CONCEPTE FUNDAMENTALE ALE GENETICII ECOLOGICE

De la apariia sa ca tiin, n anul 1900, cnd Carl Correns, Hugo de Vries i Erick von Tschermack au confirmat valabilitatea universal a legilor ereditii formulate n anul 1865 de ctre Gregor Mendel, genetica s-a dezvoltat ntr-un ritm atins de puine alte tiine. Evoluia de la genetica caracterelor calitative i cantitative la genetica molecular este impresionant i a creat bazele pentru progrese uimitoare n domeniul aplicaiilor practice. Conform anticiprilor forurilor tiinifice internaionale, genetica va fi tiina mileniului trei, adic tiina care va avea cel mai puternic impact n evoluia societii. Studiile de genetic sunt o component esenial pentru aplicaii majore n agricultur, medicin, sau ecologie i protecia mediului. Aplicaiilor simple, cum sunt transmiterea la descendeni a caracterelor calitative (distincte i constante la diferiii indivizi) i cantitative (prezentnd o variaie continu), li s-au adugat aplicaii mult mai complexe, cum sunt studiul variabilitii genetice i implicit fenotipice, determinate de recombinarea genetic n cadrul indivizilor i populaiilor, producerea de mutaii ca efect al aciunii unor factori de mutageni (factori de stres, factori care genereaz instabilitatea genetic, incluznd agenii mutageni chimici, fizici, biologici i elementele genetice transpozabile), studiul mecanismelor moleculare implicate n modificarea informaiei genetice, studiul cilor de terapie genic, studiul fluxului vertical i orizontal de gene, etc. Genetica este n prezent o tiin foarte complex, care face adesea apel la metode de investigaie i interpretare a rezultatelor aparinnd altor domenii ale tiinei, cum sunt statistica, bioinformatica, biochimia sau biologia celular. Spectrul foarte larg de aplicaii i specificitatea metodelor de investigaie au determinat apariia unui numr mare de ramuri ale geneticii, printre care genetica vegetal, genetica animal, genetica uman, radiogenetica, genetica cantitativ, genetica evoluiei, genetica molecular, genomica, genetica populaiilor, genetica ecologic sau ecogenetica, etc. De exemplu, ecogenetica este ramura geneticii care are ca obiect de studiu constituia ereditar a organismelor i respectiv caracterele manifestate de indivizii unei populaii ca efect al interaciunii dintre genotip i mediu, fcnd distincie ntre variaiile ereditare, care afecteaz genotipul, i variaiile epigenetice, care afecteaz exclusiv fenotipul i nu sunt ereditare. In timp ce genetica molecular studiaz structura i funciile genelor la nivel molecular, genetica ecologic sau ecogenetica (ale crei baze au fost puse de Briton E.B. Ford, autorul primei cri cu titlul Genetic Ecologic, aprut n anul 1964) studiaz populaiile slbatice de organisme. Variabilitatea genetic a indivizilor din cadrul populaiilor sau polimorfismul genetic al populaiilor, consecin a recombinrii genetice i mutaiilor (genice, cromozomiale i genomice), a fluxului de gene intra- i interpopulaional, a derivei genetice i a eroziunii genetice, constituie baza adaptrii la condiiile de mediu i totodat condiia esenial pentru meninerea populaiei i/sau supravieuirea speciei.

Genele i Cromozomii Suportul Informaiei Genetice Inscrise n ADN

Importana nucleului i a coninutului su a fost recunoscut odat cu observarea fuziunii nucleilor a doi gamei n cursul procesului de fertilizare. Urmtorul pas important a fost descoperirea cromozomilor, vizibili la microscopul optic cnd sunt colorai cu colorani bazici. S-a descoperit apoi c cromozomii segreg att n gamei ct i n celulele fiice. In sfrit, au fost observate trei reguli importante n ceea ce privete complementul cromozomial (setul complet de cromozomi) al plantelor superioare i animalelor: 1. Nucleul fiecrei celule somatice (o celul a corpului, n contrast cu o celul germinal, sau gamet) conine un numr fix de cromozomi, tipic pentru o anumit specie. Totui, numrul de cromozomi variaz extrem de larg de la o specie la alta, fr a fi dependent de complexitatea organismului. 2. In nucleii celulelor somatice cromozomii sunt prezeni n mod obinuit n perechi. De exemplu, cei 46 de cromozomi ai indivizilor umani constau n 23 de perechi, iar cei 14 cromozomi ai plantelor de mazre constau n 7 perechi. Unul din cromozomii fiecrei perechi provine de la genitorul matern i cellalt de la genitorul patern. Celulele cu nuclei de acest fel, coninnd dou seturi similare de cromozomi, sunt denumite diploide. 3. Celulele germinale, sau gameii, care se unesc n cursul fertilizrii pentru a produce stadiul diploid al celulelor somatice, au nuclei care conin un singur set de cromozomi, constnd dintr-un membru al fiecrei perechi. Aceti nuclei sunt haploizi. La organismele complexe care se dezvolt din celule unice, prezena unui numr diploid de cromozomi n celulele somatice i a unui numr haploid de cromozomi n celulele germinale indic existena a dou procese de diviziune nuclear. Unul dintre acestea mitoza - menine numrul de cromozomi, pe cnd cellalt meioza - l reduce la jumtate. Aceste dou procese sunt descrise n subcapitolele urmtoare. Mitoza Mitoza este un proces precis al diviziunii celulare care asigur ca fiecare dintre cele dou celule fiice s primeasc un complement de cromozomi identic cu cel al celulei parentale. Procesul este n mod esenial acelai la toate organismele i este remarcabil de simplu: 1. Fiecare cromozom este deja prezent ca o structur replicat la nceputul fiecrei diviziuni nucleare. 2. Fiecare cromozom se divide longitudinal n dou jumti identice care se separ una de cealalt. 3. Jumtile de cromozomi separate se mic n direcii opuse, fiecare fiind inclus n una dintre cele dou celule fiice care se formeaz. In celulele care nu sunt pregtite pentru mitoz cromozomii nu sunt vizibili la microscopul optic. Acest stadiu al ciclului celular se numete interfaz. In cadrul pregtirii pentru mitoz are loc sinteza materialului genetic din cromozomi (ADN), care se realizeaz n cursul unei perioade a interfazei trzii denumit S (Figura 2.1). Sinteza ADN este nsoit de replicarea cromozomilor. Perioada S este precedat de o perioad denumit G1 i urmat de

o perioada G2, n care nu se realizeaz sinteza ADN. Ciclul celular, sau ciclul de via al celulei, este n mod obinuit descris n termenii acestor trei perioade ale interfazei, urmate de mitoz (M). Aadar, aa cum se prezint n Fig. 2.1, G1 S G2 M. In aceast reprezentare, diviziunea citoplasmei n dou pri aproximativ egale coninnd nucleii este inclus n perioada M. Durata ciclului celular variaz dependent de tipul de celul. La majoritatea organismelor superioare ciclul celular dureaz ntre 18 i 24 de ore. Durata relativ a diferitelor perioade ale ciclului celular variaz de asemenea considerabil n funcie de tipul de celul. De regul, mitoza este perioada cea mai scurt a ciclului celular, care se realizeaz ntr-un interval de 1/2 or pn la 2 ore.

G2

G1

Celule care i nceteaz diviziunea

S

Figura 2.1 Fazele ciclului celular. Sinteza ADN se realizeaz numai n faza S, n timp ce n faza presintetic (G1) i n cea postsintetic (G2) cantitatea de ADN rmne constant: simpl n G1 i dubl n G2. Diviziunea celulei se realizeaz n faza M (mitoza) a ciclului celular

Mitoza este divizat convenional n patru stadii - profaza, metafaza, anafaza, i telofaza, avnd urmtoarele particulariti: 1. Profaza. In timpul interfazei, cromozomii au forma unor filamente lungi i nu pot fi vizualizai la microscopul optic. Cu excepia a unul sau mai muli corpusculi ntunecai (nucleoli), nucleul are un aspect difuz, granular. Inceputul profazei este marcat de condensarea cromozomilor n interiorul nucleului sub forma unor iraguri subiri, distincte, vizibile la microscopul optic. Cromozomii sunt deja dublai longitudinal, constnd din dou subuniti strns asociate, denumite cromatide. Fiecare pereche de cromatide este produsul replicrii unui cromozom n perioada S a interfazei. Cromatidele dintr-o pereche sunt unite ntr-o regiune specific a cromozomului denumita centromer. Pe msur ce profaza progreseaz, ca urmare a unui proces de super-rsucire, cromozomii devin mai scuri i mai groi. In profaza trzie au loc trei evenimente: 1) nucleolii dispar; 2) nveliul nuclear se dezintegreaz; 3) se formeaz fusul mitotic. Fusul este o structur bipolar coninnd mnunchiuri de fibre care se ntind ntre polii celulelor. Fiecare cromozom se ataeaz la cteva fibre ale fusului prin intermediul centromerului su. 2. Metafaza. Dup ataarea la fibrele fusului, cromozomii se mic spre centrul celulei pn ce toi centromerii se aeaz ntr-un plan echidistant de polii fusului mitotic. Perioada n care cromozomii sunt situai n planul central al fusului este denumit metafaz. In acest stadiu cromozomii ating maximum de contractare i sunt cel mai uor de numrat i de studiat sub aspect diferenelor de morfologie.

3. Anafaza. In anafaz centromerii se divid longitudinal i cele dou cromatide surori ale fiecrui cromozom se mic opus spre cei doi poli ai fusului. Odat ce centromerii se divid, fiecare cromatid sor devine n fapt un cromozom separat. Micarea cromozomilor se realizeaz n parte prin scurtarea progresiv a fibrelor fusului ataate la centromeri, care trag cromozomii n direcii opuse spre poli. La ncheierea anafazei, cromozomi sunt dispui n dou grupuri lng polii opui ai fusului. Fiecare grup conine acelai numr de cromozomi care a fost prezent n nucleul interfazic de origine. 4. Telofaza. In timpul telofazei, n jurul fiecrui grup compact de cromozomi se formeaz un nveli, se formeaz nucleolii, iar fusul dispare. Cromozomii parcurg procesul invers condensrii, pn cnd nu mai sunt vizibili ca entiti distincte. Cei doi nuclei fii dobndesc uor aspectul tipic interfazei, pe msur ce citoplasma celulei se divide n dou pri care se separ prin sintetizarea unui perete celular nou ntre celulele fiice. Meioza Meioza este modul de diviziune celular prin care se formeaz celule cu un singur membru din fiecare pereche de cromozomi prezent n celula premeiotic. Cnd o celul diploid cu dou seturi de cromozomi parcurge meioza, rezult patru celule fiice, fiecare diferit din punct de vedere genetic, i fiecare coninnd un set haploid de cromozomi. Meioza const din dou diviziuni nucleare succesive, ale cror detalii eseniale sunt prezentate n continuare. 1. Inainte de prima diviziune nuclear, cei doi membri ai fiecrei perechi de cromozomi, despre care se spune ca sunt omologi unul altuia, devin strns asociai pe toat lungimea lor. Deoarece fiecare cromozom omolog este deja replicat, aceast asociere const n fapt dintr-un duplex de dou cromatide surori unite n regiunea centromerului. Prin urmare, mperecherea cromozomilor omologi produce o structur tetra-catenar. 2. In prima diviziune nuclear, cromozomii omologi mperecheai se separ unul de cellalt. Se formeaz doi nuclei, fiecare coninnd un set haploid de cromozomi duplicai. 3. A doua diviziune nuclear este oarecum asemntoare cu o diviziune mitotic. Nu are loc nici o replicare a cromozomilor, dar n metafaz cromozomii se aliniaz n zona central a fusului, iar n anafaz cromatidele fiecrui cromozom se separ n nucleii fii. Efectul net al celor dou diviziuni este formarea a patru nuclei haploizi, fiecare coninnd echivalentul unei singure cromatide sor din fiecare pereche de cromozomi omologi. Dei procesul meiozei este similar la toate organismele cu reproducere sexual, att la animalele ct i la plantele femele, doar unul dintre cei patru nuclei se dezvolt ntr-o celul funcional (ceilali trei se dezintegreaz). La animale, produii meiozei (gameii) sunt ovulele i spermatozoizii. La plante, produii meiozei sunt ovulele i grunciorii de polen.

Meioza este un proces mult mai complex i considerabil mai lung dect mitoza, necesitnd zile sau chiar sptmni. Esena meiozei const n realizarea a dou diviziuni ale nucleului, n condiiile unei singure duplicri a cromozomilor. Diviziunile nucleare denumite prima diviziune meiotic i a doua diviziune meiotic - pot fi separate ntr-o secven de stadii similare celor descrise n cazul mitozei. Evenimentele distinctive ale acestui important proces se produc pe parcursul primei diviziuni meiotice. Prima diviziune meiotic Cele patru stadii definite ale primei diviziuni meiotice sunt profaza I, metafaza I, anafaza I, i telofaza I. In general, aceste stadii sunt mai complexe dect cele corespunztoare n cazul mitozei. 1. Profaza I. Acesta este un stadiu lung, care la majoritatea organismelor superioare dureaz cteva zile, i este mprit convenional n cinci substadii - leptoten, zigoten, pachiten, diploten i diachineza. In leptoten cromozomii devin vizibili ca structuri lungi asemntoare unor iraguri. Perechile de cromatide surori pot fi distinse prin microscopie electronic. In aceast faz iniial a condensrii cromozomilor, la intervale neregulate de-a lungul lor apar numeroase granule dense. Aceste contractri localizate, denumite cromomere, au numr, mrime i poziie caracteristic pentru un cromozom dat. Perioada zigoten este marcat prin mperecherea latur pe latur a cromozomilor omologi, proces denumit sinaps. Imperecherea ncepe n unul sau mai multe puncte de-a lungul cromozomilor i are ca rezultat o asociere foarte precis ntre cromomere. Fiecare pereche de cromozomi omologi aflai n sinaps este denumit ca fiind un bivalent. Pe durata stadiului pachiten, condensarea cromozomilor continu, i complementul cromozomial este reprezentat de numrul haploid de bivaleni. Fiecare bivalent const dintr-o tetrad de patru cromatide, dar n mod obinuit cele dou cromatide surori ale fiecrui cromozom nu pot fi distinse. In cursul pachitenului apare un eveniment important din punct de vedere genetic, denumit crossing-over, dar acesta nu este evident dect dup trecerea la diploten. In diploten, cromozomii aflai n sinaps ncep s se separe. Totui, ei rmn asociai la anumite intervale de-a lungul lungimii lor prin legturi n cruce. Fiecare legtur n cruce, denumit chiasm, este rezultatul unei ruperi i reuniri ntre cromatide non-surori. Cu alte cuvinte, o chiasm rezult din schimbul fizic ntre cromatidele cromozomilor omologi (Figura 2.4). In meioza normal, fiecare bivalent are cel puin o chiasm, ns bivalenii formai din cromozomi lungi au adesea trei sau mai multe. Pe parcursul perioadei finale a profazei I -diachineza- cromozomii ating maximum de condensare. Cromozomii omologi formnd bivaleni rmn conectai prin cel puin o chiasm, care persist pn la prima anafaz meiotic. Aproape de sfritul diachinezei, este iniiat formarea fusului i se produce ruperea nveliului nuclear. 2. Metafaza I. Bivalenii se poziioneaz cu centromerii celor doi cromozomi omologi n pri opuse ale planului format de mijlocul fusului. Orientarea perechilor de centromeri ai fiecrui bivalent spre polii fusului este ntmpltoare (randomizat). 3. Anafaza I. In acest stadiu, cromozomii omologi, fiecare compus din dou cromatide unite printr-un centromer nedivizat, se separ unul de cellalt i se mic spre polii opui ai fusului. 4. Telofaza I. La ncheierea anafazei I, lng fiecare pol al fusului se afl cte un set haploid de cromozomi constnd din cte un omolog din fiecare bivalent. In timpul telofazei,

fusul se dezorganizeaz i, dependent de specie, ori se formeaz foarte repede un nveli n jurul fiecrui grup de cromozomi, ori cromozomii intr n cea de a doua diviziune mitotic dup o uoar despiralizare. A doua diviziune meiotic La unele specii, cromozomii trec direct de la telofaza I la profaza II fr pierderea condensrii; la altele, exist o scurt pauz ntre cele dou diviziuni meiotice. Replicarea cromozomilor nu se produce niciodat ntre cele dou diviziuni; cromozomii prezeni la nceputul celei de a doua diviziuni meiotice sunt identici cu cei prezeni la sfritul primei diviziuni. Dup o scurt profaz (profaza II) i formarea fusurilor pentru a doua diviziune, centromerii cromozomilor se aliniaz n fiecare nucleu n planul central al fusului n metafaza II. In anafaza II, centromerii se divid longitudinal i cromatidele fiecrui cromozom se mic spre polii opui ai fusului. Telofaza II este marcat de trecerea la condiia din interfaz a cromozomilor, n patru nuclei haploizi, nsoit de diviziunea citoplasmei. Astfel, a doua diviziune meiotic este ntr-un fel asemntoare cu o diviziune mitotic. Totui, exist o diferen important: de regul, cromatidele unui cromozom nu sunt surori identice pe toat lungimea lor deoarece formarea chiasmelor n timpul profazei primei diviziuni au ca rezultat producerea a unul sau mai multe crossing-over.

Recombinarea Genetic
Organismele vii se caracterizeaz, printre altele, prin faptul c ntre indivizii unei populaii, respectiv ai unei specii, exist nenumrate deosebiri, att genotipice, ct i fenotipice. Fiecare individ constituie o entitate unic i nerepetabil (exceptnd indivizii clonai), datorit faptului c el prezint o anumit configuraie a factorilor genetici. Deosebirile genotipice dintre indivizi se realizeaz n primul rnd prin fenomenul recombinrii genetice, prin care informaia ereditar are capacitatea de a circula n cadrul unei populaii. Recombinarea, care este unul dintre fenomenele de baz ale geneticii, poate s apar pe parcursul meiozei, caz n care este denumit recombinare meiotic, dar poate de asemenea s se produc i n celulele care parcurg mitoza, caz n care poart denumirea de recombinare mitotic sau somatic. La speciile evoluate, frecvena recombinrii mitotice este foarte sczut comparativ cu aceea a recombinrii meiotice, dar n ambele tipuri de recombinare procesul este reciproc, constnd n schimbul anumitor gene ntre un grup linkage i grupul omolog din cromozomul pereche. Fenomenul recombinrii genetice are o importan biologic extraordinar, acesta determinnd diferenierile genotipice ntre indivizii unei populaii i respectiv ai unei specii, i nu n ulimul rnd posibilitile foarte largi de adaptare i de supravieuire a organismelor. Recombinarea genetic se realizeaz n principal n cadrul procesului sexual, fapt care explic rspndirea sa extraordinar nu numai la organismele evoluate, dar chiar i la procariote, cum sunt de exemplu bacteriile. La organismele eucariote, fenomenul de recombinare genetic se realizeaz, n cadrul procesului sexual, pe trei ci:
1) 2) 3)

prin disjuncia independent a perechilor de cromozomi n cursul meiozei (recombinare intercromozomial); prin crossing-over ntre cromozomii pereche (recombinare intracromozomial); prin conversie (recombinare genetic nereciproc).

Disjuncia Independent a Perechilor de Cromozomi Studiul comparativ al mitozei i meiozei a artat c al doilea tip de diviziune este cel care asigur libera combinare a cromozomilor i, pe aceast baz, o mare variaie genotipic a gameilor i a descendenilor. Cromozomii omologi care se asociaz n metafaza I formnd bivaleni, se separ ulterior, fiecare pereche independent de celelalte, fapt care determin combinarea pe baz de probabilitate a cromozomilor provenii de la bunici. In mod logic, posibilitile de a forma mai multe combinaii n cadrul gameilor sunt direct corelate cu numrul de perechi de cromozomi. Spre exemplu, dac se ncrucieaz dou specii care au 2n=6 i dac pe fiecare pereche de cromozomi se afl cte o singur pereche de gene, hibridul care rezult va moteni jumtate din cromozomii i factorii ereditari ai fiecruia dintre genitori. Astfel, dac genitorul matern posed genele AA BB CC i cel patern genele aa bb cc, hibridul va fi Aa Bb Cc. In cursul diviziunii reducionale, acest hibrid va forma 8 tipuri de gamei datorit faptului c n metafaza meiozei cromozomii omologi se grupeaz n bivaleni (cte doi) i apoi migreaz la polii celulei n mod diferit, indiferent de originea lor. Rezultatul este formarea a 8 tipuri de gamei masculi i femeli diferii genotipic (ABC, ABc, AbC, Abc, aBC, aBc, abC, abc), prin a cror combinare se vor obine 64 de indivizi diferii din punct de vedere ereditar. Cu ct este mai mare numrul cromozomilor i respectiv al genelor n cromozomi, cu att este mai mare numrul combinaiilor posibile ale gameilor. Astfel, dac n cazul unei specii cu 8 cromozomi i cte o singur gen n cromozom, probabilitatea ca un gamet s fie diferit de altul este egal cu (1/2)4 = 1/16, iar ca un individ s fie diferit de altul este n consecin de (1/2)8 = 1/256, la o specie cu 20 de cromozomi (ex. Zea mays) probabilitatea ca un gamet s fie diferit de altul este de (1/2)10 = 1/1.024, iar ca un individ s fie diferit genotipic este de (1/2)20 = 1/1.048.576. Dac am considera c la porumb sunt numai trei gene, plasate una de alta la o distan suficient de mare, astfel nct s se poat separa uor prin crossing-over, probabilitatea ca un individ s fie diferit genotipic de alii ar fi de (1/2)60. Conform unui calcul fcut de W.R. Singleton (1964), pentru a oferi spaiu tuturor combinaiilor genotipice posibile ntr-un astfel de caz, ar fi necesar o suprafa de teren de 2.000 ori mai mare dect cea a Pmntului. Inmulirea sexuat a organismelor determin aadar o mare variabilitate genotipic a descendenilor, n primul rnd prin mecanismul de combinare pe baz de probabilitate a cromozomilor n cursul diviziunii reducionale. Pe lng aceasta, un rol important n sporirea variaiei genotipice individuale revine fenomenului de schimb de segmente cromatidice ntre cromozomii pereche (crossing-over) precum i genelor extranucleare. Fenomenul variaiei genotipice are o valoare biologic extrem, reprezentnd suportul pentru caracterul unic al indivizilor, pentru asigurarea adaptrii organismelor la variatele condiii de mediu i, n ultim analiz, pentru asigurarea supravieuirii speciilor. Recombinarea Genelor ntre Cromozomii Pereche (crossing-over) Studiul mecanismului de transmitere ereditar a artat c nu ntotdeauna genele care fac parte din aceeai grup de linkage, deci plasate n acelai cromozom, se transmit nlnuite, i c de la acest mod de transmitere a informaiei genetice exist unele excepii. Respectivele abateri au fost explicate prin posibilitatea realizrii unui schimb reciproc de gene ntre cromozomii pereche, printr-un proces care a fost denumit crossing-over.

Procesul de crossing-over se poate realiza att ntre genele de pe cromozomii sexului, ct i ntre cele plasate n autozomi. Ca i n cazul cromozomilor sexului, linkage-ul autozomal poate fi absolut (sau complet), toate genele unei grupe de linkage segregnd mpreun, sau poate fi relativ (sau incomplet), unele gene devenind separate de celelalte ntr-un anumit procentaj de segregri. Efectul imediat al recombinrii este disocierea dintr-o legtur a unor gene i formarea unei noi grupe linkage cu genele cromozomului omolog. Frecvena crossing-overelor Frecvena cu care se poate realiza recombinarea prin fenomenul de crossing-over este dependent nu de genele n sine, ci de arhitectura locilor n care sunt plasate. In general, aceasta este foarte redus i numai n cazuri rare se apropie de limita superioar de 50%, valoare care corespunde segregrii independente a caracterelor, conform legilor mendeliene. Calcularea direct a procentului de recombinare se poate efectua prin analiza genetic, conform procedeului urmtor: se ncrucieaz un organism care prezint dou gene, una dominant i una recesiv, n stare homozigot (Ab/Ab), cu un altul care prezint de asemenea cele dou gene n stare homozigot, gena recesiv i cea dominant fiind ns inversate (aB/aB), i se obine n prima generaie (F1) o descenden n totalitate dublu heterozigot (Ab/aB). In cazul cnd genele sunt plasate pe cromozomi diferii, n urma efecturii unui backcross ntre un individ (genitor matern) dublu heterozigot din F1 i un individ (genitor mascul) dublu recesiv homozigot (adic Ab/aB x ab/ab), se va produce segregarea independent, conform legilor mendeliene. Frecvena recombinrilor poate fi de asemenea calculat pe baza rezultatelor ncrucirilor ntre organisme dublu heterozigote din F1. In cazul descris mai sus, aceasta nseamn ncruciarea ntre indivizi normali i indivizi care prezint concomitent dou mutaii, adic AB/AB x ab/ab, din care vor fi obinui n F1 exclusiv descendeni de tipul AB/ab, care vor produce patru tipuri de gamei (AB, Ab, aB, ab), din combinarea crora vor rezulta att indivizi de tip parental, ct i de tip recombinat. Recombinarea Genetic Nereciproc (Conversie) Spre deosebire de recombinarea genetic reciproc, care se realizeaz prin crossing-over, recombinarea genetic nereciproc apare ca rezultat al fenomenului de conversie. Conversia se manifest prin aceea c descendena haploid a nucleului heterozigot diploid (a+ a) nu prezint raportul normal de segregare, respectiv 1:1, una dintre alele avnd o frecven mai mare dect cealalt. Astfel, la ciuperci, n locul raportului de segregare normal 4:4 se ntlnesc raporturile de 5:3; 6:2; 7:1; 8:0. S-a demonstrat c frecvena recombinrii genetice nereciproce variaz la diferite gene, iar n interiorul unei gene frecvena conversiei crete de la un capt la altul. Fenomenul de polarizare a conversiei n interiorul aceleeai gene poart denumirea de polaron. Fenomenul de conversie are loc frecvent la bacteriile lizogene, care conin profagi i din aceast cauz dobndesc caracteristici noi privind producerea de toxine, sensibilitatea la infecii cu alte virusuri, sau i modific particularitile antigenice. Acest tip de conversie se numete conversie fagic i este cel mai probabil cauzat de adiia de material genetic la genomul bacterian. Conversia genic are loc n cursul meiozei i se consider c se realizeaz n dou etape: 1. In prima etap are loc transferul a 100-200 nucleotide din molecula de ADN de pe o cromatid, pe alta, formndu-se astfel scurte secvene de ADN hibrid;

2.

In cea de a doua etap are loc corecia mperecherilor greite dintre nucleotide n cadrul ADN hibrid, n timpul sau imediat dup recombinarea intergenic prin crossing-over. Ca urmare, s-a observat existena unei corelaii ntre fenomenul crossing-over i frecvena conversiei n imediata vecintate.

MUTAIILE
Mutaia definete orice modificare ereditar i detectabil a materialului genetic, care nu este cauzat de recombinarea genetic sau de segregare. Mutaiile cauzate de factori de mediu (fizici sau chimici) sau de factori biologici apar spontan i sunt denumite mutaii naturale. In funcie de materialul genetic afectat, mutaiile sunt clasificate astfel:
a) b) c)

mutaii genice, cnd sunt afectate genele; mutaii cromozomiale, cnd sunt afectai cromozomii; mutaii genomice, cnd este afectat ntregul genom (mutaii multiple, la nivelul mai multor perechi de cromozomi).

In funcie de genele care sunt afectate, implicnd deci exprimarea fenotipic, mutaiile pot fi clasificate n mutaii dominante, co-dominante, semidominante i recesive. Mutaiile care se produc la nivelul perechilor de nucleotide sunt denumite mutaii punctiforme i sunt evident mutaii intragenice.

Mutaiile au fost de asemenea clasificate i n funcie de locul unde sunt plasate genele afectate, respectiv pe autozomi sau heterozomi, n mutaii autozomale i mutaii heterozomale (care manifest sex-linkage). Exist i mutaii ale genelor din citoplasm, denumite mutaii extranucleare. O categorie relativ distinct de mutaii o constituie mutaiile letale i mutaiile semiletale, care afecteaz gene de importan major n organism, prin a cror blocare se cauzeaz moartea individului, cel mai adesea n perioada embrionar, sau nainte de maturitatea sexual. Indiferent de nivelul la care se produc (genic, cromozomial, genomic), mutaiile au frecven variabil. Se apreciaz ns c pot exista gene mutabile, caracterizate printr-o mare instabilitate i care, n consecin, prezint o frecven mai mare a mutaiilor, comparativ cu celelalte gene din organism. O astfel de ipotez este de altfel susinut de existena seriilor de gene polialele, care sunt considerate ca fiind rezultatul instabilitii pronunate a unor gene sub influena anumitor condiii ale mediului abiotic. S-a sugerat de asemenea posibilitatea existenei unor gene mutatoare, care mresc frecvena mutaiilor altor gene. Mutaiile Naturale i Frecvena lor Se consider c una dintre cauzele mutaiilor naturale care apar la organismele vegetale i animale este radiaia cosmic, o surs permanent de nuclei de carbon, azot i oxigen, care ciocnindu-se cu nuclei ai unor atomi din aer dau natere radiaiei cosmice secundare, format din radiaii electromagnetice i corpusculare. Aceste radiaii acioneaz permanent asupra Pmntului, mpreun cu radiaiile care se produc prin dezintegrarea natural a elementelor radioactive din scoara pmntului i cu gazul radon din atmosfer, alctuind fondul natural de radiaii terestre. Atunci cnd asupra organismelor dintr-o populaie acioneaz un factor de stres fizic sau chimic, respectiv un factor mutagen, probabilitatea producerii unor mutaii este semnificativ mai mare i, de regul, are loc o cretere a frecvenei mutaiilor. Mutaiile naturale au o frecven foarte variat n funcie de condiiile de mediu i de genele afectate. Frecvena mutaiilor se poate calcula numai pentru o anumit gen, dar nsumnd valoarea frecvenei mutaiilor pentru toate genele se poate estima frecvena mutaiilor per genom. Rata mutaiilor nu este constant, ci depinde de diferii factori, printre cei mai importani fiind genotipul i condiiile de mediu. Genotipul poate influena ntr-o msur foarte important rata mutaiilor, mai ales la acele organisme la care s-a demonstrat existena aa-numitelor gene mutatoare, care mresc frecvena mutaiilor la diferite alte gene. Cauzele posibile ale activrii la nivel molecular a mecanismului de aciune al genelor mutatoare pot fi: a) prezena unei polimeraze anormale, care determin erori n replicaia ADN; b) producerea unor analogi ai bazelor azotate cu caracter mutagen, care n cursul replicaiei ADN sunt inclui n macromolecula respectiv; c) modificarea unor baze azotate din macromolecula de ADN, avnd ca rezultat apariia de erori n cursul replicaiei. Descoperirea unei gene care codific producerea unei polimeraze anormale la organisme caracterizate printr-o frecven mrit a mutaiilor reprezint o dovad n sprijinul acestei ipoteze.

Unii derivai purinici sau purine, cum sunt cafeina, azaguanina, sau adenina, au efecte mutagene demonstrate, de la foarte puternic (cafeina) la redus (adenina). In contrast, ribonucleosidele purinice nu numai c reduc frecvena mutaiilor naturale, dar au chiar efect protector fa de aciunea adeninei sau cafeinei, fapt pentru care au fost denumite substane antimutagene.

Factorii Mutageni
Faptul c radiaiile pot induce mutaii este cunoscut nc din anul 1927, cnd H.J. Muller, a demonstrat creterea semnificativ a frecvenei mutaiilor induse artificial n raport cu aceea a mutaiilor spontane. Ulterior s-a descoperit c numeroase substane chimice au efect mutagen. S-a demonstrat apoi c ocurile termice pot de asemenea induce apariia de mutaii la unele organisme, prin favorizarea instabilitii materialului genetic i a replicrii sale eronate. Factorii mutageni pot fi clasificai aadar n: (1) factori mutageni fizici; (2) factori mutageni chimici; (3) factori mutageni biologici. Indiferent de categoria din care fac parte, aciunea constant sau prelungit a agenilor mutageni determin a mrire considerabil a frecvenei mutaiilor.

Factorii mutageni fizici

In grupa factorilor mutageni fizici sunt incluse radiaiile ionizante i neionizante, precum i ocurile de temperatur. Radiaiile care pot provoca mutaii la nivelul diferitelor uniti ale materialului genetic (gene, cromozomi, genom) sunt clasificate astfel: Radiaii neionizante (care genereaz reacii fotochimice): - raze ultraviolete (UV) Radiaii ionizante (care genereaz reacii radiochimice): Radiaii electromagnetice: - raze X (Rntgen) - raze gamma () Radiaii corpusculare - raze beta (electroni) - protoni (nuclei de hidrogen) - neutroni leni sau rapizi - raze alfa (nuclei de heliu) - particule grele Radiaiile neionizante sunt radiaiile ultraviolete (UV), care fac parte din spectrul solar invizibil, fiind constituite din fotoni cu energie joas (circa 3-5 ergi/m2) i cu o lungime de und cuprins ntre 136 i 4.000 . Aciunea radiaiilor UV se exercit prin absorbia energiei fotonilor cu diferite lungimi de und de ctre moleculele substratului, care intr ntr-o stare de excitaie. Consecina acestei stri este apariia unor reacii chimice fluorescente i fosforescente, i transmiterea energiei moleculei excitate unei alte molecule. Asemenea fenomene provoac reacii chimice secundare variate n funcie de substratul asupra cruia se exercit aciunea i de lungimea de und a razelor UV. Radiaiile ionizante includ radiaiile electromagnetice i radiaiile corpusculare, care au un efect similar asupra substratului. Acestea se exercit ca unde sau ca particule ncrcate cu energie diferit i acioneaz la nivelul atomilor, fiind capabile s dezorganizeze sferele de electroni care nconjoar nucleul atomic. Se tie c atomul neutru este ntr-un echilibru

electrostatic, numrul sarcinilor electrice pozitive din nucleul atomic fiind egal cu cel al sarcinilor electrice negative ale electronilor. Radiaiile electronomagnetice, datorit energiei i a vitezei lor foarte mare, sunt capabile s smulg unul sau mai muli electroni de pe orbita exterioar a atomilor neutri ntlnii n drumul lor. Prin pierderea unui electron, atomul rmne cu o sarcin electric pozitiv n plus, devenind ion pozitiv sau cation. Electronul eliberat nu rmne liber, ci se ataeaz unui alt atom care, primind o sarcin electric negativ, devine ion negativ sau anion. Acest proces poart numele de ionizare. Dei ionii produi n urma iradierii au o via foarte scurt, de ordinul a 10-6 dintr-o secund, totui ei au posibilitatea de a intra ntr-o serie de reacii chimice cu substanele din materia iradiat, determinnd apariia unor compui noi. Dintre radiaiile ionizante, cele mai puternice sunt radiaiile electronomagnetice i n special razele gamma i razele Rntgen, care au o lungime de und mic i putere foarte mare de penetraie. Razele gamma, care iau natere n cursul dezintegrrii radioactive, au lungimea de und cea mai mic, cuprins ntre 0.005 i 1.4 . Cea mai cunoscut surs de radiaii gamma este cobaltul radioactiv (60Co). Razele Rntgen (X) sunt radiaii electronomagnetice cu aciune similar razelor gamma, avnd o lungime de und cuprins ntre 0.06 i 100 i o energie de activare de 0.01-0.1 MeV. Puterea lor de penetraie este mai mic dect aceea a radiaiilor gamma, dar suficient de mare pentru a provoca o ionizare puternic. Tot din grupa radiaiilor ionizante fac parte radiaiile corpusculare cum sunt razele (electroni), razele (nuclei de heliu), protonii (nuclei de hidrogen), neutronii i diverse particule grele, emise de asemenea n timpul dezintegrrii radioactive a unor elemente. Razele alfa () sunt formate din nuclei de heliu, alctuii fiecare din doi protoni, cu o mas de circa 7.000 de ori mai mare dect electronul, ceea ce le confer o putere de penetraie foarte mic. Distana maxim de ptrundere a particulelor alfa emise de exemplu de radium este de aproximativ 4 cm n aer i aproximativ 0.07 mm n esuturile biologice, ceea ce face ca utilizarea lor n lucrrile de mutagenez s fie limitat. Razele beta () reprezint un flux de electroni expulzai de nucleele atomice cu o vitez de 10.000-300.000 km/sec, avnd o mas mic i o putere penetrant de circa 200 de ori mai mare ca a razelor alfa. Sursele cele mai cunoscute de raze beta ce pot induce mutaii sunt izotopii radioactivi ai fosforului (32P) sau sulfului (35S). Neutronii sunt particule elementare neutre emise n cursul unor reacii nucleare, n special n reaciile de dezintegrare a nucleului de uraniu i de plutoniu. Fiind lipsii de sarcin electric ei sunt atrai sau respini de electroni sau nuclei materiei prin care trec. In funcie de energia pe care o posed, neutronii pot fi rapizi (cu energii mai mari de 0.5 MeV), cu o vitez medie (avnd o energie care variaz ntre 0.5 MeV i 1 KeV), leni (cu energie cuprins ntre 1 KeV i 1 eV) i termici (cu energie sub 0.1 eV). In urma ciocnirilor cu nucleii atomici ai materiei pe care o strbat, acetia ncep fie s emit protoni (ca n cazul iradierii cu neutroni rapizi), fie pot ptrunde n nucleu, fiind capturai de acesta (ca n cazul iradierii cu neutroni leni sau termici). In ambele situaii, iradierea cu neutroni duce la producerea unui numr de particule ncrcate electric i ioni, care genereaz reacii chimice noi, caracteristice materialelor ionizate. Msurarea radiaiei. Unitatea de msur folosit curent pentru radiaiile ionizante este rad-ul (radiation absorbed dose), care reprezint cantitatea de energie absorbit de 1 gram de materie vie sau nevie. In paralel cu rad-ul (R) este frecvent folosit o alt unitate de msur, respectiv gray-ul (Gy). Cele dou moduri de cuantificare a dozelor de iradiere sunt compatibile, ntruct 1kR (1.000 razi) este echivalentul a 100 Gy. Pentru studiul efectelor radiaiilor asupra organismului uman se folosete rem-ul (rntgen equivalent man). Aceast unitate de msur este o variant a rntgen-ului (r). Un rntgen este egal cu cantitatea de radiaii capabile s produc 2.08 x 109 perechi de ioni

ntr-un cm3 de aer la 0C i la presiunea atmosferic de 760 mm Hg. Cantitatea de radiaii corespunztoare unei uniti rntgen este capabil s provoace ntr-un esut viu formarea unei cantiti de ioni de aproximativ 1.000 de ori mai mare, respectiv 2,08 x 1012. Pentru msurarea radiaiei neutronilor rapizi se folosete ca unitate de msur echivalentul fizic rntgen (e.f.r.), care reprezint energia folosit pentru ionizare, echivalent cu energia absorbit de 1 g de ap iradiat cu 1 r de raze X. Msurarea dozelor de neutroni termici se face direct, prin determinarea cantitii de neutroni cu care este bombardat ntr-o secund o suprafa de 1 cm2 din materialul iradiat (Nt/cm2/s). Radiosensibilitatea organismelor. Rezultatele unui numr foarte mare de lucrri de inducere a mutaiilor au artat n mod concludent c diferitele organisme prezint diferene considerabile n ce privete radiosensibilitatea (Tabel 9). Pentru msurarea radiosensibilitii se folosesc noiunile de doz letal 100 (DL 100) i doz letal 50 (DL 50), care reprezint doza la care, ntr-un interval de 30 zile, mor toi subiecii supui iradierii, sau 50%. Efectele radiaiilor la nivel celular sunt foarte variate, ele determinnd ncetinirea sau blocarea diviziunilor mitotice, pierderea definitiv a capacitii de diviziune nensoit de moartea celulelor (sterilizarea celulelor), moartea celulelor dup mai multe ore de la iradiere (fr ca ele s mai intre n diviziune mitotic) sau, n cazul dozelor foarte mari de radiaii (iradiere acut), moartea instantanee a celulelor. Indiferent de tipul de iradiere, respectiv cronic (de intensitate sczut i durat lung) sau acut (de intensitate mare i durat scurt), cele mai afectate componente ale celulei sunt nucleul i cromozomii, deci materialul genetic.
Tabel 9. Variaia radiosensibilitii la unele organisme vegetale i animale.

Tipul de organisme

Plante

Animale

Om

Specia Lynum ussitatisimum Lycopersicum aesculentum Brassica napus Secale cereale Phaseolus vulgaris Abies alba Paramecium Drosophila melanogaster Salamandr obolan Broasc oarece Cine Homo habilis

DL 50 40.000 - 50.000 30.000 - 40.000 25.000 - 30.000 10.000 - 15.000 8.000 600 - 900 350.000 46.000 3.000 850 700 530 325 450

In general, frecvena mutaiilor crete proporional cu doza de iradiere. De exemplu, la Antirrhinum majus frecvena mutaiilor la 400 R este de 1.24%, iar la doza de 800 R crete pn la 4.41%. In mod similar, la Drosophila melanogaster frecvena mutaiilor letale la o doz integrat de iradiere de 750-770 R este de 2.7%, iar la doza de 9.000 R (9 kR) atinge 18.3%. Efectele Genetice ale Radiaiilor Efectele genetice ale radiaiilor ionizante sunt dependente de doz, debitul dozei, tipul radiaiei, viteza diviziunii celulare (durata ciclului mitotic), numrul i lungimea

cromozomilor, concentraia oxigenului intracelular i extracelular, reversibilitatea leziunilor cromozomiale, eficiena mecanismelor de reparare molecular a ADN. Modificrile structurale ale cromozomilor provocate de aciunea radiaiilor ionizante pot fi corelate sau nu cu mutaii. Acestea constituie ns o surs important de informaii pentru estimarea raportului cantitativ dintre doza de iradiere i daunele produse celulelor supuse iradierii. Restructurrile cromozomiale care se produc sub influena radiaiilor ionizante sunt variate. Astfel, ca urmare a unei singure rupturi cromozomiale apare un fragment acentric, care de obicei are tendina de a se uni cu captul liber al cromozomului care a fost afectat de rupere. Dac prin aceast reunire, care poart denumirea de restituie, secvena normal a genelor nu este alterat, cromozomul va fi normal att structural ct i funcional. Dac ns nainte de reunire fragmentul acentric face o rotaie de 180, cromozomul va fi modificat din punct de vedere structural, n sensul schimbrii ordinii locilor. Acest tip de modificare poart denumirea de inversie terminal sau paracentric. In cazul n care cromozomul sufer dou ruperi, cu producerea a trei segmente, dintre care numai segmentul care poart centromerul i schimb orientarea, modificarea poart denumirea de inversie pericentric. Un alt tip de modificare structural a cromozomilor care se poate produce ca urmare a radiaiilor ionizante este deleia, caz n care ruperea nu este urmat de reunirea fragmentului acentric cu restul cromozomului. Efectele genetice ale deleiei depind de mrimea fragmentului pierdut i de importana genelor situate pe el. Au fost constatate situaii n care fragmentul acentric formeaz un cromozom inelar (circular) prin unirea celor dou capete ale sale, acesta fiind pierdut la urmtoarea diviziune celular ca urmare a lipsei centromerului. Alteori, un astfel de fragment se poate suda la captul unui cromozom neomolog determinnd o translocaie terminal. Prin sudarea fragmentului acentric la cromozomul omolog se produce un alt tip de restructurare intracromozomial denumit duplicaie. In funcie de modificarea sau nu a ordinii genelor nainte de sudur, aceasta poate fi duplicaie n tandem, cnd sudura nu schimb ordinea genelor, sau duplicaie n tandem invers, cnd ordinea iniial a genelor este schimbat ca urmare a rotirii fragmentului acentric nainte de sudur. Duplicaia n tandem invers poate avea efecte genetice majore, ntruct prin efectul de poziie poate fi afectat expresia caracterelor codificate de genele afectate de restructurarea intracromozomial. Duplicaiile au o frecven mai mare dect deleiile, dar spre deosebire de acestea sunt foarte rare cazurile n care au efect letal. In cazul producerii de ruperi simultane n doi cromozomi neomologi poate avea loc schimbul reciproc de fragmente acentrice, acest tip de restructurare intracromozomial fiind denumit translocaie reciproc, care, n general, are o frecven mai mare dect translocaia terminal. Dac fragmentele translocate au centromeri, se vor forma cromozomi dicentrici sau policentrici. Fragmentele acentrice se pot suda i ele, dar vor fi lipsite de viabilitate ca urmare a lipsei centromerului. Adeseori, cromozomii dicentrici sau policentrici formeaz puni n anafaz, acest tip de aberaii cromozomiale determinnd apariia de gamei nefuncionali. Translocaiile reciproce pot fi identificate prin analiza citogenetic n cursul meiozei, deoarece datorit transferului de gene ntre cromozomi neomologi acetia devin parial omologi i formeaz figuri caracteristice, n form de cruce. Este un fapt incontestabil c plantele cu cromozomi mari sunt mai susceptibile la apariia de ruperi ale cromozomilor sau cromatidelor, dect cele cu cromozomi mici, deci au o radiosensibilitate mai ridicat. Se consider ns c aprox. 90-95% dintre rupturile primare se reunesc n configuraia iniial (proces denumit restituie) ntr-un interval cuprins ntre cteva minute i cteva ore. Celelalte rupturi, care nu refac configuraia iniial, pot evolua pe urmtoarele dou ci: (a) pot rmne deschise; (b) se pot suda nelegitim cu capetele rupte ale altor cromozomi, avnd ca rezultat producerea de translocaii.

Aberaiile de primul tip apar ca simple rupturi detectabile n mitoz, iar fragmentele de cromozomi fr centromer se pot pierde, caz n care poate avea loc i o pierdere de informaie genetic. Aberaiile de al doilea tip presupun existena simultan a dou rupturi deschise, aflate n imediata apropiere. Pe baza relaiei ntre frecvena aberaiilor i doza de iradiere s-a ajuns la concluzia c n cazul radiaiilor X i gamma, o singur particul are o probabilitate mic de a produce dou rupturi, fapt care este ns perfect posibil n cazul radiaiilor dens ionizante. Din aceast cauz, n cazul radiaiilor X sau gamma, existena a dou rupturi deschise presupune producerea a dou rupturi independente i de aceea frecvena aberaiilor de acest tip este egal cu produsul frecvenelor celor dou rupturi simple pe care le presupune. Aadar, dac frecvena aberaiilor de primul tip este dependent de doz, frecvena celor de al doilea tip este funcie de ptratul dozei. Pentru a explica apariia unor astfel de aberaii cromozomiale ca urmare a iradierii, exist dou ipoteze: Ipoteza rupturii primare consider c efectul primar al unui agent exogen este o ruptur cromatidic sau cromozomic la nivelul unui cromozom interfazic. Ipoteza presupune c, de obicei, capetele de ruptur se reunesc pentru a restaura configuraia original (restituie), dar pot exista cazuri n care capetele de ruptur pot rmne deschise sau se pot suda cu capetele altei rupturi. Rezultatul unei astfel de fuziuni a capetelor de la diferite rupturi ale cromatidelor duce la realizarea a diferite schimburi cromatidice. Ipoteza schimburilor consider c efectul primar al iradierii nu este o ruptur, ci un alt tip de leziune la nivelul cromozomului, care poate reveni la starea normal sau poate da natere unui schimb. Cnd astfel de leziuni coincid n timp i spaiu cte dou, ele se pot transforma (ntr-un stadiu ulterior al evoluiei cromozomului) n schimb cromatidic. Refacerea cromozomilor. Se consider c leziunile produse de iradierea cu ageni mutageni pot suferi un proces de restructurare spontan, dar aceasta poate fi provocat i de factori fizici, sau de anumite substane cum sunt unii aminoacizi sau proteine, derivai purinici i pirimidinici, nucleoside i nucleotide, diferite enzime, etc. Ipotezele referitoare la mecanismele moleculare ce stau la baza reparrii leziunilor cromozomice sau cromatidice i la reunirea cromozomilor rupi se bazeaz fie pe replicarea ADN ca proces esenial al restaurrii, fie pe implicarea unor proteine (enzime) n refacerea cromozomilor, fie pe ambele procese. In acest sens s-a demonstrat de altfel c o serie de enzime de tipul endonucleazelor, exonucleazelor, polimerazelor, etc., au un rol foarte important n procesul de refacere a cromozomilor afectai de iradiere.

Factori mutageni chimici

Gama substanelor chimice capabile s induc restructurri cromozomiale i mutaii este foarte larg. Deoarece multe dintre aceste substane au asupra cromozomilor efecte similare radiaiilor, provocnd de exemplu ruperi, au primit denumirea de substane radiomimetice. Substanele chimice pot induce aberaii variate de tip cromozomial, cromatidic i subcromatidic. In general, ns, substanele chimice mutagene induc aberaii de tip cromatidic i numai puine substane (ex. 8-etoxicofeina i streptonigrina) produc aberaii de tip cromozomial sau subcromatidic. Agenii chimici care produc rupturi i restructurri cromozomiale sunt clasificai astfel: a) precursori ai ADN i analogi ai bazelor azotate; b) ageni alkilani; a) unele antibiotice; b) ali factori mutageni chimici

Se consider c efectul agenilor mutageni chimici este dependent de durata de contact, concentraia, i nu n ultimul rnd de o serie de factori fizici externi (pH, concentraia O2, temperatura, etc.). Este cunoscut faptul c agenii mutageni chimici afecteaz mai ales interfaza i profaza timpurie. Substanele chimice cu efect n perioadele G1 sau S ale interfazei vor inhiba replicarea cromozomilor prin aciunea lor asupra sintezei de ADN, pe cnd cele cu efect n G2 vor afecta numai formarea cromatidelor libere, ntruct n acest stadiu ADN i cromozomii sunt deja replicai. Unii ageni chimici, cum sunt adenina, 5-fluordeoxiuridina, azaserina, aminopterina, etc., blocheaz sinteza ADN i a precursorilor si. Ali ageni, cum sunt mitomicina-C, actinomicina-D, hidrazida maleic, agenii alkilani, etc., modific proprietile chimice i fizice ale ADN. Se consider c blocarea sintezei unei anumite baze azotate determin probabil apariia unor erori n procesul de mperechere normal a nucleotidelor purinice i a celor pirimidinice n macromolecula de ADN. Cel mai puternic agent mutagen chimic s-a dovedit a fi antibioticul azaserina, care blocheaz sinteza bazelor azotate purinice, acesta fiind, n acelai timp, i un puternic alkilant. O alt categorie de substane chimice cu efect mutagen este aceea care include derivaii halogenai ai benzenului i toluenului, aminopurinele, cafeina, teofilina i teobromina, care inhib citochineza la plante, avnd ca efect inhibarea diviziunii celulare fr a afecta diviziunea cromozomului sau respectiv a nucleului. O categorie distinct de ageni chimici mutageni este aceea a substanelor care acioneaz asupra fusului de diviziune. Inhibarea formrii fusului are ca efect oprirea diviziunii celulei, fr a fi ns afectai cromozomii, care i continu diviziunea n mod normal. Precursori ai ADN i analogi ai bazelor azotate Din aceast grup fac parte un numr relativ mare de substane chimice cu efect de rupere a cromozomilor i care induc mutaii, cum sunt: adenina, dezoxiadenozina, 5-fluordezoxiuridina, 5-bromdezoxiuridina, 5-clordezoxiuridina, 5-iododezoxiuridina, citozina arabinozid, oxipurinele N-metilate (cafeina, 8-etoxicafeina, teobromina, teofilina, acidul 1,3,7,9-tetrametiluric), 5-bromuracilul, 5-cloruracilul, 5-ioduracilul, 5-floruracilul, 2-aminopurina, 2-6-diaminopurina, etc. Ageni alkilani Din grupul agenilor alkilani fac parte numeroase substane chimice mutagene, printre care iperita, dietilsulfatul, epoxizii, -propiolactona, azaserina, etc. Modul de aciune al agenilor alkilani. In general, dei exist mai multe ipoteze privind procesele care duc la apariia aberaiilor cromozomiale, se consider c acestea sunt cel mai probabil rezultatul sensibilitii foarte mari la alkilare a ADN. Agenii alkilani acioneaz numai n perioada S a ciclului mitotic, deoarece n celelalte perioade ADN cromozomial este protejat de alte substane. Sub aciunea agenilor alkilani, ADN este denaturat, devenind monocatenar. Fenomenul de alkilare a ADN continu apoi prin separarea bazelor purinice alkilate de lanul format de zaharuri i radicali fosforici. Ca urmare are loc ruperea lanului polinucleotidic al ADN. Antibiotice cu efect mutagen

Este un fapt bine cunoscut c mitomicina C, un antibiotic produs de ciuperca Streptomyces caespitotus, induce aberaii cromozomiale cu o frecvena apreciabil, att la plante, ct i la animale. Acest antibiotic are un puternic efect inhibitor asupra sintezei de ADN, fr a influena marcant sinteza ARN i a proteinelor. De asemenea, mitomicina C induce degradarea ADN i acioneaz ca un agent alkilant, afectnd preferenial regiunea constriciilor secundare. Ali factori mutageni chimici In aceast categorie de factori mutageni este inclus o multitudine de substane chimice al cror mecanism de aciune asupra acizilor nucleici este foarte variat i n mare msur necunoscut. Printre aceste substane se numr acidul nitros, hidroxilamina, hidrazina, clorura de mangan, peroxidul de hidrogen, unele metale grele, unii alcaloizi, unii colorani (ex. acridin orange), etc. Acidul nitros (HNO2) este unul dintre agenii mutageni al crui efect este cunoscut de foarte mult timp, dar al crui mod de aciune la nivelul acizilor nucleici a fost descoperit abia n urm cu 3 decenii. Acidul nitros este capabil s induc modificri att n macromolecula de ADN, ct i n cea de ARN, mecanismul su molecular de aciune constnd n dezaminarea unor baze azotate, ceea ce determin transformarea adeninei n hipoxantin, a citozinei n uracil i a guaninei n xantin. Mecanismul Molecular al Mutaiilor Printre cauzele care duc la apariia mutaiilor la nivel celular pot fi urmtoarele: modificarea structurii macromoleculei de ADN; b) deleia sau adiia uneia sau mai multor nucleotide n macromolecula de ADN; c) substituia uneia sau mai multor nucleotide n macromolecula de ADN; d) inversia unei secvene de nucleotide din macromolecula de ADN.
a)

Sub influena diverilor factori mutageni se produc erori n procesul de replicaie a acizilor nucleici, care duc la apariia de mutaii. Inlocuirea unei baze purinice n macromolecula de ADN sau ARN cu o alt baz purinic (A G), sau a unei baze pirimidinice cu o alt baz pirimidinic (T C) este denumit tranziie, n timp ce schimbarea unei baze purinice cu o baz pirimidinic sau invers (A T; A C; G T; G C) este denumit transversie. O cauz a unor astfel de erori o constituie existena unor baze azotate sub form tautomeric rar, aprute de exemplu prin schimbarea poziiei unui atom de hidrogen. In mod normal, adenina se mperecheaz n lanul polinucleotidic cu timina, ns forma tautomeric a adeninei se poate mperechea cu citozina, adic A-T devine A-C. innd seama c citozina are afinitate chimic pentru guanin, la replicaia urmtoare a macromoleculei de ADN, legtura A-C se transform n G-C. Aceasta nseamn n fapt c perechea de baze azotate A-T este nlocuit de perechea de baze G-C, fiind astfel modificat informaia genetic prin mutaie. Erorile de includere a unor nucleotide n macromolecula de ADN i erorile de replicaie a ADN constituie, la nivel molecular, mecanismele de baz care realizeaz modificarea informaiei genetice i respectiv apariia procesului mutaional. Cercetrile privind mecanismul molecular al procesului de mutagenez au artat aadar c factorii mutageni acioneaz, de obicei, la nivelul acizilor nucleici, determinnd consecine genetice importante. Modul de aciune al agenilor mutageni este foarte variat,

acetia provocnd diferite modificri, cum sunt nlocuirea unor nucleotide, adiia sau deleia de nucleotide, rupturi sau chiar depolimerizri ale macromoleculei de ADN, etc. O parte dintre aceste modificri se stabilizeaz n procesul replicaiei acizilor nucleici, fapt ce determin modificri structurale n macromoleculele de ADN i ARN. Ca urmare, apar modificri ale informaiei genetice i respectiv ale procesului de biosintez a proteinelor. Mutaiile la nivelul macromoleculelor de ADN nu sunt ntotdeauna reflectate n schimbri ale secvenei aminoacizilor, din cauza codului genetic degenerat. De exemplu, codonii UAU i UAC codific acelai aminoacid, i anume tirozina. Ca urmare, schimbarea nucleotidei ce conine uracil (U) cu o nucleotid ce conine citozin (C) n poziia a treia a codonului nu are ca efect substituirea (nlocuirea) aminoacidului respectiv. Dintre cei 64 de codoni, un numr de 3 (UAA, UAG, UGA) servesc pentru marcarea terminrii secvenei de aminoacizi a unei catene polipeptidice. O mutaie a acestor 3 codoni nu are efecte asupra secvenei de aminoacizi i ca urmare o astfel de mutaie a fost denumit mutaie nonsens. Dac ns are loc o mutaie care determin transformarea ntr-un codon terminal a unuia dintre ceilali 61 de codoni, aceasta poate avea ca efect ncheierea prematur a secvenei de aminoacizi i deci formarea unei catene polipeptidice mai scurte. Mutaiile care afecteaz unul dintre cei 61 de codoni i determin de obicei nlocuirea unui aminoacid cu altul, se numesc mutaii cu sens greit. Datorit fenomenului colinearitii, mutaia unui codon dintr-o anumit poziie din secvena de nucleotide are ca rezultat nlocuirea unui aminoacid cu altul n poziia corespunztoare din catena polipeptidic. Mutaiile care afecteaz codonii, dar care nu duc la nlocuirea unui aminoacid cu altul, se mai numesc mutaii sinonime sau mutaii neutre.

Amplificarea genic
Este un fapt demonstrat c sub aciunea unor factori de stres se poate produce replicarea independent a anumitor secvene de ADN, denumit amplificare genic. Aceasta se poate realiza pe ci variate, cum sunt poliploidizarea (inclusiv endopoliploidia i politenia), eliminarea ADN sau a unor cromozomi, diferenierea replicrii ADN prin amplificare i subreplicare, restructurarea unor segmente de ADN (n special prin aciunea transpozonilor), restructurarea unor cromozomi, etc. Unitile de amplificare genic, adic orice secven de nucleotide implicat n amplificarea genic i care devine amplificat (ADN repetitiv), au primit denumirea de ampliconi. Se consider c fenomenul de amplificare genic are un rol important n procesul diferenierii celulare, n primul rnd prin afectarea reglajului genetic al funcionrii genelor. Recent s-a demonstrat c stresul este n egal msur un fenomen perturbator al replicaiei ADN i un factor declanator al amplificrii genice. Este relevant n acest sens constatarea c prezena unor toxine n culturile de celule determin (ca rezultat al unui proces de selecie) amplificarea unor secvene de ADN. Producerea amplificrii genice n condiii de stress este probabil i explicaia pentru apariia rezistenei la diveri ageni (de exemplu, methotrexatul) n culturile de celule animale i umane. Existena fenomenului de amplificare genic constituie o dovad concludent a plasticitii permanente a genomului. Cunoaterea mecanismelor amplificrii genice poate contribui ntr-o msur important la apariia unor strategii noi de ameliorare prin manipularea in vitro a genomului, de exemplu pentru inducerea rezistenei la factorii abiotici de stress.

ELEMENTE GENETICE TRANSPOZABILE

In genomul multor specii vegetale i animale sunt prezente copii multiple ale unor secvene de ADN care au capacitatea de a-i schimba poziia dintr-un locus n altul. Intruct aceste secvene de ADN pot fi integrate n noul locus n cadrul genomului prin alte mecanisme dect omologia secvenelor de nucleotide, se consider c ele pot determina recombinarea genetic nelegitim, pot cauza mutaii, modificri n reglajul genetic al unor gene, activarea sau inactivarea unor gene i a celor adiacente locusului de integrare, restructurri cromozomiale (deleii, duplicaii, inversii, translocaii). Ca urmare a mobilitii lor, transpozonii sunt considerai responsabili pentru o parte considerabil a evenimentelor mutaionale i capabili s regleze simultan activitatea unor gene independente, acionnd n momente diferite ale dezvoltrii. La baza descoperirii de ctre Barbara McClintock (1940) a elementelor genetice mobile sau transpozabile a stat fenomenul de instabilitate somatic observat la porumb, caracterizat prin apariia de mozaicuri de culoare pe frunze, tulpini, inflorescene i endospermul boabelor. Pentru explicarea fenomenului mai sus menionat, McClintock a emis ipoteza existenei anumitor elemente de control care au capacitatea de a circula dintr-o regiune n alta a genomului i se pot insera n diferite locusuri determinnd mutaii ale genelor i chiar restructurri ale cromozomilor. Aceste elemente au fost iniial considerate gene sritoare (jumping genes) i ulterior au primit denumirea de elemente genetice transpozabile sau transpozoni. Elementele genetice transpozabile sunt secvene ale macromoleculei de ADN avnd capacitatea de a se deplasa n genom dintr-o poziie (locus) n alta, independent de gradul de omologie a acestora. Existena transpozonilor a fost demonstrat att la eucariote ct i la procariote, dimensiunea lor fiind ns extrem de variabil (ntre 750 i 40.000 pb). Pn n prezent au fost bine descrise patru categorii de transpozoni: 1) elemente de control, din care au fost deja descoperite 8 familii; 2) elemente de tip retroviral; 3) Mu (abreviere pentru mutator); 4) inserii biologic necaracterizate, cu structur similar transpozonilor. Elementele de control pot fi la rndul lor grupate n dou clase: prima include elementele autonome, care conin toat informaia necesar pentru propria lor transpoziie, dar a cror activitate (n ciuda autonomiei) poate fi afectat att de fondul genotipic ct i de factorii de mediu; a doua clas conine elementele neautonome, care pot fi mobilizate doar n prezena (oriunde n genom) unui element activ nrudit. Astfel, fragmentul inactiv, mobilizat, i activatorul formeaz un sistem dublu-element. Cel mai bine cunoscut sistem de acest fel este Ac-Ds. Majoritatea elementelor Ds sunt considerate a fi elemente Ac degenerate, n sensul c sunt nrudite cu elementele active Ac, dar au suferit mutaii i/sau deleii care le-au inactivat funcia de transpoziie. Totui, multe elemente Ds sunt omologe cu elementele active Ac doar n secvenele terminale repetate, care sunt inte necesare n procesul de transpoziie. Astfel, un membru neautonom al unei familii dublu-element poate fi construit din segmente terminale adecvate care definesc capetele fragmentelor de

mobilizat, separate de orice secven. Limita superioar de mrime a segmentelor ADN care pot fi mobilizate de transpozoni nu a fost nc determinat, dar se apreciaz c mrimea acestora poate fi de ordinul sutelor de kb. Secvena de baze pentru integrare pare s fie n mod esenial randomizat, dar relaia dintre situsul de origine al elementului i situsul n care se transpozeaz nu este n mod necesar randomizat. Astfel, Ac se deplaseaz mult mai frecvent n poziii apropiate celei de origine, dect n poziii ndeprtate i rareori se transpozeaz ntre cromozomi. Ac este n mod obinuit prezent n genom ntr-un numr redus de copii, aa nct este relativ simplu de urmrit transpoziia, att n termeni genetici ct i moleculari. In fapt, frecvena de transpoziie este cu att mai redus cu ct numrul de copii ale Ac este mai ridicat. In mod contrastant, Mu pare s se deplaseze randomizat n interiorul genomului, fr a fi limitat la transpoziii scurte. Fagul Mu este capabil s se insereze n diverse locusuri n cromozomul bacterian, provocnd o gam larg de mutaii diferite. Ulterior s-a descoperit c acesta este de fapt un transpozon, care poate s existe i sub forma unui virus temperat. Capacitatea de replicare a fagului Mu este asociat cu cea de transpoziie, ceea ce poate determina o serie remarcabil de rearanjamente cromozomiale, cum sunt fuziunea ntre dou molecule separate i autoreplicabile independent (repliconi), deleia unor secvene de nucleotide, inversia unor astfel de secvene, etc. Se afirm c transpoziia poate avea sau nu efecte detectabile, ns inseria unui element genetic transpozabil ntr-o secven de codificare determin cu mare probabilitate inactivarea genei respective. Totodat, s-a sugerat c excizia imprecis a transpozonilor poate genera rearanjamente (deleii, inversii) ale secvenelor cromozomale adiacente. Transpozonii difer n mrime i omologia de ansamblu, dar au ca trstur comun aceeai secven de flancare, format din 11 pb invers repetate (Figura 6.2 ). Dou dintre tipurile cele mai frecvente de transpozoni sunt cele notate Ac i Ds. Se pare c tipul Ds, care cuprinde subtipurile a, b i c cu mrimi cuprinse ntre 0.4 i 4 kb, provine prin deleii ale tipului Ac cu o mrime de 4.5 kb (Figura 6.2).
Ac

Transpozaza

Gena 2
TTTCATCCCTG AAAGTAGGGAC

TAGGGATGAAA ATCCCTACTTT Regiunedeletat laDsa

Dsa
TAGGGATGAAA ATCCCTACTTT RegiunedeletatlaDsb TTTCATCCCTG AAAGTAGGGAC

Dsb

TAGGGATGAAA ATCCCTACTTT
Dsc

TTTCATCCCTG AAAGTAGGGAC

TAGGGATGAAA ATCCCTACTTT

TTTCATCCCTG AAAGTAGGGAC

Cei mai simpli transpozoni sunt cei descoperii la bacterii i cunoscui acum sub denumirea de secvene de inserie sau elemente IS. Similar elementelor transpozabile de la eucariote, aceti transpozoni mici posed secvenele invers repetate la capetele lor i codific propria transpozaz (proteina enzim necesar pentru producerea exciziei i realizarea transpoziiei); transpozonii bacterieni codific de asemenea una sau mai multe proteine implicate n reglarea ratei transpoziiei. Structura molecular a unei secvene de inserie este prezentat n Figura 6.3. Transpozonii compleci au dimensiuni mai mari, deoarece pe lng genele necesare transpoziiei conin i una sau mai multe gene mobile transpozabile, cum ar fi gene pentru rezistena la antibiotice, toxine, etc. Ca structur, un transpozon complex include un segment de ADN mai mare, avnd la extremiti cte un transpozon simplu (IS), iar n partea central gena sau genele ce sunt transpozate (Figura 6.4).
IS1

Figura 6.2 Structura molecular a unor elemente genetice mobile de la Zea mays (tipurile Ds-a, Ds-b, Ds-c au aprut prin deleii ale transpozonului Ac)

IR

Gena transpozazei

IR

24pb

24pb 720pb

Tn1681 IR

IR
IS1

Gena transpozata

IR

IR
IS1

Figura 6.3 Structura molecular a unui transpozon simplu (sus) i a unui transpozon complex (jos).

Transpozonii sunt n mod obinuit desemnai prin abrevierea Tn urmat de un numr (de exemplu Tn5). Cnd trebuie s se fac referire la genele purtate de un astfel de element, se folosete i abrevierea pentru acestea. De exemplu Tn5(neo-r ble-r str-r) conine genele pentru rezistena la trei antibiotice diferite: neomicin (kanamicin), bleomicin i streptomicin (Figura 6.4). Aceste gene reprezint markeri, care fac uoar detectarea transpoziiei unui element complex.

IS50L

IS50R

NeorBler Strr

Figura 6.4 Structura molecular a transpozonului Tn5 (dup Hartl i Jones., 1998).

La Escherichia coli sunt cunoscui mai muli transpozoni compleci, cum sunt Tn3, Tn5, Tn10, etc. De exemplu, transpozonul Tn3 este constituit dintr-un segment de ADN de 4.957 pb, care are n partea central gena pentru rezistena la ampicilin, iar transpozonul Tn10 are o mrime de 9.300 pb i posed gena pentru rezistena la tetraciclin. Exist i transpozoni compleci mai mari, cum este transpozonul Tn2571, care are o mrime de 23.000 pb i posed concomitent mai multe gene de rezisten (la streptomicin, cloramfenicol, sulfonamide, etc.). Dei existena lor nu a fost dovedit pn n prezent dect la un numr restrns de specii, se apreciaz c elementele genetice transpozabile sunt ubiquitare n natur i c acioneaz ca reglatori ai activitii genelor. Un singur element transpozabil este capabil s regleze simultan activitatea unor gene independente, acionnd n momente diferite ale dezvoltrii. Prin inserie, elementele transpozabile cauzeaz duplicarea a 6-8 pb care par s rmn ca o amprent genetic dup excizia acestora. In virtutea mobilitii lor, elementele transpozabile pot inactiva gene structurale, altera reglarea genic, reactiva (posibil) gene silenioase i genera duplicaii i rearanjamente cromozomale. Dei mutaiile induse de multe elemente transpozabile sunt n fapt instabile genetic, n egal msur ele pot produce mutante stabile. Prin urmare, elementele genetice transpozabile sunt recunoscute n prezent ca o for major n modelarea structurii genomului i totodat sunt considerate ca fiind responsabile pentru o parte considerabil a evenimentelor mutaionale. Tipuri de Transpoziie De regul, transpozonii pot migra i se pot insera n orice locus din genom, dei uneori prefer s se insereze n anumite secvene de nucleotide. S-a demonstrat existena a trei moduri distincte de realizare a transpoziiei elementelor transpozabile: 1) transpoziie simpl; 2) transpoziie replicativ; 3) retrotranspoziie. Prin transpoziia simpl are loc migrarea unui element genetic transpozabil ntr-un alt locus din genom, determinnd astfel apariia unui gol (gap) n vechiul loc de inserie. Inseria sa n noul locus are ca rezultat inducerea unor restructurri cromozomiale, inactivarea unei gene sau a genelor adiacente, mutaii, etc. Transpoziia replicativ se realizeaz prin replicarea transpozonului, urmat de migrarea copiei sale ntr-un alt locus. Spre deosebire de transpoziia simpl, acest tip de transpoziie nseamn o mrire a numrului de copii ale transpozonului respectiv per genom. Retrotranspoziia se realizeaz prin transcripia transpozonului n ADN, urmat de migraia n noul locus, unde cu ajutorul enzimei revers-transcriptaza se produce transcripia invers n ADN. Sub aceast form, retrotranspozonii sunt inserai n noul locus printr-un proces de recombinare. Un exemplu de retrotranspozon este Ty de la Saccharomyces cerevisiae, care se pare c este nrudit cu retrovirusurile care au genom ARN, cum este cazul virusului imunodeficienei umane (HIV). De regul, mobilitatea transpozonilor este determinat de condiii de stres (de exemplu iradierea cu radiaii ionizante sau neionizante, ocuri de temperatur, aciunea unor ageni chimici mutageni, etc.), iar inserarea lor n genom se realizeaz probabilistic. Intruct elementele genetice transpozabile pot fi integrate n noul locus n cadrul genomului prin alte mecanisme dect omologia secvenelor de nucleotide, ele pot determina recombinarea genetic nelegitim, pot cauza mutaii, modificri n reglajul genetic al unor gene, activarea sau inactivarea unor gene i a celor adiacente locusului de integrare, restructurri cromozomiale (deleii, duplicaii, inversii, translocaii).

GENETICA POPULAIILOR Genetica populaiilor se ocup cu studiul distribuiei i schimbrii (modificrii) frecvenei alelelor sub influena celor patru fore implicate n procesul evoluiei: selecia natural, driftul genetic, mutaia i fluxul de gene. Genetica populaiilor ia de asemenea n considerare subdivizarea populaiei i structura populaiei n spaiu. In primul rnd, se ncearc explicarea unor fenomene cum sunt adaptarea i speciaia. Genetica populaiilor a devenit o component esenial a teoriei moderne a evoluiei, fondatorii ei fiind Sewall Wright, J.B.S. Haldane i R.A. Fisher, care au pus de asemenea i bazele unei discipline nrudite genetica cantitativ. Scopul teoretic al geneticii populaiilor este cel definit de Lewontin n anul 1974. El i-a imaginat dou spaii: un spaiu genotipic i un spaiu fenotipic. Misiunea unei teorii complete a geneticii populaiilor este aceea de a pune la dispoziie un set de legi care ofer posibilitatea elaborrii unei hri predictibile a genotipurilor unei populaii (G1) corespunztoare unui spaiu fenotipic (P1), n care are loc selecia, i a unui alt set de legi ce permite cartarea populaiei care rezult (P2) n funcie de spaiul genotipic (G2), n care genetica Mendelian poate prezice genotipurile urmtoarei generaii, completnd astfel ciclul. Exprimarea ntr-o formul matematic a acestui ciclu este urmtoarea (dup Lewontin, 1974):

unde T1 reprezint legile genetice i epigenetice, aspectele biologiei funcionale sau ale dezvoltrii, care transform un genotip ntr-un fenotip. In continuare ne vom referi la aceasta sub formularea harta genotip - fenotip. T2 este transformarea datorat seleciei naturale, T3 sunt relaiile epigenetice care prezic genotipurile pe baza fenotipurilor selectate i, n sfrit, T4 legile geneticii Mendeliene. Frecvena alelelor este o msur a frecvenei relative a unei alele la un locus ntr-o populaie. In mod obinuit este exprimat ca o proporie sau ca un procentaj. In genetica populaiilor, frecvenele alelelor arat diversitatea genetic a populaiei unei specii sau, echivalent, bogia ansamblului de gene. Frecvena alelelor este definit dup cum urmeaz: Date fiind urmtoarele: 1. un locus particular pe cromozom i o gen ocupnd acel locus 2. o populaie de indivizi purttori ai n loci n fiecare dintre celulele lor somatice (de exemplu doi loci n celulele unei specii diploide, care conin dou seturi de cromozomi) 3. o variant sau alel a unei gene, atunci frecvena alelelor este fracia sau procentajul de loci pe care le ocup alelele n cadrul populaiei. Genetica populaiilor studiaz diferitele fore ce pot s conduc la modificri ale distribuiei frecvenelor alelelor, cu alte cuvinte, la evoluie. Pe lng selecie, aceste fore sunt reprezentate de driftul genetic, mutaie i fluxul de gene (sau migraie).

Efectul mutaiei S considerm rata de mutaie a alelei A la o alel a (probabilitatea ca o copie a genei A s devin a n cursul replicrii ADN ce precede meioza). Dac pt este frecvena

alelei A n generaia t, dac qt = 1 pt este frecvena alelei a n generaia t, i dac nu exist alte cauze ale modificrii frecvenei genei (de exemplu, nu acioneaz selecia natural), atunci schimbarea n frecvena alelei ntr-o generaie este:

unde pt 1 este frecvena la generaia anterioar. Aceasta ne spune c frecvena lui A descrete (i frecvena lui a crete) cu o msur ce este proporional cu rata de mutaie i cu proporia p a tuturor genelor care sunt nc disponibile pentru mutaii. Astfel, p devine mai mic pe msur ce frecvena lui p nsi descrete, deoarece sunt din ce n ce mai puine alele A care pot fi transformate prin mutaie n alele a. Putem s aproximm c dup n generaii de mutaie,

Selecia natural este procesul prin care organismele individuale cu caractere favorabile au o probabilitate mai ridicat de a supravieui i reproduce dect cele cu caractere nefavorabile. Selecia natural acioneaz asupra individului ca ntreg, dar numai componenta ereditar va fi trecut la descendeni, rezultatul fiind acela c caracterele favorabile, ereditare, vor deveni mai comune n generaia urmtoare. Dup o perioad lung de timp, acest proces pasiv d natere la adaptri i duce la speciaie. Un exemplu binecunoscut de selecie natural n aciune este acela al dezvoltrii rezistenei la antibiotice de ctre microorganisme. Antibioticele au fost folosite pentru a lupta mpotriva bolilor bacteriene nc de la descoperirea penicilinei, n anul 1928, de ctre Alexander Fleming. Totui, folosirea larg i mai ales greit a antibioticelor a condus la creterea rezistenei bacteriilor fa de antibiotice, pn la situaia n care Staphylococcus aureus rezistent la meticilin a fost descris ca un superduntor din cauza pericolului pentru sntate i a relativei sale invulnerabiliti fa de medicamentele existente. Populaiile bacteriene naturale conin, printre indivizii al cror numr este incalculabil, o variaie considerabil la nivelul materialului lor genetic, n primul rnd datorit mutaiilor. Atunci cnd sunt expuse la antibiotice, majoritatea bacteriilor mor rapid, dar unele pot s posede mutaii care le fac mai puin susceptibile. Dac expunerea la antibiotic este scurt, aceti indivizi vor supravieui tratamentului. Aceast eliminare a indivizilor neadaptai sau slab adaptai dintr-o populaie este un exemplu concludent de selecie natural n aciune. Bacteriile care supravieuiesc se vor reproduce n continuare producnd urmtoarea generaie. Datorit eliminrii indivizilor neadaptai din generaia trecut, aceast populaie conine mai mult bacterii care au o anumit rezisten fa de antibiotic. In acelai timp, se produc mutaii noi, adugnd variaie genetic n plus la cea existent. Mutaiile spontane sunt foarte rare, foarte puine au vreun efect i de regul orice efect (dac exist) este negativ (nefavorabil). Totui, populaiile de bacterii sunt enorme i se ntmpl ca un numr mic de celule bacteriene s dobndeasc mutaii benefice. Dac o mutaie nou reduce susceptibilitatea unor bacterii la un antibiotic, ele vor avea o probabilitate mult mai mare de supravieuire cnd vor fi confruntate cu un antibiotic. Dup o perioad de timp suficient de lung i expuneri repetate la antibiotic, va apare o populaie de bacterii rezistente la respectivul antibiotic. Recent au aprut cteva tulpini noi de Staphylococcus aureus care sunt rezistente la vancomicin i teicoplanin. Ecesta este un exemplu de ceea ce se numete cursa narmrii, n care bacteria continu s formeze tulpini care sunt mai puin susceptibile la antibiotic, n timp ce cercetarea medical continu s dezvolte noi antibiotice care le pot omor. O situaie similar este aceea a rezistenei pe care o dezvolt insectele la pesticidele folosite pentru protecia plantelor de cultur.

Selecia natural acioneaz asupra fenotipului. Fenotipul este rezultatul de ansamblu al constituiei genetice a unui individ (genotip), mediului, i a interaciunilor dintre gene i dintre gene i mediu. Adesea, selecia natural acioneaz asupra caracterelor specifice ale unui individ. Unele caractere sunt determinate de o singur gen, dar majoritatea sunt determinate i influenate n exprimare de mai multe gene diferite. Variaia are n cazul majoritii acestor gene efecte slabe asupra fenotipului. Elementul cheie n nelegerea seleciei naturale este conceptul de adecvare la condiiile de via (mediu). Selecia natural acioneaz asupra indivizilor, dar efectul su mediu asupra tuturor indivizilor cu un genotip particular este adecvarea acelui genotip. Adecvarea este msurat ca proporia descendenei care supravieuiete, multiplicat cu media fecunditii, i este echivalentul pentru succesul reproductiv al genotipului. O valoare a adecvrii mai nalt de 1 indic c frecvena acelui genotip crete n populaie, n timp ce o valoare mai mic de 1 indic c aceasta scade. Adecvarea relativ a genotipului este estimat ca proporia adecvrii unui genotip de referin. Coeficientul de selecie este o msur a adecvrii relative, reprezentnd diferena dintre adecvarea relativ a dou genotipuri. Cu ct coeficientul de selecie este mai mare, cu att selecia natural va aciona mai puternic mpotriva genotipului cu cea mai sczut adecvare. Selecia natural se produce n fiecare stadiu de via al unui individ (Figura *) i ea poate afecta n oricare dintre aceste stadii posibilitatea ca un individ s supravieuiasc i s se reproduc. Dup natere, un individ trebuie s supravieuiasc pn la vrsta adult nainte de a se putea reproduce, i selecia celor care ating acest stadiu este denumit selecia pentru viabilitate. La multe specii, adulii trebuie s concureze unii cu alii pentru mperechere (selecia sexual), i succesul n aceast competiie asigur participarea la formarea urmtoarei generaii. Cnd speciile se reproduc mai mult de o dat, o supravieuire mai lung n etapa de reproducere are ca rezultat creterea numrului de descendeni (selecia pentru supravieuire). Fecunditatea femelelor (de exemplu, cte ou depune o pasre) i a masculilor (de exemplu, sperma gigantic la anumite specii de Drosophila) poate fi limitat (selecia pentru fecunditate). Viabilitatea gameilor produi poate s difere, n timp ce conflictul intragenomic dintre gameii haploizi poate avea ca rezultat selecia gametic sau selecia genic. In sfrit, unele combinaii ale gameilor pot fi mai compatibile dect altele (selecia dup compatibilitate). Selecia are ca inte caractere specifice ale individului, i dac un astfel caracter are o component ereditar se constat tendina ca el s devin mai comun n urmtoarea generaie. Formele sub care se poate manifesta selecia pentru caracterele specifice pot fi considerate ca selecia pentru i selecia de. Selecia pentru se refer la caracterele int ale seleciei, respectiv la cauzele seleciei, pe cnd selecia de se refer la efectele sale. Selecia pentru un caracter specific determin prin urmare selecia anumitor indivizi. Selecia pentru un caracter specific poate s aib de asemenea ca rezultat selecia indirect a altor caractere. Aceasta se poate ntmpla cnd dou sau mai multe caractere sunt legate genetic prin mecanisme cum sunt pleiotropia (o singur gen afecteaz caractere multiple) i dezechilibrul de linkage (asocierea nerandomizat a dou gene). Teoria genetic a seleciei naturale Selecia natural este un concept simplu, n care diferenele de adecvare dintre fenotipuri joac un rol crucial. Totui, puterea explicatorie a seleciei naturale vine din interpretarea mecanismului seleciei pe baza suportului su genetic. Direcionarea seleciei

Cnd o component a unui caracter este ereditar, selecia va altera frecvenele diferitelor alele (variante ale genei) implicate. Selecia poate fi divizat n trei clase, pe baza efectului asupra frecvenei alelelor. Selecia pozitiv sau direcional apare cnd o anumit alel are o adecvare mai mare dect celelalte, determinnd o cretere a frecvenei acelei alele pn la adecvarea total la mediu, ceea ce face ca ntreaga populaie s exprime fenotipul adecvat. Mult mai comun este selecia stabilizatoare sau purificatoare, care scade frecvena alelelor care au efecte nefavorabile asupra fenotipului (ceea ce ar nsemna o mai slab adecvare), pn la eliminarea lor din populaie. Selecia purificatoare determin conservarea peste timp a trsturilor genetice funcionale (de exemplu, secvene de codificare a proteinelor sau secvene reglatoare) datorit presiunii asupra variantelor duntoare (negative). In sfrit, exist un numr de forme de selecie de echilibrare, care nu determin adecvarea total dar permit meninerea unei alele la frecvene intermediare ntr-o populaie. Aceasta poate s apar la speciile diploide cnd indivizii cu o combinaie de dou alele diferite ntr-un locus de pe cromozom (heterozigoi) au o adecvare mai ridicat dect indivizii care au dou alele identice (homozigoi). Aceasta se numete avantajul heterozigoiei asupra supradominanei. Meninerea variaiei alelice poate s apar de asemenea prin selecia disruptiv sau diversificatoare, care favorizeaz genotipurile care se abat (deprteaz) de la medie n orice direcie, i poate determina o distribuie bimodal a valorilor caracterului. In sfrit, poate s apar prin selecia dependent de frecven, n cazul creia adecvarea unui fenotip particular depinde de distribuia n populaie a celorlalte fenotipuri. Selecia i variaia genetic O parte din ntreaga variaie genetic este neutr din punct de vedere funcional; de exemplu, ea nu produce efecte fenotipice sau diferene semnificative n adecvare. Anterior se considera c partea cea mai mare a variaiei genetice este coninut n ADN necodificator, dar studii recente au artat c pri largi ale secvenelor care l alctuiesc sunt nalt conservate i aflate sub aciunea puternic a seleciei purificatoare; de exemplu ele nu variaz prea mult de la un individ la altul, indicnd c mutaiile n aceste regiuni au consecine negative. Cnd variaia genetic nu determin diferene de adecvare, selecia nu poate afecta direct frecvena acesteia. Inlnuirea genelor condiioneaz ntr-o msur important rezultatul seleciei, n special cnd sunt implicate gene plasate foarte aproape pe cromozom. n cursul formrii gameilor, recombinarea materialului genetic determin regruparea alelelor. Totui, ansa ca o astfel de regrupare s aib loc ntre dou alele depinde de distana dintre acele alele; cu ct sunt mai aproape una de alta, cu att este mai puin probabil ca s se produc regruparea. In consecin, cnd selecia intete o alel, aceasta va determina automat i selecia celeilalte alele; prin acest mecanism, selecia poate avea o puternic influen asupra modelelor de variaie n genom. Echilibrul mutaie selecie Selecia natural determin reducerea variaiei genetice prin eliminarea indivizilor neadaptai i, prin aceasta, a mutaiilor care cauzeaz inadaptarea. Totodat, se produc mutaii noi, determinnd un echilibru ntre mutaii i selecie. Rezultatul exact al celor dou procese depinde att de rata cu care se produc mutaii noi ct i de tria seleciei naturale. In consecin, modificri ale ratei mutaiilor sau presiunii de selecie vor determina schimbarea echilibrului mutaii - selecie.

Deriva genetic (driftul genetic) Deriva genetic este termenul folosit n genetica populaiilor pentru a face referire la deriva statistic n timp a frecvenei alelelor ntr-o populaie finit datorit efectelor de selecie ntmpltoare n formarea generaiilor succesive. Intr-un sens mai ngust, deriva genetic se refer la dinamica ateptat a alelelor neutre n populaie (acelea care nu au nici efect pozitiv, nici efect negativ asupra adecvrii) care pot ajunge la o frecven de 100% n absena mecanismelor ce afecteaz distribuia lor. In timp ce selecia natural descrie tendina alelelor benefice de a deveni mai comune cu trecerea timpului (i a celor detrimentale de a deveni mai puin comune), deriva genetic se refer la tendina fundamental a oricrei alele de a varia ntmpltor ca frecven n timp. Deriva genetic poate fi modelat ca un proces stochastic care ia natere ca urmare a seleciei ntmpltoare n producerea descendenilor. Genele fiecrei noi generaii nu sunt simple copii ale genelor indivizilor din generaia anterioar care au avut succes n reproducere, ci mai degrab o selecie, care include unele erori statistice. Deriva este efectul cumulativ n timp al acestei erori de selecie asupra frecvenei alelelor n populaie. Prin definiie, deriva genetic nu are o direcie preferat. O alel neutr poate s creasc sau s scad ca frecven n orice generaie dat cu aceeai probabilitate (probabilitate egal). Totui, dac timpul este suficient de lung, alela (aa cum prezice analiza matematic a derivei genetice) fie va disprea, fie va deveni 100% prezent n populaie, dup care nu mai exist variaie a frecvenei genei respective. Din acest punct de vedere, deriva genetic tinde s elimine n timp din populaie variantele genei, astfel nct toi indivizii speciei vor deveni eventual homozigoi pentru aceast gen. Deriva genetic este aadar opus fenomenului mutaional, prin care, n populaie, sunt introduse noi variante (mutaii ntmpltoare). Ca i selecia, deriva genetic acioneaz asupra populaiilor, alternd frecvena alelelor i predominana caracterelor. Deriva este observat cel mai puternic n populaiile mici i determin modificri care nu trebuie s fie n mod necesar adaptative. Frecvena alelelor Cnd alelele unei gene nu difer n ceea ce privete adecvarea, numrul de purttori dintr-o generaie este n medie proporional cu numrul de purttori din generaia anterioar. Dar media nu este niciodat concordant, deoarece fiecare generaie reprezint ascendena pentru urmtoarea o singur dat. De aceea, frecvena unei alele difer adesea la descenden de frecvena sa la generaia parental. In generaia descendenilor, alela ar putea prin urmare s aib o frecven p, uor diferit de p. In aceast situaie, se spune c frecvenele alelelor au suferit o deriv (drift). Trebuie menionat faptul c n generaiile urmtoare frecvena alelei nu va fi determinat de noua frecven p, ceea ce nseamn c driftul este un proces fr memorie. Tria efectului de deriv genetic este guvernat de mrimea populaiei efective. Cnd mrimea populaiei efective este mic, driftul genetic va fi mai puternic. Alele n deriv au de obicei o durat de via finit. Deriva se ncheie atunci cnd alelele fie ating o frecven zero i dispar din populaie, fie ating frecvena de 100% i devin alele unice n populaie. Ulterior unui astfel de eveniment, frecvena alelelor se poate schimba doar prin introducerea sau apariia unei noi alele, rezultat dintr-o nou mutaie. Durata de via a unei alele este guvernat de mrimea efectiv a populaiei. Intr-o populaie foarte mic, vor fi necesare doar cteva generaii pn la stabilizarea derivei genetice. Intr-o populaie mare, stabilizarea va avea loc dup mult mai multe generaii. In medie, o alel va fi fixat n 4Ne generaii, unde Ne este mrimea efectiv a populaiei.

Conform principiului Hardy-Weinberg, care susine c frecvenele genelor ntr-o populaie de gene nu se schimb peste timp, o populaie trebuie s fie suficient de larg pentru a preveni ca deriva genetic s schimbe frecvenele alelelor n timp. Aa se explic de ce legea este instabil ntr-o populaie mic. Driftul genetic i selecia natural acioneaz rar separat, ambele fore fiind active ntr-o populaie. Totui, gradul n care alelele sunt afectate de deriva genetic i selecie variaz dependent de mprejurare. Intr-o populaie mare, n care deriva genetic apare foarte ncet, chiar i o selecie slab asupra unei alele va mpinge frecvena sa n sus sau n jos (dependent de faptul dac alela este favorabil sau duntoare). Totui, dac populaia este foarte mic, deriva genetic va predomina. In acest caz, efectele selective mici pot s nu fie vizibile n nici o msur, ntruct micile schimbri ale frecvenei care s-ar produce ar fi mascate de deriva genetic. Calcularea frecvenei alelelor pornind de la frecvena genotipurilor Dac f(AA), f(Aa), i f(aa) sunt frecvenele celor trei genotipuri la un locus cu dou alele, atunci frecvena p a alelei A i frecvena q a alelei a poate fi obinut prin numrarea alelelor. Deoarece fiecare homozigot AA const numai din alele A, i deoarece jumtate dintre alelele fiecrui heterozigot Aa sunt alele A, frecvena total p a alelelor A n populaie se calculeaz ca:

frecvena lui A In mod similar, frecvena q a alelei a este dat de:

frecvena lui a Ar fi de ateptat ca suma lui p i q s fie 1, ntruct ele sunt frecvenele singurelor dou alele prezente. Intr-adevr, suma lor este 1:

i din aceasta obinem: q = 1 p i p = 1 q Dac exist mai mult de dou forme alelice diferite, frecvena fiecrei alele este simplu frecvena homozigoilor plus jumtate din suma frecvenelor tuturor heterozigoilor n care apar. Este interesant de remarcat c frecvena alelei poate fi ntotdeauna calculat pornind de la frecvena genotipului. Reciproca, totui, cere ntrunirea condiiei mperecherii (polenizrii, n cazul plantelor) la ntmplare (randomizate), luat n calcul de legea Hardy Weinberg. Aceasta se datoreaz n parte frecvenelor celor trei genotipuri i frecvenelor celor dou alele. Exemplul urmtor este foarte relevant. Considerai o populaie de zece indivizi i un locus dat, cu dou alele posibile, A i a. Presupunei c genotipurile indivizilor sunt urmtoarele: AA, Aa, AA, aa, Aa, AA, AA, Aa, Aa, i AA

Atunci, frecvenele alelei A i respectiv alelei a sunt:

Deriva genetic n populaii Deriva genetic (driftul genetic) poate avea efecte profunde i adesea bizare asupra istoriei evolutive a unei populaii. Aceste efecte pot avea efecte nefavorabile pentru supravieuirea populaiei. Intr-o populaie care datorit unor factori adveri se reduce numeric, deriva genetic poate determina modificri brute i dramatice ale frecvenei alelelor, care apar independent de selecie. In astfel de situaii, multe dintre adaptrile benefice pot fi eliminate chiar dac ulterior populaia revine la mrimea sa obinuit. In mod similar, populaiile migratoare se pot confrunta cu efectul de fondator, caz n care civa indivizi cu o alel rar din generaia originar pot genera o populaie care are frecvene ale alelelor ce par a fi n contradicie cu selecia natural. Efectele de fondator sunt uneori considerate a fi responsabile de frecvenele ridicate ale unor boli. Aadar, pentru orice populaie (de microorganisme, plante, animale) echilibrul este starea n care frecvenele de apariie a variatelor mutaii sunt fixe peste timp (n decursul generaiilor). Dup un timp suficient, orice populaie cu rate constante ale mutaiilor ar trebui s ating echilibrul. Cnd o populaie ajunge la echilibru, mutaiile nefavorabile (negative, duntoare) vor intra n populaie i vor prsi populaia cu aceeai rat. Aceasta nseamn c o mutaie care este doar uor duntoare se va rspndi la cea mai mare parte a indivizilor din populaie, n schimb o mutaie care este foarte duntoare se va rspndi la o proporie foarte mic din populaie. Ambele tipuri de mutaii vor cauza un numr de decese per generaie egal cu frecvena lor de apariie n populaie. Astfel, cnd populaia este n echilibru, ansa ca un ovul fertilizat s supravieuiasc este mai mic sau egal cu ansa pe care o are atunci cnd nu au aprut mutaii noi duntoare. De aceea, cnd populaia a ajuns la echilibru, dac exist o ans mic ca un descendent s nu prezinte defecte noi, atunci exist o ans ca el s supravieuiasc. In acest context este necesar s se neleag ce este o mutaie duntoare. Trebuie considerat duntoare orice mutaie care afecteaz organismul ntr-un mod pe care acesta nu este capabil s l compenseze. Intruct populaiile sunt n general stabile peste perioade lungi de timp, aceasta nseamn c un organism cu o mutaie duntoare va avea n mod tipic mai puin de un descendent care supravieuiete. Este de asemenea important s se neleag c numai genele eseniale vor persista ntr-o populaie ca gene funcionale pentru perioade lungi de timp. Genele neeseniale vor suferi mutaii care le vor distruge funcia, i deoarece organismul este capabil s compenseze lipsa funciei lor, astfel de mutaii se vor acumula peste timp pn ce gena va deveni nefuncional n ntreaga populaie. Aceasta nseamn c evoluia va elimina eventual toat redundana, i numai genele de care organismul are cu adevrat nevoie pentru supravieuire vor fi meninute. Ca urmare, ntr-un sens, toate speciile vor tri eventual la limita extinciei.

ORGANISMELE MODIFICATE GENETIC I IMPACTUL LOR ASUPRA MEDIULUI

AVANTAJELE UTILIZRII OMG In condiiile n care exist reineri mai mult sau mai puin justificate fa de introducerea organismelor modificate genetic (OMG) n mediul natural, sau fa de folosirea i comercializarea oricrui produs reprezentnd organism transgenic sau derivat al acestuia, cteva avantaje poteniale ale utilizrii lor sunt totui evidente. Dintre avantajele oferite de folosirea OMG, cele mai importante sunt cele care se refer la sporirea valorii biologice i a profitabilitii, asigurarea surselor neconvenionale pentru producerea de enzime industriale, polimeri, peptide, uleiuri industriale (de exemplu, uleiuri hidraulice), noi biocombustibili solizi, asigurarea de surse noi de fibre i hrtie, valoarea potenial ca ageni pentru bioremediere i fitoremediere, capabili s decontamineze mediile naturale de diferiii poluani. In ultimul timp, din volumul

impresionant de informaii, pe lng cele mai importante avantaje, reies frecvent i numeroase riscuri poteniale ale introducerii microorganismelor sau plantelor modificate genetic. Aceste riscuri sunt de regul grupate n dou categorii: 1) riscuri pentru sntatea consumatorilor; 2) riscuri pentru mediu. Reducerea polurii apelor i solului cauzat de utilizarea pesticidelor Un exemplu relevant pentru avantajele pe care le prezint introducerea n cultur a plantelor transgenice cu rezisten la atacul duntorilor este oferit de cartof, una dintre speciile cu foarte mare importan economic. Este un fapt bine cunoscut c cultivarea cartofului nu este uoar, aceast specie fiind atacat de gndacul de Colorado (Leptinotarsa decemlineata), infectat de virusurile rspndite de afide i de bacteriile care produc bacterioza cartofului. Pentru controlul patogenilor i duntorilor cartofului, cultivatorii folosesc un sortiment de fungicide (pentru controlul bacteriozei), insecticide (pentru controlul afidelor i al larvelor gndacului de Colorado) i fumigante (pentru controlul nematozilor din sol). De exemplu, pentru eliminarea afidelor este folosit methamidophos-ul, un compus organofosforic toxic care efecteaz sistemul nervos. Compania Monsanto a creat un soi transgenic de cartof coninnd o gen Bt pentru controlul atacului gndacului de Colorado, combinat cu o alt gen pentru controlul rspndirii virusurilor de ctre afide. Cultivarea soiului transgenic, denumit NewLeaf, permite aadar reducerea considerabil a polurii mediului cu substanele chimice folosite convenional pentru controlul duntorilor. Totodat, cartofii produi de plantele transgenice pot fi considerai ca fiind liberi de orice reziduuri chimice, ce pot constitui un risc potenial pentru sntatea consumatorilor.

Conservarea calitii solurilor Calitatea solului este n mod indiscutabil afectat de tehnologiile de ntreinere a diferitelor culturi de interes agricol, bazate pe aplicarea mecanizat de tratamente cu fungicide, bactericide, pesticide. Tasarea solului determinat de trecerile repetate, anuale i multianuale ale diferitelor maini agricole are consecine profund negative, ce deriv din modificarea proprietilor structurale, respectiv cele de textur, aerare, permeabilizare, etc. Cifrele pe care le ofer statisticile arat c cultivarea plantelor modificate genetic prin introducerea genelor pentru rezisten la duntori a determinat n anul 2002 reducerea cantitii de pesticide folosite pentru controlul lor cu 22-23 milioane de kilograme. De exemplu, cultivarea soiului Ingard de bumbac modificat genetic, introdus n cultura comercial n Australia n anul 1996, a determinat reducerea cu 40-60% a tratamentelor cu pesticide pentru controlul duntorilor. Favorizarea bio-remedierii

Se admite c tehnologiile de modificare genetic permit n prezent crearea de plante care pot dezvolta optim n medii cu condiii de stres i care, adesea, pot fi folosite n efortul de a ameliora anumite condiii de stres. Din acest punct de vedere, este evident interesul pentru acele plante (denumite generic fitoremediatori) care ar putea fi folosite pentru curarea solului din zonele contaminate cu metale grele, arsenic, petrol, TNT i multe alte elemente toxice. Bio-remedierea (incluznd fitoremedierea) se caracterizeaz prin folosirea speciilor de plante i microorganisme pentru tratamentul in situ al zonelor de teren poluate cu o varietate de substane periculoase. Plantele sunt de maxim utilitate n ansamblul procesului, respectiv a strategiilor de bioremediere, ntruct ele previn eroziunea i scurgerea, care pot conduce la rspndirea substanelor toxice n zonele adiacente. In prezent se utilizeaz cteva tipuri de fitoremediere, incluznd fitoextracia (care se bazeaz pe capacitatea natural a plantelor de a reine anumite substane, cum ar fi metalele grele, i de a le stoca n celulele lor pn la recoltare) fitodegradarea (o cale prin care plantele convertesc poluanii organici ntr-o form non-toxic) fitostabilizarea (n care plantele elibereaz anumite chimicale care se leag de contaminani pentru a-i face mai puin biodisponibili i mai puin mobili n mediul nconjurtor) i fitovolatilizarea (proces prin care plantele extrag poluanii din sol i i convertesc ntr-un gaz care poate fi eliberat fr efecte negative n atmosfer). Prin inginerie genetic este posibil crearea de plante transgenice capabile s combine caracterele agronomice benefice cu potenialul de remediere al bacteriilor organismele folosite tradiional n bioremediere. Fitoremedierea aplicat pentru curarea mediului de metale grele reprezint un exemplu excelent pentru procesul de bioremediere facilitat de plante i pentru rolul su n ndeprtarea stresului de mediu. In mod tradiional, cnd o zon devine contaminat cu metale grele, acea zon trebuie excavat, iar solul trebuie ndeprtat (transportat ntr-o locaie de umplere). Acest proces este extrem de costisitor, n acest sens fiind relevant un calcul care arat c pentru curarea unui hectar contaminat pe adncimea de 1 metru se cheltuiete echivalentul a 500.000 pn la 2.500.000 euro, depinznd de intensitatea polurii i de toxicitatea poluantului. Se estimeaz c costul fitoremedierii ar putea fi de 20 ori mai puin costisitor, fcnd aceast practic mai puin prohibitiv. Tipul ideal de fitoremediator este o specie vegetal care produce o cantitate mare de biomas, crete rapid, are un sistem radicular extins i este uor de cultivat i recoltat. Din pcate, nu exist fitoremediatori naturali care s posede aceste caliti. Aceasta este de altfel explicaia interesului pentru crearea i folosirea unor fitoremediatori transgenici eficieni. Multe boli genetice sunt rezultatul ptrunderii n organism, prin consumul de plante, a metalelor toxice din sol. Fitoremedierea terenurilor contaminate cu astfel de metale devine prin urmare crucial pentru protecia sntii consumatorilor. De exemplu, plumbul este unul dintre contaminanii cel mai dificil de ndeprtat din sol, ca de altfel i unul dintre cei mai periculoi (duntori). Prezena plumbului n mediu poate avea efecte devastatoare asupra creterii plantelor i, totodat, poate avea ca rezultat grave efecte secundare (incluznd debilizarea i retardarea mintal) dac este ingerat de oameni sau animale (Lasat, 2000).

RISCURI POTENIALE ALE INTRODUCERII IN MEDIU A OMG Organismele modificate genetic i produsele obinute din acestea au devenit un motiv de ngrijorare pentru o parte important a populaiei i a dat natere unor controverse i dezbateri de larg amploare. Cu certitudine, dezbaterile nu se vor ncheia foarte curnd pentru c rspunsurile la ntrebri cum sunt: (a) Va exacerba existena plantelor transgenice cu resisten la un anumit duntor sau boal apariia de noi duntori sau ageni patogeni rezisteni, i va deveni aceast problem mai grav dect n cazul alternativei tradiionale? (b) Dac prin fluxul de gene caracterele (de exemplu tolerana la concentraii ridicate de sruri, rezistena la boli, etc.) sunt transferate la varietile slbatice, vom asista la o expansiune n aceste nie a varietilor respective care va avea ca rezultat suprimarea diversitii biologice n zonele nconjurtoare? (c) Trebuie s se schimbe n continuare mediul rural prin aplicarea mai multor erbicide, ncurajat de disponibilitatea mai multor plante de cultur rezistente la erbicide? (d) Va determina adoptarea larg a plantelor tolerante la stres o cretere considerabil n utilizarea terenurilor pe care agricultura tradiional nu putea fi practicat, ntr-un mod care distruge ecosistemele naturale valoroase? (e) Proteinele codificate de transgenele introduse n plantele modificate genetic (PMG) nu au potenial alergen? (f) Exprimarea posibil a genei pentru -endotoxin (gena Bt) n polen nu va pune n pericol insectele polenizatoare, cum sunt albinele?, vor rmne controversate. La unele dintre aceste ntrebri se poate rspunde cu alte ntrebri: In condiiile n care nu exist cale de ntoarcere la agricultura organic a mileniului trecut, este bine s continum agresarea mediului prin folosirea practicilor agricole care duc la degradarea calitii solului i a apei?, sunt plantele modificate genetic pentru rezistena la boli i duntori i produsele derivate din acestea un pericol mai mare pentru sntatea consumatorilor, dect plantele care sunt tratate de pn la 20 de ori ntr-un an cu compui chimici (fungicide, pesticide) pentru controlul agenilor patogeni i duntorilor?, etc. Migrarea transgenelor n populaiile nemodificate genetic Unul dintre riscurile introducerii n cultur a PMG care preocup deopotriv comunitatea i oamenii de tiin este posibilitatea migrrii transgenelor n plante slbatice nrudite cu cele introduse n cultur, sau a transferului orizontal de gene (ntre specii foarte ndeprtat nrudite sau nenrudite). Migrarea transgenelor de la plantele cultivate la plantele slbatice, ar crea dezechilibre cu efecte greu de estimat n ecosistemele naturale, dar care ar putea afecta chiar agro-ecosistemele. De exemplu, evadarea de la plantele de porumb sau rapi modificate genetic a unei transgene pentru rezistena la erbicide i integrarea ei n plante slbatice nrudite (unele considerate buruieni), ar face extrem de dificil controlul acestora. Un exemplu deja bine cunoscut este cel al rapiei modificate genetic. Rapia pentru ulei rezistent la erbicidul Basta a fost prima plant modificat genetic a crei cultivare a fost aprobat n ri ale Uniunii Europene. Acceptarea introducerii n cultur a acestei plante transgenice nu a fost unanim, datorit faptului c rapia pentru ulei se poate ncrucia liber cu forme slbatice de rapi, prezente adesea ca buruieni n cmpurile cultivate sau n apropierea acestora. In eventualitatea migrrii transgenelor exist riscul ca forme nrudite cu rapia s devin buruieni persistente, greu de combtut prin tratamentul cu erbicide.

Avantajul intenionat al introducerii n cultur a rapiei transgenice este acela al controlului buruienilor prin doar cteva tratamente cu erbicidul Basta, un agent de control relativ nepoluant. Riscul introducerii n cultur al acestei plante modificate genetic deriv din faptul c, dac rezistena s-ar rspndi la alte varieti de rapi, s-ar ajunge la necesitatea unor tratamente suplimentare cu ageni de control mai poluani, ceea ce ar fi n contradicie cu scopul iniial. In contextul menionat sunt de asemenea relevante rezultatele investigaiilor efectuate n Danemarca pe durata testrii n condiii de cmp a unei forme transgenice de sfecl de zahr rezistent la erbicidul Roundup, care au artat apariia unui numr mare de hibrizi ntre plantele cultivate de sfecl i cele de sfecl slbatic. Recent s-a raportat c n probele de porumb slbatic recoltate n Mexic pentru analize moleculare a fost identificat ADN transgenic (Quist i Chapella, 2001), dei cultivarea porumbului transgenic a fost interzis n aceast ar nc din anul 1998, tocmai datorit existenei unor forme slbatice de Zea, care se pot poleniza liber cu polen de la plantele modificate genetic de porumb introduse n cultur.

Figura *. Casetele reprezint populaiile iniiale, iar sgeile reprezint cile posibile ale fluxului de gene. Cercurile reprezint populaii potenial transgenice dup introducerea transgenelor i introgresie.

Argumentul invocat cel mai adesea de contestatarii tehnologiilor de modificare genetic pentru demonstrarea riscului potenial al transferului orizontal de gene este legat de folosirea promoter-ului CaMV pentru exprimarea n plante a transgenelor. Dac adepii introducerii n cultur a PMG susin c nu exist nici o dovad c CaMV, care infecteaz o gam larg de crucifere folosite n alimentaia uman, poate determina prin recombinare creterea anormal a nivelului expresiei genelor normale sau producerea de virusuri noi,

contestatarii PMG afirm c promoter-ul CaMV 35S s-ar putea recombina cu unele virusuri nrudite, cum ar fi virusul hepatitei B. Este ns incontestabil faptul c pentru ca promoter-ul CaMV s se recombine cu alte virusuri animale sau umane ar trebui ca ntregul promoter s fie excizat i reinserat precis n noul situs, sau ca captul su 3 s se lege precis de gena gazd ori de gena viral. Mai mult, se afirm c chiar i n cazul cnd s-ar putea produce o recombinare implicnd promoter-ul CaMV 35S, aceasta ar trebui s fie extrem de rar ntruct secvenele transgenice sunt prezente n concentraie foarte redus, adic doar una sau cteva copii per celul. Se afirm de asemenea c compui potenial carcinogenici exist deja din abunden n produsele vegetale naturale, ceea ce nu justific teama fa de generarea de noi toxine sau carcinogene n plantele transgenice ca urmare a unor astfel de evenimente de recombinare. Dezbaterea pe aceast tem este ns departe de a se ncheia, deoarece, aa cum susin unii specialiti n biologia molecular, genomul viral nud difer semnificativ de virusul intact. Acesta din urm, constnd din genomul CaMV nvelit n nveliul su proteic, nu este infecios pentru indivizii umani i nici pentru animalele i plantele non-susceptibile. Susceptibilitatea este n fapt determinat de nveliul proteic, aa nct ingerarea virusului intact nu are nici un fel de consecine. Genomul viral nud este considerat a fi cu mult mai infecios i a avea o gam mult mai larg de gazde dect virusul intact. Progresele nregistrate recent n domeniul terapiei genice i terapiei de baz de acizi nucleici nu las nici o ndoial asupra faptului c acizii nucleici nuzi sau liberi pot dobndi accesul la toate celulele animalelor model sau ale indivizilor umani. O astfel de eventualitate poate reprezenta ntr-adevr un motiv de ngrijorare dac, aa cum se susine, promoter-ul CaMV 35S ca parte integrant a virusului difer semnificativ de promoter-ul 35S n ADN transgenic. Este de ateptat ca suspiciunile legate de posibilitatea transferului orizontal de gene s determine aprofundarea studiilor n domeniul recombinrii virale, mai ales c unele dintre studiile recente au confirmat c virusurile plantelor pot s achiziioneze o varietate de gene virale de la plantele transgenice. Afectarea biodiversitii Agricultura modern are efecte intrinsec distructive asupra mediului natural, n special asupra diversitii biologice. Aceste efecte sunt n mod deosebit negative, atunci cnd practicile agricole sunt ineficiente, sau cnd tehnologiile agricole convenionale aplicate (tratamente cu erbicide, fungicide, insecticide, fertilizatori, sistemul de arturi, etc.) sunt inadecvate trsturilor mediului (de sol i clim, n special). Este o realitate incontestabil c practicile agricole tradiionale au determinat afectarea negativ puternic a mediului, chiar iremediabil n unele cazuri, n multe regiuni ale lumii. Impactul potenial al PMG a fost analizat cu mare atenie de comunitatea tiinific i se consider c acesta este preferabil impactului tehnologiilor agricole convenionale. Se recunoate ns c, datorit folosirii nc limitate la nivel mondial i constrngerilor de natur geografic i ecologic n ceea ce privete introducerea lor n cultur, informaiile referitoare la efectelor lor actuale asupra mediului i diversitii biologice sunt nc foarte rare. In consecin nu se poate vorbi de un consens n privina seriozitii, sau chiar existenei, oricrui efect negativ al tehnologiilor de modificare genetic asupra mediului. Comunitatea tiinific contientizeaz ns necesitatea analizei aprofundate a factorilor de risc i a consecinelor posibile nc din primele etape ale crerii de noi soiuri transgenice, i

a instituirii unui sistem de monitorizare i evaluare a riscurilor pe parcursul testelor de cmp i introducerii n cultura comercial. Studiile de risc necesit informaii de baz privind biologia i ecologia speciei i a celor nrudite, caracterele noi rezultate prin aplicarea tehnologiei de modificare genetic, precum i date ecologice relevante despre locul n care se intenioneaz introducerea n mediu a PMG. Obinerea acestor informaii poate fi dificil, dac avem n vedere diversitatea de medii. Este de asemenea unanim prerea c o atenie deosebit trebuie acordat centrelor de origine sau de diversitate a plantelor cultivate, deoarece n zonele respective pot exista multe rude slbatice la care noile caractere ar putea fi transferate. Pentru mediile speciale, este nevoie ca plantele transgenice s fie create prin tehnologii care la reduc la minimum posibilitile de migrare a genelor prin polen i efectele acestuia asupra speciilor slbatice nrudite, prin folosirea fie a metodelor de inducere a androsterilitii, fie a ereditii materne ca rezultat al transformrii cloroplastelor. Creatorii de plante modificate genetic sunt, evident, contieni de riscul potenial al migrrii transgenelor, ceea ce a determinat deja adaptarea strategiilor de obinere de PMG, de exemplu n sensul asigurrii sterilitii polenului produs de plantele transgenice. Invadarea Unele plante cultivate, cum este rapia pentru ulei, au numeroase rude slbatice cu care se pot hibrida ncruciat. Nu exist nici o ndoial c astfel de hibrizi se vor forma, ntrebarea este doar cum se vor comporta ei n habitatele naturale. O consecin nedorit ar putea fi scparea unui astfel de hibrid de influena reglatoare a dumanilor si naturali, ceea ce ar determina creterea abundenei i distribuiei lor. Exemplele cel mai des citate pentru o asemenea situaie sunt cele ale plantelor rezistente sau tolerante la erbicide i respectiv cele ale plantelor rezistente la virusuri. Capacitatea de a deveni buruian se refer la situaia n care o plant cultivat sau hibrizii si se instaleaz ca o buruian n alte cmpuri sau ca o specie invadatoare n alte habitate. Specialitii sunt de acord c riscul ca plantele cultivate s devin ele nsele buruieni este extrem de sczut deoarece caracteristicile care le fac dorite ca plante de interes comercial le fac de regul foarte puin apte s supravieuiasc i s se reproduc n slbticie. In schimb, buruienile care se pot hibrida natural cu plante rezistente la erbicide au potenialul de a dobndi caracteristica de toleran la erbicid, ceea ce le-ar conferi un avantaj n prezena erbicidului. Acest avantaj ar putea sta la baza persistenei lor i a invadrii de noi nie. Intruct aceste riscuri sunt reale, au fost imaginate deja o serie de strategii care ar permite eliminarea lor, incluznd evitarea plantrii speciilor modificate genetic n centrele de origine (implicit de maxim biodiversitate) sau n care exist rude slbatice, sau crearea de zone tampon pentru izolarea speciilor transgenice de soiurile convenionale (nemodificate). Au fost de asemenea imaginate strategii de inginerie genetic pentru modificarea perioadei de nflorire n scopul prevenirii polenizrii ncruciate, pentru asigurarea neincorporrii transgenelor n polen, sau pentru crearea de soiuri transgenice al cror polen s fie steril i prin urmare incapabil de germinare (implicit de realizare a fecundrii). Unii specialiti consider c n absena presiunii de selecie pentru gena responsabil de tolerana la erbicide, plantele transgenice n care a fost introdus acest caracter nu ar prezenta nici un risc pentru mediu, deci nici riscul de a deveni potenial invadatoare sau dominante. Se consider c un risc cu probabilitate mai mare l prezint plantele n care au fost introduse caracteristici ce le confer toleran la stres, o astfel de caracteristic fiind considerat rezistena la patogenii virali. Aadar, o problem crucial este cea legat de

posibilitatea ca hibrizii transgenici (cu gene neutre sau posibil avantajoase) s devin mai abundeni n habitatele naturale. Ecologia unui OMG nu este fundamental diferit de a nici unui alt organism. Prin urmare, teoria ecologic ofer un cadru adecvat pentru stabilirea impactului potenial al oricrui organism modificat genetic. Criteriul de baz pentru aprecierea capacitii de invadare este acela c populaiile trebuie s aib o rat finit de cretere mai mare de zero pentru a persista (rata finit de cretere este echivalent numrului mediu de semine produse per smn germinat). Studiile realizate pn n prezent nu au adus dovezi n sprijinul ipotezei unei capaciti mai ridicate de invadare a OMG. Plantele rezistente la virusuri creeaz un motiv total diferit de ngrijorare, acela al posibilitii ca hibrizii s ias de sub influena reglatoare a patogenilor si. Studiul interaciunilor plant-patogen a permis dou consideraii. Prima se refer la faptul c genele pentru rezisten sau toleran la virus par s fie foarte rare sau absente la rudele slbatice ale plantelor cultivate. A doua se refer la faptul c exist o varietate de vectori construii prin tehnicile de biologie molecular care confer rezisten la virusuri (incluznd gene izolate de la mamifere, drojdii, plante, sau de la virusurile nsei). Modul diferit n care este conferit rezistena face ca riscurile genetice pe care acestea le pot prezenta s fie de asemenea diferite. Totui, transgenele derivate din patogen sunt probabil substanial diferite de genele de rezisten derivate din plante i patogenii nu au o istorie co-evolutiv cu aceste mecanisme de rezisten. Aceste consideraii au reflectat necesitatea unei nelegeri mai bune a mecanismelor de rezisten i a unor experimente ecologice de mare relevan pentru estimarea fr erori a potenialului de invadare. Sunt necesare aadar experimente n cmp pe scar larg, n care o varietate de genotipuri s fie plasate ntr-o gam larg de contexte ecologice. In absena cunoaterii ecologice de ansamblu realizat printr-un complex de studii de caz, riscul potenial al capacitii de invadare a hibrizilor transgenici aprui prin hibridarea natural cu plante modificate genetic nu poate fi stabilit cu exactitate. Apariia superpatogenilor i superduntorilor Specialitii sunt de acord c utilizarea extensiv i de lung durat a plantelor de cultur posednd gena Bt (pentru rezisten la duntori) sau genele pentru rezisten (toleran) la glifosat i glufosinat (erbicidele la care sunt tolerante sau rezistente plantele introduse deja n cultur) pot stimula dezvoltarea de noi mecanisme de rezisten sau toleran i implicit apariia de insecte duntoare i buruieni rezistente. Astfel de situaii au aprut n mod obinuit n cazul plantelor cultivate convenionale (nemodificate), n sensul c numeroi patogeni au devenit n timp rezisteni sau tolerani la pesticidele folosite pentru controlul lor. Se poate de aceea presupune c i n cazul plantelor modificate genetic prin introducerea de gene care le confer rezistena la duntori i ageni patogeni, acetia vor putea dobndi la un moment dat capacitatea de a sparge rezistena i de a putea folosi n continuare plantele respective ca gazde sau surs de hran. In mod similar, pe plan mondial, peste 120 de specii de plante considerate buruieni au dezvoltat rezisten sau toleran la erbicidele folosite pentru combaterea lor. Deoarece apariia de duntori sau buruieni cu rezisten este foarte probabil n cazul utilizrii extensive n culturi a plantelor modificate genetic cu rezisten la acetia, specialitii au recomandat deja adoptarea unor strategii de management. Msura n care se va produce, i severitatea impactului super-duntorilor, agenilor patogeni i a buruienilor asupra mediului, sunt ns n continuare un subiect foarte controversat.