Crecimiento de Champinon ostra (Pleorotus ostreatus) en sustrato contaminado con hidrocarburos.

Marco terico.
El negocio de los aceites en el mundo es grande, rentable y complejo. EN los Estados Unidos se consumen unos 7,6 millones de toneladas mtricas de lubricantes, en Japn 2,2 millones, en la Unin Europea 4,7 millones. La demanda mundial de aceites lubricantes llega aproximadamente a 40 millones de toneladas anuales. En Mxico el mercado de los aceites y lubricantes es uno de los ms importantes, con un consumo aproximado de 60 millones de litros por mes. El residuo de estos aceites industriales se convierte en uno de los ms contaminantes que existen. Es tan nocivo para el medio ambiente que fue uno de los primeros residuos en ser considerado como un problema por las naciones industrializadas del mundo. Su potencial contaminante es enorme, ya que se habla de que dos litros de un cambio de aceite son capaces de contaminar toda el agua de una alberca olmpica, y un solo litro podra contaminar la superficie de un campo de ftbol. Adems de contaminar tanto el suelo como las aguas superficiales y subterrneas, afectando gravemente la fertilidad del suelo e imposibilitando el cultivo, los aceites contienen metales pesados y tienen una muy baja biodegradabilidad. El mar tambin se ve altamente afectado cuando se vierten estos residuos en las aguas ocenicas, ya que estos hidrocarburos pueden durar entre 10 y 15 aos flotando sobre las aguas. Debido a los recientes accidentes involucrando derrames de petrleo y aceite, existen organizaciones e instituciones que buscan elaborar tcnicas que puedan corregir los daos que el vertido de estas sustancias produce al medio ambiente.

Una de las lneas ms populares de trabajo actualmente es la de la biorremediacin. A grandes rasgos, la biorremediacin es el nombre que se le da a cualquier proceso que utilice algn organismo vivo (en especial microorganismos, hongos, plantas, y sus derivados) para que un medio contaminado regrese a su condicin natural. A pesar de lo que se podra pensar, la biorremediacin ha sido utilizada desde hace siglos. Un ejemplo es la desalinizacin de terrenos agrcolas por accin de plantas capaces de extraer sales. La micorremediacin se refiere a una forma de biorremediacin en la cual se utilizan fungi para limpiar un rea contaminada. La micorremediacin se refiere especficamente al uso del micelio del hongo para la biorremediacin. Uno de los principales papeles de los hongos en el ecosistema es el de la descomposicin, proceso realizado por el micelio. Como esta estructura se encuentra generalmente oculta bajo la tierra, se ha llegado a subestimar el papel de los hongos, pero su impacto es macroscpico. El micelio secreta algunas encimas y cidos extracelulares que son capaces de romper lignina y celulosa, los dos bloques principales de las fibras de las plantas. (Singh 2006). Estos compuestos orgnicos estn compuestos por largas cadenas de hidrocarburos, que estructuralmente se parecen a muchos contaminantes orgnicos. La clave de la micorremediacin es encontrar la especie de hongos que ataquen a un contaminante especfico. Una caracterstica importante de los hongos es que estos se pueden regenerar de ambos esporas y fragmentos de la hifa. (Paul Stamets). Actualmente se conducen experimentos con hongos para absorber algunos contaminantes presentes en el suelo como hidrocarburos poli cclicos, PCBs y derivados del petrleo (aceites y combustibles). (Atlas, Philip 2005).

Ilustracin 1: Crecimiento del hongo en sustrato contaminado (www.fungi.com).

Un experimento fue realizado por los laboratorios Battelle, lder en investigacin de biorremediacin. Tomaron un lote de suelo contaminada con aceite de diesel e hidrocarburos aromticos. Inocularon el lote con micelio del champin ostra (Pleurotus ostreatus). Despus de cuatro semanas ms del 95% de los hidrocarburos aromticos haban sido reducidos a componentes no txicos. Lo que sucedi despus fue una sorpresa inesperada para los investigadores. Despus de ocho semanas los championes en estado de putrefaccin atrajeron moscas, las moscas trajeron consigo otros organismos, como aves, las aves trajeron consigo semillas y el lote se convirti en un pequeo jardn lleno de vida. Otros lotes de suelo se trataron con procedimientos de biorremediacin tradicional usando bacterias. El lote tratado con champin ostra fue el nico en el que la vida comenz a resurgir. (Thomas et al. 2000).

Objetivo.
Objetivo general.
Observar el crecimiento de Pleorutus ostreatus en un sustrato contaminado.

Objetivos especficos.
Cultivar Pleorotus ostreatus en sustrato contaminado con aceite de coches usado. Cultivar Pleorotus ostreatus en sustrato no contaminado. Comparar el crecimiento del hongo en ambos sustratos. Observar si el sustrato contaminado puede albergar vida vegetal aproximadamente 8 semanas despus del cultivo del micelio.

Metodologa.
1. Obtencin del inculo. a. El inculo del hongo Pleuratus ostreatus fue proporcionado por el Dr. Rafael Pea. 2. Preparacin del medio de cultivo Papa Dextrosa Agar (PDA). 3. Aislamiento del inculo a partir del cultivo in vitro.

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a. Se localiza dentro del inculo un cuerpo fructfero inmaduro. b. Se corta un trozo del cuerpo fructfero inmaduro de la parte inferior (aproximadamente 1cm2). c. Se hace un corte en el pleo para exponer el tejido interno, estril del hongo. d. Con una pinza estril y fra se toma una parte pequea del tejido blanco, que se desinfecta con una sol. 10% de hipoclorito y se lava en un vaso estril con agua destilada estril por 30 segundos, tres veces consecutivas. e. Se deja secar este tejido sobre un papel filtro estril por 5 minutos. Inoculacin del hongo. a. Se coloca este tejido sobre una caja Petri con agar PDA. b. Se deja crecer a una temperatura ambiente hasta que el hongo invada la caja. c. El hongo puede ser colocado en refrigeracin a 4C para inactivar su crecimiento hasta su prximo uso. (Opcional). Preparacin de la semilla de sorgo. a. La semilla de sorgo se debe lavar con agua corriente, dejar remojar toda la noche. b. Al da siguiente se debe lavar nuevamente. c. Hervir en agua por 15 minutos. d. Preparar paquetes de 250g en bolsas de polipropileno de 20x30cm y agregar 1.75g de carbonato de calcio (yeso agrcola) para disminuir la acidez. Se sellan las bolsas con cinta testigo. e. Se esterilizan las bolsas en la olla de presin a 121C a 15lb/ft, durante 15 min. Se dejan enfriar las bolsas durante 48 horas, teniendo una humedad del 50 %. Inoculacin de la semilla de sorgo a. Se elabora en campana de flujo laminar bajo completa asepsia, desinfectando la superficie de trabajo con alcohol y flameando. b. El micelio que crece sobre el agar en la caja Petri se corta en cuatro fragmentos y con una aguja de diseccin desinfectada y flameada se toma uno de estos fragmentos y se coloca sobre la semilla, homogenizando dentro de la bolsa. c. Se sellan las bolsas con cinta adhesiva, dejando que entre un poco de aire. d. Se incuba de 25-28C en obscuridad hasta que el micelio cubre totalmente la semilla. Inoculacin de los sustratos contaminados y no contaminados. a. Se utiliza un sustrato de paja pasteurizado por inmersin en agua caliente. El sustrato se sumerge en agua a 75-80C durante una hora. b. Se transfieren 5kg del sustrato en bolsas de polipropileno. c. La mitad de las bolsas se contaminan con diferentes volmenes de aceite de automvil usado, la otra mitad (grupo control) se deja limpio. d. Se siembra en inculo en la paja contaminada y no contaminada tomando 250g de micelio.

e. Las bolsas se colocan en un lugar oscuro y hmedo y se espera su crecimiento. f. Adicionalmente se puede sembrar micelio en una mezcla de tierra y paja contaminada con aceite de auto y dejar a la intemperie para observar el resultado. 8. Observacin.

Cronograma de actividades.
Semana 1 (4-10 sept)
Obtencin del inoclo. Preparacin del medio PDA

Semana 2 (11-17 sept)

Aislamiento del inculo a partir del cultivo in vitro. Inoculacin del hongo.

Semana 3 (18-24 sept)

Preparacin de la semilla de sorgo. Inoculacin de la semilla de sorgo

Semana 4 (25-1 oct)

Revisin del hongo en semilla.

Semana 5 (2 sept-8 oct)

Inculacin de hongo en sustratos contaminados y no contaminados.

Semanas 6-12 (9 oct-19 nov)

Revisin del hongo.

Bibliografa.
Altas, Ronald; Philip Jim. Bioremediation: applied solutions for real world environmental cleanup. ASM Press. Washington DC. (2005)

Bhatt,M., Cajthaml,T., Sasek,V. Mycoremediation of PAH contaminated soil. Folia Microbiologica, 3: 255-258. (2002)

Singh, Harbhajan. Mycoremediation: fungal bioremediation. New York: Wiley-Interscience. (2006)

Thomas, S.A. "Mushrooms: Higher Macrofungi to Clean Up the Environment", Battelle Environmental Issues. (2000)

Micologa.

ITESI

Integrantes: Luis Jorge Negrete Alcalde

Louis Paul Decena Segarra Rosa Mara Guadalupe Gutirrez Panales.

Tema: Crecimiento de Champin ostra (Pleorotus ostreatus) en sustrato contaminado con hidrocarburos.

Profesor: Dr. Francisco Alejo Iturvide.