Cintica Enzimtica

Prof. Rita de Cassia Siqueira Curto Valle Depto. Engenharia Qumica Universidade Regional de Blumenau

Cintica enzimtica
Estuda a velocidade com que ocorrem as transformaes de reaes catalisadas por enzimas. Velocidade de transformao de substrato em produto Leva determinao de parmetros cinticos para deduzir a atividade enzimtica, a afinidade da enzima pelo substrato e os mecanismos atravs dos quais leva a cabo a catlise.

Cintica enzimtica - objetivos

Medir as velocidades das transformaes que se processam; Estudar a influncia de condies de trabalho naquelas velocidades:
pH; Temperatura; Concentrao de reagentes e das enzimas; Concentrao de inibidores e de ativadores;

Correlacionar as velocidades das transformaes com algum dos fatores que as afetam; Colaborar com a otimizao do processo; Estabelecer critrios para o controle de processo Projetar um reator adequado

Atividade enzimtica
a velocidade na qual a enzima catalisa a reao Unidades da atividade enzimtica: U: quantidade de enzima que promove a formao de 1 mol de produto por minuto Deve sempre estar referenciado uma quantidade especfica de amostra Exemplo: 20 U/g de mamo 1 g de mamo tem uma quantidade de enzima que transforma 20 mol de substrato por minuto

Atividade enzimtica
Unidades da atividade enzimtica: Katal: quantidade de enzima que transforma 1 mol de substrato por segundo ou forma 1 mol de produto por segundo Deve sempre estar referenciado uma quantidade especfica de amostra Exemplo: 45 katal/mL de amostra 1 mL da amostra tem uma quantidade de enzima que transforma 45 moles de substrato por segundo

Fatores que influenciam a atividade enzimtica

Temperatura
medida que T, V da reao, at o ponto em que T, vai V
T = temperatura V = velocidade

Fatores que influenciam a atividade enzimtica

Temperatura
Estabilidade trmica

Fatores que influenciam a atividade enzimtica

Temperatura
Tempo de meia vida (t1/2) tempo no qual as enzimas perdem 50% da sua atividade numa determinada temperatura

Fatores que influenciam a atividade enzimtica O stio ativo da enzima est

pH

frequantemente composto de grupos ionizveis que devem estar na forma inica adequada para manter a conformao, unir os substratos ou catalisar a reao. A atividade da enzima deve ser medida no pH timo

Fatores que influenciam a atividade enzimtica

pH

medida que pH, V da reao, at o ponto em que pH, vai V Fixam-se [E], [S] e a temperatura. Ex.: pHtimo para pepsina = 1,5 a 3

Fatores que influenciam a atividade enzimtica

pH
Resistncia ao pH

Fatores que influenciam a atividade enzimtica

Concentrao de enzima

Fatores que influenciam a atividade enzimtica

Presena de inibidores compostos que diminuem a velocidade da reao Agem de diferentes formas
Inibio competitiva Inibio no-competitiva

Frmacos Preservativos de alimentos Compostos txicos

Fatores que influenciam a atividade enzimtica

Concentrao de substrato

Elevadas concentraes de substrato podem preservar a estabilidade da enzima sob efeito da temperatura e do pH

Fatores que influenciam a atividade enzimtica

Concentrao de substrato
[E]; T e pH = ctes

medida que [S], V da reao, at o ponto em que [S], V torna-se cte V=Vmax

Fatores que influenciam a atividade enzimtica

Concentrao de substrato
Concentraes altas a velocidade ser mxima. At o ponto de saturao da vo enzima no afeta a velocidade.

Vmax

[S]

Fatores que influenciam a atividade enzimtica

Concentrao de substrato
Desvios da linearidade ocorrem:
Presena de inibidores na soluo de enzima; Presena de substncias txicas; Presena de um ativador que dissocia a enzima; Limitaes impostas pelo mtodo de anlise.

Determinao da velocidade de reao

Complicador - a concentrao do substrato varia ao longo da reao medida que este vai se transformando em produto.

Velocidade de reao Ento como medir a velocidade de uma reao enzimtica?

Velocidade de reao
Limitar a velocidade em alta [S] devido saturao dos stios ativos da Enzima Determinar a velocidade inicial da reao v0 (velocidade inicial)

Velocidade de reao
Variaes da concentrao de substrato so negligenciveis [P] baixa

Cintica de Michaelis e Menten

Modelo cintico que melhor explica a influncia das concentraes iniciais de enzima e substrato na velocidade inicial da reao enzimtica

(1913) Leonor Michaelis -Enzimologista Maud Menten - Pediatra

Cintica de Michaelis e Menten

Hipteses:
O substrato e a enzima reagem reversivelmente entre si formando um composto intermedirio denominado complexo enzima-substrato. O complexo formado ou se decompe, regenerando a enzima e formando os produtos da reao.

Cintica de Michaelis e Menten

v

K1 = cte de velocidade de formao do complexo K2 = cte de velocidade de dissociao do complexo K3 = cte de velocidade de decomposio do complexo, formando produto v = velocidade de formao do produto S = concentrao inicial de substrato E = concentrao inicial de enzima P = concentrao de produto

Cintica de Michaelis e Menten

velocidade de catlise, ou velocidade inicial (v0) igual ao produto da concentrao de ES por k3 v0 = K3 [ES] A velocidade de formao de ES corresponde a k1 [E].[S] A velocidade de quebra de ES corresponde a (k2 + k3). [ES] A velocidade de formao de ES ser: k1 [E].[S] = (k2 + k3). [ES]

A constante de Michaelis (KM) definida como:

Reescrevendo...

Cintica de Michaelis e Menten

Considerando que a concentrao da enzima livre [E] corresponde concentrao da enzima total [ET], menos a concentrao da enzima ligada [ES]

Como: v0 = K3 [ES] Fazendo as devidas substituies Condio reacional necessria Como a [S] >>> [ET], a E est saturada com o [S] e a [ES] = [ET] Nestas circunstncias, [S] muito maior do que KM e [S] /([S] + KM) ~ 1 Nestas condies Velocidade mxima de formao de P = Vmax Ento Equao de Michalis-Menten

Cintica de Michaelis e Menten

Vo = V
max

[S]

Km + [S]

Essa equao explica o comportamento da cintica de reaes catalisadas por enzimas:

1) Se [S] muito maior do que KM

a velocidade da reao mxima e independe da concentrao do substrato

2) Se [S] muito menor do que KM,

a velocidade da reao diretamente proporcional concentrao de substrato.

Cintica de Michaelis e Menten

Vo = V
max

[S]

Km + [S]

Essa equao explica o comportamento da cintica de reaes catalisadas por enzimas: v = Vmax [S] Km 2

3) Se [S] igual a KM

v = Vmax
1

Vmax
2

Km

[S]

Determinao de Km e Vmx
Mtodo grfico de Lineweaver-Burk
1 v = Km Vmax [S] + 1 Vmax

1 v
Inclinao =

Km Vmax

Vmax -1 Km 1 [S]

Determinao de Km e Vmx
Mtodo grfico de Eadie-Hofstee
v v=V K max m [S]

Vmax
Inclinao =

-Km

Vmax Km v [S]

Determinao de Km e Vmx
Mtodo grfico de Hanes-Woolf
K [S] 1 m + = [S] v V V max max

[S] v Km Vmax
Inclinao =

1 Vmax

-Km

[S]

Constante de afinidade
KM = K2 + K3 K1

Imaginando um caso limitante, em que k2 seja muito maior do que k3; isto significa que a dissociao do complexo ES em E mais S mais rpida do que a formao de E mais produto (P). Portanto, quando k3 muito menor do que k2, KM igual constante de dissociao de ES. Em outras Km alto baixa afinidade Km baixo alta afinidade Km depende: o aspectos especficos do mecanismo de reao; o n de passos da reao; o velocidades relativas dos passos individuais