlovc. Lid indukuj introgresivn hybridizaci pedevm introdukcemi exotickch druh
ryb, nebo modifikacemi habitat (Scribner et al. 2001).
V eledi kaprovitch ryb vetn rodu Barbus je mezidruhov hybridizace ast a
hybridi jsou asto fertiln, i kdy jejich plodnost, ovlivnn mnoha faktory, me bt snena
(Pethon 1978; Chevassus 1983; Wood et Jordan 1987; Berrebi et al. 1993; tancl 1996).
7
1.2. Jednotliv ppady hybridizace zpadopalearktickch parem podrodu Barbus
Podrod Barbus tvo monofyletick skupina parem, kter se od podrodu Luciobarbus
Heckel, 1843, fylogeneticky oddlila pravdpodobn ped vce ne osmi miliony let (tzv.
Rhodsk tektogenn etapa, kter reaktivovala latitudiln sloku Alpinskho orogennho psu)
(Machordom et Doadrio 2001b). Podrod Barbus se mimo jin vyznauje ptomnost
vyhloubench lcovitch [dentes exclavati cochleariformes, dle Heckela (1843)] trojadch
poerkovch zub (dentes pharyngei: 2.3.5.-5.3.2.) na poerkov kosti ptho abernho
oblouku. Centrum rozen podrodu se nachz v severnm mediternu. Nkte autoi len
druhy podrodu Barbus na velk fluvio-lacustrinn je se jev jako skupina monofyletick, a
mal rheofiln, jejich pvod se vak zd bt polyfyletick (Tsigenopoulos et Berrebi 2000)
(Ploha 2.). Drobn rheofiln druhy lze dle rozdlit do dvou skupin, na druhy spadajc do
okruhu B. petenyi a do okruhu B. cyclolepis (Berrebi et Tsigenopoulos 2003).
Mezidruhov hybridizace tchto parem je zajmav jev. Jednotliv druhy jsou si
znan podobn. Klasick taxonomie zaloen na morfologii nedoke mnohdy s uritost
vyeit fylogenetick vztahy mezi jednotlivmi formami. Rozlien, pedevm nslednch
generac, hybrid pouze na zklad morfologie je rovn dosti sloit a nepli spolehliv
(Valenta et al. 1979), co se netk pouze rodu Barbus, nbr i jinch skupin ryb s vysokm
obsahem DNA (Wolf et al. 1969). Biochemick a molekulrn genetick metody jsou v tomto
ppad nezbytnm nstrojem pro zjitn hybridnho statutu jedinc a smr introgrese
v prod (Kocher et Stephien 1997).
1.2.1. Barbus caninus Bonaparte, 1839 x Barbus plebejus Bonaparte, 1839
Barbus caninus je malm rheofilnm druhem, kter dle Bianca (1995) pvodn obval
Pdsko - Bentskou ichtyogeografickou oblast severn Itlie. Introdukovn byl do nkolika ek
stedn Itlie. Bhem 20. stolet byl rznmi autory, jako napklad Karamanem (1971),
povaovn za poddruh B. meridionalis (detaily in Bianco 2003). Statut druhu mu navrtil
Bianco (1995) na zklad morfologie.
Barbus plebejus je velkm fluvio-lacustrinnm druhem. Bianco (1995) uvd, e
pvodn rovn obval Pdsko-Bentskou oblast. Introdukovn byl do TosknskoLatinsk
ichtyogeografick oblasti, kterou ji obval B. tyberinus. Nkolika autory byl v minulosti
povaovn za poddruh B. barbus, nikoli vak Karamanem (1971) (detaily in Bianco 2003).
8
Betti (1995) popsal pomoc morfologickch znak B. plebejus x B. caninus hybridn
znu v ece Adige. Tsigenopoulos et al. (2002) analzou mitochondriln DNA (mtDNA) a
alozym zjistili introgresi gen B. plebejus do genomu B. caninus.
Dle tchto autor je forma nazvan B. tyberinus geneticky velmi blzk B. plebejus,
protoe nevykazuje dn jasn rozdly ani v alozymovch, ani v mtDNA markerech. Bianco
(2003) vak tyto zvry odmt.
Dle Tsigenopoulose et al. (2002) dva jedinci B. caninus z eky Pellice (povod Pdu,
sever Itlie) ve svch genotypech nesli 6 alozymovch alel, charakteristickch pro populace
B. plebejus / B. tyberinus. Pt z nich se nachzelo v heterozygotnm stavu s alelou specifickou
pro B. caninus. V ece Pellice ij B. caninus spolen s B. plebejus a tyto alely zde mohou bt
vsledkem introgrese. To je podpoeno i mtDNA daty. Tito dva jedinci obsahovali
charakteristick haplotyp B. plebejus. Tento druh se nejsp rozil do povod ek, pedtm
obvanch pouze B. caninus (Tsigenopoulos et al. 2002).
Bianco (1995) mimo hybrid B. caninus x B. plebejus v Pdsko-Bentsk oblasti
upozoruje na existenci hybridnch jedinc B. caninus x B. tyberinus v centrln Itlii, kam
byl B. caninus introdukovn. dn podrobnj prce se vak tmto ppadem dosud
nezabvala. V Itlii velmi asto dochzelo k rozshlm introdukcm ryb, ani byl pedem
znm taxonomick statut forem jak nativnch, tak introdukovanch (Bianco et Ketmaier
2001). Napklad v ece Omrone ij spolu s pvodnm druhem B. tyberinus, kter je zde
ohroen vyhynutm, dal ti pro toto povod exotick druhy parem (Bianco 1995).
1.2.2. Barbus haasi Mertens, 1924 x Barbus meridionalis Risso, 1826
Jde o dva blzce pbuzn rheofiln druhy s parapatrickmi arely rozen, o
taxonomickm statutu B. haasi vak petrvvaj pochybnosti. Nejprve byl popsn jako druh
(B. haasi Mertens, 1924), pot piazen jako poddruh B. barbus (B. b. bocagei Almaa, 1971),
B capito (B. capito haasi, Karaman 1971) a B. plebejus (B. plebejus haasi Almaa, 1982)
(Machordom et al. 1990). Na zklad studia extern morfologie a osteologie panlskch
parem rodu Barbus Doadrio (1984) navrtil B. haasi status druhu, jeliko se v mnoha znacch
li od B. barbus, B. plebejus i B. capito. Naopak zjistil, e jej pouze minimum znak odliuje
od B. meridionalis, co plat i u dat, zskanch analzou mtDNA (viz. Ploha 2.). Callejas et
Ochando (2002) rovn uvdj, e B. meridionalis a B. haasi vykazuj dle RAPD (Randomly
Amplified Polymorphic DNA) divergenci, kter bv vtinou pisuzovna poddruhm.
9
Machordom et al. (1990) pomoc enzymov elektroforzy analyzovali pt populac
parem z ek Matarraa, Ripoll, Tordera, Arbucias a Dourbie, aby ovili hybridizaci tchto
dvou druh ve panlsku. Populace z eky Ripoll, kter se nachz na hranici arel mezi
obma druhy, je nejsp hybridnho pvodu, nebo obsahuje znaky charakteristick pro oba
druhy. Nebyli zde chyceni jedinci ani jedn ist linie, ani F1 generace. Vsledn genotyp tto
populace je patrn nsledkem hybridizace v minulosti a v souasn dob ji zde ke kontaktu
s rodiovskmi druhy nedochz.
1.2.3. Barbus meridionalis Risso,1826 x Barbus barbus (Linnaeus, 1758)
Barbus barbus lze zaadit do skupiny velkch fluvio-lacustrinnch parem. Jde o iroce
rozen druh, jeho arel se rozkld od jihovchodn Anglie po ernomosk mo. Chyb
ve vtin jin Evropy (Kotlk et Berrebi 2001).
Barbus meridionalis je rheofiln. V minulosti byla rznmi autory tmto nzvem
oznaovna velk st parem, obvajcch evropskou st stedozemnho a ernomoskho
mo. V souasnosti jsou tak nazvny pouze parmy obvajc eky jihovchodn Francie a
severovchodnho panlska (Doadrio et Perdices 2003).
Hybridizace B. meridionalis a B. barbus byla pozorovna v ece Lergue spadajc do
povod eky Hrault a zkoumna na zklad genetickch i morfologickch znak. dn
z padesti ulovench hybrid se neukzal bt F1, objevili se zptn kenci i potomstvo
kenc. Plodn byli hybridn jedinci obojho pohlav. Studovan hybridn populace
obsahovala vt mnostv alel B. barbus, ne B. meridionalis. Morfologick znaky koreluj
s genetickou introgres (Berrebi et al. 1993; Daryus et Berrebi 1993; Chenuil et al. 2000).
Philippart et Berrebi (1990) experimentln zjistili, e hybridn samci prvn fililn
generace (F1) vznikl kenm jikernaky B. barbus a mlka B. meridionalis jsou steriln.
Hybridn jedinci samiho pohlav naopak ji ve dvou letech vku pohlavn dospvaj a jsou
schopni vtru. Do dvou let vku rstov rychlost i dlkov pohlavn dimorfismus F1 hybrid
odpovd B. barbus, chovanch za stejnch podmnek. Berrebi et al. (1992) uvdj a
trojnsobn vy spotebu kyslku u nkterch hybrid.
Bhem experimentlnch simulac pirozenho vtru v akvrich, neobjevili Poncin et
al. (1994) dn kompletn behaviorln bariry, kter by spolen vtr tchto dvou druh
blokovaly.
10
1.2.4. Barbus peloponnesius Valenciennes, 1842 x Barbus albanicus Steindacher, 1870
Barbus albanicus, endemit severozpadnho ecka, z fylogenetickho hlediska pat
mezi stedn vchodn druhy podrodu Luciobarbus (Berrebi et Tsigenopoulos 2003) a proto
se jm nebudu podrobnji zabvat.
Barbus peloponnesius je drobn rheofiln druh, kter obv sympatricky s druhem
pedchozm zpad ecka, na rozdl od nj se vak vyskytuje i na jihu Peloponskho
poloostrova (Zardoya et Doadrio 1999). Karaman (1971) pod tmto nzvem vytvoil
polytypick druh, do nj slouil nkolik rznch forem, napklad B. petenyi a B. rebeli, co
m za nsledek rzn nesrovnalosti a dodnes. Tohoto schmatu se pidruje, akoli
pochybuje, i Kottelat (1997). Economidis et al. (2003) ve zmnn druhy vytrvale povauj
za pouh poddruhy.
Economidis et Herzig-Straschil (2003) uvdj, e se tyto dv formy k v ece
Achelous, odkud byl v roce 1939 Stephanidisem popsn a zakreslen jeden jedinec. Akoliv je
tento ppad zajmav, nebo zastnn druhy spadaj do rznch podrod, nikdo jej zatm
hloubji nezkoumal.
1.2.5. Barbus tauricus Kessler, 1877 x Barbus petenyi Heckel, 1852
Systematick postaven velk fluvio-lacustrinn formy z vchodu Bulharska, kterou
v tomto ppad nazvm B. tauricus, je zatm stle nejasn. Bogutskaya et al. (2003) uvd
pro tuto oblast endemick poddruh B. tauricus bergi pvodn popsan jako B. barbus bergi
Chichkoff, 1935. Kotlk et Berrebi (2001) na zklad porovnn mtDNA ukzali, e bulharsk
parmy byly geneticky nediferencovan od B. escherichii Steindachner, 1897, z ernomoskch
ptok v severn Anatolii a souasn evolun blzk B. barbus ze stedn Evropy, a
doporuili je proto povaovat za poddruh B. barbus escherichi. Nsledn podrobnj studie
Kotlka et al. (2004) ukzala, e B. tauricus z Krymskho polostrova byli geneticky velmi
blzc populacm ze severn Anatolie a z vchodnho Bulharska, a provizorn proto
Bulharskou formu oznaili jako B. tauricus escherichii. Tito autoi upozornili na nutnost
taxonomick revize druhovho komplexu B. barbus a B. tauricus z celho povod ernho
moe (Kotlk et al. 2004).
11
Barbus petenyi je malm rheofilnm druhem. Akoli byla tato parma pvodn popsna
jako druh (Heckel 1852), vtina nsledujcch autor ji piazovala jako poddruh k B.
meridionalis Risso, 1826 (Steindachner 1882; Berg 1949), nebo B. peloponnesius
Valenciennes, 1842 (Karaman 1971). Samotn B. peloponnesius vak nap. Almaa (1984)
piadil jako poddruh k B. meridionalis. Pesto napklad Starmach et Roso (1961), i
Rembiszewski et Rolik (1975) povaovali druhov status B. petenyi za oprvnn.
Taxonomie drobnch rheofilnch parem v prbhu 20. stolet lkala mnostv autor, asto
doznvala radiklnch zmn a mezi rznmi vdci panuj neshody i nadle. V souasnosti se
ada autor na zklad molekulrnch dat pikln k nzoru, e B. petenyi je nutno povaovat
za samostatn druh (Karakousis et al. 1995; Tsigenopoulos et al. 1999; Tsigenopoulos et
Berrebi 2000; Machordom et Doadrio 2001b; Kotlk et Berrebi 2002; Kotlk et al. 2002).
Kotlk et Berrebi (2002) fylogenetickou analzou mtDNA a porovnnm dostupnch
alozymovch dat (Tsigenopoulos et al. 2002) identifikovali v rmci B. petenyi ti divergentn
evolun linie odpovdajc druhm.
Kotlk et al. (2002) uvdj, e tento druh obv horsk a podhorsk potoky a ky
povod stedn Tiszy a dolnho Dunaje ve Vchodnch a Jinch Karpatech Rumunska.
Nejsevernj znm populace se nachz v ece Mure v Transylvnii. Dle se vyskytuje
v povod dolnho Dunaje v poho Star Planina Bulharska. Mimo povod Dunaje je jet
znm z bulharsk eky Kamtchya na vchod poho Star Planina, kter samostatn st do
ernho moe a patrn tvo jihovchodn hranici jeho rozen.
Dobrovolov (1993; 1996) popsal pirozenou hybridizaci B. tauricus a B. petenyi
pomoc izoelektrick fokusace (IEF) i krobov horizontln elektroforzy sedmi proteinovch
systm. V ece Eleshnitsa (povod Kamtchyi) zjistil vskyt F1 generace a zptnch kenc
k B. petenyi. Tent autor se ve svch pracech rovn okrajov zmiuje o hybridizaci B.
petenyi a B. barbus v povod Dunaje. Bnrescu et al. (2003) uvdj historickou masovou
hybridizaci tchto dvou druh v ece Bistriva Moldoveneacsa, indukovanou vstavbou
vodnch dl. Ionescu (1968) piadil hybridn jedince k B. plebejus. O nkolik let pozdji
parmy z tohoto povod vymizely (Bnrescu et al. 2003).
12
1.2.6. Barbus barbus (Linnaeus, 1758) x Barbus carpathicus Kotlk, Tsigenopoulos, Rb et
Berrebi, 2002
Obrzek 1. Arel pvodnho rozen Barbus barbus a B. carpathicus.
Arely rozen obou druh se pekrvaj (jsou sympatrick). V mstech spolenho
vskytu vak B. carpathicus v jednotlivch tocch zaujm vdy ve poloen seky (jejich
distribuce v prostoru je parapatrick). Existuj ale pomrn irok zny, kde se oba dva druhy
vyskytuj souasn (syntopicky). Geografick arel jejich rozen ukazuje mapka. (Obrzek
1.)
13
1.2.6.1. Barbus carpathicus
Obrzek 2. Barbus carpathicus z eky Udava; ilustrativn foto (4.8.2004)
Obrzek 3. Barbus carpathicus z eky Udava; ilustrativn foto (4.8.2004)
14
Na zklad fylogeografick studie B. petenyi, pomoc sekvenc mitochondrilnho
(mtDNA) genu pro cytochrom b (cyt b) a analzy alozym, dospli Kotlk et Berrebi (2002)
k zvru, e se jedn o polyfyletick taxon, vyadujc revizi. Kotlk et al. (2002) jej rozdlili
v ti linie, odpovdajc druhm, kter lze sice jen tko rozliit pomoc morfologie, ale maj
odlinou evolun historii (tzv. cryptic, neboli sibling, species): B. carpathicus, B. balcanicus
a B. petenyi. Pedci nejen B. carpathicus a B. balcanicus, ale i napklad B. caninus a B.
meridionalis se od linie vedouc k B. petenyi (obsahujc v t dob jet pedky napklad B.
prespensis a B. rebeli) oddlili pravdpodobn ji ped 5,6 - 6 miliony let, koncem miocnu.
V prbhu pliocnu, ped asi 4 miliony let, se od sebe odtpily linie vedouc k B. carpathicus
a B. balcanicus.
Holotyp B. carpathicus, NMW-94604 (pvodn PK521, ternn slo 7273), 110,0
mm, ulovili V. lechta a P. Kotlk 9. jna 1998. Typovou lokalitou (Terra typica) je eka
Ublianka v Ube, kter je ptokem Uhu v povod Dunaje (48 53 N, 22 23 E).
Morfologicky se B. carpathicus od B. balcanicus a B. petenyi li mrn delm
rypcem, kter je zapiatl a ponkud i zbarvenm. Zkladn zbarven horn poloviny tla je
tmavohnd, spodn st tla a bicho jsou bl se lutavm ndechem. Hbet, boky a v men
me i hlavu m pokryty drobnmi tmav hndmi skvrnami. Naloutl a jemn skvrnit jsou i
neprov ploutve, narozdl od provch ploutv, kter jsou beze skvrn (Kotlk et al. 2002). Dle
Peze (1995) jsou zejmna na ocasn a hbetn (dorzln) ploutvi patrn nznaky pskovit
pigmentace. Dorzln ploutev je vyztuena 2(3) nebo 3(4) nevtvenmi (posledn mkk,
posteriorn neozuben) a 7(8) nebo 8(9) vtvenmi paprsky (lepidotrichia), z nich posledn
je v bzi roztpen. Jej vnj okraj je rovn, nebo slab konkvn. (Bin ploutve [pinnae
ventrales] tvo 2 nevtven a 9 vtvench; prsn ploutve [pinnae pectorales] 1 nevtven a
13-17 vtvench lepidotrichi.) itn (anln) ploutev obsahuje 1(2) nebo 2(3) nevtven a 4
(5) nebo 5 vtvench lepidotrichi, posledn je rovn bazln roztpeno. Pi sklopen
dosahuje anln ploutev mezi sted ocasnho nsadce a sted ocasnho ploutevnho laloku.
Poet perforovanch upin (squamae) v postrann e (linea lateralis) dosahuje 51(52)-64
(57). Poet ad nad postrann rou in 8(10)-12(12), pod postrann rou 8(6)-9(9).
Pobinice (peritoneum) je ern pigmentovan melanofory (Kotlk et al. 2002). U st jsou 2
pry dosti dlouhch vousk, pedn pr dosahuje po zadn nozdry, zadn pr do poloviny oka,
nebo a k jeho zadnmu okraji. Hodnoty v zvorkch uvd Pez (1995).
Pohlavn dimorfismus nen pli vrazn. Dle Peze (1995) se vtina autor shoduje
v rozdln relativn dlce itn ploutve, kter by mla bt del u samic. K odlien lze pout
rovn charakteristick stavn ploutv samc pi stisknut, podobn jako u vtiny
15
kaprovitch ryb. Movchan et Smirnov (1981) uvd, e se samci dovaj maximln 4 let
vku (DT 129 mm) a samice a 8 (DT 205 mm). Pekrik (2004) bhem tletho vzkumu
nezjistil v ece Udav dnho jedince starho 5 let (DT 170mm). Samci v ece Udava jsou
schopni vtru ji ve st 1+, kdy m kolem 70 mm (vlastn pozorovn).
Vtr je porcov (dvkov) a probh na mlinch od ervna do srpna s odstupem 15-
30 dn. Tyto litofiln ryby vytvej skupinky o maximln 10 jedincch a tou se do hnzd o
prmru asi 50 cm, kter je mono pozorovat, dky oranovm jikrm, jimi je trkovit dno
pokryto. Prmrn absolutn plodnost se pohybuje okolo 4000 jiker na jikernaku (Movchan
et Smirnov 1981).
Barbus carpathicus obv byste tekouc a nepli hlubok seky horskch a
podhorskch tok Zpadnch a Vchodnch Karpat (Kotlk et al. 2002). Pravdpodobn zde
v ichtyobiologick klasifikaci rybch psem tato parma nahrazuje lipana podhornho
[Thymallus thymallus (Linnaeus, 1758)], jeliko v mstech jejho masovho vskytu chyb
(Kux et Weisz 1964). Vtina arelu spad do povod horn Tisy a zahrnuje Slovensko,
Polsko, Rumunsko, Ukrajinu a Maarsko. Mimo povod Dunaje jsou znmy populace
z povod horn Visly Polska a Slovenska i hornho Dnstru. Zpadn hranici souvislho
rozen tvo ka Sikenica v povod Hronu (Kotlk et al. 2002). Akoliv Kux (1964) zde
hodnotil jej vskyt jako masov, v souasn dob je mstn populace na pokraji zniku v
dsledku opakovanch otrav, necitlivch zsah do nho koryta, trvale vysokmu zneitn
a jist i dky intenzivnmu zarybovn jinmi druhy ryb (stn sdlen pedsedy MsO SRZ
Levice a vlastn pozorovn). Historick daje o jejm vskytu v zpadnji poloench ekch
(Vh, Nitra) povauje Kux (1964) za myln. Zauner (1998) informuje o opakovanch
nlezech izolovanch jedinc rheofiln parmy v povod hornho Dunaje v Rakousku. Kotlk et
al. (2002) pokldaj za velmi pravdpodobn, e se jedn o rovn o B. carpathicus. O jejich
ojedinlm vskytu v hlavnm toku Dunaje na Slovensku informuje i Pez (1995). Heckel et
Kner (1858) p, e nejvt exemple B. petenyi, kter mli k dispozici, pochzej z Ole
(povod Odry) u Tna. Zde se vak nepodailo vskyt rheofilnch parem potvrdit ani pi
speciln zamench przkumech (Balon 1963). Dle mho nzoru se mohlo jednat o B.
carpathicus, kter se vyskytuje v nedalek Visle. Heckel et Kner (1858) neuvdj, jak ke
zmnnm exemplm pili, je tedy mon o jejich skutenm pvodu pochybovat. Jin
hranici rozen tvo povod eky Some odvodovan jin horn Tisou (Kotlk et al. 2002).
16
Druhy obvajc horn seky tok maj schopnost pekonat rozvod dky takzvanmu
nmu pirtstv (river capture). To je proces, kdy v dsledku eroze, i zablokovn
pvodnho koryta, eka nebo jej st zmn smr svho toku tak, e nsledn tee do jinho
povod. Vechny organismy obvajc tuto st eky zmn svou pslunost k novmu povod
spolen s n. K tomuto geologickmu jevu zcela jist dochzelo ve zven me
v postglacilnch obdobch, kdy masy vody z tajcch horskch ledovc zpsobovaly
zvenou erozi, vytven pledovcovch jezer, doasnch tok a novch nch spojen, a
tak umonily migraci chladnomiln sladkovodn fauny do novch oblast a genetick tok mezi
doasn izolovanmi populacemi (Arkhipov et al. 1995). Prv tomuto jevu vd B.
carpathicus za sv souasn rozen z tok jinch svah severnho Karpatskho oblouku
odvodovanch horn Tisou, kter patrn vytvoily refugium tto formy bhem poslednho
glacilnho maxima ped 18 000 lety (Kotlk et Berrebi 2002). Pro rheofiln parmy naopak
tvo nepekonatelnou bariru doln toky ek.
1.2.6.2. Barbus barbus
Obrzek 4. Barbus barbus z eky Udava; ilustrativn foto (4.8.2004)
Linn zaloil svj popis na Atrediho a Gronoviov a jako typovou lokalitu uvd
Europe australis. Kottelat (1997) stanovil lektotyp (Gronoviuv exempl: BMNH 1853, 11,
12: 144) a tm i typovou lokalitu eku Ijssel u Deventeru v Nizozem, odkud tento jedinec
s nejvt pravdpodobnost pochz.
17
Barbus barbus se od sympatrickch drobnch rheofilnch parem li pedevm
ptomnost siln osifikovanho ozubenho trnu v dorzln ploutvi a vzrstem a 85 cm, od
fylogeneticky pbuznjch parem fluviolakustrinnho typu pak hlavn uspodnm spodnho
rtu, kter m dva laloky a uprosted je ztlustl.
Zbarven je znan variabiln. Pez (1995) povauje za typick olivov zelen hbet,
nazelenal, nebo nazltl boky a blolut bicho. Mlad tohoron ryby bvaj mramorovan
skvrnit, vjimen tmav hnd pigmentov skvrny petrvvaj do rann dosplosti. Prov
ploutve jsou naervenal, neprov bvaj na okrajch tmav.
Barbus barbus je velmi plastick druh a jednotliv subpopulace vykazuj znan
rozdly ve velkm potu meristickch i plastickch morfometrickch znak.
Vysok pinna dorsalis je vyztuena 3(3) a 5(4) nevtvenmi (posledn siln
osifikovan, jeho cel zadn okraj lemovn dvma adami zoubk, jejich poet se zvyuje s
dlkou ryby) a 6(8) a 9 vtvenmi lepidotrichii. Jej vnj okraj je siln konkvn. Kad
pinna ventralis je tvoena 2 nevtvenmi a 7(8)-9 vtvenmi; pinna pectoralis 1 nevtvenm
a 13(16)-18(18) vtvenmi lepidotrichii. Pinna analis obsahuje 1(2) a 4(3) nevtven a 4(5)
a 6 vtvench lepidotrichi. Pi sklopen nedosahuje anln ploutev k zkladn ploutve
ocasn. Linea lateralis obsahuje 62(54)-66(66) perforovanch upin. Poet ad nad postrann
rou in 11(12)-16(14), pod postrann rou 7(7)-12(9). Peritoneum je svtl. Homocerkn
hluboce vykrojen ocasn ploutev (pinna caudalis) se obvykle vyznauje ponkud delm
dolnm lalokem (Bnrescu et al. 2003). Hodnoty v zvorkch uvd Pez (1995). U st jsou
2 pry vousk, pedn (rostrln) pr je krat, ne zadn (maxilrn) a nedosahuje k nozdrm.
Zadn pr vousk dosahuje k pednmu okraji oka (Pez 1995). Star jedinci mohou mt
vousky relativn del (Bnrescu et al. 2003).
Pohlavn dvojtvrnost je nevrazn. Krupka (1983) zjistil u populace z eky Vlry
nsledujc statisticky prkazn pohlavn rozdly v morfologickch znacch: samci se oproti
samicm vyznauj nim potem abernch tyinek, vtm prmrem oka, delm, vym a
irm koenem ocasu, ni vkou tla a itn ploutve. Jin autoi uvdj rozdly v jinch
znacch (viz. Bnrescu et al. 2003; Pez 1995). Krupka (1985) u te populace zjistil, e
samci pohlavn dospvaj ji v 1+ roce vku a dovaj se maximln 10 let. Samice dospvaj
v 5+ roce vku, ij a 15 let a rostou ji od prvnho roku rychleji, ne samci. Vraznj
rozdl je v prstcch hmotnosti, ne dlky.
Vtr probh v noci na kamenit dno, mrn a stedn proudivch (0,2-0,5 m/s) a
mlch sek ek v hloubce 0,5-0,7 m nejastji od dubna do ervence, pi teplot vody
kolem 16-17C (minimln vak 13,5C; Baras et Philippart 1999), nejastji v 2-3 dvkch
18
po 10-15 dnech. Tyto litofiln ryby vytvej tec hejna s pevahou mlk a 20:1
(Bnrescu et al. 2003), 4-6:1 (Krupka 1987) 15-130 (Baras 1994). ). Heckel et Kner (1858)
uvdj, e tec hejno tvo a 100 jedinc, kte jsou seazeni v ps. V pedu jsou samice, za
nimi vt samci a nakonec drobnj. Baras (1994) referuje o velkm potu pivnch
samek (tzv. sneakers), kte se samikm sice nedvo, ale ve vhodnou chvli oplodn jikry.
Ti se vyskytuj nejastji v pomru 5:2 dvocm se samcm. Jikernaky po vtru trdlit
opout a vrac se zpt a za ji zmnnch 10-15 dn.
Absolutn plodnost samic o celkov dlce 30-40 cm a hmotnosti 0,35-0,90 kg se
pohybuje od 12 300 do 35 500 oocyt vech (vtinou 4) generac (Krupka 1987; Poncin et al.
1996), piem mnostv jiker v prvn dvce me tvoit 37,6-54,4 % (Hochman 1965). lut
jikry jsou mrn a stedn lepkav o prmru 1,9 ped a 2,9 mm po plnm nabobtnn
(Pez 1995). Bnrescu et al. (2003) uvd hustotu jiker na trdliti na 300-800 ks/cm
2
dna,
30% je neoplozench.
Chromozomov uren pohlav je tzv. ZW typu (tzn. sami heterogametick a sam
homogametick), jak zjistili metodou indukovan gynogeneze Castelli et Philippart (1993).
Barbus barbus obv proudiv a dobe prokyslien seky podhorskch i ninnch
ek s tvrdm dnem (tzv. parmov ichtyobiologick psmo). Arel vskytu se rozprostr od
Anglie po Dnpr, od jihu Baltu a Severnho moe po sever Pyrenej a Alp. Na vchod Anglie
je pvodn v 7 povodch, ale postupn byla a stle je introdukovna do dalch ek Anglie a
Walesu (Wheeler et Jordan 1990). Chyb v Dnsku, Skandinvii, Litv, Estonsku a Finsku
(Bnrescu et al. 2003). Bianco (1995) uvd lovky introdukovan B. barbus z ek Farma a
Merse (povod Omrone, Tosknsko) a z eky Brenta na severovchod Itlie. Zd se, e se zde
k s jinmi druhy parem.
Bnrescu et al. 2003 uvd, e B. barbus je rybou spe stanovitn. Pelz et Kstle
(1989) pomoc radiotelemetrie zjistili periodick 60-200 m pesuny bhem dne. Nejaktivnj
jsou za rannho rozbesku a za pozdnho soumraku. Bhem dne vyhledvaj stinn msta,
obvykle pod mosty. Lucas et Batley (1996) rovn pomoc radiotelemetrie sledovali seznn
migrace parem. Potvrdili krtk jarn tahy na ml trdlit (2-20km) a podzimn na zimovit.
Za zmnku stoj daje Steinmanna et al. (1937), kte po 37 dnech v Dunaji ulovili znaenho
jedince parmy obecn 303 km od msta vyputn.
Uml reprodukce a transfery parem mezi rznmi povodmi zatm nejsou ve vtin
Evropy pli rozen (Bohlen et Nolte 1998; lechtov et al. 1998). Lze proto oekvat, e
souasn genetick strukturace prodnch populac nen, v dsledku rybskho hospodaen,
vznamn ovlivnna, ale e odr pirozen demografick a biogeografick zmny, ke
19
kterm dochzelo napklad v souvislosti s tvrtohornmi klimatickmi zmnami (Hewitt
2004).
Kotlk et Berrebi (2001) zjistili nejvt diverzitu mtDNA haplotyp v povod Dunaje,
co podporuje pedstavu Bnresca (1991), e tento druh parmy kolonizoval Evropu z tohoto
glacilnho refugia. Dky efektu river capture se pravdpodobn B. barbus il
periglacilnmi ekami nap dnenmi povodmi bhem oteplovn na konci poslednho
(Wrmskho) glacilu, ped piblin 10 000 lety. Zajmav je fakt, e ve Francii takka chyb
nejbnj haplotyp Dunajskho povod. Tento nlez me indikovat, e mstn populace,
kter se sem z Dunaje rozily bhem pedchozho interglacilu (Riss/Wrm) ped 130-115
tisci lety, pekaly posledn glacil zde. Dky tzv. prchodu hrdlem lahve (bottleneck effect)
vymizel u tchto populac obvykle detekovan polymorfismus. K sekundrnmu post-
pleistocnnmu kontaktu mezi tmito liniemi pravdpodobn dolo v Rn a Weseru (Kotlk
et Berrebi 2001). Obdobn scn expanze z Dunajskho refugia ve dvou krocch navrhuj
Durand et al.(1999) pro jelce tlout [Leuciscus cephalus (Linnaeus, 1758)].
1.2.6.3. Mezidruhov hybridi
Akoli B. carpathicus pat k nejnovji popsanm druhm parem evropskho
kontinentu, hybridn jedinci prv tto formy s B. barbus, byli jako prvn analyzovni pomoc
biochemickch metod Valentou et al. (1979).
V sympatrickch populacch parem se vyskytuje mnoho pechodnch forem (Kux et
Weisz 1958, 1964; Kux 1982; Valenta et al. 1979). Rolik (1970), na zklad morfologickho
vyeten 20 samch a 20 samich jedinc z eky Oslava v povod Sanu, kter se nsledn
vlv do Visly, chybn popsala hybridn formy jako zvltn poddruh B. cyclolepis waleckii,
akoliv dve (Rolik 1967) publikovala morfologickou charakteristiku 8 hybrid: 4 z Oslavy
(sbrky Zoologickho institutu PAN ve Varav) a 4 z povod horn Visly (sbrky Moravskho
musea v Brn). Kotelat (1997) uvd B. cyclolepis walecki jako synonymum k B.
peloponnesius.
Krupka et Holk (1976) povaovali nzor Rolik (1970) na existenci tetho druhu
parem na Slovensku i v Polsku za sprvn, ale piadili jej k druhu B. plebejus ve smyslu
Karamanovy revize (1971), kter byl polytypick, nebo autor v nm smstnal mnoho do t
doby oddlench druh, vetn B. cyclolepis. K pedstav o existenci dalho druhu na
Slovensku je vedl fakt, e hybridn jedinci v nkterch znacch (napklad poet upin
v postrann e) nevykazuj intermediln fenotyp, jak by se dalo oekvat (Holk et Hensel
20
1972). Existenci mezidruhovch hybrid vech t forem nezamtli. [Dnes je znmo, e
hybridn jedinci (i F1) vtiny druh ve velk sti morfologickch znak intermediln
fenotyp nevykazuj (Rieseberg et Randall Linder 1999).]
Nov druh pro tuto oblast byl dle Rolik (1970) charakterizovn 3(3) a 4(4)
nevtvenmi (posledn stedn osifikovan, na jeho zadn stran sah jemn zoubkovn do 2 /
3 jeho celkov vky) a 7(7) a 9(8) vtvenmi lepidotrichii v hbetn ploutvi, jej vnj
okraj je mrn konkvn a esovit. Kad pinna ventralis je tvoena 2 nevtvenmi a 8(8)-9
vtvenmi; pinna pectoralis 1 nevtvenm a 15(14)-18(15) vtvenmi lepidotrichii. Pinna
analis obsahuje 3(3) nevtven a 5(5) vtvench lepidotrichi. Pi sklopen dosahuje anln
ploutev samic k zkladn ploutve ocasn, sam nikoliv. Linea lateralis obsahuje 55(53)-70
(68) perforovanch upin. Poet ad nad postrann rou in 11(11)-13(13), pod postrann
rou 7(7)-10(9) (Rolik 1970). daje v zvorkch uvd Krupka et Holk (1976). Pedn pr
vousk je krtk a vjimen dosahuje k nozdrm, zadn pr do poloviny oka.
Zkladn zbarven hbetu je hnd, boky zlatolut, velmi slab skvrnit. Skvrny jsou
ptomny i na hlav dorzln a kaudln ploutvi; ventrln, pektorln a spodn lalok kaudln
ploutve jsou oranov (Rolik 1970).
Karyotypy B. barbus, B. carpathicus i jejich hybrid jsou shodn (Valenta et al. 1979;
Rb 1980; Rb et Collares-Pereira 1995). Valenta et al. (1979) vak objevili, e lze odliit
rozdly v elektroforetick mobilit transferrin (Tf) a izoenzym, laktt dehydrogenzy (LDH)
i malt dehydrogenzy (MDH), charakteristickch pro druhy B. barbus i B. carpathicus.
Zrove potvrdili existenci hybrid, pro jejich identifikaci v budoucnu doporuuj pedevm
pln diagnostick Tf a MDH.
Stratil et al. (1983) studovali znanou heterogenitu a polymorfismus Tf u 214 jedinc
B. barbus, 306 B. carpathicus a 14 hybrid, z nich bylo na zklad morfologickch znak
ureno 5 jako B. barbus, a 5 jako B. carpathicus, kter byly bhem let (1976-1979) uloveny
nedaleko Plave (eka Poprad). Bohuel, na zklad studia pouze jednoho lokusu jsou
s jistotou odhalovni pouze pslunci F1. Nsledn generace hybrid a zptn kenci ji
mohou nst alely pouze jednoho druhu.
lechtov et al. (1993) pomoc elektroforetick analzy 12 enzymovch systm
zjistili 15 polymorfnch a 10 monomorfnch lokus, z nich povaovali 4 za pln druhov
diagnostick (LDH-C*, sMDH-4*, PGM-3* a Tf*). Mezi 109 analyzovanmi jedinci obou
druh, z ek Poprad, Torysa a Laborec, nalezli 6 hybrid, nkte obsahovali kombinace alel,
jak je mon oekvat u zptnch kenc, nebo nslednch fililnch generac. Potvrdili tak
existenci plodnch prodnch hybrid.
21
Kotlk et al. (2002) analyzovali sekvence mtDNA dvou jedinc, vzorky jejich tkn
zskali od Dr. Alic Boro (viz. Boro 2000) pod nzvem B. cyclolepis waleckii. Jeden jedinec
vykazoval mtDNA specifickou pro B. barbus, druh pro B. carpathicus (Kotlk et al. 2002).
Dr. Nina Bogutskaya urila jin 2 jedince, kte podle jejho nzoru nesli znaky B. cyclolepis
waleckii, narozdl od pedchozch. Oba obsahovali mtDNA typickou pro B. barbus (Kotlk
-stn sdlen).
lechtov et al. (1998) pi studiu genetick variability B. barbus v esk republice
odhalili nepatrnou introgresi privtnch alel B. carpathicus do genomu B. barbus v ece Dyji
v povod Moravy, kter se sice vlv do Dunaje, ale neexistuj ani dn mn znm
historick zznamy, e by se tu alespo v minulosti, by sporadicky, B. carpathicus
vyskytovala. Autoi lnku se piklnj k nzoru, e hybridn jedinci, kte vznikli v mstech
syntopickho vskytu obou druh, mohli bt splaveni bhem povodn do hlavnho toku
Dunaje, odkud po ase vythli do jinho nho systmu a obohatili mstn populaci o ciz
alely. Vzhledem k ojedinlm nlezm rheofilnch parem i v hlavnm toku Dunaje (viz.
kapitola B. carpathicus) se domnvm, e tato monost je pravdpodobn. Dle mho nzoru
vjimen prnik ojedinlch kus B. carpathicus na trdlit B. barbus rovn nen zcela
vylouen. Ve prospch hybrid mon hraje vy mobilita, ve prospch B. carpathicus vak
mnohem vy abundance.
Pestoe byla hybridizace mezi B. barbus a B. carpathicus studovna adu let
s vyuitm morfologickch a pozdji genetickch metod, zstv mnoho dleitch otzek
nezodpovzeno. Rozsah a smry hybridizace nebo mra introgrese mezi genofondy
zastnnch druh zstvaj i nadle skryty pod roukou tajemstv, kterou chci ve sv prci
poodhalit. Oproti pedchozm genetickm studim vyuvm nejen esti pln a t sten
diagnostickch izoenzymovch lokus, ale tak mikrosatelitovho lokusu a mitochondriln
DNA , a to souasn v nkolika prodnch populacch.
Ve svoj prci jako vbec prvn pouvm kombinaci jadernch a cytoplazmatickch
marker pi studiu hybridizace tchto druh. Takovto cytonuklern markery pedstavuj
nstroj s velmi vysokou vypovdac schopnost (Avise 2001), pedevm jsou-li vyuity
v kombinaci s etologickm a ekologickm studiem hybridizanch proces (Asmussen et al.
1989; Arnold 1993).
Rozsah hybridizace i mru a smr mezidruhov introgrese hodnotm v ece Poprad
z povod Visly, kde charakterizuji i poetn vzorky populac obou rodiovskch druh.
Obecnou platnost zvr ovuji na dalch lokalitch v ekch Laborec a Torysa z povod
Dunaje.
22
2. Materil
Na ece Poprad byly odebrny vzorky ze 7 lokalit (Obrzek 5.), kde byl pedpokldn
syntopick vskyt obou druh. Odbr byl proveden kvantitativn v absolutnch etnostech P.
Kotlkem, V. lechtou a P. Rbem 21.-23.10.1997. Kolekce obsahuje i tkn paratyp B.
carpathicus: NMW 94607:1 3, 3 ex., 140.0 177.0 mm Hromo; NMW 94608:1 3, 3 ex.,
142.1 164.0 mm potok ubotnka; MNHN 2001 2812, 3 ex., 108.0 166.0 mm Orlov;
MNHN 2001 2813, 3 ex.,146.3 181.0 mm Plave; CMK 17001 2 ex., 167.0 186.0 mm,
Andrejovka.
Obrzek 5. Lokality na ece Poprad
Poprad je jedinm slovenskm tokem, odvdjcm sv vody do Baltskho moe. B.
barbus i B. carpathicus zde dosahuj maximln zaznamenan nadmosk vky (650 m.n.m.)
v rmci SR i R u obce Spisk Matejovce. Na te lokalit byli zrove zjitni i hybridi.
Morfologie eit jet ve poloench sek by sice obma druhm stle vyhovovala, ale
nevyhovuj jim tamj teplotn pomry (Kux et Weisz 1960).
23
seky, z nich byly odebrny vzorky, le podstatn n (viz. Tabulka 1.). Koryto eky
zde dosahuje e kolem 50ti metr, pevldaj v nm proudiv a peejovit seky
s oblzitokamenitm dnem, msty vytv tiiny s psitobahnitmi nnosy (Ploha 3.).
Pobl Star ubovni a Kurna byl zaznamenn vskyt hybrid ji v roce 1959 (Kux
et Weisz 1960).
Pro srovnn jsou v prci pouity t ryby z povod Dunaje. Na tchto lokalitch vak
byli 11.-13.10.1998 lechtou a Kotlkem pednostn vybrni jedinci, kte se zdli bt
hybridy. U obce Sabinov zjistili vskyt hybrid Kux et Weisz (1964) v roce 1962. V okol
Hankovc v r. 1958 sice Kux ichtyologick przkum rovn provdl a zaznamenal oba
druhy parem ve vysokch abundancch, ale s hybridy se zde nesetkal (Kux 1964).
Vzorky z byly zskny standardnm elektrolovem, ve spoluprci s rybi mstnch
organizac Slovenskho Rybrskho Zvzu se sdlem v ilin. Pouit byl benznov elektrick
agregt ML 3 (vrobce: Radomr Bedn) 300-600 V, 4 A, 2000 W, regulovateln kmitoet
20-150 Hz.
Jedinci byli pedbn ureni dle hrub morfologie v etnostech, zobrazench
v tabulce (Tabulka 1.).
Tabulka 1. Seznam vech lokalit a jedinc.
povod eka lokalita souadnice
(E / N)
nadmosk
vka
datum
sbru
B. barbus
(ks)
B. carpathicus
(ks)
hybridi
(ks)
Visla Poprad Orlov 2053 / 4916 479 m.n.m. 21.10.1997 1 35 3
Andrejovka 2054 / 4916 474 m.n.m. 21.10.1997 0 37 0
Kurn 2055 / 4915 470 m.n.m. 21.10.1997 0 1 0
Plave 2050 / 4917 488 m.n.m. 22.10.1997 2 5 1
ubotinka 2051 / 4917 485 m.n.m. 22.10.1997 0 9 0
Star ubova 2042 / 4919 510 m.n.m. 23.10.1997 50 31 0
Hromo 2048 / 4916 490 m.n.m. 23.10.1997 0 55 0
Dunaj Laborec Hankovce 2157 / 4902 180 m.n.m. 11.10.1998 2 13 2
Kokovce 2158 / 4903 188 m.n.m. 12.10.1998 2 1 3
Torysa Sabinov 2054 / 4916 320 m.n.m. 13.10.1998 6 10 4
24
3. Metody
3.1. Detekce proteinov variability
Proteinov variabilita byla detekovna pomoc gelov elektroforzy. Jedn se o prvn
iroce pouitelnou metodu studia genetick promnlivosti a jej vznik v 50. letech 20. stolet
zpsobil revoluci v chpn mikroevolunch a makroevolunch proces, v porozumn
genetick variabilit uvnit prodnch populac, fylogenetickm vztahm, tokm gen,
hybridizaci, zkoumn druhovch hranic a porozumn dalm problmm (Smithies 1959).
Tato metoda je zaloena na pohybu stic v elektrickm poli. Pohyb protein
zpsobuj kladn (Arg, Lys, His) a zporn (Asp, Glu) nabit postrann etzce aminokyselin,
pitahovan k zporn katod a kladn anod. Pohyb makromolekuly je dle urovn jej
konformac, celkovm nbojem a pH pufru pouitho pi elektroforze.
Iontov pufr stabilizuje elektrick nboj prosted, zprostedkovv iontov spojen
mezi elektrodami a gelem a redukuje interakce mezi nabitmi postrannmi etzci protein
s nabitmi skupinami v gelu. Pufr je pidvn do samotnho gelu ji ped jeho ppravou a
rovn tvo prosted elektrodovho mostu. Pi enzymov elektroforze bv vyuvno velk
mnostv rznch pufrovch systm (Hillis et al. 1996). Ty jsou empiricky testovny pro
efektivitu s jednotlivmi organismy, typy tkn a enzymy (May 1993).
Aminokyselinov sekvence protein se mn v dsledku mutac v kdujcch DNA
sekvencch. Tyto mutace mohou pozmnit tvar a nboj, prv tak jako katalytickou schopnost
a stabilitu protein (Shaw in Hillis et al. 1996). Pedpokld se, e vechny alely v lokusu jsou
kodominantn, tzn. exprimovan.
Zkladn metody elektroforzy jsou vertikln, horizontln (nejrozenj) a
kapilrov. Dle je meme rozdlit na elektroforzy v kontinulnm pufru, v diskontinulnm
pufru (multifzick), izotachoforzu, izoelektrickou fokusaci, denaturan elektroforzu
v moovin a SDS, dvourozmrnou (2 D) (Hillis et al. 1996). Jako nosie jsou pouvny
krob (pohyb zvis na velikosti stic a nboje) (Smithies 1955), celulzoacett, agar,
agarza (pohyb zvis pouze na velikosti nboje), polyakrylamid (pohyb zvis na velikosti
stic a nboje) (Hillis et al. 1996).
Barvic metody lze rozdlit do esti hlavnch skupin: chromogenick, fluorogenick,
radioaktivn, chemick detekce, barvy elektronovho transferu, enzymovho spojen (Hillis et
al. 1996).
Aby byla dlouhodob uchovna aktivita jednotlivch enzym (minimln 3 roky),
mus bt vzorky uchovvny za stabiln teploty hluboko pod bodem mrazu (-70C). astj
25
rozmrazen a nsledn zmrazen vzorku mv za nsledek nejen snen aktivity
analyzovanch enzym, ale me naruit kompartementaci buky a do t mry, e se zanou
tvoit i mezilokusov izozymov kombinace.
Elektroforza enzym i neenzymatickch protein poskytuje dva typy dat data
zskan analzou izozym a data alozymov. Termn izozym (izoenzym) byl zaveden
Markertem a Mollerem (1959) a vztahuje se k jakmukoli prouku danho enzymovho
systmu na gelu. Oznauje vechny funkn podobn formy danho enzymu vetn vech
polymer sloench z podjednotek, kdovanch bu rznmi lokusy, nebo rznmi alelami
tho lokusu. Pojem alozym byl zaveden pozdji Prakashem et al. (1969) pro tu st izozym,
kter jsou variantami polypeptid pedstavujcmi rzn alelick varianty jednoho lokusu
(jsou kdovny rznmi alelami tho genu). U heterozygot jsou tedy jako alozymy
oznaovny pouze extrmn prouky (nejrychlej a nejpomalej), tj. ty, kter se objevuj jako
jeden pruh u homozygot. Vechny prouky mezi nimi (u multimernch enzym) jsou
izozymy pedstavujc rzn kombinace produkt obou alel (Powell 1994).
Tato metoda m nkolik omezen. Je zde problm s homologizac pruh, nebo stejn
elektromorfy nemusej pedstavovat ortologn proteiny. Pouh tetina neredundantnch
substituc vede k zmn elektrickho nboje. Nelze detekovat mutace, kter nejsou
translatovny. Nejsou zachyceny nekdujc sekvence. Lze prokzat pouze rozdly, nikoliv
shody. Metoda je pouiteln pouze pro rozpustn (vtinou globulrn) proteiny (Hillis et
al. 1996). Na druhou stranu je vak alozymov/ izozymov elektroforza metodou pomrn
levnou, rychlou, dobe fungujc a s velmi nzkm rizikem kontaminace (Kocher et Stepien
1997).
Pro rozlien jednotlivch alel se pouvaj seln hodnoty (v %) vyjadujc jejich
relativn pohyblivost v gelu pi elektroforze. Tyto hodnoty se vtinou vztahuj k alele, kter
se objevuje u zkoumanho taxonu s nejvy frekvenc. Relativn pohyblivost tto alely se
oznauje jako 100 % (Shaklee et al. 1990).
Pi dostatenm sil vtinou lze, dky novm mutacm, v populacch detekovat
vzcn alely. Jejich vznam pro evolun zmny je zanedbateln, nebo bvaj brzy
eliminovny nhodnm driftem nebo selekc. Proto bylo zavedeno arbitrrn kriterium,
pomoc kterho je polymorfismu definovn. Jako polymorfn oznaujeme takov lokus, u
kterho frekvence nejpoetnj (obecn) alely dosahuje nejve 95% (p s 0,95). V ppad
analzy vzork s vysokmi poty jedinc bv nkdy aplikovno citlivj kriterium
polymorfismu s frekvenc obecn alely 99% (p s 0,99)(Hartl et Clark 1997).
26
3.1.1. Postup
3.1.1.1. Pprava vzork
Vzorky jatern a svalov tkn byly odebrny z ryb erstv usmrcench
pedvkovnm anestetikem a zamrazeny. Tyto vzorky jsou dlouhodob uchovvny pi
teplot 70 C, kadavery pak pi 20 C.
Piblin 1 gram kadho vzorku byl homogenizovn homogeniztorem Ultra-Turrax
(IKA-WERK) v Tris-NaCl (pH = 8,5) homogenizanm pufru (Valenta et al. 1971). Po
pidn cca 5 l Tetra-chlor methanu (navzn tuk) byly homogenty protepny vortexem
MS1 Minishaker (IKA
TM
Works) a nsledn usazeny centrifugac v chlazen (-4C) centrifuze
Hettich 30 RF pi 11 000 ot./min. po dobu 20 minut. Supernatant byl oddlen a uchovvn pi
70C pro pozdj elektroforzu, nebyl-li t den zpracovn.
3.1.1.2. Elektroforza
Analyzovno bylo pt enzymovch systm kdovanch devti strukturnmi genovmi
lokusy, kter zahrnovaly glukosa 6-fosft isomerasu (GPI-2*, E.C.5.1.3.9.), laktt
dehydrogenasu (LDH-A1*, E.C.1.1.1.8.), malt dehydrogenasu (sMDH-1*, sMDH-2*, sMDH-
3*, sMDH-4*, E.C.1.1.1.37.), fosfoglukomutasu (PGM-1*, PGM-2*, E.C.5.4.2.2.) a
superoxid dismutasu ( SOD-2*, E.C.1.15.1.1.).
Enzymy byly dleny horizontln elektroforzou (VN Zdroj, Vvojov dlny SAV)
v 11% krobovm gelu. Ten vznikl smsenm 37,08 (40,44) g hydrolyzovanho krobu a 300
(400) ml pslunho gelovho pufru ve vakuov zbrusov bace s kulatm dnem. daje
v zvorkch udvaj mnostv potebn pro vznik gel o mocnosti 6 mm. Sms byla za stlho
mchn ve vodn lzni ohta na 85C, nae byla vodn vvvou odvzdunna. Tekut gel
byl nalit do pedem pipravench forem o rozmrech asi 260 x 120 x 4 (6) mm, tvoench
sklennou deskou, sklennmi postraky na delch stranch a gumovmi na kratch, a
opatrn piklopen druhou sklennou deskou. Po ztuhnut byla deska, kter tvoila pvodn
dno formy odstranna a nahrazena plastovou foli, kter m zamezit vysychn gelu. Vzorky
byly do gelu, rozkrojenho 3,5 cm od okraje, kter je bhem elektroforzy nejble zpornmu
plu, vneny pomoc savho Whatmanova paprku (No. 3; 7,0 x 5,5 mm) v mnostv 11 kus
/ gel. Pro kontrolu, zda elektroforza b sprvn, byla k nkterm vzorkm pidna
bromfenolov mod (BFB). Elektroforza probhala za teploty 5C v chladnice. Byl-li
27
pouvn zsadit Tris-citrtov pufr (pH= 7,41 / 8,6 pro gelov / elektrodov pufr; Valenta et
al. 1971) pro svalov MDH, GPI a LDH a jatern MDH a GPI, trvala elektroforza pi napt
180 V proudu 40mA (50mA) piblin 14 hodin. Hodnoty udvaj napt a proud pi pouit
gel o mocnosti 4 mm, z nich lze rozkrojenm zskat 2 barvc plochy. daj v zvorce
vyjaduje proud pi pouit gel o mocnosti 6 mm, pouvanch pi barven 3 protein. Pro
elektroforzu protein PGM a SOD, exprimovanch v jatern tkni byl pouit alkalick tris-
citrt-lithium-bortov pufrov systm (pH= 7,41 / 8,6; ) dle Poulika (1957) pi napt 200
V a proudu 40mA (50mA). Alkalickho Tris-citrt-lithium-bortovho pufrovho systmu dle
Fergusona a Walace (1961) pi napt 350 V (po vyndn paprk 450 V), proudu 40mA
(50mA), trvajcm 5-7 h., kter je nutno chladit vodou, bylo pouito na proteiny GPI, LDH a
PGM exprimovan ve svalech.
3.1.1.3. Barven
Alozymy byly detekovny pomoc standardnch chromogenickch metod. GPI, PGM a
SOD byly barveny dle Pasteura et al. (1987), MDH a LDH dle Harrise et Hopkinsona (1976)
(Ploha 4.). Vzhledem k efektu tzv. elektrodekantace, pi kterm se s postupujcm asem
proteiny o vysok molekulov hmotnosti postupn propadaj na spodn stranu gelu, co
me zpsobit jejich slabou i nedostatenou koncentraci v hornch vrstvch, byly pro slabji
se barvc proteiny (MDH, LDH, SOD) pouity spodn sti gel.
Kad obarven gel byl vyfotografovn, elektromorfy zakresleny a obarven
agarzov gel sloupnut na filtran papr, usuen, vylisovn i s podkladem nalepen do
protokolu vedle nkresu.
3.1.1.4. Nomenklatura alel
Nomenklatura lokus a alel pouit v tto prci vtinou odpovd doporuen Shaklee
et al.(1990). Relativn elektroforetick mobilita alel je vztaena k nejfrekventovanj alele,
nebo lokusu u B. carpathicus. Vjimku tvo lokus tetrasomick lokus GPI-2*, jeho alely
byly pro zjednoduen oznaovny psmeny S (slow) F (fast) S
f
(faster slow) a F
f
(faster fast) a
mnostv slic. Nzvoslov je, pokud mono, sjednoceno s pedchozmi publikacemi, kter
na toto tma v minulosti vzely.
28
3.2. Analza DNA
Veker DNA byla izolovna ze svalov tkn, konzervovan v 95% roztoku etanolu,
pomoc Chelexu (viz. Kotlk et Berrebi 2001). Nespornmi vhodami tohoto postupu jsou
nzk nklady jak finann, tak asov.
Vzorek tkn jsem jsem promsil vortexem MS1 Minishaker (IKA
TM
Works) s 400 l
5% roztoku Chelexu 100 resin (Biorad) a 15 l proteinzy K (20 mg/ml) a nechal inkubovat
pi 55C v termobloku MD-02 (Major Science) asi 12 hodin. Potom jsem sms vail 15 min.
ve stojnku s vkem, nebo jinak se vtina mikrozkumavek pi vaen oteve, opt promsil
vortexem, krtce stoil v minicentrifuze MPW-50 (Med Instruments) (max. 1600 ot./min.) a
zmrazil, nezpracovval-li jsem hned dle. Dleit je nezapomenout vdy ped pouitm
suspenzi krtce stoit v centrifuze (max. 1600 ot./min.).
3.2.1. Jadern DNA
Polymorfismus jadern DNA (nDNA) byl studovn nejen nepmo (alozymy), ale i
pmo. Pomoc PCR byly selektivn amplifikovny fragmenty DNA, obsahujc mikrosatelit
se tybzovm motivem. Pesn dlka fragment byla zjiovna pomoc automatickho
sekventoru.
3.2.1.1. Mikrosatelity
Mikrosatelity jsou velice krtk, 2-6 pr bz dlouh tandemov repetice se sklonem
nhodn bt rozmstn v genomu a jsou asto mstem sklouznut pi replikaci (ssm slipped-
strand mispairing theory; Levinson et Gutman 1984). Jsou iroce distribuovan v nuklernm
genomu a jsou vysoce polymorfn. Takzvan stepwise mutation model pedpokld, e
k inzerci nebo deleci novch nukleotid nejastji dochz po celch motivech. Jednotliv
alely se tedy vtinou li prv o dlku motivu (Kimura et Ohta 1978), nebo jej nsobek (Di
Rienzo et al. 1994).
Mikrosatelity se iroce pouvaj pi analze systm provn sexulnch partner a
genetick struktury populac (Kocher et Stepien, 1997).
29
Studovn byl mikrosatelitov lokus Barb79 (Chenuil, 1997).
Sekvence: 5(N)
22
(TACC)
2
(TATC)
19
(N)
115
3
(N)
n
zna nerepetivn sekvence o n nukleotidech
Tun oznaen st je zdrojem polymorfizmu.
Sekvence primer: F (Forward) 79: 5-GAG TGA ATC ATT ACA TCC CT-3
R (Revers) 79: 5-GCT TTT CTT GTA TTA GTA TTT-3
Primery byly na 5konci fluorescenn znaen -N-Acetylglukosaminidasou (HEX) (East
Port Praha).
3.2.1.1.1. Postup
Pouito bylo upravench postup dle Bruce et Hursta (1996). Dvouetzcov DNA
(dsDNA) byla amplifikovna v 50 l reakn smsi obsahujc 1,25 l pracovnho roztoku
kadho primeru (10x zedn zsobn roztok), 4 l MgCl
2
, 1 l dNTP (10mM, Top-Bio), 5
l kompletnho reaknho pufru (10x, Taq buffer, Top-Bio), 0,25 l Taq UniS polymerzy
(5U/l, Top-Bio), 27,25 l demineralizovan H
2
O a 10 l roztoku DNA.
PCR reakce v Peltierov termlnm cykleru PTC 200 (MJ Research) zaala 3
minutovou fz pedbn denaturace pi 94
o
C, po n nsledovalo 35 cykl skldajcch se ze
t krok: fze denaturace pi 92
o
C (35 s), annealing pi 46
o
C (35 s) a prodlouen pi 72
o
C
(50 s). Takto namnoen seky mtDNA byly okamit pouity, nebo uchovny krtkodob pi
4
o
C i dlouhodob pi -20
o
C. spnost PCR byla zkontrolovna standardn horizontln
elektroforzou, obdobn jak je uvedeno v nsledujc kapitole.
Dlkov polymorfizmus byl zjiovn kapilrovou elektroforzou pomoc sekventoru
ABI-Prism
TM
310-3 Genetic Analyzer (Applied Biosystems), programovho balku ABI-
Prism
TM
Data Collection Software v. 3.0.0 (Applied Biosystems)

a ABI-Prism
TM
GeneScan
Analysis Software v. 3.7 (Applied Biosystems)

pro WindowsNT
TM
(Microsoft).
3.2.2. Mitochondriln DNA
Matesk pvod hybrid i smr a mra cytoplazmatick introgrese byly hodnoceny na
zklad druhov pslunosti mtDNA.
Alely parmy obecn byly od variant parmy karpatsk odlieny s vyuitm analzy
dlky fragment zskanch po roztpen mtDNA restriknmi enzymy (endonukleasami),
kter rozpoznvaj specifick tetranukleotidov sekvence (Avise 1994).
30
3.2.2.1 Vlastnosti mitochondriln DNA
Jedn se o jednoetzcovou cirkulrn molekulu o velikosti 16 a 20 kbp (Carvalho et
al. 1995). Amplifikace mtDNA profituj z mnohonsobnch kopi tohoto kompaktnho
genomu v ivoinch bukch. Vtina somatickch bunk m tisce kopi mtDNA; to
poskytuje velk mnostv potench kopi pro PCR (Hillis et al. 1996).
Pi analze mtDNA se vychz z jednoho zsadnho pedpokladu. V naprost vtin
ppad nesou vichni potomci shodn kopie
1
haploidn matesk
2
mtDNA (cytoplazma
vajka pochz od samice), kter nepodlh rekombinaci. Toho lze vyut pro stanoven
mateskho druhu astncho se hybridizace (Kocher et Stepien 1997). Rozdly v sekvenci
mtDNA podmiuj vskyt rozdlnch haplotyp. Bhem mnoha generac se urit seky mn
piblin konstantn rychlost pouze dky mutacm, kter vak mtDNA u vtiny organism
kumuluje rychleji, ne jadern geny. Nkter seky mtDNA jsou vak vysoce konzervativn
(Hillis et al. 1996).
Maternln ddinost mtDNA me mt velmi zajmav negativn dopad na
ivotaschopnost malch populac. Fertilita spermi velmi zce souvis s dokonalou funkc
mitochondri. Drobn mutace, kter nem tm dn vliv na ivotaschopnost samice, me
sam fertilitu vrazn redukovat (Gemmell et Allendorf 2001). Efektivn velikost populace
mitochondrilnho genomu je oproti jadernmu pouze tvrtinov. Mutace mtDNA jsou tedy
mnohem senzitivnj ke genetickmu driftu a efektu hrdla lhve (tzv. bottleneck effect), ne
je tomu u mutacch jadernch (Birky et al. 1983). Kumulace mtDNA mutac, kter sniuj
sam plodnost, v populaci, me hrt v pevn malch populac vznamnou roli (tzv.
cytoplazmatick sam sterilita).
3.2.2.2. Postup
1
Heteroplasmie u ryb viz. Brown et al. 1992; Nesb et al. 1998; Ludwig et al. 2000.
2
Obsah paternln mtDNA uvnit bunk potomk viz. Gyllensten et al. 1991; Taanman 1999.
31
Fragment o velikosti 664bp, zahrnujc st genu pro cytochrom b byl selektivn
amplifikovn pomoc standardn PCR s vyuitm primer L15267 ( 5-AAT GAC TTG AAG
AAC CAC CGT-3) a H15891 ( 5-GTT TGA TCC CGT TTC GTG TA-3) (Brioaly et al.,
1998). Psmena L (light strand) a H (heavy strand) zna pozici 3 konc primer v kompletn
sekvenci mtDNA kapra (Cyprinus carpio) (Chang et al. 1994).
PCR probhala v Peltierov termlnm cykleru (MJ Research) v 50 l reaknch
objemech, kter vznikly smsenm 1,25 l pracovnho roztoku kadho primeru (10x zedn
zsobn roztok), 4 l MgCl
2
, 1 l dNTP (10mM, Top-Bio), 5 l kompletnho reaknho pufru
(10x, Taq buffer, Top-Bio), 0,25 l Taq UniS polymerzy (5U/l, Top-Bio), 27,25 l
demineralizovan H
2
O a 10 l roztoku DNA.
Porovnnm soubor nukleotidovch sekvenc pro parmu obecnou a parmu karpatskou
(Kotlk et Berrebi 2001, 2002) byly s pouitm programovho balku DNASIS
TM
for
Windows
TM
(Hitachi Software) vybrny diagnostick restrikn enzymy. Za diagnostick byly
povaovny endonuklezy, jejich clov sekvence se pekrvaly s polymorfnmi pozicemi
vykazujcmi alternativn fixovan nukleotidov stavy v mtDNA parmy obecn a parmy
karpatsk (Tabulka 2.).
Tabulka 2. Pouit diagnostick endonuklezy.
Barbus carpathicus Barbus barbus
RE pufr sekvence N Pozice fragmenty N pozice fragmenty
HaeIII Y
+
/Tango GG!CC 2 142/378 143/236/215 2 142/406 143/264/187
MboI R
+
!GATC 2 234/351 117/233/244 1 234 233/361
MspI R
+
C!CGG 2 140/210 70/140/384 1 140 144/454
Restrikce probhala minimln 5 hodin v termostatu za optimln reakn teploty 37C,
spolen pro vechny ti enzymy, v 12 l objemech, z nich 4 l tvoil PCR produkt; 6,3 l
H
2
O; 1,2 l pufr (Y
+
/Tango; nebo R
+
) a 0,5 l restrikn enzym. Mikrozkumavky s reakn
sms byly ped umstnm v termostatu promseny vortexem MS1 Minishaker (IKA
TM
Works) a krtce stoeny v centrifuze Universal 32 R (Hettich)(1200 ot./min.).
Po roztpen tmito restriknmi enzymy se poet nebo dlka fragment mtDNA obou
druh liila a mohla bt odetna s vyuitm elektroforzy (zdroj: BioRad Power Pac 300)
(napt 90V, proud 30A, as 20min.) v 2 % agarzovm gelu. Ten vznikl vaenm 2g agarzy
(Sigma) ve 100 ml pufru TBE 0,5x (40 mM Tris-HCl (pH 8,0) + 2 mM EDTA-NaOH (pH
8,0) + 90 mM HBO
3
) v mikrovlnn troub. Zasunut hebene do tekut agarzy, obohacen o
2 l roztoku ethidium bromidu (10 mg EtBr/ ml H
2
O) (Serva), umonilo vznik jamek pro
32
nanen jednotlivch vzork. Po utuhnut gelu a vyjmut hebene byla vanika umstna do
elektroforetick cely s 0,5x koncentrovanm TBE elektroforetickm pufrem, tak aby vrstva
pufru nad gelem dosahovala piblin 2 3 mm. K natpenm vzorkm byl pidn vdy 1 l
nanecho pufru (0,2 % BFB; 60 mM EDTA v 50 % glycerolu) a nsledn byly pomoc
mikropipety vkldny do jamek pod hladinou pufru v cele Hu 10, nebo Hu 13 (Scie-Plas). Do
krajnch jamek bylo vdy naneseno 1,5 l pracovnho roztoku standardu, obsahujcho sms
vkldacho pufru a fragment DNA o dlce 100-1000 bp, licch se pesn o 100 bp
(GeneRuller).
EtBr navzan na DNA pi vystaven UV zen emituje svteln zen o vy vlnov
dlce, ne m dopadajc, m ji vizualizuje (tzv. fotoluminiscence). Vsledek byl snmn
kamerou umstnou v UV transilumintoru MultiImage
TM
Light Cabinet (Alpha Inotech
Corporation) vybavenm UV-B fluorescentn lampou (Ushio) a pevdn do digitln podoby
programem Chemimager 4000i v. 3.36 Alpha Ease 1996 (Alpha Inotech Corporation).
33
3.3. Analza populan struktury (F statistika)
Pro proteinovou analzu byly vybrny pednostn lokusy, kter jsou v rmci
jednotlivch druh monomorfn [frekvence nejetnj alely dosahuje minimln 95% (Hartl
et Clark 1997)], ale vykazuj mezidruhovou divergenci. Pro populan genetickou
charakteristiku jednotlivch populac obou druh se tak hodil pouze mikrosatelitov lokus
Barb79, kter vykazoval variabilitu v populacch obou druh. Z analyzovanch enzymovch
lokus je za polymorfn (ne- monomorfn) v rmci B. barbus mono povaovat Pgm1,
v rmci B. carpathicus pak LdhA1.
Z dat byly odhadnuty indexy fixace F, dle Wrighta (1969) postupy dle Weira et
Cockerhama (1984), pomoc potaovho programu Genetix v.4.03 (Belkhir et al. 1998),
kter je voln pstupn na internetov adrese: www.univ-montp2.fr/~genetix/genetix.htm
Ppadn snen heterozygotnosti jedinc zpsoben nenhodnm penm
v jednotlivch subpopulacch bylo odhadnuto jako koeficient inbreedingu (F
IS
) (vysok
hodnoty mohou ukazovat na siln inbreeding, naopak zporn hodnoty naznauj, e
v subpopulaci dochz k negativnmu vbrovmu pen).
Dle Weira et Cockerhama (1984):
Tento koeficient je citliv na odchylky od Hardy-Weinbergovy rovnovhy.
K odhadu fixanho indexu (Wright 1921) (F
ST
), kterm odhaduji rozdly mezi
subpopulacemi, bylo pouito jak modifikovanho postupu dle Weira et Cockerhama (1984):
tak podle Robertsona et Hilla (1984) (ven odhad) (formalizovno Weirem et
Cockerhamem 1984, 1363 p.):
34
) (
) (
1
i i i
i
C B
C
f
+
=

) (
) (
i i i i
i
C B A
A
+ +
=

u
1
1
*
) (
) 1 ( *
) (
1
+ +

=

=
n C B A
P A
RH F
n
i i i i
i i
ST
a jeho korekc dle Raufaste et Bonhomme (2000), pro vt poet alel:
A
i
interpopulan sloka variance alelickch frekvenc
B
i
intrapopulan sloka variance alelickch frekvenc (mezi jedinci uvnit kad populace)
C
i
sloka variance alelickch frekvenc mezi gametami uvnit kadho jedince
P
i
prmrn pozorovan frekvence alely i
npoet alel v lokusu
n
p
poet lokalit
Rozdln vypovdac schopnosti F
ST
odhadnut pomoc pouitch metod jsou uvedeny
v nsledujc tabulce (Tabulka 3.).
Tabulka 3. Srovnn pouitch typ odhadu fixanho koeficientu.
0,00 < FST < 0,05 0,05 < FST < 0,10 FST > 0,10
FST (u) neodchlen, variance siln neodchlen, variance stedn neodchlen, variance slab
FST(RH) odchlen, variance slab odchlen, variance stedn odchlen, variance siln
FST(RH) neodchlen, variance slab neodchlen, variance stedn neodchlen, variance siln
Testy vznamnosti sledovanch hodnot F
IS
a F
ST
byly uskutenny provedenm 20 000
permutac v souboru daj.
Wright (1978) doporuil nsledujc kvalitativn interpretaci F
ST
(in Hartl et Clark
1997, 118 p.).
0,00 < F
ST
< 0,05.nzk genetick diferenciace
0,05 < F
ST
< 0,15.stedn genetick diferenciace
0,15 < F
ST
< 0,25.siln genetick diferenciace
F
ST
> 0,25. velmi siln genetick diferenciace
Nutno podotknout, e zpsoby vpotu, kter jsem pouil se od pvodnch znan li.
Stejn tak i zskan vsledn hodnoty. Pro exaktn kvantifikaci mry diferenciace by bylo
nutn dan vsledky testovat, co v tomto ppad nen nezbytn.
Pomoc F statistiky byl proveden i formln test nhodnho pen mezi obma druhy,
vyjden jako F
IS
, do nj byli zaazeni vichni analyzovan jedinci, vechny lokusy (vyjma
GPI-2*) a vechny lokality.
35
|
|
.
|

\
|

+ =

=
n
i i p
ST
ST ST
n
P n n
RH F
RH F RH F
1
2
3
1
) 1 (
) (
) ( ) ' (
3.4. Detekce cytonuklern nerovnovhy
Pojmem cytonuklern nerovnovhy (disequilibria) rozumm nenhodnou asociaci
mezi jednotlivmi genotypy diagnostickch jadernch (nuklernch) lokus a druhov
specifickmi variantami mitochondrilnho (cytoplazmatickho) genomu, jej kvantitativn a
kvalitativn zhodnocen pomh charakterizovat hybridn populaci a odhalit zodpovdn
evolun procesy (Avise 2001).
Dle Arnolda (1994) cytonuklern nerovnovhy pedstavuj nov nstroj k zjiovn:
1. hladin toku gen; 2. st reproduknch barir; 3. smr hybridizace; 4. hladin vbrovho
pen (assortative matting); 5. mechanism selekce hybrid.
Vztah mezi jadernmi a cytoplazmatickmi markery byl kvantifikovn pomoc
potaovho programu CND (Asmussen et Basten 1994, 1996; Basten et Asmussen 1997),
kter je voln pstupn na adrese: http://statgen.ncsu.edu/brcwebsite/software_BRC.php
Provedeny byly vpoty koeficient alelickch nerovnovh: D
A
M
=

P
A
M
-P
A
P
M
a
analogicky i vpoty t koeficient genotypickch nerovnovh: D
AA
=P
AA
M
-P
AA
P
M
D
Aa
=P
Aa
M
-P
Aa
P
M
D
aa
=P
aa
M
-P
aa
P
M
obdobn vyjadujcch nenhodn asociace mezi kadm nuklernm genotypem a obma
cytotypy (Asmussen et Basten 1994). Pro plnost rovn uvdm vsledky testu Hardy-
Weinbergovy rovnovhy dle Weira (1990): D
A

=

P
AA

-P
A
2
. Psmeno D oznauje koeficient
nerovnovhy (disequilibrium), P oznauje frekvenci. Hornm indexem jsou oznaeny jadern
geny a dolnm cytoplazmatick alely (cytotypy).
Vnitrodruhov polymorfn a pln diagnostick lokusy Barb79 a PGM-2* byly
upraveny dle doporuen Avise (2001) tak, e alely specifick pro kad druh byly sdrueny, a
lokusy byly zpracovny jako dialelick.
K interpretaci zjitnch cytonuklernch kombinac je rovn pouito jejich vynesen
do 3x2 tabulky dle Avise (2001).
36
3.5. Odvozen pvodu jedince
U jedinc 1. fililn generace (F1) oekvme heterozygotn stav alel ve vech pln
diagnostickch autozomlnch lokusech. Zptn kenci (tzv. backcross; BC) maj nkter
pln diagnostick lokusy, specifick pro jeden ze zastnnch druh, v homozygotnm stavu.
Lze pedpokldat, e pi kadm zptnm ken, s tmt rodiovskm druhem, se sn
poet alel v heterozygotnm stavu o 50%. Nsledn generace hybrid (F) naopak mohou
obsahovat homozygotn lokusy obou druh. Jedinec vdy nese mateskou mtDNA (Avise
2001).
Procentick vyjden podl rodiovskch genotyp ve vslednm hybridnm
genotypu, se ktermi se lze asto setkat v podobn zamench pracech, povauji za
zavdjc. Jedinec me snadno splovat procentick kritrium pro oekvn F1 (0,5) a
pitom nebt heterozygotn ve vech pln diagnostickch lokusech. Z tohoto dvodu se pi
klasifikaci hybrid o tento daj oprat nebudu.
Boecklen et Howard (1997) dospli k pesvden, e kombinace minimln 4-5 pln
diagnostickch znak (marker) sta k hrub klasifikaci genotypov kompozice v hybridn
zn, ale vce ne 70 jich je nutnch k odlien istch druh od pokroilejch BC (4-5
generace) s relativn nzkm rizikem chyby (10%). Mnou zvolen poet marker dle tchto
autor sta, abych s 10% chybovost odliil BC 2 od rodiovskch druh. Riziko zmny BC
1 za F1, i rodiovsk druh je miziv (P=0,0039).
Rieseberg et Randall Linder (1999) na zklad experimentlnho ken rznch
druh slunenic (rod Helianthus) zjistili, e dky rozshlm chromozomovm pestavbm a
nsledn siln endogenn i exogenn selekci na hybridn potomstvo, se zjiovan genotypy
asto vrazn li od oekvanch. Vtinou dochz k eliminaci nejvce rekombinantnch
genotyp. Odvozen rodokmenu pokroilch generac hybrid a zptnch kenc je tedy
obtn a nemon, bez ohledu na mnostv uitch molekulrnch marker.

37
4. Vsledky
4.1. Nuklern znaky
4.1.1. Analza lokus kdujcch proteiny
Celkem bylo analyzovno 5 enzymovch systm v 9 lokusech ve vzorcch somatick
svaloviny a jatern tkn 273 jedinc parem (rod Barbus) z celkem 10 lokalit na Vchodnm
Slovensku, nleejcch k mom Baltskho a ernho moe.
4.1.1.1. Distribuce alel
Z vslednch 9 lokus je 5 pln diagnostickch, monomorfnch pro kad druh
(sMDH-2*, sMDH-3*, sMDH-4*, sMDH-5*, SOD-2*), u B. barbus je polymorfn PGM-1*, a
u B. carpathicus LDH-A1* (lechtov et al. 1993). Lokus GPI-2* je monomorfn u
B. carpathicus, ale polymorfn u B. barbus, jeliko je vak zrove tetrasomick a asto se
v nm vyskytuje i alela, za stvajcch podmnek elektroforeticky neodliiteln od B.
carpathicus, musel bt z vtiny analz vylouen. Vzcn se jako tetrasomick u obou druh
jev i lokus PGM-2*.
Podl polymorfnch lokus P = N
0,95
/n in u B. carpathicus: 0,11 u B. barbus: 0,33. Za
elem snadn detekce, co mon nejvtho mnostv introgredovanch alel, byly pednostn
vybrny monomorfn pln diagnostick lokusy.
GPI-2* (dimer)
B. carpathicus: monomorfn, pouze alela 100 (F)
B. barbus: polymorfn, tetrasomick, 4 alely, z nich nejastj je za stvajcch
podmnek neodliiteln od 100 (F).
LDH-A1* (tetramer)
B. carpathicus: polymorfn, vedle alely 100, kter se vyskytovala astji, se na vtin
lokalit objevovala i alela 200.
B. barbus: monomorfn, alela za stvajcch podmnek neodliiteln od 100.
sMDH-1* (dimer)
B. carpathicus: monomorfn, pouze alela 100
B. barbus: monomorfn, pouze alela 85
38
sMDH-2* (dimer)
B. carpathicus: monomorfn, pouze alela 100
B. barbus: monomorfn, pouze alela 98
sMDH-3* (dimer)
B. carpathicus: monomorfn, pouze alela 100
B. barbus: monomorfn, pouze alela 106
sMDH-4* (dimer)
B. carpathicus: monomorfn, pouze alela 100
B. barbus: monomorfn, pouze alela 102
PGM-1* (monomer)
B. carpathicus: monomorfn, pouze alela 100
B. barbus: polymorfn, 3 alely, z nich jedna je za stvajcch podmnek neodliiteln
od 100.
PGM-2* (monomer)
B. carpathicus: monomorfn (P
0,05
), alela 100, vzcn alela 70, pokud bychom vzali
v vahu cel vzorek(7 z 201jedinc). V samotnm povod Dunaje je mnohem
astj (4 z 24jedinc). Na 1 % hranici (P
0,01
) jej lze povaovat za polymorfn.
B. barbus: polymorfn, alely 80, 90. V povod Dunaje i 70, jako tetrasomick (2
jedinci- 1. hybrid, 1.v ostatnch lokusech B. barbus).
SOD-2* (dimer)
B. carpathicus: monomorfn, pouze alela 100
B. barbus: monomorfn, pouze alela 50
4.1.2. Analza mikrosatelitu
Mikrosatelitov lokus Barb79
sla vyjaduj absolutn velikost fragmentu (bp). Mimo potu repetic se druhy mohou
liit i v dlce nerepetitivn sekvence. K oven tohoto tvrzen by vak bylo nutn jeho
osekvenovn.
B. carpathicus: polymorfn, 4 alely. Privtn alela povod Dunaje 204. Alely spolen
obma povodm: 208, 212, 216.
B. barbus: polymorfn, 14 alel. Privtn alely povod Dunaje: 223, 251, 255, 291.
Exkluzivn alely v povod Visly: 231, 235, 243, 259, 267, 275. Alely spolen obma
povodm: 203, 227, 279, 283.
39
4.1.3. Genetick variabilita
daje charakterizujc genetickou variabilitu jsou uvedeny v tabulkch 4. a 5.
Tabulka 4. Alelick frekvence polymorfnch lokus Barbus carpathicus.
Populace Orlov Andrejovka Kurn Plave ubotinka
Star
ubova Hromo Hankovce* Kokovce* Sabinov*
(N) 38 37 1 6 9 31 55 13 1 10

LDH-
A1* 100 0,4474 0,5135 0,0000 0,4167 0,5000 0,5806 0,4364 0,8846 1,0000 0,9500
200 0,5526 0,4865 1,0000 0,5833 0,5000 0,4194 0,5636 0,1154 0,0000 0,0500

H exp. 0,4945 0,4996 0 0,4861 0,5000 0,4870 0,4919 0,2041 0,0000 0,0950
H n.b. 0,5011 0,5065 0,0000 0,5303 0,5294 0,4950 0,4964 0,2123 0,0000 0,1000
H obs. 0,4211 0,4865 0,0000 0,5000 0,7778 0,3226 0,5455 0,2308 0,0000 0,1000

Barb79 204 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0385 0,5000 0,4000
208 0,5789 0,6216 0,5000 0,5000 0,6667 0,7742 0,5909 0,8462 0,5000 0,5500
212 0,3026 0,2973 0,5000 0,2500 0,2222 0,1935 0,2727 0,0769 0,0000 0,0500
216 0,1184 0,0811 0,0000 0,2500 0,1111 0,0323 0,1364 0,0385 0,0000 0,0000

H exp. 0,5592 0,5186 0,5000 0,6250 0,4938 0,3621 0,5579 0,2751 0,5000 0,5350
H n.b. 0,5667 0,5257 1,0000 0,6818 0,5229 0,3681 0,5630 0,2862 1,0000 0,5632
H obs. 0,6316 0,3784 1,0000 0,3333 0,6667 0,3871 0,5636 0,2308 1,0000 0,2000

celk. H exp. 0,5268 0,5091 0,2500 0,5556 0,4969 0,4246 0,5249 0,2396 0,2500 0,3150
H n.b. 0,5339 0,5161 0,5000 0,6061 0,5261 0,4315 0,5297 0,2492 0,5000 0,3316
H obs. 0,5263 0,4324 0,5000 0,4167 0,72 0,3548 0,5545 0,2308 0,5000 0,1500
P(0.95) 1,0000 1,0000 0,5000 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 0,5000 1,0000
P(0.99) 1,0000 1,0000 0,5000 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 0,5000 1,0000
Alel/lokus 2,5000 2,5000 1,5000 2,5000 2,5000 2,5000 2,5000 3,0000 1,5000 2,5000
*) Lokality z povod Dunaje
N poet jedinc
H exp. heterozygotnost oekvan v ppad, e se populace nachz v Hardy-
Weinbergov rovnovze
H n.b. oekvan heterozygotnost (H exp.) korigovan (non biased) pro ikmost
vzorkovn (zvyuje vznamnost haploidnch hodnot: (2n-1)/(2n-2))
H obs. pozorovan heterozygotnost (vyjaduje relativn zastoupen heterozygot
v jednotlivch populacch)
P pomr polymorfnch lokus, kde nejastj alela dosahuje frekvence
maximln 95% (99%)
40
Tabulka 5. Alelick frekvence polymorfnch lokus Barbus barbus.
Populace Orlov Plave Star ubova Hankovce* Kokovce* Sabinov*
(N) 1 2 46 1 2 6

PGM-1* 94 1,0000 0,7500 0,5326 0,0000 0,5000 0,0833
96 0,0000 0,0000 0,2174 0,5000 0,0000 0,5833
100 0,0000 0,2500 0,2500 0,5000 0,5000 0,3333

H exp. 0,0000 0,3750 0,6066 0,5000 0,5000 0,5417
H n.b. 0,0000 0,5000 0,6132 1,0000 0,6667 0,5909
H obs. 0,0000 0,5000 0,5435 1,0000 1,0000 0,6667

Barb79 203 0,0000 0,5000 0,3261 0,5000 0,0000 0,0833
223 0,0000 0,0000 0,0000 0,5000 0,0000 0,3333
227 0,0000 0,0000 0,0543 0,0000 0,2500 0,0000
231 0,0000 0,0000 0,0435 0,0000 0,0000 0,0000
235 0,0000 0,0000 0,0109 0,0000 0,0000 0,0000
243 0,0000 0,0000 0,0326 0,0000 0,0000 0,0000
251 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,2500 0,0000
255 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,2500 0,3333
259 0,0000 0,0000 0,0109 0,0000 0,0000 0,0000
267 0,0000 0,0000 0,0109 0,0000 0,0000 0,0000
275 0,5000 0,2500 0,1196 0,0000 0,0000 0,0000
279 0,0000 0,0000 0,0435 0,0000 0,2500 0,0000
283 0,5000 0,2500 0,3478 0,0000 0,0000 0,1667
291 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0833

H exp. 0,5000 0,6250 0,7502 0,5000 0,7500 0,7361
H n.b. 1,0000 0,8333 0,7585 1,0000 1,0000 0,8030
H obs. 1,0000 1,0000 0,8261 1,0000 1,0000 0,1667

celk. H exp. 0,2500 0,5000 0,6784 0,5000 0,6250 0,6389
H n.b. 0,5000 0,6667 0,6859 1,0000 0,8333 0,6970
H obs. 0,5000 0,7500 0,6848 1,0000 1,0000 0,4167
P(0.95) 0,5000 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000
P(0.99) 0,5000 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000 1,0000
Alel/lokus 1,5000 2,5000 6,5000 2,0000 3,0000 4,0000
*) Lokality nlec do povod Dunaje
N poet jedinc
H exp. oekvan heterozygotnost
H n.b. korigovan (non biased) heterozygotnost (H exp.)
H obs. pozorovan heterozygotnost
P pomr polymorfnch lokus
41
4.1.3.1. Prmrn poet alel v polymorfnch lokusech
Prmrn poet alel na polymorfn lokus se v rmci jednotlivch populac u B. barbus
pohyboval v rozmez hodnot 1,5 - 6,5 v zvislosti pedevm na mnostv vzork z populace.
V rmci srovnateln poetnch kolekc je patrn vt poet alel u populac z povod Dunaje.
Relativn vysok prmrn poet alel na lokus je zpsoben mikrosate-litovm lokusem, kter
je u tohoto druhu vysoce variabiln. (Tabulka 5.)
Prmrn poet alel na polymorfn lokus se v rmci jednotlivch populac u B.
carpathicus pohyboval v rozmez hodnot 1,5 - 3. V povod Dunaje je vy dky vskytu
privtn mikrosatelitov alely o velikosti 204 bp. (Tabulka 4.)
4.1.3.2. Prmrn heterozygotnost v polymorfnch lokusech
Prmrn pozorovan heterozygotnost v polymorfnch lokusech B. barbus dosahovala
hodnot 0,4167 - 1,0000. V nejpoetnji zastoupen populaci ze Star ubovni (Poprad) takka
odpovd oekvn (viz. test F
IS
ne). Siln deficit pozorovanch heterozygot oproti
oekvanm byl detekovn v mikrosatelitovm lokusu Barb79 na lokalit Sabinov v ece
Torysa (Tabulka 5.; viz. tak test F
IS
).
Prmrn pozorovan heterozygotnost v polymorfnch lokusech u B. carpathicus
dosahovala hodnot 0,2308 - 0,7222. Ni hodnoty vykazovaly lokality z povod Dunaje, kde
je rovn ni frekvence vskytu alely 200 lokusu LDH-A1*. Siln deficit pozorovanch
heterozygot oproti oekvanm byl detekovn v mikrosatelitnm lokusu Barb79 na lokalit
Sabinov (Torysa). (Tabulka 4.)
4.1.3.3. Vnitropopulan variabilita
Vnitropopulan variabilitu charakterizuje koeficient inbreedingu F
IS
(dle Weira et
Cockerhama 1984). Akoliv v ece Poprad nelze zamtnout nulovou hypotzu (H
0
), e se
populace nachz v Hardy-Weinbergov rovnovze, pro lokality z povod Dunaje to neplat.
Jak u B. carpathicus tak u B. barbus je evidentn, e je tato situaci zpsobil pedevm siln
deficit heterozygot v kolekci z lokality Sabinov (viz. tabulky 4. a 5.). Celkov F
IS
u B.
barbus sice nen signifikantn, ale pro lokus Barb79 je dokonce na 0,1% hladin vznamnosti.
(Tabulka 6.)
42
Tabulka 6. Charakteristika populac rodiovskch druh pomoc F statistiky. Hvzdiky
udvaj hladinu vznamnosti u statisticky prkaznch hodnot.
F
ST
() F
ST
(RH) F
ST
(RH') F
IS
(f) jedinc
lokali
t alel
Poprad-
B. carpathicus
LDH-A1* -0,0009 -0,0009 -0,0009 0,0529 177 7 2
Barb79 0,0006 0,0006 0,0006 0,0316 177 7 3
celk. -0,0002 0,0001 0,0001 0,0420 177 7
Poprad-
B. barbus
PGM-1* -0,0580 -0,0551 -0,0532 0,1238 49 3 3
Barb79 -0,0696 -0,1472 2,5900 -0,0995 49 3 10
celk. -0,0644 -0,1305 2,1094 -0,0006 49 3
Dunaj-
B. carpathicus
LDH-A1* -0,0462 -0,0462 -0,0462 -0,0436 24 3 2
Barb79 0,1234 0,0355 0,060,4200** 24 3 4
celk. 0,0832 0,0151 0,03340,2947* 24 3
Dunaj-
B. barbus
PGM-1* 0,1434 0,1674 0,1844 -0,3023 9 3 3
Barb79 -0,1675 -0,0699 0,04920,5362*** 9 3 8
celk. -0,0247 -0,0171 0,0793 0,2143 9 3
B. barbus
PGM-1* 0,1028* 0,0910* 0,0923* 0,0665 58 6 3
Barb79 0,0841* 0,0683* 0,6196 0,0001 58 6 14
celk. 0,0924** 0,0713* 0,5493 0,0294 58 6
B. carpathicus
LDH-A1* 0,0888*** 0,0888*** 0,0888*** 0,0525 201 10 2
Barb79 0,0306** 0,1317*** 0,2089*** 0,0699 201 10 4
celk. 0,0591*** 0,1210*** 0,1788*** 0,0617 201 10
B. barbus
Poprad versus
Dunaj
PGM-1* 0,1306* 0,1076* 0,1129* 0,0679 58 6 3
Barb79 0,1313*** 0,0993*** 3,5966*** -0,0066 58 6 14
celk. 0,1310*** 0,1004*** 3,1321*** 0,0264 58 6
B. carpathicus
Poprad versus
Dunaj
LDH-A1* 0,2865*** 0,2865*** 0,2865*** 0,0488 201 10 2
Barb79 0,0768** 0,2010*** 1,0991*** 0,0776 201 10 4
celk. 0,1890*** 0,2224*** 0,8960*** 0,0640 201 10
*)P0,05
**)P0,01
***)P0,001
F
ST
() fixan koeficient (odhad dle Weira et Cockerhama 1984)
F
ST
(RH) fixan koeficient (odhad dle Robertsona et Hilla 1984)
F
ST
(RH) fixan koeficient (odhad dle Raufaste et Bonhomme 2000)
F
IS
(f) koeficient inbreedingu (odhad dle Weira et Cockerhama 1984)
Poprad versus Dunaj porovnn populac Popradskho a Dunajskho povod, vzniklch
smenm vzork ze vech lokalit danch povod
43
4.1.3.4. Variabilita mezi subpopulacemi
Variabilitu mezi subpopulacemi jsem hodnotil pomoc fixanho koeficientu F
ST
,
odhadovanho 3 rznmi zpsoby, kter vak poskytly velmi podobn vsledky. Jednotliv
populace v rmci povod se signifikantn neli. Populace B. carpathicus z eky Poprad je
takka uniformn. Naopak, na 0,1% hladin vznamnosti jsou vzjemn odlin populace
reprezentujc rzn povod. Dle Wrighta (1978) by bylo mon populace B. carpathicus
z Popradu charakterizovat jako siln diferenciovan od populac dunajskho povod.
Popradsk populace B. barbus lze oznait jako stedn diferenciovan od populac povod
dunajskho (Tabulka 6.). V ppad podrobnj populan genetick studie by bylo nutn tato
tvrzen tkajc se stupn diferenciace testovat. Pro ely tto prce to vak nepokldm za
nezbytn.
4.1.3.5. Formln test nhodnho pen mezi obma druhy
Vsledek formlnho testu nhodnho pen (random mating) mezi B. carpathicus a
B. barbus, kter je jinak intuitivn patrn, je vynesen v nsledujc tabulce (Tabulka 7).
Deficit heterozygot (prkazn a kladn F
IS
) v ece Poprad, signifikantn na 5% hladin
vznamnosti (P=0,019), a tsn i na vech lokalitch dohromady (P=0,54), je zpsoben
nzkm potem hybrid. Naopak na kontrolnch lokalitch v povod Dunaje, kde byli
selektivn vybrni jedinci s morfologicky intermedilnm fenotypem, nejen, e nememe
vylouit, e populace le v Hardy-Weinbergov rovnovze, ale dokonce je zde naznaen
deficit homozygot (zporn, le neprkazn F
IS)
. V tomto ppad jde vak sp o zhodnocen
kvality vzorkovn. Velmi vznamn rozdly mezi subpopulacemi (prkazn F
ST
), jsou
zpsobeny rznm procentuelnm zastoupenm obou druh na jednotlivch lokalitch.
(Tabulka 7.)
Tabulka 7. Formln test nhodnho pen mezi Barbus carpathicus a B. barbus.
populace F
IS
(f) F
ST
() F
ST
(RH) F
ST
(RH) jedinc lokalit
Poprad 0,0739* 0,6927*** 0,3550*** 1,0834*** 230 7
Laborec -0,14060,5648*** 0,3179*** 0,5609** 23 2
povod Dunaje -0,03380,5231*** 0,2359*** 0,3665* 43 3
vechny 0,0443* 0,6566*** 0,2963*** 1,3726* 273 10
*)P0,05
**)P0,01
***)P0,001
44
4.2. Mitochondriln DNA
Introgrese druhov specifick mtDNA nebyla detekovna ani v jednom smru. Vichni
hybridn jedinci nesli mtDNA B. barbus. Z diagnostickch restriknch endonuklez se
z technickch dvod nejlpe osvdil Msp I (Obrzek 6.)
Obrzek 6. Vsledky tpen mtDNA Barbus carpathicus, B. barbus a vech hybridnch
jedinc z eky Poprad diagnostickm restriknm enzymem Msp I.
45
4.3. Cytonuklern nerovnovhy
Hodnoty jednotlivch koeficient nerovnovhy (D) a vsledky test vznamnosti jsou
uvedeny v tabulkch. Jako normalizovan (D) v nich oznauji (
D
~
) upraven s vyuitm
marginlnch hodnot (maximlnch teoretickch hodnot vzhledem k genotypovm frekvencm
v souboru) a jsou konenm vstupem testu (Asmussen et Basten 1994). Stedn chybou (H
0
)
mm na mysli stedn chybu odhadu za pedpokladu, e plat nulov hypotza (D = 0;
populace se nachz v cytonuklern rovnovze). Stedn chybou (H
1
) je stedn chyba odhadu
za pedpokladu, e plat alternativn hypotza (D 0). Testov statistika (n
2 ~
r
) je tradin
uvna pi zjiovn prkaznosti koeficient nerovnovhy. M piblin distribuci
2
(Asmussen et Basten 1994). V testu na 0,05 hladin vznamnosti tedy zamtme H
0
(D = 0),
je-li n
2 ~
r
> 3,84 (zskanou hladinu vznamnosti ukazuje kolonka Pravdpodobnost). Exaktn
pravdpodobnost udv hladinu pravdpodobnosti H
0
(D = 0) zjitnou na zklad Fischerova
exaktnho testu. Kolonky MSSa ( = 0,1) / MSSa ( = 0,5) vyjaduj minimln velikosti
vzorku (Minimal Sample Size) pi = 0,05; piem = pravdpodobnost vskytu chyby
I.druhu (zamtnut H
0
za pedpokladu, e plat), = pravdpodobnost vskytu chyby II.druhu
(nezamtnut H
0
).
4.3.1. Povod Popradu
Hodnoty jednotlivch koeficient nerovnovhy (D) a vsledky test vznamnosti jsou
uvedeny v tabulkch 8-10.
Vzorek tvo 230 jedinc. Frekvence alely A (pln diagnostick pro B. barbus) (pA) je
u lokus MDH-1*, MDH-2*, MDH-3*, SOD-2* rovna 0,23. U MDH-4*, PGM-2* a Barb79 je
rovna 0,22. Frekvence (pM) cytotypu charakteristickho pro B. barbus oznaovanho zde jako
M je rovna 0,23. Zhruba 21% vech parem ulovench v ece Poprad tvo zstupci ist B.
barbus, nebo pokroil generace hybrid (vce ne tet generace), kter takka nen mon
zachytit. Asi 2% jsou zachycen hybridi s mtDNA B. barbus a konen 77% jsou zstupci B.
carpathicus, patrn pouze ist linie.
Hodnoty vech koeficient nerovnovhy (D) jsou signifikantn (P0,05). Patrn jsou
drobn odlinosti mezi lokusy, zpsoben ptomnost BC. Minimln poty jedinc
s pslunm genotypem nezbytn k detekci nerovnovh byly dodreny na hladin = 0,5.
Zjitn hodnoty jednotlivch cytonuklernch nerovnovh ukazuj, e hybridizace je
46
jednosmrn, ovlivnn pohlavm (viz. interpretace ne). Dochz k introgresi alel B.
carpathicus do genofondu B. barbus.
Tabulka 8. Hodnoty koeficient nerovnovhy (D) v povod Popradu pro lokusy MDH-1*,
MDH-2*, MDH-3*, SOD-2* a mtDNA s vsledky test vznamnosti.
Koeficient nerovnovhy D
A
D
AA
M D
Aa
M D
aa
M D
A
M
Odhadnut (
D
~
)
0,1706 0,1706 0,0067 -0,1773 0,1740
Normalizovan (D) 0,9752 1,0000 1,0000 -1,0000 1,0000
Stedn chyba (H0) 0,0115 0,0115 0,0026 0,0117 0,0183
Stedn chyba (H1) 0,0151 0,0151 0,0047 0,1497 0,0149
Testov statistika (
2 ~
r n
)
218,7000 218,8000 6,7380 230,0000 90,8400
Pravdpodobnost 0,0000 0,0000 0,0344 0,0000 0,0000
Exaktn pravdpodobnost -0,0100 0,0000 0,0523 0,0000 0,0000
MSSa ( = 0.1) 14 14 626 13 23
MSSa ( = 0.5) 4 4 131 4 10
AA:Aa:aa = 51:2:177
Tabulka 9. Hodnoty koeficient nerovnovhy (D) v povod Popradu pro lokusy MDH-4*,
Barb79 a mtDNA s vsledky test vznamnosti.
Koeficient nerovnovhy D
A
D
AA
M D
Aa
M D
aa
M D
A
M
Odhadnut (
D
~
)
0,1673 0,1673 0,0100 -0,1773 0,1723
Normalizovan (D) 0,9625 1,0000 1,0000 -1,0000 1,0000
Stedn chyba (H0) 0,0115 0,0115 0,0032 0,0117 0,0181
Stedn chyba (H1) 0,0152 0,0152 0,0057 0,0150 0,0148
Testov statistika (
2 ~
r n
)
213,1000 213,4000 10,1500 230,0000 90,6500
Pravdpodobnost 0,0000 0,0000 0,0062 0,0000 0,0000
Exaktn pravdpodobnost -0,0100 0,0000 0,0117 0,0000 0,0000
MSSa ( = 0.1) 14 14 414 13 23
MSSa ( = 0.5) 4 4 87 4 10
AA:Aa:aa = 50:3:177
Tabulka 10. Hodnoty koeficient nerovnovhy (D) v povod Popradu pro lokus PGM-2* a
mtDNA s vsledky test vznamnosti.
Koeficient nerovnovhy D
A
D
AA
M D
Aa
M D
aa
M D
A
M
Odhadnut (
D
~
)
0,1639 0,1640 0,0134 -0,1773 0,1706
Normalizovan (D) 0,9496 1,0000 1,0000 -1,0000 1,0000
Stedn chyba (H0) 0,0114 0,0114 0,0036 0,0117 0,0179
Stedn chyba (H1) 0,0153 0,0153 0,0065 0,0150 0,0148
Testov statistika (
2 ~
r n
)
207,4000 207,9000 13,5900 230,0000 90,4700
Pravdpodobnost 0,0000 0,0000 0,0011 0,0000 0,0000
Exaktn pravdpodobnost -0,0100 0,0000 0,0026 0,0000 0,0000
MSSa ( = 0.1) 15 15 308 13 23
MSSa ( = 0.5) 4 4 65 4 10
AA:Aa:aa = 49:4:177
47
4.3.2. Povod Dunaje
Hodnoty jednotlivch koeficient nerovnovhy (D) a vsledky test vznamnosti jsou
uvedeny v tabulkch 11-12.
Vzorek tvo 43 jedinc. Frekvence alely A (pln diagnostick pro B. barbus) (pA) je u
lokus MDH-1*, MDH-3*, PGM-2*, SOD-2* a Barb79 rovna 0,33. U MDH-2* a MDH-4* je
rovna 0,34. Frekvence cytotypu M (charakteristickho pro B. barbus) (pM) je rovna 0,44.
. Hodnoty vech koeficient nerovnovhy (D) jsou signifikantn (P0,01). Patrn jsou
drobn odlinosti mezi lokusy, zpsoben ptomnost BC. Minimln poet vzork byl
dodren na hladin = 0,5. Pro lokusy MDH-2*, MDH-4* byl dodren dokonce na hladin
= 0,1. Zjitn koeficienty (D) ukazuj, e hybridizace je jednosmrn, ovlivnn pohlavm a
vede k introgresi alel B. carpathicus do genofondu B. barbus.
Tabulka 11. Hodnoty koeficient nerovnovhy (D) v povod Dunaje pro lokusy MDH-1*,
MDH-3*, PGM-2*, SOD-2*, Barb79 a mtDNA s vsledky test vznamnosti.
Koeficient nerovnovhy D
A
D
AA
M D
Aa
M D
aa
M D
A
M
Odhadnut (
D
~
)
0,1033 0,1168 0,1298 -0,2466 0,1817
Normalizovan (D) 0,4704 1,0000 1,0000 -1,0000 1,0000
Stedn chyba (H0) 0,0335 0,0308 0,0320 0,0376 0,0329
Stedn chyba (H1) 0,0341 0,0286 0,0286 0,0088 0,0155
Testov statistika (
2 ~
r n
)
9,5170 14,3800 16,4600 43,0000 30,4700
Pravdpodobnost 0,0086 0,0008 0,0003 0,0000 0,0000
Exaktn pravdpodobnost -0,0100 0,0002 0,0000 0,0000 0,0000
MSSa ( = 0.1) 48 30 25 5 9
MSSa ( = 0.5) 17 11 10 4 5
AA:Aa:aa = 9:10:24
Tabulka 12. Hodnoty koeficient nerovnovhy (D) v povod Dunaje pro lokusy MDH-2*,
MDH-4* a mtDNA s vsledky test vznamnosti.
Koeficient nerovnovhy D
A
D
AA
M D
Aa
M D
aa
M D
A
M
Odhadnut (
D
~
)
0,1188 0,1298 0,1168 -0,2466 0,1882
Normalizovan (D) 0,5318 1,0000 1,0000 -1,0000 1,0000
Stedn chyba (H0) 0,0341 0,0320 0,0308 0,0376 0,0340
Stedn chyba (H1) 0,0336 0,0286 0,0286 0,0088 0,0156
Testov statistika (
2 ~
r n
)
12,1600 16,4600 14,3800 43,0000 30,6100
Pravdpodobnost 0,0023 0,0003 0,0008 0,0000 0,0000
Exaktn pravdpodobnost -0,0100 0,0000 0,0002 0,0000 0,0000
MSSa ( = 0.1) 37 25 30 5 9
MSSa ( = 0.5) 14 10 11 4 5
AA:Aa:aa = 10:9:24
48
4.3.3. Ob povod dohromady
Hodnoty jednotlivch koeficient nerovnovhy (D) a vsledky test vznamnosti jsou
uvedeny v tabulkch 13-16.
Vzorek tvo 273 jedinc. Frekvence alely A (pln diagnostick pro B. barbus) (pA) je
u vech lokus rovna 0,24. Pln diagnostickou alelu B. carpathicus oznauji a. Frekvence
cytotypu M (charakteristickho pro B. barbus) (pM) je rovna 0,26. Piblin 22%
analyzovanch jedinc tvo zstupci ist B. barbus, nebo pokroil generace hybrid (vce
ne tet generace), kter takka nen mon zachytit. Zhruba 4% jsou zachycen hybridi
s mtDNA B. barbus a konen 74% jsou zstupci B. carpathicus, patrn pouze ist linie.
Hodnoty vech koeficient nerovnovhy (D) jsou prkazn odlin od nuly (P0,01).
Patrn jsou drobn odlinosti mezi lokusy v normalizovanm D
A
, zpsoben ptomnost BC.
Minimln poet vzork byl dodren na hladin = 0,1. Zjitn hodnoty koeficient
nerovnovhy (D) ukazuj, e pirozen hybridizace je jednosmrn, ovlivnn pohlavm.
Patrn dochz k introgresi pouze alel B. carpathicus do genofondu B. barbus.
Tabulka 13. Hodnoty koeficient nerovnovhy (D) pro lokus Barb79 a mtDNA s vsledky
test vznamnosti.
Koeficient nerovnovhy D
A
D
AA
M D
Aa
M D
aa
M D
A
M
Odhadnut (
D
~
)
0,1586 0,1591 0,0351 -0,1942 0,1766
Normalizovan (D) 0,8694 1,0000 1,0000 -1,0000 1,0000
Stedn chyba (H0) 0,0110 0,0110 0,0057 0,0118 0,0161
Stedn chyba (H1) 0,0137 0,0136 0,0091 0,0126 0,0123
Testov statistika (
2 ~
r n
)
206,4000 210,1000 38,1100 273,0000 120,5000
Pravdpodobnost 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000
Exaktn pravdpodobnost -0,0100 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000
MSSa ( = 0.1) 17 16 115 11 20
MSSa ( = 0.5) 5 5 28 4 9
AA:Aa:aa = 59:13:201
49
Tabulka 14. Hodnoty koeficient nerovnovhy (D) pro lokus MDH-2* a mtDNA
s vsledky test vznamnosti.
Koeficient nerovnovhy D
A
D
AA
M D
Aa
M D
aa
M D
A
M
Odhadnut (
D
~
)
0,1641 0,1645 0,0297 -0,1942 0,1793
Normalizovan (D) 0,8907 1,0000 1,0000 -1,0000 1,0000
Stedn chyba (H0) 0,0112 0,0111 0,0052 0,0118 0,0163
Stedn chyba (H1) 0,0136 0,0135 0,0085 0,0126 0,0124
Testov statistika (
2 ~
r n
)
216,6000 219,2907 31,9976 273,0000 120,8000
Pravdpodobnost 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000
Exaktn pravdpodobnost -0,0100 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000
MSSa ( = 0.1) 16 15 138 11 19
MSSa ( = 0.5) 5 5 33 4 9
AA:Aa:aa = 61:11:201
Tabulka 15. Hodnoty koeficient nerovnovhy (D) pro lokusy MDH-1*, MDH-3*,
MDH-4*, SOD-2* a mtDNA s vsledky test vznamnosti.
Koeficient nerovnovhy D
A
D
AA
M D
Aa
M D
aa
M D
A
M
Odhadnut (
D
~
)
0,1613 0,1618 0,0324 -0,1942 0,1780
Normalizovan (D) 0,8801 1,0000 1,0000 -1,0000 1,0000
Stedn chyba (H0) 0,0111 0,0110 0,0055 0,0118 0,0162
Stedn chyba (H1) 0,0136 0,0135 0,0088 0,0126 0,0123
Testov statistika (
2 ~
r n
)
211,5000 214,6831 35,0402 273,0000 120,6000
Pravdpodobnost 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000
Exaktn pravdpodobnost -0,0100 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000
MSSa ( = 0.1) 16 16 126 11 19
MSSa ( = 0.5) 5 5 30 4 9
AA:Aa:aa = 60:12:201
Tabulka 16. Hodnoty koeficient nerovnovhy (D) pro lokus PGM-2* a mtDNA s vsledky
test vznamnosti.
Koeficient nerovnovhy D
A
D
AA
M D
Aa
M D
aa
M D
A
M
Odhadnut (
D
~
)
0,1558 0,1564 0,0378 -0,1942 0,1753
Normalizovan (D) 0,8587 1,0000 1,0000 -1,0000 1,0000
Stedn chyba (H0) 0,0110 0,0109 0,0059 0,0118 0,0160
Stedn chyba (H1) 0,0137 0,0136 0,0094 0,0126 0,0123
Testov statistika (
2 ~
r n
)
201,3000 205,6000 41,2000 273,0000 120,4000
Pravdpodobnost 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000
Exaktn pravdpodobnost -0,0100 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000
MSSa ( = 0.1) 17 17 106 11 20
MSSa ( = 0.5) 5 5 25 4 9
AA:Aa:aa = 58:14:201
50
4.3.4. Interpretace dle Avise
Vsledek zakreslen do 3x2 tabulky (Tabulka 17.) dle Avise (2001), je spolen vem
pln diagnostickm lokusm pro ob povod. Pozornost si zasluhuje absence genotypu M
aa
(tj.
jadernho genotypu homozygotnho pro alelu B. carpathicus v kombinaci s mtDNA
specifickou pro B. barbus) ve vech lokusech, co znamen neptomnost F2 generace. Tento
stav bv interpretovn jako dkaz pro sterilitu jednoho pohlav hybrid zamezujc ken
hybrid F1 generace mezi sebou. Stejn tak i absence m
AA
, kter navc v kombinaci s absenc
m
Aa
zna striktn jednosmrnost hybridizace.
Tabulka 17. 3x2 tabulka dle Avise (2001) spolen vem pln diagnostickm jadernm
lokusm pro ob povod.
AA Aa aa
M ++ ++ 0
m 0 0 ++
D
AA
M
; D
Aa
M
; D
aa
M
; D
A
M
0
++ pozorovanch genotyp je vce ne pedpokldanch (prkazn kladn D)
0 absence genotypu v tto buce
51
4.4. Hybridn genotypy
Pomoc cytonuklernch genetickch marker bylo celkem detekovno 14 hybridnch
jedinc. Zastoupen hybrid i rodiovskch druh na jednotlivch lokalitch ukazuje Tabulka
18.
Tabulka 18. Poty jedinc Barbus carpathicus, B. barbus a hybrid dle zjitnch genotyp
na jednotlivch lokalitch.
povod eka lokalita B.barbus (ks) B.carpathicus (ks) hybridi
Visla Poprad Orlov 1 38 0
Andrejovka 0 37 0
Kurn 0 1 0
Plave 2 6 0
ubotinka 0 9 0
Star ubova 46 31 4
Hromo 0 55 0
Dunaj Laborec Hankovce 1 13 3
Kokovce 2 1 3
Torysa Sabinov 6 10 4
Tyto vsledky se ponkud li od pedpoklad zaloench na hrub morfologii
(Tabulka 1.). Na lokalit Orlov byli 3 jedinci, jejich fenotyp v cytonuklernch markerech
odpovd oekvn pro B. carpathicus, ureni podle hrub morfologie jako hybridi. Na
lokalit Plave je situace u jednoho jedince obdobn. Pomoc diagnostickch jadernch
marker byli zjitni 4 hybridi, dle hrub morfologie uren jako B. barbus, na lokalit Star
ubova. Jeden hybrid v Hankovcch, jeho kombinace jadernch znak spluje oekvn
pro F1, byl uren dle hrub morfologie jako B. barbus. Na lokalitch Kokovce a Sabinov se
pedpoklady hrub morfologie shoduj se zjitnm genotypem.
Konkrtn elektroforetick fenotypy, z nich lze usuzovat genotyp, vech zjitnch
hybrid na jednotlivch lokalitch ukazuje Tabulka 19. Celkov sice vrazn pevauj
hybridi 1. fililn generace (11 jedinc F1: 2 BC1: 1 BC2), na samotn ece Poprad je vak
situace mnohem vyrovnanj (2 F1: 1 BC1: 1 BC2).
52
Tabulka 19. Konkrtn elektroforetick fenotypy vech zjitnch hybrid ve vech
analyzovanch nuklernch lokusech. Tun jsou vyneseny alely specifick pro Barbus
carpathicus. Pln diagnostick lokusy jsou oznaeny zkratkou P.D.
Lokalita Hybrid
Izoenzymov lokusy Mikrosatelit
LDH-A1* sMDH-1* sMDH-2* sMDH-3* sMDH-4* GPI-2* PGM-1* PGM-2* SOD-2* Barb79
P.D. P.D. P.D. P.D. P.D. P.D. P.D.
Star ubova
(Poprad)
BC1 100/100 85/85 98/98 106/106 100/102 2F2S 94/100 90/100 50/50 203/212
BC2 100/100 85/85 98/98 106/106 102/102 2F2S 96/100 90/100 50/50 275/283
F1 100/200 85/100 98/100 100/106 100/102 2F2S 100/100 90/100 50/100 208/275
F1 100/200 85/100 98/100 100/106 100/102 2F2F
f
100/100 90/100 50/100 212/284
Hankovce (Laborec)
F1 100/200 85/100 98/100 100/106 100/102 1S3F 96/100 90/100 50/100 212/223
F1 100/100 85/100 98/100 100/106 100/102 1S3F 100/100 90/100 50/100 203/208
BC1 100/100 85/100 98/98 100/106 102/102 1S3F 94/94 90/100 50/100 212/223
Kokovce (Laborec)
F1 100/100 85/100 98/100 100/106 100/102 1Sf3F 96/100 90/100 50/100 203/208
F1 100/100 85/100 98/100 100/106 100/102 4F 94/100 90/100 50/100 212/223
F1 100/100 85/100 98/100 100/106 100/102 1S3F 96/100 90/100 50/100 216/255
Sabinov (Torysa)
F1 100/100 85/100 98/100 100/106 100/102 1S3F 100/100 90/100 50/100 203/208
F1 100/100 85/100 98/100 100/106 100/102 1S3F 96/100 90/100 50/100 204/247
F1 100/100 85/100 98/100 100/106 100/102 4F 94/100 90/100 50/100 204/259
F1 100/100 85/100 98/100 100/106 100/102 1S3F 96/100 90/100 50/100 208/259
53
5. Diskuse
5.1. Populan-genetick charakteristika populac
U populac obou druh parem z eky Poprad nelze zamtnout, e se nachz v Hardy-
Weinbergov rovnovze. Nejsou prkazn rozdly mezi jednotlivmi subpopulacemi.
Formln test potvrdil, e tok gen mezi obma druhy je omezen. Zastoupen hybridnch
jedinc v popradsk populaci parem je miziv (1,74%). Odhady nerovnovh mezi jadernmi a
cytoplazmatickmi znaky ukzaly, e hybridizace je pouze jednosmrn. Pestoe tedy
k mezidruhovmu ken dochz, m vsledky ukazuj, e hybridizace nenaruuje integritu
jednotlivch druh. Zd se, e k introgresi do genomu B. carpathicus vbec nedochz.
Populace obou druh parem z eky Poprad se prkazn li (F
ST
> 0) od
konspecifickch populac z povod Bodrogu (Dunaje). Rozdly jsou patrn nejen v rznch
frekvencch vskytu jednotlivch alel. Vskyt privtn mikrosatelitov alely v populacch B.
carpathicus z povod Bodrogu me bt interpretovn jako dsledek prbhu kolonizace
povod Visly tmto druhem z povod Dunaje (Kotlk et Berrebi 2002). Akoliv populace B.
barbus obou povod obsahuj privtn alely, ve vzorcch z povod Bodrogu srovnateln
velikosti je jich detekovno vt mnostv. Tento fakt rovn podporuje ve zmnnou
pedstavu postglaciln kolonizace povod Visly (Kotlk et Berrebi 2001).
Pouze na zklad formlnho testu, kter porovnv alelick frekvence jadernch
gen, nelze zamtnout H
0
(absenci reprodukn izolanch mechanism) na lokalitch
z povod Bodrogu, co je pravdpodobn zpsobeno clenm obohacenm vzorku o hybridn
jedince (viz. Materil).
Na vtin lokalit nelze zamtnout, e populace obou druh le v Hardy-Weinbergov
rovnovze. Nadbytek homozygot obou druh, v mikrosatelitovm lokusu Barb79, na lokalit
Sabinov zpsobil signifikantn kladn koeficient inbreedingu F
IS
, kter ukazuje na nenhodn
pen s velmi blzce pbuznmi jedinci.
1. Tento jev mohl bt vyvoln nedvnm drastickm zsahem do mstn populace,
kter rapidn snil jej velikost (napklad otrava). Nasvduje tomu obdobn situace u obou
druh. K redukci populace by muselo dojt nedvno, nebo jinak by se obnovila rovnovha.
Obdobn krtkodob by tak mohla zapsobit fragmentace populace vybudovnm nepli
vzdlench vodnch staveb.

54
2. Me jt o artefakt vzorkovn, celkov nepli vysok poty jedinc a souasn
vysokou variabilitu mikrosatelitovho lokusu. Na ostatnch lokalitch, kde byly vzorky
vybrny stejnm zpsobem, se ale s takovmto efektem nesetkvm. Proto nepokldm toto
vysvtlen za pli pravdpodobn.
3. Pozitivn vbrov pen, kter by mohlo mt podobn efekt (Nei 1987; Hartl et
Clark 1997), mi v kontextu charakteristik techo systmu parem (Baras 1994; Poncin et al.
1994) a vsku hybrid pijde nepravdpodobn.
4. Odchylku od Hardy-Weinbergovy rovnovhy me zpsobit i selekce (Nei 1987;
Weir 1996). Mikrosatelitov lokusy, jakoto nekdujc sekvence vak bvaj povaovny za
neutrln markery, na n selekce pli nepsob. Jejich frekvenci ale me ovlivovat
molekulrn tah gen, s nimi jsou ve vazb (Rieseberg et Randall Linder 1999). Situace na
ostatnch lokalitch vak pedstavu negativn selekce proti heterozygotm, ani pozitivn
selekce ve prospch homozygot nijak nepodporuj.
5. Mohlo by jt rovn o vskyt tzv. nulov alely jej ptomnost by vizuln
zpsobila exces homozygot, nebo jedinci u nich by byla v heterozygotnm stavu by byli
myln povaovni za homozygoty pro druh lokus. Vzhledem k tomu, e se u dnho
jedince nevyskytla v homozygotnm stavu a zrove by byla ptomna u obou druh,
nepokldm za nutn tuto hypotzu testovat a povauji ji za nepravdpodobnou.
55
5.2. Hybridn situace u parem rodu Barbus
Nejpodrobnji se obdobnm ppadem hybridizace, kter nese spoustu spolench
rys, zaobrali ve Francii, kde se k B. barbus a B. meridionalis, co vedlo k nahromadn
mnostv daj o zodpovdnch evolunch procesech (Berrebi et al. 1993; Daryus et Berrebi
1993; Chenuil et al. 2000). Berrebi et al. (1993), pestoe nepouili cytoplazmatick marker,
ve sv studii zjistili, e se v hybridn populaci nevyskytoval dn jedinec ani jednoho istho
druhu nebo F1, ale obsahovala mnohem vc alel specifickch pro B. barbus. Toto zjitn
spluje pedpoklady asymetrick hybridizace a introgrese do B. barbus a podporuj jej i
morfologick data (Daryus et Berrebi 1993; Crespin et Berrebi 1999).
Rheofiln parma B. meridionalis je fylogeneticky relativn blzce pbuzn B.
carpathicus. Kotlk et Berrebi (2002) uvd, e se jejich pedci oddlili na pelomu Pliocnu a
Miocnu, ped asi 5ti miliony let. Proto budu sv vsledky podrobnji srovnvat s daji
publikovanmi pro hybridn populace B. barbus a B. meridionalis ve Francii.
5.2.1. Scn hybridizace Barbus barbus a B. carpathicus
Jeliko vichni hybridi obsahovali mtDNA specifickou pro B. barbus, je mon pouze
jeden zpsob vzniku F1: 1. B. carpathicus + B. barbus . Nasktaj se vak dv monosti
vzniku zjitnch BC k B. barbus: 1. F1 + B. barbus ; 2. B. barbus + F1 . Zjitn
situace je spolen obma povodm.
5.2.1.1. Mon dvody zjitn situace
5.2.1.1.1. Etologick
Mezidruhovmu ken B. carpathicus + B. barbus mohou brnit siln
behaviorln bariry.
Gougnard et al. (1987) popsal specifick tec chovn francouzskch B. barbus
v akvriu: Jikernaka se zved od trkovitho dna, pohybuje genitln papilou v substrtu,
okzale roztahuje pektorln a ventrln ploutve, protahuje hubu a rozevr skele. Obdobn se
chovajc samci nedaleko uvoluj sperma. Toto chovn se me mnohokrt opakovat.
Poncin et al. (1994) udvaj pozorovan maximum 284 bhem 11 hod. Dle tchto autor,
tomuto popisu pesn odpovd i chovn francouzskch B. meridionalis. Bhem vtru se
vak u B. barbus vyskytuje i zvltn typ chovn, kdy jedinci opanho pohlav, ale i pouze
samci, plavou vysokou rychlost hlavami proti sob (Gougnard et al. 1987). Tento typ chovn
56
u B. meridionalis Poncin et al. (1994) nepozorovali, ani kdy se samci B. barbus snaili toto
chovn u samic B. meridionalis indukovat. Pesto v akvrich spn dochzelo k vtrm
ve vech kombinacch.
Co se te interpretace jejich vsledk, musm vak podotknout, e vechny ryby byly
k vtru hormonln stimulovny. Rovn byli vybrni nadstandardn velc jedinci B.
meridionalis (DT 205 ; 112 ).
Z tohoto dvodu pokldm existenci silnch behaviorlnch barir, kter by brnili
mezidruhovmu ken B. carpathicus + B. barbus , za nepli pravdpodobnou.
Situace v prod se ale me od experimentlnch podmnek velmi liit (Wirtz 1999).
U obou druh se vyskytuje dlkov pohlavn dimorfismus. Velk B. barbus me na
drobnho B. carpathicus psobit jako superatraktant a mal rozmry mu mohou pomoci
proniknout k samici, ji okupovan dvocmi se samci, a prosadit se tak oproti rozmrnjm
pivnm samcm B. barbus. U B. barbus je dlkov pohlavn dimorfismus jet mnohem
markantnj. Je tedy mon, e samce B. barbus relativn mal B. carpathicus nepitahuje,
nebo srovnateln velk B. barbus jet nedoshly pohlavn dosplosti.
5.2.1.1.2. Ekologick
Pedpokldm-li, e druhy maj primrn oddlen trdlit, znamen to, e B. carpat-
hicus pronikaj na trdlit B. barbus a spn se zde vytraj. Oproti tomu pohlavn dospl
B. barbus na trdlit B. carpathicus asi nepronikaj, emu by nasvdovala i napklad data
Pekrika (2004) z eky Udava. Vylouit to ovem jednoznan nelze.
Situaci by bylo nutn zhodnotit v kontextu konkrtnch ek a trdli. Je nutn
podotknout, e takka ve vech ekch Slovenska dlouhodob probh tba trku. Tm
dochz k permanentn disturbanci pirozenho habitatu tchto ryb, kter se tak mohou
dostvat do uho kontaktu, n by tomu bylo pirozen (ern - stn sdlen; vlastn
pozorovn).
Poncin et al. (1994) uvdj, e jikernaky B. meridionalis jsou, ohledn vhodnho
substrtu, podstatn mn vybrav, ne B. barbus, k emu je patrn vedou nestabiln
podmnky hornch tok. Dokonce jsou schopny se vytt i ve voln vod.
57
5.2.1.1.3. Fyziologick
Mnou zskan vsledky by mohli nasvdovat i existenci kompletn postkopulan
bariry pro tento smr hybridizace. V celm datovm souboru se nenala ani jedna vjimka.
Zjitn schma cytonuklernch nerovnovh dle Avise (2001) rovn ukazuje na
neptomnost, nebo neplodnost jednoho z pohlav F1, dky absenci F2.
Philippart et Berrebi (1990) objevili funkn sterilitu F1 , vzniklch umlm vtrem
B. meridionalis + B. barbus . Opan bohuel experiment neprovdli. F1 vznikali
astji (2 : ). Vykazovali mnohem pomalej rst ne samice, podobn jako je tomu u
rodiovskch druh. Tito autoi rovn zjistili, e rychlost rstu ani mnostvm jiker F1 (B.
barbus x meridionalis) za B. barbus pli nezaostvaj, ale dve dospvaj. Jak je to vak
s jejich fertilitou a viabilitou potomstva, nezkoumali.
1. Chromozmov rove
Heterogametick pohlav B. barbus je samice (ZW; typ Abraxas) (Castelli et
Philippart 1993). Pokud vak pat B. meridionalis rovn k typu Abraxas, zjitn situace
odporuje tzv. Haldaneov hypotze (1922): Je-li jedno pohlav neplodn, nebo chyb, jedn
se vdy o to heterozygotn. Chromozmov uren pohlav B. carpathicus, ani B.
meridionalis bohuel zatm nikdo nezjioval. Je-li tomu naopak (XY; typ Drosofila),
emu neodporuje zjitn smr hybridizace, mohli bt nedaleko objevu velmi zajmav
situace. Potomstvo by mohlo bt: XW, XZ, YW a YZ.
U ryb se asto li typ chromozmov determinace pohlav i v rmci eled u velmi
pbuznch druh, dokonce je znm i ppad u rznch lini tho druhu (Xiphophorus
maculatus). V komernm chovu tilapi (rod Oreochromis) se tradin vyuv
mezidruhovch kenc (nap. O. niloticus (XX) samice x O. aureus (ZZ) samec), nebo
takovto uniformn F1 potomstvo je sloeno pedevm ze samc, kte se vyznauj vysokmi
prstky. Fakt, e mnostv samc nen 100%, je zpsoben tm, e ne vechny pohlav
determinujc faktory, kter se vak li v sle exprese, jsou umstny na gonozmech (Devlin
2002).
2. Cytonuklern nekompatibilita
Sam funkn sterilita hybrid B. barbus x meridionalis me bt zpsobena
stenou nekompatibilitou nuklernho a mitochondrilnho genomu. Spermie jsou vysoce
citliv na dokonalou funkci mitochondri. Nepatrn zhoren jejich funkce, kter m mal,
58
nebo dokonce dn vliv na viabilitu a fertilitu samice, me mt za nsledek neplodnost
samce (Gemmell et Allendorf 2001). Berrebi et al. (1992) uvdj a tyikrt vy spotebu
kyslku u nkterch hybrid B. barbus x meridionalis.
Jeliko B. carpathicus pravdpodobn v minulosti prola silnm bottleneckem
(Kotlk et Berrebi 202), vykazuje velmi nzkou genetickou variabilitu. Jak se ji zmiuji v j
vnovan kapitole, je mtDNA mnohem citlivj k efektivnmu snen populace, ne
nuklern. Zd se mi pravdpodobnj, e mtDNA B. carpathicus bude inkompatibiln
s jadernm hybridnm genomem, ne je tomu u mtDNA siln geneticky variabiln B. barbus.
Domnvm se, e charakter haploidn mtDNA by mohl v tomto ppad hrt zsadnj roli,
ne diploidn nuklern genom. (Prv proto, e diploidn = flexibilnj.) Bohuel jsem o
takov teorii v literatue nenael dnou zmnku.
3. Preference spermi
Polyandrick reprodukn systm parem ponechv spermie silnmu seleknmu tlaku
(Simmons 2001). Nakolik v tomto ppad plat pedpoklad nadazenosti konspecifickch
spermi (Howard et al. 1998; Howard 1999) zatm nikdo nezkoumal. Je pravdpodobn, e se
ve vzjemnm rozpoznn gamet budou oba smry liit.
Chenuil et al. (1998) zjiovali rozdlnou reprodukn zdatnost samc B. meridionalis,
ale vsledek jejich pokusu nen pli pesvdiv, nebo peilo minimum potomstva.
5.2.1.2. Porovnn s pedchozmi zjitnmi
lechtov et al. (1993) na zklad 4 diagnostickch lokus v ekch Poprad, Torysa i
Laborec detekovali 6 hybridnch jedinc jejich elektroforetick fenotypy odpovdaly
oekvn pro BC 1 do B. carpathicus i B. barbus a zstupcm F2 i F1. Jeliko vak nepouili
dn cytoplazmatick marker, nelze urit jejich maternitu.
Tyto daje nejsou v pmm rozporu s mmi zvry ohledn pouze jedn monosti
vzniku F1.
BC1 do B. carpathicus mohou vzniknout: F1 + B. carpathicus . Takov BC1 by
ovem pravdpodobn obsahovali mtDNA specifickou pro B. barbus. V cel kolekci jsem
vak neobjevil dnou znmku cytoplazmatick introgrese ani v jednom smru.
Detekce BC do B. carpathicus by tedy svdila sp pro existenci plodnch F1 ,
budu-li stle pedpokldat sterilitu jednoho pohlav F1, co nabourv detekce genotypu,
splujcho oekvn pro F2. Stejn vzor ale me vzniknout i kombinac BC + BC, nebo BC
59
+ F1 (Redenbach et Taylor 2003), navzdory pedpokladu eliminace nejvce rekombinantnch
genotyp (Rieseberg et Randall Linder 1999; viz. kapitola 3.5.). Zmnn pedpoklad se vak
v tomto ppad asi siln uplatuje. Prokazateln hybridn jedinci na studovanch lokalitch
v ece Poprad dohromady tvo pouze zanedbateln procento populace parem, pestoe zde
byli poprv zaznamenni ji 4.9.1959 (Kux et Weisz 1960) a nejsp zde k hybridizaci
dochz po celou dobu spolenho vskytu, stejn jako ve vech ostatnch povodch.
Vzhledem k tomu, e se pravdpodobn oba dva druhy spolen rozili do povod Visly dky
river capture pes eku Poprad a povod Horndu koncem poslednho glacilu (ped 10 000
lety), nezd se, e by zde hybridizace ohroovala integritu zastnnch druh. Paradoxn lze
ci, e B. barbus si tmto zpsobem pouze obohacuje svj, ji tak siln polymorfn (lechtov
et al. 1998), genom.
5.2.1.3. Porovnn s ostatnmi ppady mezidruhov hybridizace v rmci podrodu Barbus.
Oproti mm zjitnm byli takka ve vech ppadech, studovanch pomoc
molekulrnch marker, zjitni jedinci, u nich lze z kombinace alel usuzovat na pslunost
k F2 generaci. Vjimkou vak nen ani ppad B. barbus x B. meridionalis, kde Philippart et
Berrebi (1990) experimentln ovili sterilitu F1 .
V obou ppadech hybridizace B. meridionalis byla zjitna hybridn zna, kde ist
rodiovsk druhy zcela chybly. Ppad B. haasi a B. meridionalis (Machordom et al. 1990)
vak nese pli mnoho velmi odlinch rys a nem smysl na nj poukazovat.
Pouze Tsigenopoulos et al. (2002) zaznamenali vskyt hybrid i pomoc
mitochondrilnch marker. Nzk poet jedinc (B. caninus + hybridi) z lokality (9), kde
navc zcela chybli zstupci fluvio-lacustrinnho rodiovskho druhu (B. plebejus),
neumouje bohuel ani v tomto ppad vyvozovat hlub zvry ohledn smr a mry
introgrese. Oba dva hybridn jedinci nesli mtDNA specifikou pro B. plebejus a zrove
splovali oekvn pro F2 generaci v nDNA markerech. Mon jsou zde tedy plodn F1
hybridi obojho pohlav.
Dobrovolovem (1993; 1996) popsan pirozen hybridizace B. tauricus a B. petenyi se
jev bt opanho smru. Vyskytuj se zde asi pouze F1 a BC k druhu rheofilnmu. Ten vak
v tomto ppad vykazuje vy genetick polymorfismus, ne druh fluvio-lacustrinn.
60
6. Zvr
Hlavn zjitn m studie je mon shrnout do nsledujcch bod:
1. Populace Barbus carpathicus i B. barbus z eky Poprad se pravdpodobn nachzej
v Hardy-Weinbergov rovnovze.
2. Nejsou prkazn genetick rozdly mezi jednotlivmi subpopulacemi v ece Poprad.
3. Populace obou druh parem z Popradu se geneticky li od konspecifickch populac
z povod Dunaje.
4. Druhy se plodn k v obou povodch, zastoupen detekovatelnch hybridnch jedinc
v popradsk populaci je vak miziv (1,74%).
5. Hybridizace je jednosmrn. Zpsob vzniku F1 je vdy: B. carpathicus + B. barbus .
6. Tok jadernch i cytoplazmatickch gen mezi obma druhy je vrazn omezen
7. Dochz pouze ke zptnmu ken k B. barbus. K introgresi do genomu B. carpathicus
nedochz.
8. Zjitn absence F2 bv vtinou dsledkem sterility jednoho pohlav F1.
9. Kombinace etologickch, ekologickch a fyziologickch initel je s nejvt
pravdpodobnost zodpovdn za genetickou architekturu hybridizace.
61
7. Perspektivy
Pestoe vsledky, kter plynou z tto prce, pisply k porozumn tomuto ppadu
hybridizace, je zejm, e stle petrvv nutnost dlho prohlubovn naich znalost.
Prioritu v dalm vzkumu by, dle mho nzoru, mla mt identifikace a kvantifikace
pre- a postkopulanch izolanch mechanizm. Primrn bych navrhoval provzt
experimentln uml vtr, podobn jako Philippart et Berrebi (1990). Oproti tomuto lnku,
bych vak zvil poet skupin o 1 kontroln. Vznikly by tmto skupiny A1, A2 : B. barbus;
B1, B2: B. barbus (samci) x B. carpathicus (samice); C1,C2: B. carpathicus (samci) x B.
barbus (samice); D1,D2: B. carpathicus. Pi vtru by byli pouiti vdy 2 samci na 1 samici.
Generan ryby by byly oznaeny individuln a nsledn potomstvo skupinov (nap.
zastienm ploutv, elastomerami, i tekutm duskem, poppad jinou bnou metodou).
Dle by bylo ideln odchovat hybridn jedince do pohlavn dosplosti a pokusit se o zptn
ken. Pokud by se bhem experiment neobjevily nepekonateln problmy, bylo by urit
zajmav pokusit se o rozen projektu na dal evropsk druhy parem, u nich je potvrzena,
i pedpokldna existence pirozench hybrid.
Genetick rozbor ryb by byl pouze jednou z mnoha monch analz, nabzejcch se
k realizaci. Nezanedbateln pnos by jist mly morfologick, etologick a fyziologick
studie. Nepochybn zajmav by bylo zrealizovat polopirozen vtr v akvrich dle Poncina
et al. (1994). To by bylo nezbytn pro ppadnou etologickou studii, ale pnosn i pro
zpesnn celkov kvantifikace praekopulanch, praezygotickch a postzygotickch zbran.
Vhodn by bylo zrove provzt histologick i morfometrick vyeten hybridnch jedinc,
obdobn jako Poncin et al. (1996).
Akoliv ve Francii bylo provedeno mnoho pokus na podobnm ppadu hybridizace,
stle nebylo dosaeno jednoznanch vsledk. Prce zmnnch autor povauji do jist
mry za prkopnick. Bylo by vhodn se z nich pouit a navzat na n. Je velmi
pravdpodobn, e celkov vsledek je souhrou nkolika vliv, je jsem zde nastnil a mnoha
tch, kter jsem opomenul.
Vzhledem k tomu, e B. carpathicus je endemickm druhem severn sti Karpat s
omezenm rozenm, ml by vzniknout urit tlak na jeho ochranu. To by mlo jist zvit
jeho zajmavost a v neposledn ad tak ulehit zskvn prostedk na vzkum, zrove by
to vak mohlo zkomplikovat dal sbr materilu.
62
Seznam pouit literatury
Allendorf F.W., Leary R.F., Spruell P., Wenburg J.K., 2001: The problems with hybrids:
setting conservation guidelines. Trends in Ecology and Evolution 16 (11), 613-622.
Almaa C., 1984: Notes on some species of western paleactic Barbus (Cyprinidae, Pisces).
Arquivos do Museu Bocage (Ser. C) 1, 1-76.
Anderson E., G.L. Stebbins, 1954: Hybridization as an evolutionary stimulus. Evolution 8,
378-388.
Arkhipov S.A., Ehlers J., Johnson R.G., Wright H.E. Jr., 1995: Glacial drainages towards the
Mediterranean during middle and late Pleistocene. Boreas, 24, 196 206.
Arnold M.L., 1993: Cytonuclear disequilibria in hybrid zones. Annu.Rev.Ecol.Syst. 24, 521-
554.
Arnold M.L., 1997: Natural Hybridization and Evolution. Oxford University Press.
Asmussen M.A., Arnold J., Avise J.C., 1989: The effect of assortative mating and migration
on cytonuclear associations in hybrid zones. Genetics 122, 923-934.
Asmussen M.A., Basten C.J., 1994: Sampling Theory for Cytonuclear Disequilibria. Genetics
138, 1351-1363.
Asmussen M.A., Basten C.J., 1996: Constraints and normalized measures for cytonuclear
disequilibria. Heredity 76, 207-214.
Avise J.C., 2001: Cytonuclear genetic signatures of hybridization phenomena: Rationale,
utility, and empirical examples from fishes and other aquatic animals. Reviews in Fish
Biology and Fisheries 10, 253-263.
Balon E., 1963: Dodatok k ichtyobiologickej charakteristike rieky Ole a vskytu Barbus
meridionalis petnyi. Zool. listy 12(3), 262-264.
Baras E., 1994: Constraints imposed by high densities on behavioural spawning strategies in
the barbel, Barbus barbus. Folia Zool. 43, 255266.
Baras E., Philippart J.C., 1999: Adaptive and evolutionary significance of a reproductive
thermal threshold in Barbus barbus. J. Fish. Biol. 55, 354375.
Barton N.H., Hewitt G.M., 1985: Analysis of hybrid zones. Annu.Rev.Ecol.Syst. 16, 113-148.
Basten C.J., Asmussen M.A., 1997: The Exact Test for Cytonuclear Disequilibria. Genetics
146, 1165-1171.
Bnrescu P.M., 1991: Zoogeography of Fresh Waters, 2: Distribution and Dispersal of Fresh
Water Animals in North America and Eurasia. AULA-Verlag, Wiesbaden.
63
Bnrescu P.M., Bogutskaya N.G., Movchan Y.V., Smirnov A.I., 2003: Barbus barbus
(Linnaeus, 1758). In:The Freshwater Fishes of Europe,5/II: Cyprinidae 2/II (eds.
Bnrescu P.M., Bogutskaya N.G.), 43 98. AULA-Verlag,Wiesbaden.
Belkhir K., Borsa P., Goudet J., Chikhi L., Bonhomme F., 1998: GENETIX, logiciel sous
Windows pour la gntique des populations <http://www.univ-
montp2.fr/~genetix/genetix.htm . Montpellier, France: Laboratoire Gnome et
Populations, CNRS UPR 9060, Universit Montpellier II.
Berrebi P., 1995: Speciation of the genus Barbus in the North Mediterranean Basin: recent
advances from biochemical genetics. Biological Conservation 72, 237-249.
Berrebi P., Cattaneo-Berrebi G., Le Brun N., 1993: Natural hybridization of two species of
tetraploid barbels: Barbus meridionalis and Barbus barbus (Osteichthyes, Cyprinidae)
in southern France. Biological Journal of the Linnean Society 48, 319-333.
Berrebi P., Kottelat M., Skelton P., Rb P., 1996: Systematics of Barbus: state of the art and
heuristic comments. Folia Zool. 45 (Suppl. 1), 5-12.
Berrebi P., Pouyard L., Crespin L., 1992:Barbus hybridisation (fish, Cyprinidae): Description
of the hybrid zone (genetics ethology). In Genetics and Evolution of Aquatic
Organisms. Symposium, Bangor, sep. 1992.
Berrebi P.,Tsigenopoulos C.S., 2003: Phylogenetic organization of the genus Barbus sensu
stricto :a review based on data obtained using molecular markers. In:The Freshwater
Fishes of Europe,5/II: Cyprinidae 2/II (eds. Bnrescu P., Bogutskaya N.G.), 1122.
AULA-Verlag,Wiesbaden.
Betti L., 1995: Prime osservazioni sullibridazione del barbo commune (Barbus
barbus plebejus Val.) e Barbo canino (Barbus meridionalis Risso). Studi
trentini di Scienze Naturali. Acta Biologica 70, 23-28.
Bianco P.G., 1995: A revision of the Italian Barbus species (Cypriniformes: Cyprinidae).
Ichthyol. Explor. Freshwaters 6, 305-324.
Bianco P.G., 2003: Barbus caninus Bonaparte, 1839. In: The Freshwater Fishes of Europe,
5/II: Cyprinidae 2/II (eds. Bnrescu P.M., Bogutskaya N.G.), 129 146. AULA-
Verlag, Wiesbaden.
Bianco P.G., Ketmaier V., 2001: Anthropogenic changes in the freshwater fish fauna of Italy,
with reference to the central region and Barbus graellsii, a newly established alien
species of Iberian origin. J. Fish Biol. 59 (Suppl.A),190-208.
Birky C.W., 1983: An approach to population and evolutionary genetic theory for genes in
mitochondria and chloroplasts, and some results. Genetics 103, 513527.
64
Boecklen W.J., Howard D.J., 1997: Genetic analysis of hybrid zones: numbers of markers and
power of resolution. Ecology 78, 2611-2616.
Bogutskaya N.G., Smirnov A.I., Movchan Y.V., 2003: Barbus tauricus Kessler, 1877. In: The
Freshwater Fishes of Europe, 5/II: Cyprinidae 2/II (eds. Bnrescu P.M., Bogutskaya
N.G.), 397 420. AULA-Verlag,Wiesbaden.
Bohlen J., Nolte A., 1998: Die barbe, Barbus barbus (Linn, 1758), in der Hunte. Drosera, 98,
79 82.
Boro A., 2000: Brzanka Barbus peloponnesius .In:Bryliska M.(ed.), Ryby sodkowodne
Polski. Wydawnictvo Naukove PWN, Warszawa, 183 186.
Brown J.R., Beckenbach A.T., Smith M.J., 1992: Mitochondrial DNA length variation and
heteroplasmy in populations white sturgeons (Acipenser transmontanus). Genetics
132, 221228.
Bruce I.J., Hurst C.D., 1996: An introduction to PCR and hybridisation techniques.
Oxford University Press.
Callejas C., Ochando M.D., 2002: Phylogenetic relationships among Spanish Barbus
species (Pisces, Cyprinidae) shown by RAPD markers. Heredity 89, 3643.
Carvalho G. R., Pitcher T.J., 1995: Molecular Genetics in Fisheries. Chapman and Hall, New
York.
Castelli, M., Philippart, J.C., 1993: La dtermination du sexe chez les barbeaux
(Osteichthyes, Cyprinidae, Barbus). Cahiers dEthologie 13 (2), 191- 194.
Crespin L., Berrebi P., 1999: Asymetrical introgression in freshwater fish hybrid zone
as revealed by a morphological index of hybridization. Biological Journal of the
Linnean Society 67, 57-72.
Darius H., Berrebi P., 1993: Asymtrie et anomalies morphologiques dans la zone hybride de
la Lergue (sud de la France) Barbus barbus x Barbus meridionalis. Cahiers
dEthologie 13 (2), 243-144.
Devlin R.H., Nagahama Y., 2002: Sex determination and sex differentiation in fish: an
overview of genetic, physiological, and environmental influences. Aquaculture 208,
191364.
Di Rienzo A., Peterson A.C., Garza J.C., 1994: Mutational processes of simple-sequence
repeat loci in human populations. Proceedings of the National Academy of Sciences of
the USA, 91, 31663170.
65
Doadrio I., 1984: Relaciones Filogenticas y Biogeogrficas de los Barbos (Barbus,
Cyprinidae) de la Pensula Ibrica y Aportes Corolgicos y Biogeogrficos a su
Ictiofauna Continental. Ph.D. dissertation, Madrid.
Doadrio I., 1990: Phylogenetic relationships and classification of western paleactic species of
the genus Barbus (Osteichthyes, Cyprinidae). Aquatic Living Resources 3, 265-282.
Doadrio I., Perdices A., 2003: Barbus meridionalis Risso, 1826. In:The Freshwater Fishes of
Europe,5/II: Cyprinidae 2/II (eds. Bnrescu P.M., Bogutskaya N.G.), 23 41. AULA-
Verlag, Wiesbaden.
Dobrovolov I.S., 1993: Taxonomie des barbeaux du genre Barbus en Bulgarie: tude
biochimique. Cahiers dEthologie 13 (2), 239- 240.
Dobrovolov I.S., 1996: Biochemical genetic characteristics of Barbel (Barbus Cuvier genus)
from Bulgarian rivers. Folia Zool. 45 (Suppl. 1), 59-65.
Dowling T.E., Secor C.L., 1997: The role of hybridization and introgression in the
diversification of animals. Ann. Rev. Ecol. Syst. 28, 593-619.
Durand J.D., Persat H., Bouvet Y., 1999: Phylogeography and post-glacial dispersion of the
chub (Leuciscus cephalus) in Europe. Molecular Ecology, 8, 989 997.
Durand J.D., Tsigenopoulos C.S., nl E., Berrebi P., 2002: Phylogeny and Biogeography
of the Family Cyprinidae in the Middle East Inferred from Cytochrome b DNA-
Evolutionary Significance of This Region. Mol. Phylogenet. Evol. 22, 91-100.
Economidis P.S., 2003: B. macedonicus Karaman, 1928. In:The Freshwater Fishes of
Europe,5/II: Cyprinidae 2/II (eds. Bnrescu P.M., Bogutskaya N.G.), 271 276.
AULA-Verlag,Wiesbaden.
Economidis P.S., Herzig-Straschil B., 2003: Barbus albanicus Steindacher, 1870. In:The
Freshwater Fishes of Europe,5/II: Cyprinidae 2/II (eds. Bnrescu P.M., Bogutskaya
N.G.), 23 41. AULA-Verlag,Wiesbaden.
Economidis P.S., Sori M.V., Bnrescu P.M.:2003: Barbus peloponnesius Valenciennes,
1842. In:The Freshwater Fishes of Europe,5/II: Cyprinidae 2/II (eds. Bnrescu P.M.,
Bogutskaya N.G.), 301 337. AULA-Verlag,Wiesbaden.
Ferguson K.A., Wallace L.C., 1961: Starch gel electrophoresis of anterior pituitary hormones.
Nature 190, 629-630.
Gemmell N.J., Allendorf F.W., 2001: Mitochondrial mutations may decrease population
viability. Trends in Ecology and Evolution 16 (3), 115-117.
66
Gougnard I., Poncin P., Ruwet J.C., Philippart J.C., 1987: Description et analyse du
comportement de reproduction du barbeau Barbus barbus (L.) en aquarium. Influence
du nombre de mles courtisants sur les comportements observs. Cahiers dEthologie
applique 7, 293- 302.
Gyllensten U., Wharton D., Josefsson A., Wilson A.C., 1991: Paternal inheritance of
mitochondrial DNA in mice. Nature 352, 255257.
Haldane J.B.S., 1922: Sex ratio and the unisexual sterility of hybrid animals. J. Genet. 12,
101-109.
Harris H., Hopkinson D.A., 1976: Handbook of Enzyme electrophoresis in Human Genetics.
North-Holland, Amsterdam.
Harrison R.G., 1990: Hybrid zones: windows on evolutionary process. Surveys in
Evolutionary Biology 7, 69-128.
Hartl D., Clark A.G., 1997: Principles of population genetics. Sinauer, Sunderland, MA.
Heckel J., 1843: Abbildungen und Beschreibung der Fische Syricus, nebst einer neuen Clas-
sification und Charakteristik smmtlicher Gattungen der Cyprinen. Stuttgart.
Heckel J., 1852: Verzeichniss der Fische des Donaugebietes in der ganzen Ausdehnung des
strreichischen Kaiserstaates. Vehr. Zool. Bot. Ges. Wien 2, 28-33.
Heckel J., Kner R., 1858: Die Ssswasserfische der streichischen monarchie mit Rcksicht
auf die Angrnzenden lnder. Verlag von Wilhelm Engelmann, Leibzig.
Hewitt G.M., 2004: Genetic consequences of climatic oscillations in the Quaternary.
Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B: Biological
Sciences, 359, 183-195.
Hochman L., 1965: K vznamu plodnosti v populan dynamice ostroretky sthovav
(Chondrostoma nasus L.), jelce tlout (Leuciscus cephalus L.) a parmy obecn
(Barbus barbus L.) v podmnkch eky Oslavy. Acta Univ. Agric. Brno, . A, 3: 487-
502.
Holk J., Hensel K., 1972: Ichtyologick pruka. Obzor, Bratislava.
Howard D.J., 1999: Conspecific sperm and pollen precedence and speciation. Annual Review
of Ecology and Systematics 30, 109-132.
Howard D.J., Gregory P.G., Chu J., Cain M.L. 1998: Conspecific sperm precedence is an
effective barrier to closely related species. Evolution 52: 511516.
Howes G.J., 1987: The phylogenetic position of the Yugoslavian Cyprinid genus Aulopyge
Heckel, 1841, with an appraisal of the genus Barbus Cuvier et Cloquet, 1816 and the
subfamily Cyprinidae. Bull. Br. Mus. Nat. Hist. 52, 165-196.
67
Howes G.J., 1991: Systematics and biogeography: an overview. In: Cyprinid Fishes,
Systematics, biology and exploitation (eds. Winfield I.J., Nelson J.S.), 1-33. London:
Chapmann and Hall.
Hubbs C.L., 1955: Hybridization between fish species in nature. Syst. Zool. 4, 1-20.
Chang Y.S., Huang F.L., Lo T.B., 1994: The complete nucleotide sequence and gene orga-
nization of carp (Cyprinus carpio) mitochondrial genome. J. Mol. Evol. 38, 138155.
Chenuil A., Desmarais E., Pouyaud L., Berrebi P., 1997: Does polyploidy lead to fewer and
shorter microsatellites in Barbus (Teleostei, Cyprinidae)? Mol.Ecol. 6., 169-178.
Chenuil A., Binda O., Cattaneo-Berrebi B., Poncin P., Berrebi P., 1998: Relative reproductive
succes of males in polyandrous crosses of Barbus meridionalis revealed by
microsatellite fingerprinting. Folia Zool. 47 (Suppl. 1), 53-60.
Chenuil A., Galtier N., Berrebi P., 1999: A test of the hypotesis of an autopolyploid vs.
allopolyploid origin for a tetraploid lineage: application to the genus Barbus
(Cyprinidae). Heredity 82, 373-380.
Chenuil A., Crespin L., Pouyaud L., Berrebi P., 2000: Movements of adult fish in a hybrid
zone revealed by microsatellite genetic analysis and capture-recapture data. Freshwater
Biology 43, 121-131.
Chevassus B., 1983: Hybridization in fish. Aquaculture 33, 245-262.
Ionescu V., 1968: Vertebratele din Romnia. Edit. Acad., Bucureti, 497 p.
Karakousis Y., Machordom A., Doadrio I., Economidis P.S., 1995: Phylogenetic relationships
of Barbus peloponnesius Valenciennes, 1842 (Osteichthyes: Cyprinidae) from Greece
with other species of Barbus as revealed by allozyme electrophoresis. Biochem. Syst.
Ecol. 23, 365375.
Karaman S.M., 1971: Ssswasserfische der Trkei. 8. Teil: Revision der Barben Europas,
Vordenasien und Nordafrikas. Mitteilun-gen Aus Dem Hamburgischen Zoologischen
Museum und Institut, 67, 175 254.
Kimura M., Ohta T., 1978: Stepwise mutation model and distribution of allelic frequencies in
a finite population. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75 (6) 2868-2872.
Kocher T.D., Stepien C.A., 1997: Molecules and Morphology in studies of Fish evolution. In:
Molecular Systematics of Fishes (eds. Kocher T.D., Stepien C.A.), 1-11. New York:
Academic Press.
Kotlk P., Berrebi P., 2001: Phylogeography of the barbel (Barbus barbus) assessed
by mitochondrial DNA variation. Mol. Ecol. 10, 2177-2185.
68
Kotlk P., Berrebi P., 2002: Genetic subdivision and biogeography of the Danubian
rheophilic barb Barbus petenyi inferred from phylogenetic analysis of
mitochondrial DNA variation. Mol. Phylogenet. Evol. 5, 91-100.
Kotlik P., Tsigenopoulos C., Rab P.,Berrebi P., 2002: Two new Barbus species from the
Danube River basin, with redescription of B. petenyi (Teleostei:Cyprinidae). Folia
Zool. 51 (3), 227 240.
Kotlk P., Bogutskaya G., Ekmeki F.G., 2004: Circum Black Sea phylogeography of Barbus
freshwater fishes: divergence in the Pontic glacial refugium. Mol. Ecol. 13, 87-95.
Kottelat M., 1997: European freshwater fishes. An heuristic checklist of the freshwater fishes
of Europe (exclusive of former USSR), with an introduction for non-systematists and
comments on nomenclature and conservation.Biologia, Bratislava 52, 1 271.
Krupka I., 1983: Rozrenie, systematick prslunos, vybran asti biolgie a biotechnolgie
umelej reprodukcie mreny obyajnej (Barbus barbus (Linnaeus, 1758)). Kand. dis.
prca, Lab. rybrstva a hydrobiol., Bratislava, 142 pp., nepubl.
Krupka I., 1985: Prspevok k poznaniu veku a rastu mreny obyajnej (Barbus barbus
(Linnaeus, 1758)) v rieke Vlre. Prce Laboratria rybrstva a hydrobiolgie 4 (5),
199-215.
Krupka I., 1987: Uml vtr a odchov pldku parmy. Metodiky VRH .23, Vodany.
Krupka I., J. Holk, 1976: On the occurence of Barbus plebejus in the Poprad river
(Vistula basin, Czechoslovakia) with regard to its assumed hybrid origin. Vest.
Cs. Spol. Zool. 40, 163-178.
Kux Z.,1964: Ichtyofauna zpadn sti karpatskho oblouku a pilehlch nin. Kandidtsk
disertan prce, Institute of Vertebrate Research, Czechoslovakian Academy of
Sciences, Brno.
Kux Z., 1982: Pspvek k problematice hybrid druh Barbus barbus a Barbus meridionalis
ve vodch vchodnho Slovenska. Parazitologick aktuality 2,128-131.
Kux Z., Weisz T., 1958: Pspvek k poznn ichtyofauny eky Topl v bardjovskm okrese.
Acta Musei Moraviae 43, 145-174.
Kux Z., Weisz T., 1960: Pspvek k poznn ichtyofauny Dunajce, Popradu, Vhu a Hronu.
Acta Musei Moraviae 45, 203-240.
Kux Z., Weisz T., 1964: Pspvek k poznn ichtyofauny slovenskch ek. Acta Musei
Moraviae 49, 191-246.
Levinson G., Gutman G.A., 1987: Slipped-Strand Mispairing: A Major Mechanism for DNA
Sequence Evolution. Mol.Biol.Evol.4(3), 203-221.
69
Lucas M.C., Batley E., 1996: Seasonal movements and behaviour of adult barbel Barbus
barbus, a riverine cyprinid fish: implications for river management. Journal of Applied
Ecology 33, 1345-1358.
Ludwig A., May B., Debus L., Jenneckens I., 2000: Heteroplasmy in the mtDNA Control
Region of Sturgeon (Acipenser, Huso and Scaphirhynchus). Genetics 156, 19331947.
Machordom A., Berrebi P., Doadrio I., 1990: Spanish barbel hybridization detected using
enzymatic markers: Barbus meridionalis Risso x Barbus haasi Mertens (Osteichthyes,
Cyprinidae). Aquat. Living Resourc. 3, 295- 303.
Machordom A., Doadrio I., 2001a: Evidence of a Cenozoic Betic-Kabilian connection based
on freshwater fish phyllogeography (Luciobarbus, Cyprinidae). Mol. Phylogenet.
Evol. 18, 252- 263.
Machordom A., Doadrio I., 2001b: Evolutionary history and speciation modes in cyprinid
genus Barbus. Proc. R. Soc. Lond. (Biol.) 268, 1297- 1306.
Markert C., Moller F., 1959: Multiple forms of enzymes: Tissue, ontogenetic, and species
specific patterns. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 45, 753-763.
May B., 1993: Starch gel electrophoresis of allozymes. In: Molecular Genetic Analysis of
Populations. A Practical Approach (ed. Hoelzel A.R.). Oxford: IRL Press.
Mayr E., 1963: Animal Species and Evolution. Cambridge: Harvard Univ. Press.
Moritz C., Hillis D.M., 1990: Molecular Systematics Context and Controversies. In:
Molecular Systematics. (eds. Hillis D.M., Moritz C.), 1-10. Sunderland: Sinauer
Associates, Inc.
Movchan I.V, Smirnov A.I., 1981: Fishes, Cyprinidae, part 1. Fauna Ukraini, vol. 8, Fishes.
liv. 2, part 1. Naukova Dumka, Kiev.
Myers G.S., 1960: Preface to any future classification of the cyprinid fishes of the genus
Barbus. Stanford Ichthyological Bul. 7, 212215.
Nei M., 1987: Molecular evolutionary genetics. Columbia Univ. Press.
Nelson J.S., 1976: Fishes of the World. Wiley-Interscience, New York.
Nelson J.S., 1994: Fishes of the World. 3rd ed., Wiley and Sons, New York.
Nesb C. L., Arab M.O., Jakobsen K.S., 1998: Heteroplasmy, length and sequence variation
in the mtDNA control regions of three percid fish species (Perca fluviatilis, Acerina
cernua, Stizostedion lucioperca). Genetics 148, 19071919.
Oellermann L.K., P.H. Skelton, 1990: Hexaploidy in yellowfish species (Barbus, Pisces,
Cyprinidae ) from southern Africa. J. Fish. Biol. 37, 105- 115.
Otto S.P., Whitton J., 2000: Polyploid incidence and evolution. Ann.Rev.Genet. 34, 401437.
70
Pasteur N., Pasteur G., Bonhomme F., Catalan J., Britton-Davidian J., 1987: Manuel
Technique de Genetique par Electrophorese des Proteines. Technique et
Documentation (Lavoisier), Paris.
Pekrik L., 2004: tdium ichtyocenz povodia rieky Udava. Diplomov prce.
Pelz G.R., Kstle A., 1989: Ortsbewegungen der Barbe Barbus barbus (L.)
radiotelemetrische Standortbestimmungen in der Nidda (Frankfurt/Main).
Fischkologie 1(2), 15-28.
Pez M., 1995: 12. rod Barbus Cuvier, 1817 Parma, Mrena. In: Fauna R a SR/ Mihulovci
a ryby 2 (eds. Baru V., Oliva O.), 132-145. Academia, Praha.
Pethon P., 1978: Age growth and maturation of natural hybrids between roach (Rutilus
rutilus, L.) and bream (Abramis brama,L.) in lake Oyeren, SE Norway. Acta
Hydrobiol. 20 (4), 281-295.
Philipp D.P., Childers W.F., Whitt G.S., 1979: Evolution of patterns of differential gene
expression: a comparison of the temporal and spatial patterns of isozyme locus
expression in two closely related species (northern largemouth bass, Micropterus
salmoides, and smallmouth bass, Micropterus dolomieui). J. Exp. Zool. 210, 473-488.
Philippart J.C., Berrebi P., 1990:Experimental hybridization of Barbus barbus and Barbus
meridionalis: physiological, morphological, and genetic aspects. Aquat.living resour.
3, 325-332.
Plnet S., Pagano A., Joly P., Fouilett P., 2000: Variation of plastic responses to oxygen
availability within the hybridogenetic Rana esculenta complex. J. Evol. Biol. 13 (1),
20-28.
Poncin P., Jeandarme J., Berrebi P., 1994: A behavioral study of hybridization between
Barbus barbus and Barbus meridionalis. J. Fish Biol. 45, 447-451.
Poncin P., Thiry M., Lepoint A., Philippart J.C., 1996: Histological and biometrical study of
intraovarian oocytes in barbel (Barbus barbus) reared in captivity. Folia Zool. 45
(Suppl. 1), 117-121.
Poulik M.D., 1957: Starch electrophoresis in a discontinuous system of buffers. Nature 180,
1477.
Powell J.R., 1994: Molecular techniques in population genetics: A brief history. In: Molecular
Ecology and Evolution: Approaches and Applications (eds. Schierwater B., Streit B.,
Wagner G.P., DeSalle R.). Berlin: Birkhauser Verlag.
Rb P., 1980: Cytogenetick studium nkterch druh ryb eledi Cyprinidae. Thesis SAV,
Libchov.
71
Rb P., Collares-Pereira M.J., 1995: Chromosomes of European cyprinid fishes (Cyprinidae,
Cypriniformes): a review. Folia Zool. 44 (3), 193214.
Raufaste N., Bonhomme F., 2000: Properties of Bias and Variance of Two Multiallelic
Estimators of F
ST
. Theoretical Population Biology, 57, (3), 285-296.
Redenbach Z., Taylor W.B., 2003: Evidence for bimodal hybrid zones between two species of
char (Pisces: Salvelinus) in northwestern North America. J. Evol. Biol. 16(6), 1135-
1148.
Rembiszewski J., Rolik H., 1975: Katalog Fauny Polski (A checklist of the freshwater fishes
of Poland). Panstwowe Wydawnictwo Naukowe, Warszava.
Rieseberg L.H., Randall Linder C., 1999: Hybrid classification: insights from genetic map-
based studies of experimental hybrids - Hybridization and Resistance to Parasites.
Ecology 80, 346-352.
Rieseberg L.H., Wendel J.F., 1993: Introgression and its consequences in plants. In Hybrid
zones and the Evolutionary Process (ed. R.G. Harrison), 70-109. Oxford, UK, Oxford
Univerzity Press.
Robertson A., Hill W.G., 1984: Deviations from Hardy-Weinberg proportions: sampling
variances and use in estimation of inbreeding coefficients. Genetics 107, 703-718.
Rolik H., 1967: O nektrych naturalnych krzywkach ryb karpiowatych (Pisces, Cyprinidae)
w Polsce. Fragmenta Faunistica 14, 153 167.
Rolik H., 1970: Barbus cyclolepis waleckii ssp. n. A new subspecies of B. cyclolepis
Haeckel, 1840, from the Vistula and Dniester basin (Pisces, Cyprinidae). Bull. Acad.
Pol. Sci., Cl. II. Vol. XVIII Ser. Sci. Biol., 401- 404.
Scribner K.T., Page K.S., Barton M.L., 2001: Hybridization in freshwater fishes: a review of
case studies and cytonuclear methods of biological inference. Reviews in Fish Biology
and Fisheries 10, 293-323.
Seehausen O., 2004: Hybridization and adaptive radiation. Trends in Ecology and Evolution
19 (4), 198-207.
Schwartz F.J., 1981: World literature to fish hybrids with an analysis by family, species and
hybrid. NOAA Technical Report NMFS SSRF-750, Suppl.1.
Simmons L.W., 2001: The evolution of polyandry: an examination of the genetic
incompatibility and good-sperm hypotheses. J. Evol. Biol. 14, 585-594.
Shaklee J.B., Allendorf F.W., Morizot D.C., Whitt G.S., 1990: Gene nomenclature for
protein-coding loci in fish. Trans. Amer. Fish. Soc. 119, 2-15.
72
Starmach K., Roso E., 1961: Morfometryczna charakterystyka brzanki (Barbus petenyi
Heckel) z Grnej Wisly Morphometric charakteristics of Barbus petenyi Heckel
from the upper region of Wisla (Vistula). Acta Hydrobiol. 3, 217-224.
Stebbins G.L., 1966: Processes of Organic Evolution. Inglewood Cliffs, NJ: Prentice-Hall.
Steinmann P., Koch W., Scheuring L., 1937: Die Wanderungen unserer Swasserfische.
Dargestelt auf Grund von Markierungsversuchen. Z. Fisch. Hillswiss. 35, 369-467.
Stratil A., Bobk P., Tomek V., Valenta M., 1983: Transferins of Barbus barbus, Barbus
meridionalis petenyi and their hybrids. Genetic polymorphism, heterogeneity and
partial characterization. Comp. Biochem. Physiol. Vol. 76B, No. 4, 845- 850.
lechtov V., lechta V., Berrebi P., 1993: Diversit gnetique du genre Barbus dans les
rivires tchques et slovaques. Cahiers dEthologie 13 (2), 207- 210.
lechtov V., lechta V., Luskov V., Lusk S., Berrebi P., 1998: Genetic variability of
common barbel, Barbus barbus populations in the Czech Republic. Folia Zool.,
47 (Suppl.1), 21 33.
tancl J., 1996: Hybridizace mezi cejnem velkm (Abramis brama) a perlnem
ostrobichm (Scardinius erytrophthalmus). Diplomov prce.
Taanman J.W., 1999: The mitochondrial genome: structure, transcription, translation and
replication. Biochimica et Biophysica Acta 1410, 103-123.
Templeton A.R., 1981: Mechanisms of speciation a population genetic approach.
Annu.Rev.Ecol.Syst. 12, 23-48.
Templeton A.R., Hemmer H., Mace G., Seal U.S., Shields W.M. et Woodruff D.S., 1986:
Local adaptation, coadaptation, and population boundaries. Zoo Biology 5, 115-125.
Tsigenopoulos C., Berrebi P., 2000: Molecular phylogeny of North Mediterranean freshwater
barbs (genus Barbus: Cyprinidae) inferred from cytochrome b sequences:
biogeographic and systematic implications. Mol. Phylogenet. Evol.14, 165- 179.
Tsigenopoulos C. S., Karakousis Y., and Berrebi P. 1999: The North Mediterranean Barbus
lineage: Phylogenetic hypotheses and taxonomic implications based on allozyme data.
J. Fish Biol.54, 267286.
Tsigenopoulos C., Kotlk P., Berrebi P., 2002: Biogeography and pattern of gene flow among
Barbus species (Teleostei: Cyprinidae) inhabiting the Italian Peninsula and
neighbouring Adriatic drainages as revealed by allozyme and mitochondrial sequence
data. Biological Journal of the Linnean Society 75, 83- 99.
Turner G.F., 1999: What is a fish species ? Reviews in fish biology and fisheries 9(4),
281-297.
73
Uyeno T., Smith G.R., 1972: Tetraploid origin of karyotype of catostomid fishes. Science
175, 644646.
Valenta M., Hylgaard-Jensen J., Jensen E. S., 1971: Interaction of veronal, phyrophosphate,
citrate and protein with lactate dehydrogenase isozyme determination and kinetics.
Acta Veterinaria Scandinavia 12, 15-35.
Valenta M., Rb P., Stratil A., Klal L., Oliva O., 1979: Karyotypes, heterogeneity, and
polymorphism of proteins in the tetraploid species Barbus meridionalis and its hybrids
with Barbus barbus. Proc. XVIth Anim. Blood Gprs Biochem. Polymorph. Vol. IV.,
204- 214.
Weir B.S., 1990. Genetic data analysis. Sinauer, Sunderland, MA.
Weir B.S., 1996: Genetic Data Analysis II. Sinauer, Sunderland, MA.
Weir B.S., Cockerham C.C., 1984: Estimating F-statistics for the analysis of population
structure. Evolution 38: 1358-1370.
Wheeler A., Jordan D.R., 1990: The status of the barbel, Barbus barbus (L.) (Teleostei,
Cyprinidae), in the United Kingdom. J. Fish. Biol. 37, 393- 399.
White M.J.D., 1978: Modes of speciation. WH Freeman, San Francisco.
Winfield I.J., Nelson J.S., 1991: Cyprinid fishes - Systematics, biology and exploitation.
Chapman and Hall, London.
Wirtz P., 1999: Mother speciesfather species: unidirectional hybridization in animals with
female choice. Animal Behavior 58, 112.
Wolf U., Ritter H., Atkin N.B., Ohno S., 1969: Polyploidization in the fish family Cyprinidae,
order Cypriniformes. I. DNA - content and chromosome sets in various species
of Cyprinidae. Humangenetik 7, 240- 244.
Wood A.B., Jordan D.R., 1987: Fertility of roach x bream hybrids, Rutilus rutilus (L.) x
Abramis brama (L.), and their identification. J. Fish. Biol. 30, 249- 261.
Wright S., 1921: Systems of mating I-V. Genetics 6:111-178.
Wright S., 1969: Evolution and the genetics of populations. Vol. 2. The theory of gene
frequencies. University of Chicago Press.
Wright S., 1978: Evolution and the genetics of populations. Vol. 4. Variability within and
among natural populations. University of Chicago Press, IL.
Zardoya R., Doadrio I., 1999: Molecular evidence on the evolutionay and biogeographical
patterns of European cyprinids. J. Mol. Evol. 49, 227-237.
Zauner G., 1998: Der Semling eine verschollene Fischart wurde wiederentdeckt. sterreichs
Fischerei, 51(10), 218.
74
Seznam tabulek
Tabulka 1. Seznam vech lokalit a jedinc..24
Tabulka 2. Pouit diagnostick endonuklezy...32
Tabulka 3. Srovnn pouitch typ odhadu fixanho koeficientu35
Tabulka 4. Alelick frekvence polymorfnch lokus Barbus carpathicus..40
Tabulka 5. Alelick frekvence polymorfnch lokus Barbus barbus..41
Tabulka 6. Charakteristika populac rodiovskch druh pomoc F statistiky...43
Tabulka 7. Formln test nhodnho pen mezi Barbus carpathicus a B. barbus44
Tabulky 8.- 10. Hodnoty koeficient nerovnovhy (D) v povod Popradu pro pln
diagnostick lokusy a mtDNA s vsledky test vznamnosti..47
Tabulky 11.- 12. Hodnoty koeficient nerovnovhy (D) v povod Dunaje pro pln
diagnostick lokusy a mtDNA s vsledky test vznamnosti..48
Tabulky 13.- 16. Hodnoty koeficient nerovnovhy (D) v obou povod pro pln
diagnostick lokusy a mtDNA s vsledky test vznamnosti.49-50
Tabulka 17. 3x2 tabulka dle Avise (2001) spolen vem pln diagnostickm lokusm pro
ob povod.51
Tabulka 18. Poty jedinc Barbus carpathicus, B. barbus a hybrid dle zjitnch genotyp
na jednotlivch lokalitch.52
Tabulka 19. Konkrtn elektroforetick fenotypy vech zjitnch hybrid ve vech
analyzovanch nuklernch lokusech53
Seznam obrzk
Obrzek 1. Arel pvodnho rozen Barbus barbus a B. carpathicus13
Obrzek 2. Barbus carpathicus z eky Udava; ilustrativn foto (4.8.2004)14
Obrzek 3. Barbus carpathicus z eky Udava; ilustrativn foto (4.8.2004)14
Obrzek 4. Barbus barbus z eky Udava; ilustrativn foto (4.8.2004)17
Obrzek 5. Lokality na ece Poprad23
Obrzek 6. Vsledky tpen mtDNA Barbus carpathicus, B. barbus a vech hybridnch
jedinc z eky Poprad diagnostickm restriknm enzymem Msp I.45
75
Plohy
Ploha 1. Fylogenetick rekonstrukce taxonu Barbus sensu lato pevzat z prce:
Machordom et Doadrio (2001).
Ploha 2. Fylogenetick rekonstrukce taxonu Barbus sensu stricto pevat z prce: Berrebi et
Tsigenopoulos (2003).
Ploha 3. Fotografie z povod Popradu.
Ploha 4. Konkrtn postupy pouit pi barven enzymovch systm.
76
Ploha 1. Fylogenetick rekonstrukce taxonu Barbus sensu lato.
Fylogenetick strom, sestaven na zklad analzy sekvenc ATPas 8 a 6 a
cytochromu b, je pevzat z prce Machordom et Doadrio (2001). V zvorkch za druhovmi
jmny je uvedena zkratka zem pvodu analyzovanho vzorku (Al-Alrsko, BH-Bosna a
Hercegovina, Eg-Egypt, Et-Etiopie, GC-Guinea, Gr- ecko, Is-Izrael, It-Itlie, Mo-Maroko,
Ro-Rumunsko, Ru-Rusko, SA-Jihoafrick republika, Sp-panlsko, Tu-Tunisko). daje
v trojhelncch udvaj stupe ploidie.
Ploha 2. Fylogenetick rekonstrukce taxonu Barbus sensu stricto.
Tento fylogenetick strom sestavili Berrebi et Tsigenopoulos (2003) kombinac
vsledk mnoha pedchozch prac rznch autor. Za druhovmi jmny je velkmi psmeny
uvedena zkratka zem pvodu analyzovanho vzorku. (ALB-Albnie, ALG-Alrsko, ARM-
Armnie, CRO-Chorvatsko, ETH-Etiopie, FR-Francie, GR-ecko, ISR-Izrael, IT-Itlie,
MOR-Maroko, RUS-Rusko, SLK-Slovensko, SLV-Slovinsko, SP-panlsko, TR-Turecko,
TUN-Tunisko). Forma, kter je zde oznaovna jako B. petenyi, nen toton s druhem
B. petenyi Heckel, 1852, obvajcm ptoky dolnho toku Dunaje.
Ploha 3. Fotografie z povod Popradu

1. Ukzka typickho
nho profilu na
studovanm seku
eky Poprad.
2. ka ubotnka
v povod Popradu.
Vzorky byly odebrny
z seku pod jezem.
3. Takto vypadala
eka Poprad nedaleko
obce Plave.
Ploha 4. Konkrtn postupy pouit pi barven enzymovch systm
SOD Superoxid dismutasa (jatern tk)
1. Agar + H
2
O (0,6 + 30 ml)
2. Pufry a roztoky: 0,05 M TRIS pH 8,0 (30 ml)
3. Barvy: MTT (0,010 g 2x1 ml)
PMS (0,005g 1x1 ml)
PGM Fosfoglukomutasa (svalov i jatern tk)
1. Agar + H
2
O (0,6 + 30 ml)
2. Pufry a roztoky: 0,05 M TRIS pH 8,0 (25 ml)
0,2 M MgCl
2
(8 ml)
3. Substrt: G-1-P Na
2
(0,1 g 1x1 ml)
4. Koenzymy: NAD (0,4 g 2x1 ml)
NADP (0,005 g 1x1 ml)
5. Barvy: NBT (0,010 g 2x1 ml)
MTT (0,005g 1x1 ml)
PMS (0,005g 1x1 ml)
6. Enzymy: G-6-P-DH (17 U) Leuconostoc (25 ul)
LDH - Laktt dehydrogenasa (svalov tk)
1. Agar + 0,2M TRIS pH 8,5 (0,6 + 40 ml)
2. Pufry a roztoky: 0,05 M pyrofosft sodn (10 ml)
3. Substrt: sodn sl lakttu (2x1 ml)
4. Barvy: (2x7 ml)
LDH + GPI kombinovan barven (jatern tk)
1. Agar + H
2
O (0,6 + 30 ml)
2. Pufry a roztoky: 0,05 M TRIS pH 8,0 (30 ml)
0,2 M MgCl
2
(5 ml)
3. Substrt: sodn sl lakttu (5x1 ml)
F-6-P Na (0,04 g 1x1 ml)
4. Koenzymy: NAD (0,08 g 4x1 ml) nebo
NADP (0,010 g 2x1 ml)
5. Barvy: NBT (0,010 g 2x1 ml)
MTT (0,005g 1x1 ml)
PMS (0,005g 1x1 ml)
6. Enzymy: G-6-P-DH (17 U) Leuconostoc (20 ul)
GPI Glukzafosft izomerasa (svalov tk)
1. Agar + H
2
O (0,6 + 30 ml)
2. Pufry a roztoky: 0,05 M TRIS pH 8,0 (30 ml)
0,2 M MgCl
2
(8 ml)
3. Substrt: F-6-P Na (0,04 g 1x1 ml)
4. Koenzymy: NAD (0,02 g 1x1 ml)
NADP (0,005 g 1x1 ml)
5. Barvy: NBT (0,010 g 2x1 ml)
MTT (0,005g 1x1 ml)
PMS (0,005g 1x1 ml)
6. Enzymy: G-6-P-DH (17 U) Leuconostoc (25 ul)
MDH Malt dehydrogenasa (jatern i svalov tk)
1. Agar + 0,2M TRIS pH 8,5 (0,6 + 40 ml)
2. Pufry a roztoky: 0,05 M pyrofosft sodn (10 ml)
3. Substrt: sodn sl maltu (2x1 ml)
4. Barvy: (2x7 ml)
Vysvtlivky:
NBT nitrotetrazoliov mod (Nitro blue tetrazolium)
MTT thiazolylov mod (Methyl thiazolyl tetrazolium)
PMS fenazin metosulft (Phenazin methosulphate)
NAD nikotinamid-adenin dinukleotid
NADP nikotinamid-adenin dinukleotid fosft
F-6-P Na sodn sl fruktza-6-fosftu
G-1-P Na
2
disodn sl glukza-1-fosftu
G-6-P-DH glukza-6-fosft dehydrogenasa izolovan z Leuconostoc mesenteroides