CULTIVOS MONOSPRICOS Los cultivos monospricos se usan para obtener cultivos desarrollados de una espora simple.

(Arias, 2008) Para obtener cultivos monospricos se cortaron pequeos fragmentos de las lesiones de las hojas que mostraban cuerpos de fructificacin, segn el mtodo descrito por CROUS (1998). En estos cultivos se analiz la tasa de crecimiento (a las cuatro-ocho semanas), se midi el color del aislado tanto en su parte inferior como superior usando el colormetro Color-Eye 7000 (GretagMacbeth) y se hizo una estimacin visual de la textura y forma de los mrgenes de la colonia. (Crous, 1998) La extraccin del ADN fngico se llev a cabo bien directamente de las lesiones necrticas de las hojas o a partir de los aislamientos obtenidos, y una vez caracterizados, se tomaron rodajas de cuatro milmetros de dimetro, se coloco una en cada matraz (10 en total), que contenan 50 ml del medio de cultivo lquido papa-dextrosa acidificado; enseguida, se pusieron en agitacin constante durante 5-10 das a 100-200 rpm. Pasado este tiempo el contenido de cada matraz se filtro en manta de cielo con el objeto de separar los conidios del micelio del hongo. Los conidios obtenidos se sembraron en PDA y una vez que germinaron se sembraron en cajas Petri con PDA para as obtener cultivos monospricos. (French y Herbert, 1980) Los cultivos monospricos se obtuvieron de un cultivo puro, al cual se le agregaron 20 ml de agua destilada estril, y con una varilla de vidrio se realiz un raspado del micelio, para remover las esporas. De esta suspensin se realizaron diluciones sucesivas de 1:10, 1:100 y 1:1000. De la ltima dilucin, se tomo una gota y se coloco en el centro de una caja Petri con PDA y se disperso con una

varilla de vidrio estril. Cada una de las esporas germinadas se aisl de forma independiente encajas Petri con PDA. (French y Herbert, 1980) Para lo anterior, se toman dos tubos con 5ml de agua destilada estril con, con una aguja de diseccin se pasa una pequea porcin del crecimiento a uno de los tubos, de esta suspensin se toma con una asa en argolla una alicota que se mezcla en el otro tubo; por duplicado se toman 10 ml del segundo tubo y se esparce por agotamiento con una ansa de argolla sobre una caja con agar de papa dextrosa. Luego las cajas se incuban a 25C y se observan diariamente hasta ver la germinacin de una espora que inmediatamente es transferida a un tubo con PDA inclinado y se continua con la incubacin hasta el desarrollo total de la colonia. (Koneman, 2001) PDA: Medio muy nutritivo que estimula la esporulacin del hongo. Para su preparacin se utilizan 200 g de papas peladas y partidas, las cuales se cocinan en 500 ml de agua destilada durante 1 h. Simultneamente, en otro recipiente caliente y mediante agitacin se disuelve el agar en 500 ml de agua destilada. El extracto de papas se cuela usando una gasa doblada en varias capas y se mezcla con el agar disuelto. A esta solucin se le agrega 20 g de dextrosa. Tambin se puede usar medio PDA en polvo (39 g/L). El volumen total se lleva a 1 L y el medio se coloca en cajas de Petri o tubos y se esteriliza por 20 minutos. En autoclave. Los medios de cultivo se esterilizan, en recipientes de 1 L a 120C y 15 libras de presin por pulgada cuadrada, durante 20 minutos. Los recipientes grandes deben esterilizarse por ms de 20 minutos. Llenado de cajas Petri con el medio de cultivo: Despus de la esterilizacin del medio de cultivo y de las cajas de Petri, stas se llenan con el medio de cultivo. Para esto se utiliza una cmara de transferencia, si no dispone de una cmara de este tipo, se humedece la superficie de una mesa con un desinfectante lquido y se evitan las corrientes de aire.

El procedimiento para el llenado de las cajas Petri es el siguiente: El recipiente que contiene el medio de cultivo se destapa, evitando tocar la boca del frasco, el cual debe pasarse sobre la llama de una lmpara de alcohol. La tapa de la caja de Petri se abre nicamente lo necesario para colocar sobre ella la boca del recipiente que contiene el medio de cultivo y se dispensa de 20 a 25 ml del lquido. La caja de Petri y el recipiente se tapan. La caja se agita con movimientos de rotacin para que el medio de cultivo se distribuya uniformemente. Las diferentes muestras se siembran en medio APD (infusin de papa blanca 30%, dextrosa 2%, agar1.5 %). (Toriello, 2008) Se escogieron cuerpos fructferos de cada una de las cepas y se colocaron en caja de Petri de vidrio. Los frutos se desinfestaron con hipoclorito de sodio al 1% durante dos minutos, las lesiones ocasionadas por la enfermedad se desprendieron y se sembraron en el medio de cultivo PDA. De los aislamientos obtenidos, y una vez caracterizados, se tomaron rodajas de cuatro milmetros de dimetro, se coloco una en cada matraz (10 en total), que contenan 50 ml del medio de cultivo lquido papa-dextrosa acidificado; enseguida, se pusieron en agitacin constante durante 5-10 das a 100-200 rpm. Pasado este tiempo el contenido de cada matraz se filtro en manta de cielo con el objeto de separar los conidios del micelio del hongo. Los conidios obtenidos se sembraron en PDA y una vez que germinaron se sembraron en cajas Petri con PDA para as obtener cultivos monospricos. (Montiel, 2001)

Medios de cultivo. El medio de cultivo es una sustancia o solucin que permite el desarrollo de microorganismos, mientras que el cultivo es el producto del crecimiento de un organismo. Los medios utilizados en micologa deben contener los nutrientes suficientes para asegurar el desarrollo y reproduccin de los hongos (carbono, nitrgeno, vitaminas, oligoelementos, etc.) y un pH ligeramente cido (6 6.3) para facilitar su crecimiento e inhibir al mismo tiempo el desarrollo de otros microorganismos. Se puede aadir antibiticos antibacterianos para inhibir el crecimiento de bacterias saprofitas que suelen contaminar las muestras. (Caedo, 2004) Al identificar las enfermedades de plantas, es recomendable aislar los microorganismos que son posibles agentes patgenos. Para lograr este objetivo, los microorganismos principalmente hongos y bacterias) se aslan en medios de cultivo artificiales, con el fin de poder purificarlos y estimular su esporulacin para la produccin de inoculo. Este se utiliza en la inoculacin de plantas para reproducir sntomas, paso necesario en la identificacin de patgenos (postulados de Koch). (Gilchrist et al, 2005) Tipos de medios. Los medios de cultivo son combinaciones de substancias o soluciones que permiten el crecimiento de uno o ms organismos. Pueden ser slidos o lquidos; la nica diferencia es que los slidos contienen agar, se preparan en frascos, cajas Petri o tubos de cultivo, y se utilizan para aislar y mantener hongos y bacterias. Los medios lquidos se usan principalmente para incrementar las poblaciones de hongos y bacterias, y determinar sus propiedades fisiolgicas, ya sea en condiciones estticas o en agitacin. Esta ltima permite una mayor aireacin, que, a su vez, ayuda a lograr un crecimiento uniforme y mantener la patogenicidad. Los medios se pueden agrupar, segn su composicin, en:

Carentes de nutrientes, o de nutricin muy pobre. Estos son utilizados para obtener cultivos monospricos, aislar patgenos que se encuentran en el tejido vegetal del cual tomarn los nutrientes, y tambin para forzar la esporulacin de algunos hongos. El ms comn de estos medios es el llamado agar-agua. Nutritivos. Entre stos figuran los naturales, los semi-sintticos y los sintticos. Los naturales contienen nicamente tejidos vegetales (como hojas, races, vainas y granos), en trozo o macerados, que han sido esterilizados. Los semi-sintticos contienen substancias naturales (extractos de animales y extractos o preparados vegetales, como harina de maz y hojuelas de avena) y elementos sintticos. Todo el contenido de los sintticos est qumicamente definido, y pueden ser reproducidos en forma especfica cuando son requeridos. Algunos medios sintticos y semi-sintticos vienen en forma deshidratada y slo se les agrega agua. Todo medio de cultivo debe elaborarse con agua destilada. (Gilchrist et al, 2005) Determinacin del medio de cultivo. Se determina el medio de cultivo que debe utilizarse dependiendo de la tarea a realizar: aislamientos, estudios biolgicos y fisiolgicos de un hongo (para los que hay que producir estructuras sexuales o asexuales), o bien, la produccin de inculo. El tipo de medio es de suma importancia, ya que de l depende que el organismo mantenga su patogenicidad y capacidad de producir propgulos de reproduccin. Otro factor importante en los medios de cultivo es el pH que, en el caso de los hongos, debe ser de 5.8 a 6.5, segn las necesidades del organismo en cuestin. (Gilchrist et al, 2005)

Preparacin de medios de cultivo. Durante la prctica de laboratorio de un curso bsico, se recomienda elaborar dos medios de cultivo, papa dextrosa agar (PDA) y agar-agua (AA), considerados los ms importantes por su uso tan frecuente. En cuanto a los dems medios, en la seccin correspondiente a cada patgeno se indica cual (o cuales) medio(s) conviene usar. Medios de cultivo que se utilizan para el aislamiento y crecimiento de hongos. A fin de identificar y estudiar los patgenos, es necesario aislar y cultivarlos. Por tanto, se recomienda practicar la preparacin de algunos de los medios de cultivo ms utilizados, como los dos que se describen a continuacin. Agar-agua (AA). Suele utilizarse para aislar y hacer germinar esporas, obtener cultivos monospricos y verificar la viabilidad del inoculo. Componentes: Agar 15-20 g Agua destilada 1000 ml Preparacin: en el matraz, diluir el agar en agua destilada (ocupar solo la mitad de la capacidad del matraz) y esterilizar. Papa-dextrosa-agar (PDA). Este medio es el ms utilizado para el aislamiento, crecimiento y almacenamiento de hongos, pues es apropiado para numerosas especies. Componentes: Papas partidas 250 g

 Dextrosa 10 g Agar 20 g Agua destilada 1000 ml En muchos pases se vende en el mercado PDA deshidratado que se prepara agregando agua destilada en la proporcin sealada por el fabricante y esterilizando como sigue. Pesar 9.75 g de PDA preparado y deshidratado en un matraz de 500 ml; agregar 250 ml de agua destilada. La suspensin se calienta hasta homogeneizarla; luego se colocan 4 a 5 ml de medio en cada tubo de ensayo utilizando una jeringa. Los tubos se cierran y esterilizan, y se ponen a enfriar en posicin inclinada hasta que el medio se solidifica. Si no se tiene una jeringa dosificadora para llenarlos, se usa un embudo sostenido en una plataforma de metal. Ajustar un pedazo de manguera flexible en la parte terminal del embudo, controlando la salida con una pinza Mohr. La cantidad deseada de medio se mide en un tubo que se usa en forma constante como patrn de medida durante el proceso de llenado. (Gilchrist et al, 2005)

Figura 1. Preparacin de medios de cultivo. Obtencin de cultivos monospricos.

Para establecer una coleccin confiable, es necesario partir de aislamientos monospricos que garanticen la autenticidad y pureza de los mismos y de los datos que se consigan. Los aislamientos monospricos pueden ser por colonia o por punta de hifa. (Caedo, 2004) Una vez aislado el patgeno causante de una enfermedad, es necesario obtener aislamientos formados por varios individuos de la misma especie. Los trabajos de investigacin o de aplicacin prctica en los programas de mejoramiento gentico requieren que se cuente con un grupo de individuos que sean representativos de la poblacin del patgeno con que se desea trabajar. Para cumplir con el objetivo de tener aislamientos puros generados a partir de una sola espora, se deben seguir los siguientes pasos bajo condiciones aspticas: Obtenga una suspensin de baja concentracin de conidios en agua estril de la especie en estudio a partir del cultivo inicial. Tome 0.5 ml de dicha suspensin, virtala en una caja Petri con medio agar-agua y disprsela con una varilla de vidrio estril. Observe la germinacin de los conidios bajo el estereoscopio a intervalos de tiempo regulares (24, 48 y 72 horas). Cuando estos inicien su germinacin, tome una aguja previamente esterilizada a la flama, ubique los conidios que germinan en forma aislada y tome el pedacito del agar donde se encuentran estos. Transfiera uno por uno los conidios en germinacin a cajas Petri individuales. Use el medio de cultivo recomendado para el crecimiento del patgeno en estudio. Continu vigilando el crecimiento de cada colonia obtenida. Descarte aquellas que muestren un crecimiento concntrico doble o triple, ya que este patrn indica que fue transferida ms de una espora durante el trabajo con la aguja bajo el estereoscopio. Esto es comn cuando hay poca experiencia. (Gilchrist et al, 2005) PURIFICACION DE HONGOS

En algunos casos es difcil separar a un hongo de ciertas bacterias contaminantes (an usando sustancias bacteriostticas) o separar dos hongos que se desarrollan juntos en las siembras realizadas. En otros casos de hongos muy variables, se recomienda hacer una purificacin gentica, aunque esto es relativo puesto que las clulas pueden ser multinucleares. Segn los hongos esporulen o n, estos tipos de purificacin se pueden realizar con las tcnicas de cultivos de punta de hifa o monospricos. (French y Herbert, 1980) Cultivos de punta de hifa. Siembre una porcin de hongo en su medio de cultivo en el centro de una placa de un medio con bajo contenido nutricional o en medio agar agua con 3% agar; adicinele una sustancia bacteriosttica apropiada. En cuanto se desarrollen hifas separadas en el medio, ubique una punta con un microscopio estereoscpico a 80-120x, o con el objetivo 10x de un microscopio compuesto al cual hayan quitado los objetivos restantes. Corte la hifa detrs de la clula terminal con un bistur del uso oftlmico desinfectado en alcohol y flameado (sin sostener en una llama). Tambin puede utilizar una navaja de afeitar montada en una vara de madera o vidrio. Corte un bloque de agar rectangular que contenga la hifa y transfiralo a una placa o a un tubo de medio inclinado para que crezca. (French y Herbert, 1980) Cultivos monospricos. Existen muchos mtodos para hacer cultivos monospricos; se dan aqu los que se consideran ms simples o tiles, y cuya eficacia ha sido comprobada. (French y Herbert, 1980)

Mtodo de ubicar en placas. a. Prepare placas de agar agua 3% (30 g agar/lt) con uno o dos das de anticipacin.
b. Haga aspticamente suspensiones de esporas, de concentracin de

alrededor de 2500/cc (vase Incremento de Inculo y Uniformizacin de Inculo, en el Capitulo 11). Si las esporas son difciles de separar, utilice Tween 80 a concentracin 10-5. c. Con un ansa-aro, estre una gota de la suspensin sobre el medio, o vierta un volumen adecuado para mojar la superficie, escurriendo el exceso de inmediato (tal vez sea necesario reducir la concentracin de esporas para conseguir una buena separacin entre una y otra). d. Ubique las esporas. Esto puede facilitarse se deja transcurrir el tiempo necesario para que se desarrolle ligeramente un tubo germinativo, o una ramificacin micelar mayor, siempre y cuando se puedan distinguir todos sus detalles para asegurarse que la colonia se origina a partir de una sola clula. De todas maneras es necesario esperar hasta que el agar absorba el agua agregada. La ubicacin puede hacerla de dos maneras:
1) Con microscopio estereoscpico a 80-120x, una vez que se halla ubicado la

espora o colonia monosprica deber asegurarse que no haya otra en su cercana, y con una ansa-esptula corte un bloque de agar que la contenga, transfirindola a un medio apropiado para su desarrollo; 2) Con microscopio compuesto, usando slo el objetivo 10x; quite los otros que puedan entorpecer, o arruinarse durante la operacin. Como los procesos de cortar y transferir un bloque de agar no se pueden realizar con

facilidad de visin y distancia de trabajo que permite el estereoscpico, proceda en una de las formas siguientes: a. Una vez ubicada la espora, cierre el diafragma del condensador, concentrando as un haz de luz que marca el sitio; suba el objetivo y corte el bloque del agar. Antes de transferirlo observe nuevamente para asegurarse que solo una espora ocupa el bloque. b. Utilice un Monospor isolator* el cual se monta cubriendo un objetivo especial de 10x y tiene un pequeo cilindro cortante a travs del cual se ve el centro del campo visual. Despus de ubicada una espora, descienda el objetivo hasta cortar el pequeo cilindro de agar que la contenga. Suba el objetivo, con el cilindro adherido y para expelerlo, presione levemente sobre una vejiga de aire que se conecta por un tubo. Recoja el pequeo cilindro de agar con una esptula pequea estril para transferirlo a un medio apropiado para el crecimiento de la espora. Iniciando el trabajo con el aparato estril, es posible completar muchos cultivos monospricos sin contaminarlos. El Keyworth isolator** es un aparato similar, sin el expeledor; se usa solo para cortar ya que deja el cilindro de agar en su sitio. Se puede construir un aparato similar trabajando en frio un alambre grueso de resistencia elctrica, como el que se usa para hacer una aguja de transferencia aplanada. Mtodo de observar en capilares. Prepare una suspensin de esporas de baja concentracin en agar enfriado a 45C. Con tubos capilares finos de vidrio (estriles y tibios) absorba la suspensin, y obsrvela microscpicamente para ubicar las esporas y cortar trozos que slo contengan una. Estos se siembran en un medio apropiado (C.M.I., 1968). Segn

las condiciones del trabajo escoja los medios para la suspensin (AA, APA u otro) y la siembra. Si no puede trabajar en una cmara asptica, desinfecte la superficie de los trozos de tubo capilar antes de sembrarlos. (French y Herbert, 1980)

Aislamientos de Colletotrichum sp provenientes de cultivos de mora, cultivados en medio PDA. Fuente de la imagen: Echeverra, 2006

BIBLIOGRAFIA Gilchrist-Saavedra, L., G. Fuentes-Dvila, C. Martnez-Cano, R.M. Lpez-Atilano, E. Duveiller, R.P. Singh, M. Henry e I. Garca A. 2005. Gua prctica para la

identificacin de algunas enfermedades de trigo y cebada. Segunda edicin. Mxico, D.F.: CIMMYT. Montiel, M.; Avelar, M. 2001. Etiologa de la enfermedad Clavo del Guayabo. Unidad Acadmica Agronoma, Universidad Autnoma de Zacatecas. 5as Jornadas de Investigacin Universidad Autnoma de Zacatecas. Trabajo: AP/UAGRO06/006 Toriello, C.; Montoya, S.; Zavala, R.; Navarro, B.; Basilio, Hernndez.; Hernndez V.; Mier, T. 2008. Virulencia y termotolerancia de cultivos monospricos de Metarhizium anisopliae var. anisopliae de la mosca pinta (Hemiptera: Cercopidae). Depto. de Microbiologa y Parasitologa, Facultad de Medicina, UNAM. Mxico D.F. Crous, P.W.; 1998. Mycosphaerella spp. and their anamorphs associated with leaf spot diseases of Eucalyptus. Mycological Memoir 21, 170 pp. French, E.R. y Herbert, T. 1980. Mtodos de investigacin fitopatolgica. Libros y materiales educativos, n 43. San Jos, Costa Rica, IICA. 289p. Centro de Investigacin en Biotecnologa (CIB), Centro de Investigaciones en Caf (CICAFE), Caracterizacin biolgica y molecular de aislamientos del hongo entomopatgeno Beauveria bassiana (Blsamo) Vuillemin Echeverra, B.C.F. Enero, 2006. Trabajo Final de Graduacin para optar por el grado de Bachiller en Ingeniera en Biotecnologa. Instituto Tecnolgico de Costa Rica. Caedo, T. A. E. 2004. Manual de Laboratorio para el Manejo de Hongos Entomopatgenos. Lima, Per; Centro Internacional de la Papa (CIP), Lima, Per, 62 p. Centro Internacional de la Papa (CIP).