Fundamentos y Metodologas Innovadoras para el Mejoramiento Gentico de Maz

Dr. Axel Tiessen Favier

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Fundamentos y Metodologas Innovadoras para el Mejoramiento Gentico de Maz

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Fundamentos y Metodologas Innovadoras para el Mejoramiento Gentico de Maz

PRIMERA EDICIN Versin 1.36 19 de Julio del 2009 Editorial Fundacin Ciencia Activa ISBN: 978-970-95522-3-2
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Plantas Maz Fitomejoramiento Cultivos Biotecnologa Ingeniera Gentica Genmica Marcadores moleculares Estadstica Bioinformtica Fisiologa vegetal Bioqumica Tolerancia a Sequa Calidad Nutricional

Editor Dr. Axel Tiessen Favier

Profesor-Investigador del Departamento de Ingeniera Gentica CINVESTAV Irapuato Mxico

Nota de Copyright: Este documento puede ser reproducido libremente para fines educativos sin nimos de lucro siempre y cuando se cite a todos los autores.

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Autores Contribuyentes Autor

Dr. Axel Tiessen Favier
CINVESTAV Irapuato

Contribucin
7.8 MB 900kB 800kB 200kB 100kB 250kB 1kB 1kB

Captulos
1-19 6 6 18-19 9 8-10 4 17

Dr. Fernando Gmez Merino

Colegio de Posgraduados

Dra. Libia Iris Trejo Tllez

Colegio de Posgraduados

Biol. Alejandro Lpez Fabre

CINVESTAV Irapuato

Mtro. Daniel Padilla

Facultad de Qumica UNAM

Mtra. Erandi Vargas

CINVESTAV Irapuato

Dr. Pedro Salvarrieta

Colombia

Rocha Lopez

Dr. Misael Lozano

Universidad Juarez del Estado de Durango

Dra. Natalia Palacios Rojas

CIMMYT

1kB 1kB 1kB

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Dra. Esperanza Torres

Universidad Colombia Nacional de

Dr. Silverio Lara

Garcia

Tecnolgico de Monterrey

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Indice
Pgina
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. Prlogo Introduccin Herramientas Moleculares Deteccin de polimorfismos genticos Genmica y regulacin Factores de Transcripcin Herramientas Bioinformticas Herramientas Estadsticas Biologa de sistemas Herramientas Bioqumicas Fisiologa vegetal Crecimiento, desarrollo y reproduccin Transferencia Gentica Gentica de Poblaciones Gentica cuantitativa Mapas genticos Metodologas de Mejoramiento Mejoramiento Gentico de Maz Anexos 10 22 80 103 130 152 189 206 257 263 307 375 406 428 442 447 463 503 509

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Tabla de Contenido
1. Prlogo 10 Presentacin y enfoque .........................................................................................10 Distribucin abierta ................................................................................................11 Lenguaje cientfico .................................................................................................12 Grupos de usuarios................................................................................................13 Motivacin para estudiantes ..................................................................................14 Patrocinadores .......................................................................................................16 Agradecimientos ....................................................................................................17 Sobre los autores ...................................................................................................17 Formato para las citas ...........................................................................................19 Gua general ..........................................................................................................19 2. Introduccin 22 2.1. Conceptos bsicos.................................................................................................22 2.1.1. Ambiente y gentica 22 2.1.2. Del genotipo al fenotipo 25 2.1.3. Biodiversidad 29 2.2. Origen de la variabilidad gentica..........................................................................36 2.2.1. Mutaciones 36 2.2.2. Recombinacin 37 2.2.3. Transferencia horizontal 40 2.2.4. Seleccin 42 2.2.5. El azar 44 2.3. Evolucin................................................................................................................46 2.3.1. Evolucin biolgica 46 2.3.2. Evolucin dirigida 51 2.3.3. Mejoramiento: evolucin en accin 53 2.3.4. Mejoramiento: ciencia, ingeniera y filosofa 61 2.4. El DNA ...................................................................................................................62 2.4.1. Nociones bsicas de los cidos nucleicos 62 2.4.2. Nociones avanzadas 74 2.4.3. Gentica Forward y Gentica Reversa 79 3. Herramientas Moleculares 80 3.1. PCR........................................................................................................................80 3.1.1. Historia y Principios 80 3.1.2. Tcnicas y Aplicaciones 83 3.2. Modificadores del DNA ..........................................................................................83 3.2.1. Enzimas de restriccin 83 3.2.2. Ligasas 84 3.2.3. Recombinasas 85 3.3. Mtodos de secuenciacin ....................................................................................88 3.3.1. Sanger 88 3.3.2. Pirosecuenciacin 89 3.3.3. Mtodo de apareamiento y ligacin 92 3.3.4. Mtodo de sntesis con fluorforos 102 4. Deteccin de polimorfismos genticos 103 4.1. Marcadores ..........................................................................................................103 4.1.1. Caractersticas de los marcadores 103 4.1.2. Tipos de marcadores genticos 103 4.1.3. Ejemplos de marcadores 105 4.1.4. Estrategias de genotipaje 112 1.1. 1.2. 1.3. 1.4. 1.5. 1.6. 1.7. 1.8. 1.9. 1.10.

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Tcnicas de comparacin genmica ...................................................................120 4.2. 4.2.1. Differential Display (DD) 120 4.2.2. Representational Diference Analysis (RDA) 121 4.2.3. Genome Missmatch Scanning (GMS) 123 4.3. Ejemplos de aplicaciones ....................................................................................124 4.3.1. Demostracin de Pedigr 124 4.4. Haplotipos ............................................................................................................125 4.4.1. Desequilibrio por ligamiento 125 4.4.2. Proyecto HapMap 125 4.5. Pros y contras de las herramientas moleculares.................................................126 4.5.1. Ventajas de las herramientas moleculares 126 4.5.2. Limitaciones de las herramientas moleculares 126 5. Genmica y regulacin 130 5.1. Antecedentes de la genmica..............................................................................130 5.2. Estrategias de ensamblaje genmico..................................................................131 5.3. Ejemplos de proyectos de genmica...................................................................134 5.3.1. Genomas vegetales 135 5.3.2. Genomas animales 140 5.3.3. DNA extranuclear 145 5.3.4. Genomas comparativos 151 6. Factores de Transcripcin 152 6.1. Qu son? ...........................................................................................................152 6.2. Factores de transcripcin basales .......................................................................153 6.3. Factores de transcripcin regulatorios.................................................................157 6.4. Bases de datos sobre factores de transcripcin en maz....................................161 6.5. Descripcin de algunas familias ..........................................................................162 6.6. Resumen..............................................................................................................185 7. Herramientas Bioinformticas 189 7.1. Qu es la bioinformtica? ..................................................................................189 7.2. Anlisis de secuencias.........................................................................................191 7.2.1. BLAST 191 7.3. Bases de datos ....................................................................................................195 7.3.1. Genbank y el NCBI 195 7.3.2. Maize GDB 197 7.3.3. Maize Gene Index 198 7.3.4. CIMMYT 199 7.3.5. IRRI 200 7.4. Paquetes de Software..........................................................................................201 7.4.1. Fieldbook para maz 201 7.4.2. Alternativas gratuitas de software 202 8. Herramientas Estadsticas 206 8.1. Conceptos bsicos de estadstica .......................................................................206 8.1.1. Para que sirve la estadstica? 206 8.1.2. Medidas centrales 206 8.1.3. Desviacin estndar y distribucin normal 207 8.1.4. Tipos de errores 209 8.1.5. Diseo experimental 209 8.2. Anlisis estadsticos.............................................................................................211 8.2.1. Ejemplo de anlisis usando pruebas de T 211 8.2.2. Ejemplo de anlisis usando ANOVA 216 8.2.3. Ejemplo: varianza, heredabilidad y repetibilidad 221 8.2.4. Ejemplo de grfica 228 8.2.5. Ejemplo de anlisis de bloques incompletos 228 8.2.6. Ejemplo de anlisis espacial 228

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Ejemplo de anlisis con modelos lineales 228 8.2.7. 8.2.8. Otros ejemplos 229 8.3. Software para estadstica ....................................................................................229 8.3.1. Uso de Excel 229 8.3.2. R para estadstica 231 9. Biologa de sistemas 257 9.1. Introduccin..........................................................................................................257 9.2. Genmica.............................................................................................................258 9.3. Transcriptmica....................................................................................................259 9.4. Protemica ...........................................................................................................259 9.5. Metabolmica.......................................................................................................260 10. Herramientas Bioqumicas 263 10.1. Fundamentos de enzimologa..............................................................................263 10.1.1. Qu es una reaccin qumica? 263 10.1.2. Qu es un catalizador? 264 10.1.3. Qu es una enzima? 265 10.1.4. Caractersticas generales de una reaccin enzimtica 265 10.1.5. Cmo funcionan las enzimas? 266 10.1.6. Nomenclatura de las enzimas 267 10.1.7. Regulacin de la actividad enzimtica 269 10.1.8. Modelo cintico de Michaelis-Menten 271 10.2. Fundamentos de Espectrofotometra ..................................................................278 10.2.1. La radiacin electromagntica 278 10.2.2. Cromforos 279 10.2.3. Los auxocromos 279 10.2.4. Espectro de compuestos biolgicos 280 10.2.5. La ley de Beer-Lambert 281 10.2.6. Mtodos enzimticos. 283 10.3. Anlisis de macromolculas ................................................................................288 10.3.1. Electroforesis 288 10.3.2. Cromatografa 289 10.4. Metodologas y Equipos.......................................................................................291 10.4.1. Cromatografa de lquidos (HPLC) 291 10.4.2. Cromatografa de gases (GC) 296 10.4.3. Ejemplos de metodologas usadas para el mejoramiento de maz 299 11. Fisiologa vegetal 307 11.1. Introduccin..........................................................................................................307 11.2. Asimilacin de carbono........................................................................................307 11.2.1. La fotosntesis 307 11.2.2. Plantas C3, C4 y CAM 322 11.2.3. Descripcin de las distintas rutas fotosintticas 323 11.3. Tejidos vegetales .................................................................................................332 11.3.1. Monocotiledneas y dicotiledneas 332 11.3.2. Semillas 333 11.3.3. Hojas 334 11.3.4. Races 336 11.3.5. Tallos 339 11.3.6. Tejido Vascular 341 11.3.7. Transporte vascular 345 11.3.8. Movimientos de agua 358 11.4. Asimilacin de nutrientes .....................................................................................360 11.4.1. Nitrgeno 360 11.4.2. Azufre 364 11.4.3. Fsforo 366

Otros minerales 367 11.4.4. 11.4.5. Resumen de minerales esenciales 370 11.4.6. El suelo y la nutricin 372 12. Crecimiento, desarrollo y reproduccin 375 12.1. Fundamentos del desarrollo vegetal....................................................................375 12.1.1. El ciclo celular 375 12.1.2. La mitosis 375 12.1.3. La meiosis 378 12.1.4. Ciclo de vida y reproduccin sexual 383 12.1.5. Desarrollo de flores y semillas 383 12.2. Crecimiento y desarrollo vegetativo.....................................................................387 12.2.1. Regulacin del crecimiento 387 12.2.2. Tropismos y su relacin con hormonas 387 12.2.3. Geotropismo 388 12.2.4. Fotoperiodicidad 388 12.2.5. Fitocromo 391 12.2.6. Ritmos circadianos y relojes biolgicos 392 12.3. Hormonas vegetales ............................................................................................393 12.3.1. Auxinas 394 12.3.2. Citocininas 397 12.3.3. Giberelinas 398 12.3.4. Etileno 401 12.3.5. Acido Abcsico 402 12.3.6. Resumen de hormonas como reguladoras del desarrollo vegetal 402 12.4. Desarrollo reproductivo de maz ..........................................................................405 13. Transferencia Gentica 406 13.1. Transferencia sexual............................................................................................406 13.1.1. Cruzas entre individuos de la misma especie 407 13.1.2. Cruzas entre especies diferentes 410 13.1.3. Poliploidia en el reino vegetal 413 13.2. Organismos Genticamente Modificados............................................................414 13.2.1. Transferencia por Agrobacterium 414 13.2.2. Transferencia por Biobalstica 415 13.2.3. Vectores virales para expresin transiente 415 13.2.4. Legislacin sobre los OGM en Latinoamrica 415 Ventajas y desventajas de los OGM 416 13.3. Divergnicos ........................................................................................................416 13.3.1. Definiciones 416 13.3.2. Ejemplos 419 13.4. Ejercicios de Discusin ........................................................................................423 14. Gentica de Poblaciones 428 14.1. Las leyes de Mendel ............................................................................................428 14.2. La gentica de poblaciones clsica .....................................................................429 14.3. Ley de equilibrio Hardy-Weinberg........................................................................429 14.3.1. Ejemplos de aplicaciones de la Ley de Hardy-Weinberg 431 14.4. Heredabilidad .......................................................................................................439 14.5. Parmetros matemticos de variabilidad gentica ..............................................440 15. Gentica cuantitativa 442 15.1. Carcteres de distribucin discontinua................................................................442 15.2. Carcteres de distribucin continua.....................................................................442 16. Mapas genticos 447 16.1. Tipos de mapas....................................................................................................447 16.1.1. Mapas de ligamiento 447 16.1.2. Caractersticas de la recombinacin 451

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Mapas fsicos 453 16.1.3. 16.1.4. Mapas cromosmicos o citognicos: 454 16.2. Aplicaciones de los mapas genticos..................................................................456 16.2.1. Mapa gentico de maz 458 16.2.2. Metodologas para identificar genes 459 17. Metodologas de Mejoramiento 463 17.1. Metodologas clsicas..........................................................................................463 17.1.1. Introduccin 463 17.1.2. Importancia del ambiente 463 17.1.3. Importancia de los modos de reproduccin 464 17.1.4. Autopolinizacin o polinizacin libre 464 17.1.5. Seleccin Masal 465 17.1.6. Esquemas de seleccin 471 17.1.7. Mejoramiento por pedigr 475 17.1.8. Seleccin recurrente 477 17.1.9. Metas de mejoramiento 477 17.2. Metodologas innovadoras...................................................................................482 17.2.1. Retrospectiva histrica del mejoramiento molecular de plantas 482 17.2.2. Modernizacin de viejas herramientas 492 17.2.3. Aprovechamiento de la informacin molecular disponible 496 17.2.4. Seleccin asistida por marcadores 496 17.2.5. Nuevos esquemas de mejoramiento 498 17.3. Retos para el futuro .............................................................................................501 18. Mejoramiento Gentico de Maz 503 18.1. Introduccin..........................................................................................................503 18.1.1. Caractersticas distintivas del Maz 503 18.2. Origen y razas del Maz .......................................................................................505 18.3. Heterosis ..............................................................................................................506 18.3.1. Magnitud del vigor hbrido en maz 506 18.3.2. Teoras y Explicaciones 507 18.3.3. Grupos heterticos 507 18.3.4. Aprovechamiento de heterosis en maz 508 18.4. Manejo de Cultivo y Fitotecnia.............................................................................508 19. Anexos 509 19.1. Fundamentos varios ............................................................................................509 19.2. Cronologa de algunas teoras genticas ............................................................509 19.3. Catlogo de preguntas interesantes....................................................................510 19.4. Catlogo de respuestas a las tareas ...................................................................518

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1. Prlogo
1.1. Presentacin y enfoque
La mayora de los libros sobre mejoramiento gentico tienen un enfoque tradicional que incluye slo de manera tangencial los desarrollos cientficos modernos. Si bien existe un gran nmero de referencias bibliogrficas en ingls, los libros de texto actualizados sobre mejoramiento gentico en espaol son pocos y muy limitados. Se decidi entonces escribir un texto didctico para los estudiantes de los pases latinoamericanos. El punto de partida de este libro es la recapitulacin de los fundamentos y conceptos que son necesarios hoy en da para el mejoramiento gentico moderno. Se elabor un texto con la intencin de incluir algunos conocimientos de frontera y mostrar su posible aplicacin. Con este fin, se escogi al maz como planta modelo por su importancia cultural, social y econmica. Tambin se quiso poner nfasis en las caractersticas distintivas de este cultivo, en particular la relacionada con el fenmeno de heterosis. El vigor hbrido del maz es algo fascinante, tanto desde el punto de vista terico, como prctico. La heterosis del maz es un enigma cientfico sin resolver, y adems, le da sustento econmico a muchas empresas que comercializan semilla certificada de hbridos con altos rendimientos. En qu se diferencia el mejoramiento clsico del moderno? Bsicamente en las herramientas, pues los principios y objetivos son los mismos. Algunas metodologas permiten aproximarse a los fenmenos desde diferentes niveles de observacin y escalas de eficiencia, convirtindose de esta manera en herramientas complementarias. El fitomejoramiento tradicional y moderno no son estrategias excluyentes. De manera simplificada, se puede decir que el mejoramiento moderno no es otra cosa que el refinamiento del mejoramiento clsico. Esto se logra incorporando algunas herramientas moleculares adicionales. Cules son estas? Qu se necesita saber de ellas para sacar el mayor provecho? Algunos de los mejoradores ms experimentados son personas que estudiaron en una poca en donde no se saba mucho del DNA o no se haba inventado el PCR. Se formaron en un ambiente que no poda predecir las implicaciones de la ingeniera gentica ni tampoco prever los alcances de la genmica y la bioinformtica. El punto de partida de muchos libros de texto que abordan el tema del fitomejoramiento son las clsicas leyes de herencia de Mendel y las teoras estadsticas de la gentica de poblaciones. Podra considerarse que el libro ms avanzado sobre mejoramiento clsico es el tratado de Hallauer sobre gentica cuantitativa. Sus teoras y propuestas son una excelente referencia para todos los mejoradores. Los que dominen los conceptos de Hallauer ya son expertos en el rea. Para ser exitosos en el mejoramiento no se necesita entender la estructura del DNA ni ninguna de las implicaciones de la genmica o metabolmica. Sin embargo, en un mundo competitivo en donde la rapidez, la eficiencia y la economa son cada vez ms importantes, es crucial incorporar todas las herramientas que se han desarrollado en los ltimos aos para facilitar el trabajo y obtener mejores resultados. Es por ello que en este libro se decidi partir de los cidos nucleicos y de los fundamentos moleculares de la herencia. Usando esas bases, pretendemos acercarnos a los diferentes temas de la gentica, bioqumica, y la fisiologa vegetal, que son relevantes para incrementar el rendimiento o la calidad de un cultivo.

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1.2. Distribucin abierta

Para promover la difusin de los conocimientos incluidos en este documento con fines acadmicos y no lucrativos se ha decidido usar un formato digital as como un modelo de distribucin basado en la filosofa de cdigo abierto. La libertad de copyright significa que los usuarios tienen el derecho a imprimir y distribuir tantas copias quieran de est documento en formato digital o impreso sin tener que pagar regalas ni estar limitados por restricciones legales de impresin o de fotocopiado. Lo nico que se requiere es que siempre se cite la fuente original, y que se de crdito a los autores originales del texto. El concepto de cdigo abierto significa que cualquier investigador que desee enriquecer este documento, puede hacerlo como potencial autor contribuyente. Para ello, deber contactar al editor quien le informar de los procedimientos a seguir. En trminos generales, a los interesados se les enviar la versin ms actualizada del archivo Word para que puedan editarla con la opcin de control de cambios activada. Regresarn su versin mejorada al editor principal. El revisar la pertinencia de las correcciones y la calidad cientfica y didctica del material adicionado. En caso de que la contribucin lo amerite, el editor incluir los cambios y se le dar el crdito correspondiente al autor contribuyente para despus distribuir la nueva versin del documento a toda la comunidad. Las nuevas versiones se distribuirn cada seis meses. Hacemos una invitacin a todos los investigadores de Latinoamrica a participar en este proyecto de cdigo abierto y autora conjunta para que con su contribucin mejoren este libro. Para la distribucin masiva usaremos el formato digital pdf para una re-edicin ms rpida y flexible. La distribucin de esta informacin por medio de CDs y la Web nos permite ofrecerla de manera gratuita y masiva. Ms que cubrir los gastos de edicin y produccin por medio de la venta de ejemplares impresos con copyright restringido, trataremos de hacer sustentable este proyecto educativo por medio de un modelo de patrocinios y donaciones de parte de entidades pblicas y privadas. Alentamos a todos los maestros y profesores de universidades a usar este material informativo para sus respectivas clases sobre mejoramiento gentico y biotecnologa. Estos apuntes pueden ayudar a complementar y enriquecer sus cursos. La libertad de copyright les permite distribuir este documento gratuitamente a todos sus alumnos para que ellos puedan aprender de manera autodidacta. De esta forma, los estudiantes pueden prepararse antes o despus de la clase, y as el profesor tendr mayor libertad de usar su tiempo frente al grupo para aclarar dudas y resolver problemas. Nosotros favorecemos un modelo educativo basado en la reflexin, la experimentacin y el descubrimiento. Quisiramos fomentar el talento cientfico de los jvenes, y no restringirlos con un aprendizaje de memoria que no permite el desarrollo de la creatividad. Ms bien queremos fomentarles su capacidad de razonamiento lgico, y ayudarles a tener la mente siempre abierta para aplicar los criterios cientficos de anlisis neutral y juicio crtico. Si en la actividad acadmica o durante las clases surge alguna idea de cmo mejorar la preparacin cientfica de los estudiantes, no duden en contactar al editor para que le enven sus sugerencias concretas de como enriquecer este proyecto. La filosofa de coautora abierta solamente funciona con la participacin proactiva y entusiasta de todos los usuarios.

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1.3. Lenguaje cientfico

En este documento usamos el castellano como idioma principal y el ingls como idioma complementario. La mayor parte de este documento est en espaol. Esto con el fin de facilitar el entendimiento de algunos conceptos bsicos para los estudiantes de habla hispana. Tambin incluimos algunas secciones completas en ingls para motivar a los estudiantes a practicar el idioma internacional de la ciencia. Un estudiante que no domine la lectura en ingls, nunca podr hacer ciencia de calidad internacional. El manejo del ingls, tanto escrito como oral, es fundamental. Entre ms rpido se pueda familiarizar con el ingls, mucho mejor ser su preparacin acadmica. Estamos concientes de que en este documento no usamos el castellano con la pureza que exige la Real Academia de la Lengua Espaola. Usamos algunas expresiones regionales, en su mayor parte trminos mexicanos, pero tambin muchos anglicismos y palabras extranjeras. No quisimos traducir todos los trminos tcnicos cientficos al espaol, ya que en algunos casos se desvirtan demasiado. Es por ello que preferimos hablar de primers que de cebadores. Hablamos de tejidos sink o source y de gentica forward y reverse. Para evitar conflictos con puristas lingsticos, usamos letra itlica para todos los trminos extranjeros. Preferimos usar las abreviaciones en ingls que las homologas espaolas. Es por ello que usamos PCR (Polymerase Chain Reaction) en lugar de RCP, decimos QTLs (Quantitative Trait Loci) en lugar de LCQ, hablamos de maz QPM (Quality Protein Maize) en lugar de maz ACP. Tambin usamos los trminos de MAS (marker assisted selection) en lugar de SAM, o bien ANOVA (Analisis Of Variance) en lugar de ADV. En el caso de los cidos nucleicos, usamos las abreviaciones de DNA y RNA. En los modelos lineales usamos las letras de E (Environment), G (Genetic) y R (residual Randomness). Tambin hablamos de interacciones GxE en lugar de interacciones GxA. La inclusin de trminos cientficos extranjeros a veces crea una polmica entre colegas. Si bien podra ser tema de una larga discusin lingstica, los debates se resolvieron de manera prctica para este libro de texto. Se dejaron las variantes que el editor consider ms atractivas. Tenemos la conviccin de que el idioma no es algo esttico sino que debe evolucionar con el tiempo. La mejor forma de escribir un libro sobre mejoramiento gentico moderno es incluyendo um cierto progresismo en el seno de su estructura y lenguaje. Nadie habla hoy en da el espaol del Quijote de Cervantes. Algunas abreviaturas y trminos extranjeros con el tiempo se adoptan de forma natural. En Latinoamrica no decimos ordenador sino computadora. Hablamos de trocas, trailers y clutch. Decimos ok y bye. Son pocos los que usan los nombres completos de abreviaturas como: LASER, RAM, CPU, DVD, USB, DOLBI, etc. Actualmente no es raro escuchar a estudiantes decir: voy a blastear el cDNA para disear los primers correctos para m RT-PCR. El verbo blastear para algunos es una aberracin lingstica, mientras que para otros es de lo ms normal. Es natural decir lser en lugar de su nombre completo (Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation). De igual forma, nadie se sorprende cuando dicen que un memory stick (memoria USB) tiene un MB de RAM. Nuestros abuelitos tal vez si se queden con los ojos cuadrados. Sin embargo, este libro no es para viejitos. Este libro esta escrito para los jvenes modernos que no tienen problema de entender y adoptar diversas palabras del ingls.

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1.4. Grupos de usuarios

Este texto surge de la inquietud de combinar conocimiento actualizado sobre fisiologa, bioqumica, biologa molecular, genmica, metabolmica y bioinformtica, para aplicarlo en algo muy concreto: el mejoramiento gentico de una especie vegetal como el maz. Actualmente, los docentes de diversas universidades, de programas de biologa, agronoma y fitotecnia, entre otros, no enfatizan los conceptos anteriormente mencionados. En Cinvestav Irapuato recibimos a estudiantes con un inters muy alto en la biotecnologa aplicada y el mejoramiento gentico. Muchos vienen con muy buenas aptitudes y habilidades en los temas agrcolas, pero muy pocos pasan el examen de admisin por falta de conocimientos cientficos bsicos sobre biologa molecular, qumica, bioqumica, matemticas o ingls. Si bien este libro no pretende remediar todas esas deficiencias, por lo menos si trata de facilitar algunos de tales conocimientos. Nuestra intencin es que los estudiantes, desde una etapa temprana, fortalezcan su entendimiento y profundicen en el anlisis de los temas que se manejan en un posgrado sobre biotecnologa vegetal. Se busca apoyar la formacin de personas que sean observadoras, analticas, crticas y creativas, para que se conviertan en cientficos profesionales y se embarquen en una aventura constante para experimentar, comprobar, preguntarse y responderse. El presente documento est enfocado a los siguientes grupos de usuarios: Estudiantes avanzados de las licenciaturas de las reas biolgicas y agrcolas. Tesistas con inters de realizar un posgrado en biotecnologa, o ingeniera gentica de plantas. Docentes de universidades y profesores que imparten cursos sobre biotecnologa o mejoramiento gentico moderno. Investigadores de los departamentos de fitotecnia y biologa. Ingenieros agrnomos y tcnicos de compaas de semillas. Fitomejoradores con inquietud de aprender ms sobre biologa molecular y herramientas biotecnolgicas.

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1.5. Motivacin para estudiantes

There is no purifier in this world like knowledge; he that perfects his practice in selfless action finds that knowledge in himself in due time. Se invita, a aquellas personas que se sientan motivados por este documento, a considerar la opcin de continuar sus estudios acadmicos mas all de la licenciatura, por ejemplo, haciendo un posgrado sobre biotecnologa de plantas. Una muy buena opcin es hacerlo en Cinvestav Irapuato, o bien, en el Colegio de Posgraduados (Colpos) en Texcoco. Para tomar una decisin es muy relevante conocer el perfil de egreso de los estudiantes de maestra y doctorado. A continuacin mostramos informacin de los programas de posgrado de las instituciones de ms alto nivel para la biotecnologa de plantas en Mxico.

Cinvestav Irapuato:
Maestra en Ciencias con Especialidad en Biotecnologa de Plantas
Los egresados de esta Maestra tendrn conocimientos cientficos amplios, slidos y actualizados, tanto en la teora como en la prctica, en las disciplinas afines a las ciencias biolgicas y sus aplicaciones biotecnolgicas. Formados en un ambiente que valora la responsabilidad tica y social como componente esencial de la prctica cientfica, las aptitudes adquiridas le permitirn incorporarse directamente al mercado de trabajo, en actividades docentes en la educacin superior, como tcnicos o auxiliares de investigacin en la industria privada y el sector pblico.

Doctorado en Ciencias con Especialidad en Biotecnologa de Plantas

Los egresados de este Doctorado sern cientficos con conocimientos amplios, slidos y actualizados, tanto en la teora como en la prctica. Tendrn la capacidad de abordar problemas y de plantear y responder preguntas cientficas y de desarrollo tecnolgico, de manera rigurosa, creativa y multidisciplinaria, en reas afines a las ciencias biolgicas. Habrn desarrollado habilidades para la comunicacin, divulgacin del conocimiento y para la docencia. Su preparacin les permitir integrarse de manera competitiva, a nivel nacional e internacional, en instituciones acadmicas y de investigacin cientfica de prestigio. Podrn conformar reas propias de liderazgo e innovacin en el sector pblico y privado y participar con responsabilidad tica y social en la generacin y ejecucin de proyectos y polticas pblicas relacionadas con la investigacin y desarrollo cientfico y tecnolgico.

Que esperamos de un doctor en ciencias en Cinvestav?

El Doctor en Biotecnologa de Plantas puede hacer investigacin. Esto significa que tiene la capacidad para generar ideas, estructurar propuestas, obtener financiamiento, formular protocolos de investigacin, disear experimentos, realizarlos, analizar e interpretar los resultados, y darlos a conocer mediante la publicacin de artculos en revistas cientficas de impacto, y la participacin en congresos y otros foros. Realiza investigacin de calidad, y acta con tica. Por la excelencia de su formacin y su dominio del idioma ingls, es competitivo en el mbito cientfico nacional e internacional. Es exigente consigo mismo. Siempre busca la excelencia. Es independiente en la generacin de sus ideas y auto-dirigido en su trabajo, no-obstante su capacidad para trabajar en equipo. Sabe resolver problemas. Como investigador, empuja la ciencia constantemente hacia nuevas fronteras a travs del cuestionamiento.

Para mas detalles consultar la pgina:

http://www.ira.cinvestav.mx

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Colegio de Posgraduados:
Es una institucin mexicana de enseanza, investigacin y servicio en ciencias agrcolas, que en 1979, por decreto presidencial, se convirti en organismo pblico descentralizado del gobierno federal. Ofrece programas acadmicos sobre casi todas las disciplinas del conocimiento agronmico y afines. Su funcin es formar lderes talentosos para el sector rural. La direccin del Campus Montecillo es: Km. 36.5 Carretera Mex-Texcoco. Texcoco Edo. de Mxico C.P. 56230.

http://www.colpos.mx
Misin El Colegio de Postgraduados es una institucin educativa que genera, difunde y aplica conocimiento para el manejo sustentable de los recursos naturales, la produccin de alimentos nutritivos e inocuos, y el mejoramiento de la calidad de vida de la sociedad. Visin El Colegio de Postgraduados es una comunidad comprometida con la sociedad que fomenta el desarrollo personal, la creatividad acadmica y la generacin de conocimiento colectivo para trascender al existente a las ideologas y a la estructura disciplinaria. Reafirma los valores de la sociedad cultivando y enriqueciendo la mente y el espritu de los individuos. Sus modelos educativos y organizacionales estn actualizados y en superacin permanente. Objetivos El Colegio de Postgraduados es una institucin pblica cuyas actividades sustantivas son educacin, investigacin y vinculacin. En funcin de esas tres actividades y de la necesidad de contar con una administracin que permita realizarlas de manera eficaz, se definieron los objetivos estratgicos siguientes: Educar y formar personas creativas, innovadoras y con sentido humanista que atiendan las necesidades agroalimentarias de la sociedad en un contexto de desarrollo sustentable. Realizar investigacin generadora de conocimiento pertinente para el manejo sustentable de los recursos naturales y la produccin de alimentos nutritivos e inocuos y de otros bienes y servicios. Mejorar la calidad de vida de la sociedad y retroalimentar las actividades acadmicas a travs de la vinculacin Contar con procesos administrativos certificados que apoyen en forma eficaz y eficiente a las actividades sustantivas de la institucin.

Perfiles de los aspirantes que deseen ingresar al Colpos:

Maestra: Son aspirantes a realizar estudios de maestra en ciencias, los egresados de las escuelas profesionales de agricultura, universidades e instituciones afines con estudios equivalentes a la carrera agronmica; tambin se aceptan egresados de instituciones de enseanza superior cuyo curricula les d opcin de estudios de postgrado en el CP. Doctorado: Para realizar estudios de doctorado en ciencias se exige del aspirante una slida preparacin en ciencias bsicas y aplicadas en el campo de su especialidad, experiencia en la transmisin de conocimientos y sentido social de sus actividades. Adems es necesario haber obtenido el grado de maestra en ciencias o su equivalente.

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1.6. Patrocinadores
Los siguientes organismos e instituciones han contribuido generosamente para la elaboracin del presente documento, ya sea en trminos financieros, logsticos o intelectuales.

Unidad Irapuato

Colegio de Posgraduados

Red de Agricultura, Alimentos y Biotecnologa

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1.7. Agradecimientos
Los autores contribuyentes quisieramos agradecer a muchas personas que nos han acompaado durante la realizacin de este proyecto. Los comentarios y sugerencias de muchos estudiantes y colaboradores nos han permitido hacer de este proyecto algo mucho ms valioso de lo que imaginamos cuando iniciamos. En la primavera del 2008, este documento empez como unos apuntes de clases con menos de una docena de pginas. Ahora se ha convertido en un libro con ms de 500 pginas, en el cual se incluyen temas muy diversos y variados. Muchas gracias a todas esas personas que de forma anmima han hecho diversas correcciones y contribuciones que han sido sumamente valiosas.

1.8. Sobre los autores

Dr. Axel Tiessen Favier Laboratorio de Metabolmica y Fisiologa Molecular Departamento de Ingeniera Gentica CINVESTAV Unidad Irapuato Km. 9.6 Libramiento Norte Irapuato, CP 36821 Guanajuato, Mxico atiessen@ira.cinvestav.mx http://www.ira.cinvestav.mx El editor y los coautores de este libro se complementan mutuamente en su formacin acadmica. El Dr. Axel Tiessen Favier estudi Biologa en la Universidad de Heidelberg en Alemania. Tambien estudio un semestre en Inglaterra e hizo sus prcticas de laboratorio en el Instituto John Innes. Llev a cabo su doctorado en Bioqumica de Plantas en el Instituto Max Planck de Fisiologa Molecular de Plantas. Despus de 12 aos en Europa regres a Mxico para trabajar en un proyecto sobre tolerancia a sequa en el Centro Internacional de Mejoramiento de Maz y Trigo (Cimmyt). Posteriormente se incorpor como investigador del Departamento de Ingeniera Gentica de la Unidad Irapuato del Centro de Investigaciones y de Estudios Avanzados del Instituto Politcnico Nacional (Cinvestav). Actualmente, establece diversas lneas de investigacin sobre biotecnologa vegetal, todas ellas enfocadas a aprovechar las plantas como reactor bioqumico y fotosinttico que usa la energa solar para generar biomasa en forma de alimentos, vitaminas y otros productos de valor agregado para el ser humano y la industria. Dr. Fernando C. Gmez Merino Profesor Investigador Colegio de Posgraduados Carretera Mxico-Texcoco km 36.5 Montecillo. C.P. 56230 Estado de Mxico, Mxico fernandg@colpos.mx http://www.colpos.mx El Dr. Fernando Carlos Gmez Merino obtuvo el ttulo de Ingeniero Agrnomo de la Universidad Veracruzana en 1995. En 1997 inici sus estudios de postgrado en el Instituto de

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Recursos Genticos y Productividad del Colegio de Postgraduados, de donde obtuvo el grado de Maestro en Ciencias en 1998. De 2001 a 2004 realiz sus estudios doctorales en el Instituto de Biologa y Bioqumica de la Universidad de Potsdam, en colaboracin con el Instituto Max Planck de Fisiologa Molecular de Plantas, en Golm, Alemania. Desde 2005 es Profesor Investigador del Colegio de Postgraduados, en donde estudia los mecanismos fisiolgicos y moleculares de las respuestas de las plantas al estrs ambiental, con especial nfasis en sequa y estrs nutrimental que ocasionan algunos elementos del suelo en las plantas.

Dra. Libia Iris Trejo Tllez Profesora Investigadora Colegio de Posgraduados Carretera Mxico-Texcoco km 36.5 Montecillo. C.P. 56230 Estado de Mxico, Mxico tlibia@colpos.mx http://www.colpos.mx La Dra. Libia Iris Trejo Tllez realiz sus estudios de licenciatura en la Universidad Autnoma Chapingo, de donde 1995 obtuvo el ttulo de Ingeniero Agrnomo Especialista en Suelos. En 2000 se gradu como Maestra en Ciencias de la Especialidad de Edafologa del Colegio Postgraduados y en 2004 obtuvo el grado de Doctor en Ciencias Naturales por Universidad Libre de Berln, en Alemania. A partir de 2005 se desempea como Profesora Investigadora del Colegio de Postgraduados, donde imparte las ctedras de Mecanismos celulares de homestasis de metales en plantas y Funciones de los nutrimentos en plantas. Su lnea de investigacin se centra el estudio del efecto de los elementos benficos en las plantas y la biologa celular y molecular de la nutricin de cultivos. Dr. Misael Lpez Lozano Departamento de Fitotecnia Facultad de Agricultura y Zootecnia Universidad Jurez del Estado de Durango Dom. Conocido Venecia, CP 35000 Durango, Mxico misaelll79@hotmail.com http://www.ujed.mx Dr. Misael Lpez Lozano (BREVE SINPOSIS) Dra. Natalia Palacios Rojas (BREVE SINPOSIS) Mtro. Daniel Padilla (BREVE SINPOSIS) Mtra. Erandi Vargas (BREVE SINPOSIS)

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1.9. Formato para las citas

Los autores de este documento invirtieron mucho esfuerzo y tiempo para elaborar los diversos captulos de manera didctica y profesional. Como es comn de los trabajos cientficos que son publicados en revistas o en libros, una forma de evaluar su impacto es a travs de las citas que hacen referencia a ellos. Es por ello que pedimos que los docentes que usen los textos o figuras contenidas en el presente libro, le den crdito completo a los autores involucrados. Para facilitar la inclusin de las citas a este documento, a continuacin mostramos algunos ejemplos. El libro en su conjunto se debe citar de la siguiente manera: Tiessen, A., Gmez-Merino, F., Trejo-Tllez, L., Lpez-Fabre, A., Padilla-Chacn, D., Vargas-Ortis, E., y Palacios-Rojas, N. (2009). Fundamentos y Metodologas Innovadoras para el Mejoramiento Gentico de Maz. Edicin Primera, versin 1.36 (Bogot, Colombia: Fundacin Ciencia Activa). pp 550. ISBN: 978-970-95522-3-2 Para una cita especfica a una seccin del libro, consulte la pgina iv para revisar que autores contribuyeron a que captulo. Por ejemplo el captulo 6 se debera citar as: Gmez-Merino, F., Trejo-Tllez, L., y Tiessen, A. (2009). Cap 6. Factores de Transcripcin. p 127-163. En: Fundamentos y Metodologas Innovadoras para el Mejoramiento Gentico de Maz, A. Tiessen, ed. Edicin 1 versin 1.36 (Bogot, Colombia: Fundacin Ciencia Activa), ISBN: 978970-95522-3-2

1.10.

Gua general

El mejoramiento gentico es un arte y a la vez una ciencia. Se deriva de un conjunto de tcnicas complementarias de diferentes reas como la gentica, la agronoma, la patologa y la estadstica, entre otras. Es una tarea multidisciplinaria que requiere de un enfoque interdisciplinario. Y ms aun el mejoramiento moderno que trata de incorporar los ltimos avances de la biologa, bioqumica, fisiologa molecular y bioinformtica. El presente libro refleja esa necesidad de incluir los fundamentos de muy diversas disciplinas para que el estudiante los pueda dominar de una manera integral. Solo as podr aplicar sus conocimientos para generar un beneficio para el campo. Nuestra meta es formar personas que puedan trabajar en el laboratorio de una manera competitiva a nivel internacional, pero que a la vez sepan hacer trabajo de campo para atender las necesidades reales de los agricultores y los consumidores. El presente libro de texto est dirigido a esa nueva generacin de jvenes que quieran dedicar sus esfuerzos al mejoramiento moderno, de maz o de cualquier otro cultivo. El documento est organizado en diferentes captulos que son independientes y a la vez complementarios. Los lectores tendrn la libertad de leer el texto secuencialmente, o bien seleccionar los captulos que consideren ms relevantes, para iniciar su lectura en cualquiera de ellos. Los estudiantes

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avanzados podrn brincarse los captulos sobre los temas que ya dominan y concentrarse en aquellos para los cuales necesiten saber ms. En el captulo introductorio (captulo dos), se mencionan algunos conceptos bsicos sobre gentica, evolucin, y cidos nucleicos. En el captulo tres se explican algunas de las herramientas moleculares como la PCR y los mtodos de secuenciacin. En el captulo cuatro se habla de los polimorfismos genticos y las tcnicas de deteccin. El captulo cinco trata sobre genmica y regulacin. Ah se mencionan algunos de los proyectos genmicos tanto de plantas como de animales. En el captulo seis se explican los factores de transcripcin y su relevancia para el fenotipo de una planta. En el captulo siete se enumeran las herramientas bioinformticas que hay disponibles hoy en da, como las bases de datos del NCBI y el anlisis de secuencias con BLAST. Tambin se explican algunos de los conceptos bsicos de estadstica como las medidas centrales, varianza y tipos de error. El captulo ocho trata sobre la biologa de sistemas que incluye las reas de la genmica, transcriptomica, protemica y metabolmica. En el captulo nueve se mencionan diferentes herramientas bioqumicas que pueden ser usadas para el mejoramiento. Ah se explican las bases de las reacciones qumicas, catlisis y regulacin enzimtica, as como los fundamentos de algunas metodologas como HPLC y espectrofotometra. El captulo diez trata sobre fisiologa vegetal. Ah se mencionan los tipos de fotosntesis C3 y C4, as como la fuerza motriz del transporte vascular y las relaciones fuentedemanda, que son importantes para el rendimiento de grano. El captulo once habla sobre reproduccin y desarrollo, incluyendo la mitosis y la meiosis como base de la reproduccin sexual. En el captulo doce se explican las bases de la transformacin de plantas. Tambin se habla de los organismos genticamente modificados en un contexto ms amplio de su impacto tanto en el ambiente como para la economa globalizada. En el captulo trece se habla de la gentica clsica, incluyendo los fundamentos estadsticos de la gentica de poblaciones, como la ley de equilibrio de Hardy-Weinberg. El captulo catorce trata sobre gentica cuantitativa. Ah se habla sobre los mtodos para la deteccin de QTLs. En el siguiente capitulo se refuerzan los conocimientos sobre los mapas genticos y su uso para el mejoramiento. En el captulo diecisis se mencionan las diferentes metodologas de mejoramiento. Tanto las clsicas, como las estrategias ms modernas. El captulo diecisiete se enfoca espeficicamente al Mejoramiento Gentico de Maz. Finalmente los captulos dieciocho y diecinueve incluyen los anexos e informacin adicional. Ah podr consultar algunos catlogos de preguntas y temas interesantes, as como documentacin adicional. Se incluye un glosario de conceptos importantes, un ndice con trminos clave, y una lista de referencias y bibliografa para consulta adicional. En trminos generales, el libro tiene una estructura conceptual que se podra resumir de la siguiente forma:

Introduccin:
Biologa Ambiente Diversidad Evolucin

Fundamentos:
Biologa molecular cidos Nucleicos, estructura de genes, expresin, protenas, Gentica Leyes mendelianas, gentica de poblaciones, etc. Estadstica Azar, distribucin normal, promedio, errores, prueba T, ANOVA, etc. Bioqumica Macromolculas, Protenas, Enzimas, Metabolitos, etc. Fisiologa vegetal Fotosntesis, Desarrollo, regulacin del metabolismo, etc.

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etc.

Herramientas:
Herramientas moleculares Hibridacin, PCR, secuenciacin, marcadores, transformacin, etc. Herramientas bioinformticas Bases de datos, BLAST, anlisis de secuencias. Programas: SMS, EMBOSS, etc. Herramientas estadsticas Anlisis estadsticos, componentes de varianza, heredabilidad, etc. Programas: Excel, Fieldbook, R, etc. Herramientas bioqumicas Electroforesis, cromatografa, espectrometra HPLC, ensayos enzimticos, etc. Herramientas fisiolgicas Medicin de fotosntesis, transpiracin, clorofila, nitrgeno, estrategias de fenotipeo, etc.

Metodologas de mejoramiento:
Metodologas empricas Seleccin y serendipia. Metodologas clsicas Hibridizacin, recombinacin, seleccin por pedigr. Metodologas modernas Marcadores moleculares, fisiologa, bioqumica. Metodologas innovadoras Estrategias de fenotipo, dobles haploides, MARS, transformacin, etc.

Unidad de seleccin:
Metodologas clsicas Fenotipo Poblaciones. Seleccin en base a grupos de individuos. Pools de genes. Genotipo Plantas. Lneas individuales. Seleccin en base al genotipo de un solo individuo. Metodologas innovadoras Haplotipo Combinacin de alelos individuales. Seleccin en base a haplotipos.

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2. Introduccin
2.1. Conceptos bsicos
2.1.1. Ambiente y gentica

La gentica es una disciplina de las ciencias biolgicas, por medio de la cual se generan nuevos conocimientos sobre el funcionamiento molecular de las clulas vivas. El cido desoxiribonucleico (DNA por sus siglas en ingls de desoxiribonucleic acid) es muy importante en este contexto. La gentica nos ayuda a revelar la importancia del DNA como la molcula portadora de la informacin biolgica. Ms que ser una ciencia meramente bsica, la gentica tambin tiene un componente muy aplicado de ingeniera. Esto ha permitido desarrollar un conjunto de metodologas para manipular el DNA de una especie. Uno de los objetivos de la biotecnologa y de la ingeniera gentica es proporcionar herramientas moleculares para modificar los carcteres productivos de las especies biolgicas. Con ello se pretende lograr que algunos genes sean ms tiles y aprovechables para el ser humano. En especial, la ingeniera gentica vegetal est enfocada a mejorar la productividad de las plantas y los microorganismos benficos. Pero, cmo lograrlo de manera concreta? Cmo se puede incrementar el rendimiento de un cultivo como el maz? La tarea no es fcil. Requiere de tcnicas diversas, dedicacin, tiempo y esfuerzo. Para llegar a ser expertos en el tema hay que profundizar nuestros conocimientos sobre las bases del mejoramiento gentico. Primero hay que entender todos los fundamentos cientficos sobre el tema. Qu factores influyen en el rendimiento? La produccin agrcola en trminos de cantidad y calidad dependen de dos grandes conjuntos de factores:

Factores externos
abiticos + biticos El ambiente incluye factores fsicos y qumicos, denominados factores abiticos, como son: la disponibilidad de agua, nutrientes, luz, temperatura, etc. El ambiente externo tambin incluye factores biolgicos de interacciones ecolgicas entre diferentes especies, como por ejemplo, microorganismos simbiticos, insectos polinizadores, virus y diversos patogenos. Estos factores se denominan factores biticos.

Factores internos
genticos + epigenticos La gentica incluye una serie de factores internos sobre la herencia del DNA, como; genes, alelos, heterosis, poliploidia, epistasis, etc. Los factores genticos incluyen la informacin codificada en la secuencia nucleotdica del DNA. Tambien existe una serie de factores que no dependen de la secuencia primaria del DNA (factores epigenticos) pero que si se heredan y tambin influyen en la forma que se expresa y se manifiesta el fenotipo.

La produccin agrcola se puede incrementar al optimizar todas las variables de estos dos grandes conjuntos de factores (variables externas e internas). Es muy importante considerar los dos conjuntos de factores de forma integral, ya que el rendimiento depende del factor que es ms limitante en ese momento.

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Por ejemplo, si la limitante es la cantidad de agua que se le aplica a un cultivo, entonces no tiene caso incrementar la fertilizacin de nitrgeno ms all de un cierto lmite. De qu sirve hacer mejoramiento gentico de una forma sofisticada si las prcticas agrcolas no son adecuadas para las variedades que se estn desarrollando? Por otro lado, no tiene caso implementar la ms alta tecnologa agrcola si lo que se pretende es utilizar variedades criollas que no han sido mejoradas para esas condiciones ptimas. Es decir, el mejoramiento gentico tiene que ir de la mano con el manejo agronmico. El mejorador tiene que hacer un trabajo multidisciplinario. Tiene que saber tanto de gentica como de agronoma, patologa, fisiologa, biologa molecular y bioqumica. Y no solo debe dominar las ciencias naturales, sino que a veces tambin es muy importante saber algo de economa, sociologa, psicologa y de poltica para tener un mayor impacto. En la prctica, muy pocos cientficos dominan todas las disciplinas necesarias, por lo que el mejoramiento es una labor que debe realizarse en equipo. Se requiere un grupo de expertos con un enfoque interdisciplinario. No es la simple adicin de personas de mltiples disciplinas, sino la sinerga de diversas metodologas la que conduce al xito.

Cmo podemos optimizar las variables externas? El ambiente se puede acondicionar a travs del manejo agrcola. Esto se logra, por ejemplo, por medio de la fertilizacin, el riego, el control integral de plagas, el uso de invernaderos, etc.
La agricultura protegida, es decir, el cultivo de plantas dentro de invernaderos, es una de las tcnicas ms eficientes para incrementar los rendimientos agrcolas. Por ejemplo, en los invernaderos se optimiza la humedad relativa, se riega y fertiliza adecuadamente, se regula la temperatura, se incrementa el CO2 y se protegen los cultivos de lluvias, heladas, plagas y patgenos. Si por ejemplo a campo abierto se cosechan 200 toneladas de tomate por hectrea por ao, en un invernadero se llegan a producir hasta 600 toneladas por ao. En algunos invernaderos de Holanda ya se est rompiendo el record de mil toneladas por hectrea por ao.

Cmo se optimizan las variables internas de la gentica? El potencial gentico de una especie se puede incrementar al combinar genes y acumular alelos favorables. Esto se logra a travs del mejoramiento gentico por medio de seleccin y recombinacin. Este es un proceso que debe de ser constante y continuo, con ciclos iterativos. Muchas veces, la influencia del ambiente es mucho ms fuerte que el factor gentico. De hecho, la mayor limitante para la productividad de los cultivos vegetales es la disponibilidad de agua y nitrgeno. En promedio, los agricultores solo obtienen del 5 al 20% del mximo potencial gentico de un cultivo.
Por ejemplo, el maz puede producir hasta 16 toneladas de grano por hectrea, mientras que el rendimiento promedio en Mxico es de 2.4 ton/ha. Esto se debe a que la mayora de los agricultores siembran en tierras y localidades donde no hay suficiente nitrgeno ni agua. Algunos agricultores no obtienen los mximos rendimientos por falta de recursos o conocimientos para implementar buenas prcticas agrcolas. Si bien es cierto que se puede incrementar el rendimiento a traves de su potencial gentico, en el caso de pases con baja tecnificacin agrcola como Mxico, los factores ambientales son mucho ms limitantes para la productividad de maz a nivel nacional.

Para incrementar la produccin de grano en Mxico y Latinoamrica en general, se necesita optimizar el manejo agrcola para obtener mayores rendimientos. Sin embargo, los fertilizantes son costosos, el agua es escasa y las plagas atacan los cultivos. Es por eso que la gentica si es importante, sobre todo, si dos agricultores con el mismo suelo, insumos y manejo agrcola, comparan sus rendimientos. El uso de semilla no-mejorada o si-mejorada puede marcar la diferencia entre una agricultura rentable o no rentable. Puede significar el sustento o la ruina para un campesino y su familia. La gentica de los cultivos puede derivar en hambre o calidad de vida para pueblos enteros. El mejoramiento gentico del maz es un trabajo muy importante. Muchas personas dependen de ese cultivo para su alimentacin y sustento. El mejoramiento de especies vegetales es

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particularmente atractivo en pases megadiversos como los nuestros en Latinoamrica. El territorio mexicano cuenta con una amplia diversidad de climas, ecosistemas y suelos, lo que ha dado origen a una gran riqueza de especies, tanto animales como vegetales. Es una gran ventaja contar con un enorme acervo gentico, y debemos de cuidarlo como un patrimonio de toda la humanidad. Pero tambin es cierto que debemos de sacarle provecho a esa ventaja competitiva que nos ha dado la naturaleza. De qu nos sirve tener mucha diversidad biolgica, si las condiciones de vida de una mayora son de pobreza y marginacin? La biotecnologa vegetal nos puede ayudar a encontrar los mecanismos para que la diversidad biolgica y la riqueza natural sea una fuente de bienestar para toda nuestra sociedad.

Figura 2-1. Biotecnologa y diversidad biolgica.

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2.1.2.
2.1.2.1.

Del genotipo al fenotipo

Modelos genticos

En el siglo pasado se debati mucho acerca de la influencia del ambiente y los genes. Esta discusin no se limitaba a caractersticas de las especies vegetales, sino tambin al ser humano. Algunos decan que nuestra vida estaba determinada por el ambiente, otros opinaban que los genes lo predeterminaban todo. Hoy en da, los expertos todava no se han puesto de acuerdo acerca de algunas de nuestras habilidades. Cmo estn determinadas?, Es el talento innato que adquirimos por medio de la herencia, o es lo que aprendemos por medio de la experiencia y la educacin? Lo mismo ocurre con las plantas, qu es lo que determina la apariencia y el fenotipo de una planta? Para discutir estas cuestiones es muy importante contar con definiciones muy claras de los diferentes conceptos que vamos a utilizar. Fenotipo (F): El fenotipo es el conjunto de caracteres que se manifiestan visiblemente a nivel del individuo o poblacin. Esto pueden ser parmetros agronmicos cualitativos o cuantitativos (color, rendimiento, etc.). El fenotipo es lo que podemos observar, medir, cuantificar o cosechar. El fenotipo puede ser algo muy simple como el color del grano, pero tambin puede ser una caracterstica tan compleja, como la inteligencia o el comportamiento sexual en los seres humanos. Ambiente (E del ingls Environment): El ambiente es el conjunto de variables externas que influyen sobre el desarrollo y las funciones de un organismo. Muchas veces el ambiente controla la expresin de los genes o las protenas. Por ejemplo, la temperatura afecta la funcin de la clula, promueve la actividad de algunas enzimas o cambia el patrn de acumulacin de metabolitos. El ambiente incluye todos los factores abiticos (parmetros qumicos y fsicos) y tambin factores biticos de interacciones biolgicas y ecolgicas. Algunas variables ambientales se pueden medir, pero muchas veces no se pueden controlar en el campo. Genotipo (G): El genotipo es la suma de los genes y combinacin de alelos que tiene un determinado individuo o variedad. En trminos moleculares es la informacin gentica codificada en el DNA que est presente en el ncleo, los plstidos y mitocondrias. A nivel de especie se habla del genoma, que incluye todos los genes y su potencial de expresin. A nivel de poblacin de habla del pool gentico, mientras que a nivel individual se habla de la combinacin de alelos que estn presente en determinado genotipo. Hoy en da, uno de los temas ms importantes de las ciencias biolgicas es determinar la relacin que existe entre los genes y sus funciones especficas. Es decir, entender cmo se llega del genotipo al fenotipo y viceversa. De la genmica estructural, se est pasando cada vez ms a la genmica funcional. La secuenciacin de genomas completos es solo el principio de una tarea ms amplia dentro de la biologa de sistemas. A lo largo de la historia se han postulado varios modelos que tratan de explicar los factores que influencian el fenotipo de un individuo. Fenotipo = E Fenotipo = G Fenotipo = E + G Modelo ambientalista reduccionista Modelo genetista reduccionista Modelo aditivo simple

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El modelo aditivo asume que el factor gentico y el factor ambiental son totalmente independientes y actan de forma lineal. Sin embargo, ste no siempre es el caso. Algunas veces, el factor gentico puede tener una interaccin no-lineal con el ambiente. Un mismo alelo puede tener un efecto fenotpico diferente, dependiendo del ambiente en que se exprese. A esta interaccin que no necesariamente es aditiva ni lineal se le llama interaccin genotipo-ambiente GxE. (Genotype x Environment)

Gen A

Gen B

Ambiente

Figura 2-2. Un modelo de la determinacin fenotpica que demuestra cmo los genes y el ambiente actuan en el desarrollo interactivo para producir un fenotipo. El ambiente es como un prisma que puede cambiar la forma en que un gen se expresa a nivel de fenotipo. El mismo gen puede tener un efecto diferente dependiendo del ambiente. La combinacin de genes y la interaccion con el ambiente pueden dar lugar a fenotipos complejos. Esta complejidad significa que el fenotipo es ms que la simple suma de los efectos individuales de los genes.
De cierta forma, la interaccin gentica no-lineal contradice la nocin que generalmente nos ensean sobre los genes, derivada de los experimentos con chcharos de Gregor Mendel y las mosquitas de la fruta de Thomas Morgan. Por lo regular, un alelo que determina el color rojo o blanco de los ojos de una mosquita, va a funcionar de la misma forma, independientemente del medio en que se desarrolle el individuo. Sin embargo ste parece ser solo el caso para los caracteres bioqumicos simples. Esta relacin simple es mucho ms comn para las bacterias que para los organismos superiores. Para los caracteres fenotpicos con mayor complejidad, como el rendimiento de grano en maz, existen muchos ejemplos de que los genes no siempre actan de la misma forma, y que existe un tipo de herencia que es ms complicada de lo que generalmente se menciona en los libros de gentica clsica. Los investigadores que tienen experiencia en mejoramiento gentico estn concientes de que es un fenmeno de expresin complejo, y por eso hacen sus evaluaciones de rendimiento en diferentes localidades y en diferentes aos. De esta forma, pueden hacer un anlisis estadstico que permite calcular los efectos de G, E y GxE para tratar de identificar aquellos alelos que tienen un efecto gentico positivo y una baja interaccin con el ambiente. A esto se refieren los mejoradores cuando hablan de potencial de rendimiento y estabilidad de rendimiento. Los libros de biologa molecular muchas veces explican el concepto de la informacin gentica, simplificndolo. Por ejemplo diciendo que a partir de un gen se forma una sola protena, que siempre es la misma, y que tiene una determinada y nica funcin. Es por eso que muchos bilogos moleculares piensan que al determinar la secuencia del DNA ya saben que protena se va a formar y por ende pueden saber la funcin y el fenotipo. Recientemente se ha encontrado que a traves del mecanismo de splicing diferencial, un solo gen puede dar lugar a varias protenas diferentes. Si ya estamos convencidos de que un solo gen da origen a varias protenas, no estamos lejos de comprender porque un solo gen puede tener diferentes funciones, o que una sola protena pueda tener diferentes efectos dependiendo, del ambiente o de las dems protenas con las que se encuentre asociada.

En trminos prcticos, la interaccin GxE puede significar que un alelo puede ser favorable para condiciones de riego normal, pero detrimental bajo condiciones de sequa.
Por ejemplo, un gen que incremente el nmero de aperturas estomticass en las hojas verdes puede ayudar a que la planta tenga una mayor asimilacin de dixido de carbono. Esto ser

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benfico para la tasa fotosinttica y el rendimiento de grano en condiciones de alta humedad; sin embargo, esta misma caracterstica puede ser perjudicial si la planta se expone a una baja humedad relativa y condiciones limitantes de agua. El efecto de un gen depende del ambiente, de forma que un mismo alelo puede ser benfico o detrimental segn las condiciones particulares en que se exprese.

Para explicar esta diferencia de una respuesta gentica simple se debe de incluir el factor GxE en la ecuacin. En resumen se puede establecer un modelo ms completo como: Fenotipo = E + G + GxE Este es el modelo que en la actualidad se aplica con mayor frecuencia para el anlisis de varianzas y deteccin de QTLs (del ingls Quantitative Trait Locus). Sin embargo, hay que tomar en cuenta que este modelo todava es un poco reduccionista. Un factor que siempre est presente en todos los experimentos es el azar, y por lo tanto, se debe incluir un trmino de variabilidad residual que llamaremos R (del ingls randomness). Sin embargo, el factor R es un tanto intangible y para muchos muy molesto. Por lo regular se asume que es constante, pequeo y tiene una media de cero y una distribucin normal, por lo que en forma comn se ignora (a veces injustificadamente) y se elimina de las ecuaciones. Otro factor que tambin influye en el fenotipo, es la interaccin no lineal entre genes (interaccin GxG). Esta interaccin se expresa en forma de epistasis, heterosis y factores epigenticos.
Por ejemplo, un gen puede ser benfico en cierto fondo gentico, mientras que en otro puede ser detrimental. Un alelo puede funcionar si est presente en estado homocigtico, pero tener un efecto diferente en estado heterocigtico y viceversa. En el caso del maz, el efecto de heterosis es tan marcado (>200%), que casi todos los parmetros agronmicos importantes se tienen que evaluar en hbridos, y no en lneas homocigticas. Est fenmeno se refiere a la interaccin de gen con gen y se le puede incluir en la ecuacin como interaccin GxG.

En el presente libro enfocado a los mejoradores modernos, usaremos un modelo ms completo como: Fenotipo = E + G + GxE + GxG + R En el capitulo 8.2 explicaremos con mayor detalle como distinguir entre las diferentes variables. Daremos ejemplos de que experimentos y clculos que se deben de hacer para estimar la contribucin de cada parmetro.

2.1.2.2.

Control de variabilidad

La variabilidad fenotpica es uno de los obstculos ms grandes para el mejoramiento gentico convencional. En los ensayos de campo siempre hay mucha variabilidad. La influencia predominante del ambiente representa un problema, ya que genotipos iguales en ambientes diferentes pueden tener fenotipos muy diferentes, mientras que genotipos diferentes en un mismo ambiente pueden tener fenotipos muy parecidos. Es decir, el factor del ambiente puede ocultar a los dems factores genticos (cuando E es mucho mas grande que G).
Los mejoradores de maz tienen que identificar diferencias genticas entre variedades de menos de 1 ton/ha. Sin embargo, la variabilidad de campo muchas veces es mayor a 2 ton/ha, mientras que las diferencias entre una condicin (riego normal) y otra condicin (sequa) causa variaciones de mas de 8 ton/ha Cmo detectar diferencias sutiles con un ruido de fondo altsimo? Bajo condiciones de altsima variabilidad no-gentica, es muy difcil identificar los alelos de las variedades superiores.

Para detectar mejor las diferencias genticas, tenemos que disminuir la influencia de los dems factores que afectan el fenotipo. Interesa que el ambiente sea lo ms uniforme posible (E

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constante) para que la relacin fenotipo/genotipo sea lo menos complejo posible (F E). Esta uniformidad del ambiente ayuda a identificar mejor a los genes favorables, y as realizar las mejoras genticas deseadas, ya que la seleccin por lo general se hace sobre el fenotipo (seleccin convencional). Una de las ventajas de los marcadores moleculares es que usan la informacin del DNA y permiten as una seleccin genotpica directa. A esto se le llama seleccin asistida por marcadores moleculares (o MAS por sus siglas en ingls de Marker Assisted Selection).
Para saber si G tiene importancia y es cuantitativo para un caracter determinado en una poblacin, primero tenemos que minimizar los efectos de E y de GxE. Si el ambiente tiene la influencia mnima posible, el fenotipo depender bsicamente del genotipo. En esas condiciones podremos determinar si el fenotipo tiene cierta variabilidad y si tiene una cierta distribucin estadstica (puede ser una distribucin binomial o normal). Las distribuciones binomiales se derivan de carcteres monognicos con efectos muy marcados, mientras que las distribuciones polinomiales y distribuciones normales se explican por un gran nmero de genes involucrados (polignicos), cada uno con efecto menor y aditivo (carcteres cuantitativos).

2.1.2.3.

Matriz de parentescos

Para determinar si G tiene una influencia importante sobre el fenotipo podemos comparar el carcter de inters en individuos que comparten genes (padres-hijos, hermanos completos, medios hermanos, etc.). Hay que establecer una matriz de parentescos (ver Figura 2-3) y relacionarlo con el fenotipo. En funcin del parentesco es posible saber el porcentaje de alelos que comparten los individuos por probabilidad.

Progenitor 1
% de Homogocidad = a

Progenitor 2
% de Homogocidad = b

Progenitor 3
% de Homogocidad = c

50%

cruza

cruza

a*25% +b* 25% +50%

b*25% +c* 25%

F1

Hijo 1
100% autofecundacin

100%
Hermanos completos

Hijo 2

50%
Medios Hermanos

Hijo 3

Progenitor 4

F2

Nieto 1

25%

Nieto 2

Figura 2-3. Matriz de parentescos. Pogrenitor-Descendiente = En caso de una cruza simple, entonces los hijos (F1) compartirn 50% de los alelos con cada uno de sus padres. En caso de una autofecundacin con un solo progenitor

Si el progenitor es heterocigtico, aunque sea autofecundacin, slo se compartirn 50% de los alelos.

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homocigtico, se compartirn 100% de los alelos. Hermanos completos (misma madre y padre). En caso de que los padres sean homocigticos, la generacin F1 tendr 100% de alelos compartidos (primera ley gentica de Mendel). sta es la razn por la que los hbridos son genticamente homogneos. En la siguiente generacin F2 habr segregacin (por ejemplo del tipo 3:1 o 1:2:1). Medios hermanos (misma madre, pero diferente padre) = 50% alelos compartidos. Si los dos progenitores son heterocigticos, es decir, cada uno tienen dos alelos diferentes para un total de cuatro alelos, entonces los hermanos completos compartirn 50% de sus alelos, pero slo compartirn el 25% de las combinaciones alelicas diploides.

Si los progenitores son heterocigticos (la madre tiene dos alelos y los diferentes padres tambin tienen alelos diferentes), entonces los medios hermanos compartirn 50% de sus alelos.

El parecido entre ellos que tienen hermanos completos, en comparacin con el que tienen los hijos (F1) con sus padres (F0), es un indicador de la heterocigoticidad de los padres, y de la herencia de un carcter. Ejemplo-Maz: Si sembramos las semillas de una mazorca autofecundada (hermanos completos de un mismo padre y madre), vemos que las plantas varan mucho y el carcter que nos interesa tiene una distribucin aleatoria (curva normal) entonces, podemos decir que en este caso el factor R es grande, y el factor G influye poco (asumiendo que el factor E y GxE son constantes para todos, ya que las plantas se sembraron en el mismo surco, al mismo tiempo y bajo las mismas condiciones). En cambio, si comparamos las mazorcas de dos plantas diferentes, y vemos que los dos grupos de plantas se distinguen claramente, entonces eso nos dice que los genes si son importantes. Estudiando la distribucin de los hijos es como podremos detectar cual progenitor es mejor genticamente. Para saber la importancia de los genes es necesario una matriz de parentivos y un estudio de los fenotipos (que permitir ver qu progenitor tiene mejores genes). Si hay coherencia entre el parentesco y el fenotipo, se puede decir que la gentica si tiene un peso importante en el carcter.

2.1.3.

Biodiversidad

Ningn individuo es exactamente igual a otro; incluso dentro de una misma familia se encuentra una fuerte variacin. Se calcula que actualmente existen unas 450 mil especies vegetales y ms de dos millones de especies animales. Entendemos por diversidad biolgica o biodiversidad la variedad de formas de vida que habitan la tierra. A este conjunto se la llama la biosfera. La diversidad se compone no slo de un elemento, sino de la variacin y la abundancia relativa de especies de modo que las medidas de diversidad as consideran estos dos factores: riqueza de especies, que es el nmero de especies; y uniformidad, esto es, en qu medida son abundantes las poblaciones de cada especie. Se pueden clasificar segn los niveles de organizacin en: Diversidad gentica: Cada individuo de una especie posee una composicin gentica fruto de la evolucin de millones de aos. En el genoma est escrito el potencial de cada individuo, provocando la gran diversidad existente incluso dentro de una misma especie.

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Diversidad ambiental: La misma composicin gentica puede expresarse de diferente manera segn el ambiente y la historia del individuo, generando as plasticidad y diversidad fenotpica. Esta es la razn por la que los gemelos, aunque tengan los mismos genes, a veces sean diferentes y se comporten cada uno en su forma particular. Diversidad epigentica: Una de los mecanismos por medio del cual esas diferencias ambientales pueden heredarse a las siguientes generaciones es por medio de cambios epigenticos en el genoma. Esto se refiere principalmente a los patrones de metilacin del DNA. Los cambios epigenticos tambin se refieren a la acetilacin de las histonas y los modificadores de la cromatina. Diversidad de especies: A la diversidad global del planeta contribuyen por una parte las especies ubicuitas (especies universales) y las especies endmicas. Existen muchas especies que se encuentran muy extendidas y que en cada zona aparecen como una raza o subespecie, pero siempre dentro de la misma especie. Las especies endmicas son aquellas cuya distribucin geogrfica se limita a un rea muy localizada. Diversidad de ecosistemas: Viene dada por la multitud de ecosistemas que integran la tierra. En este nivel de diversidad existe cierta imprecisin por la ambigedad del concepto de ecosistema y la dificultad de delinear un ecosistema de otro vecino.
Un ecosistema es un sistema natural vivo que est formado por un conjunto de organismos vivos (biocenosis) y el medio fsico en donde se relacionan, biotopo. Un ecosistema es una unidad compuesta de organismos interdependientes que comparten el mismo hbitat. Los ecosistemas suelen formar una serie de cadenas trficas que muestran la interdependencia de los organismos dentro del sistema. El concepto de ecosistema tiene en cuenta las complejas interacciones entre los organismos (por ejemplo plantas, animales, bacterias, algas, protistas y hongos, entre otros) que forman la comunidad (biocenosis) y los flujos de energa y materiales que la atraviesan. Un concepto similar al de ecosistema es el de bioma, que es, climtica y geogrficamente, una zona definida ecolgicamente en que se dan similares condiciones climticas y similares comunidades de plantas, animales y organismos del suelo, a menudo referidas como ecosistemas. Los biomas se definen basndose en factores tales como las estructuras de las plantas (rboles, arbustos y hierbas), los tipos de hojas (como maleza de hoja ancha o delgada), la distancia (bosque, floresta, sabana) y el clima. A diferencia de las ecozonas, los biomas no se definen por gentica, taxonoma o semejanzas histricas y se identifican con frecuencia con patrones especiales de sucesin ecolgica y vegetacin clmax.

Los biomas tambin pueden considerarse como mega-ambientes pare el cultivo de una especie agrcola. Actualmente se distinguen diversos mega-ambientes principales para el mejoramiento de maz: Regiones templadas o Templado de ciclo corto (Iowa, Illinois, Kansas, Alemania, Inglaterra) o Templado de ciclo ms largo (Florida, Francia, Espaa) Regiones subtropicales o Valles altos (>2000 mts de altura. Etiopa, Nepal, Edo de Mxico, Hidalgo) o Subtropico (800-2000 mts de altura. India, Kenia, Jalisco, Guanajuato) o Tropico (<800mts de altura. Colombia, Brazil, Veracruz, Yucatan)

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Figura 2-4. Mapa de biomas terrestres.

2.1.3.1.

Diversidad biolgica

Figura 2-5. Diversidad de organismos eucariticos y animales.

Figura 2-6. Diversidad de hortalizas y frutas

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Figura 2-7. Diversidad de especies vegetales. Tarea 2-1 Averige el nombre comn y cientfico de algunas de las especies que se muestran en las figuras anteriores. Tarea 2-2 Refuerce sus conocimientos de botnica. Haga una lista de todas las familias de especies vegetales que conozca. Tarea 2-3 Haga un esquema de la estructura floral de las siguientes familias de plantas: poacea, brassicacea y fabacea. Cuantos spalos, ptalos, estambres y carpelos tienen las flores de esas familias? Tarea 2-4 Cual es la diferencia botnica entre flor e inflorescencia? Identifique y distinga la inflorescencia y las flores individuales del maz? Tarea 2-5 Cual es la diferencia botnica entre hoja simple y hoja compleja? Tarea 2-6 Cul es la diferencia botnica entre las espinas que se derivan de una hoja, de un tallo o de una raz? A que se refieren los bilogos cuando hablan de rganos homlogos? Tarea 2-7

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Qu especies de gramneas tienen ahuates, espinas o tricomas? Para que sirven? Los tricomas del maz como se producen?

Figura 2-8. Diversidad de formas y funciones de hojas vegetales. Tarea 2-8 A qu se refieren los cientficos cuando dicen que Mxico es un pas megadiverso? Investigue el origen de algunas especies agrcolas de consumo diario. Averige en su biblioteca o por internet cuales fueron los centros de domesticacin de las siguientes plantas: maz, trigo, arroz, frjol, chile, caa de azcar, jitomate, arroz, aguacate, cacao, nopal, papa y tabaco. Tarea 2-9 Muchas plantas de origen mesoamericano se cultivan hoy en da en todo el mundo. Sin embargo, los animales domesticados como el perro, el gato, el cerdo, el caballo, la gallina, la vaca, la cabra, la oveja y muchos animales son originarios de otros continentes. Solo el pavo (el guajolote) es de origen mesoamericano y se ha vuelto importante a nivel mundial. Es decir, de Mxico proceden muchas plantas, pero muy pocos animales con importancia econmica. Postule una hiptesis de porque sto fue as, y haga una recopilacin de informacin que le ayude a sustentarla.

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2.1.3.2.

Diversidad taxonmica

Figura 2-9. rbol de la vida a partir de ancestros comunes

Figura 2-10. Algunos ejemplos de especies de los tres dominios.

2.1.3.3.

Diversidad agrcola

En la agricultura mundial, se emplean menos de 300 especies de las 400 mil disponibles. Ms del 80% de la alimentacin mundial depende de tan solo de 3 especies (maz, trigo y arroz). Muchos cientficos estn muy preocupados por la conservacin de la diversidad biolgica y gentica de las especies silvestres. Algunas de las especies que todava no han sido domesticadas podran proporcionar genes muy valiosos. Podra ser un tesoro insustituible para el desarrollo sostenible de la humanidad durante los prximos milenios. Algunos de los genes que se podran incorporar en variedades futuras son aquellos que son responsables de resistencias a enfermedades y tolerancia a factores abiticos adversos. Tambin estn aquellos genes que podran generar nuevos colores, sabores y olores, hasta ahora inimaginados. Es por ello que la conservacin debe de ser una estrategia sistemtica de almacenamiento, clasificacin, caracterizacin, unida con bioprospeccin e introgresin. Pero no se trata solo de conservar y de almacenar. Un banco de germoplasma no tiene ninguna utilidad si no se usa tambin para caracterizacin y mejoramiento gentico.

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2.1.3.4.

Diversidad del maz

Figura 2-11. Colores y formas de mazorcas de variedades criollas. El maz es una de las especies biolgicas con mayor diversidad. Esta diversidad tan alta puede tener varios orgenes. Por un lado, el genoma de maz es de los ms plsticos y dinmicos. Esto se debe a la cantidad tan grande de transposones que contiene, y adems a la alta taza de mutacin y recombinacin. No fue una coincidencia de que los elementos genticos movibles fueran descubiertos primero en maz. Tarea 2-10 Averige quien fue Brbara McClintock. Qu fue lo que ella descubri? Qu es un elemento gentico movible? Por cules meritos cientficos le otorgaron el Premio Nobel? Tarea 2-11 Visite el sito de la Fundacion Nobel en Estocolmo y averige las contribuciones que han hecho los cientficos ms famosos en las reas de qumica y de medicina. http://nobelprize.org/ Escoja 5 premios Nobel y haga un resumen de los logros cientficos con sus propias palabras. Fue hasta despus de los aos 70s que en otras especies tambin se descubrieron los transposones. Otra razn de que sea un cultivo tan diverso, es que el maz depende 100% del ser humano para la diseminacin de su semilla y su desarrollo. Los pueblos indgenas mesoamericanos generaron una gran cantidad de razas. Estas por lo regular se distinguen por el tipo y color de grano, y no tanto por el aspecto de la planta.

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2.2. Origen de la variabilidad gentica

2.2.1. Mutaciones
2 copias idnticas

Una parte de la diversidad gentica se genera por mutaciones puntuales durante la replicacin o el ciclo celular. Por lo regular, el DNA se replica dentro del ncleo generando copias idnticas.

Gen 1
Ciclo celular Fase G1

Replicacin
Fase S

Gen 1 Gen 1
Fase G2 Mitosis Divisin Celular

Figura 2-12. Replicacin de los genes durante el ciclo celular. Por efecto del azar y fluctuaciones cunticas se pueden cometer errores al copiar el DNA. Una de las protenas responsables se llama polimerasa. Es una enzima que tiene una fidelidad de copiado mayor a 99% pero menor que 100%. Al cometerse un error de copiado, se genera una nueva variante del gen como se observa en la Figura 2-13. A esto se le llama un polimorfismo. Esta mutacin puntual puede generar un nuevo alelo. Este alelo puede tener una mejor o peor eficiencia que el original. Estas mutaciones se van acumulando durante sucesivas generaciones, de forma que con el tiempo, el alelo puede adquirir una funcin diferente. Polimorfismo

Alelo 1

Mutacin

Alelo 2

Figura 2-13. Las mutaciones dan origen a nuevas variantes de genes. Si el proceso mutagnico se combina con una duplicacin de ese gen (por ejemplo, un alelo en el cromosoma 1 se puede copiar e insertar en el cromosoma 4, obtenindose dos copias del mismo alelo en distintos loci del genoma). Por medio de mutaciones acumulativas las diferentes variantes se diversifican cada vez ms. Los alelos evolucionan de manera independiente. Con el transcurso del tiempo se obtienen genes que pertenecen a una misma familia, pero que han adquirido funciones diferentes. A estas variantes duplicadas ya no se les llama alelos sino familias de genes. Ver Figura 2-14.

Alelo 1

Duplicacin

Alelo 1a Alelo 1b

Mutaciones Mutaciones

Gen 1 Gen 2

Figura 2-14. La duplicacin y mutacin divergente genera familias de genes. El proceso de duplicacin de genes es muy comn en los organismos superiores. Cuando se secuenci el genoma completo de Arabidopsis thaliana en el ao 2000, se advirti que existan muchos bloques de genes repetidos en diferentes partes del genoma. La Figura 2-15 muestra los 5 cromosomas de Arabidopsis (lneas horizontales blancas). Las lneas verticales de colores muestran los grupos de genes que estn repetidos en diferentes cromosomas. Se puede observar que no son pocos, sino miles de genes que estn duplicados en esta planta.

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Figura 2-15. Duplicaciones segmentales del genoma de Arabidopsis. Si bien antes se pensaba que el genoma de un organismo era esttico y fijo, hoy en da se sabe que existe muchsima plasticidad durante la evolucin genmica. Por ejemplo, en maz se han secuenciado segmentos de cromosomas de diferentes variedades. Al comparar los segmentos supuestamente homlogos se han encontrado que puede haber diferencias muy grandes, por ejemplo, que hasta 30% de los genes pueden faltar o sobrar en alguna de las variedades. En la Figura 2-16 se muestra el DNA de dos variedades que comparten tres genes, mientras que el gen 3 y 5 slo estn presentes en una de las variedades, en la otra variedad tiene genes nicos.

Gen 1 Gen 1

Gen 2 Gen 2

Gen 3 Gen 4

Gen 5 Gen 6

Gen 7 Gen 7

Variedad 1 Variedad 2

Figura 2-16. Algunas lneas homocigticas de maz tienen diferentes genes en regiones homologas de sus cromosomas. Tarea 2-12 Busque artculos sobre algunos genes de maz. Ponga las referencias y haga un mapa conceptual con respecto la posible funcin de esos genes, tanto a nivel molecular como agronmico.

2.2.2.

Recombinacin

Adems de las mutaciones, otro mecanismo que contribuye de manera muy significativa a la formacin de nuevos alelos y genes es la recombinacin. Durante la meiosis los dos alelos de un padre diploide se aparean y pueden intercambiar segmentos (crossing over), formndose as dos nuevos alelos, como se muestra en la Figura 2-17.

Alelo 1 X Alelo 2

Recombinacin

Alelo 3 + Alelo 4

Figura 2-17. La recombinacin gentica crea nuevos alelos.

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Un atributo de este mecanismo es que permite generar variantes con mayor probabilidad de ser ventajosas. Una mutacin al azar tiene una gran probabilidad de ser letal, mientras que la recombinacin puede generar una variante que combine las ventajas del 5 prima (5) de un alelo, con las caractersticas superiores de la regin 3 prima (3) de otro alelo. De esta forma se puede generar un alelo recombinante mejorado (un superalelo). De hecho, parece ser que la organizacin de los genes en intrones y exones, facilita este tipo de recombinaciones entre diferentes alelos. De esta forma se pueden combinar y piramidizar mdulos de diferentes protenas, y as, generar genes con funciones novedosas. A este concepto evolutivo se le llama Exon-Shuffling (Figura 2-18).

Gen 1
Promotor Exon 1 Exon 2 Exon 3

Gen 2
Promotor Exon 1 Exon 2 Exon 3

Exon Shuffling Gen 3

Promotor Exon 1 Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 3

Figura 2-18. Exon shuffling por recombinacin. Es curioso notar que el genoma de las bacterias se caracteriza por la ausencia de exones e intrones, mientras que los genomas de organismos superiores, como el maz o el ser humano, estn repletos de ellos. Si analizamos la historia evolutiva, podramos constatar que el genoma de Zea mays ha evolucionado mucho ms rpido que el genoma de una bacteria como Escherichia coli. A qu se debe esto?

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Figura 2-19. Comparacin del genoma de E. coli, S. cerevisiae, humano y maz. Se muestran las diferencias en la densidad gnica y secuencias repetitivas. Nadie lo sabe a ciencia cierta. Tal vez sea que los intrones y el DNA basura de los organismos superiores facilita la recombinacin de exones y de esta forma se facilita la innovacin gentica. Otros procesos que podran contribuir a este fenmeno, es la ploida y los procesos de transferencia gentica por va sexual. La sexualidad incrementa la tasa de recombinacin mucho ms all de lo que las bacterias pueden lograr por medio de la conjugacin bacteriana. Todo esto combinado, es lo que ha permitido que algunos organismos evolucionen ms rpido que otros, an cuando los ciclos generativos sean mucho ms largos. Por ejemplo, un ciclo generativo de E. coli dura menos de 1 h mientras que un ciclo de maz dura ms de 3 meses. Y sin embargo, pareciera que el maz ha evolucionado ms que la bacteria coli en los ltimos cien aos. Esta es una nocin evolutiva relevante para el mejoramiento gentico, ya que cualquier mecanismo que nos ayude a acelerar la innovacin gentica facilita nuestra tarea de

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mejoramiento, ya sea, incrementando nuestra probabilidad de que la variante sea ventajosa o ayudndonos a lograrlo de manera ms rpida o eficiente.

2.2.3.

Transferencia horizontal

En la seccin anterior vimos que un gen se puede duplicar dentro de una misma especie. El gen duplicado puede quedarse cerca del gen original o transferirse entre los diferentes cromosomas (ver Figura 2-15). Podramos entonces pensar que este proceso de duplicacin y transferencia gentica tambin se lleva a cabo entre los genomas de diferentes especies? No es difcil imaginar que s puede suceder. A est fenmeno se le llama transferencia gentica horizontal (Figura 2-20) para distinguirlo de la transferencia gentica vertical (Figura 2-21) que se refiere al proceso en donde los progenitores transfieren una parte de sus genes a sus hijos de manera sexual (fenmeno de herencia).

Organismo A
Gen 1 Gen 2 Gen 3

Transferencia horizontal

Gen 1 Gen 2 Gen 3 Gen 2 Gen 3

Gen 1 Gen 2 Gen 3

Nuevo organismo
con genes adicionales

Organismo B
Figura 2-20. Transferencia gentica horizontal.

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Progenitor P1
Alelo 1a Alelo 2a Alelo 3a

Progenitor P2
Alelo 1b Alelo 2b Alelo 3b

Transferencia vertical (Herencia)

Alelo 1b Alelo 2a Alelo 3b

Descendiente F1
Figura 2-21. Transferencia gentica vertical. La transferencia gentica horizontal es un proceso muy comn en las bacterias y los microorganismos que comparten un mismo hbitat. Esto se debe, a que las bacterias tienen mecanismos especiales para transferir el DNA entre diferentes clulas. A esto de le llama conjugacin bacteriana y se lleva a cabo por medio de estructuras llamadas sex pilli. Sin embargo, las bacterias tambin pueden adquirir DNA de fuera de la clula. A este proceso se le llama transformacin gentica y es uno de los pilares metodolgicos con mayor importancia de la biologa molecular. Tarea 2-13 Averige por internet cuales son los protocolos de transformacin de bacterias mas usados en la actualidad por los laboratorios de investigacin. Haga un comparativo entre el protocolo de choque trmico (heat shock) y el protocolo de electroporacin. Cul es ms fcil? Cul es ms eficiente? Qu equipo requiere cada protocolo? Tarea 2-14 Cul de los siguientes organismos tiene un genoma plastdico: la diatomea, la vbora, la seta, el maz, la bacteria Escherichia Coli, la garrapata, el tripanosoma? Si no conoce todas las especies, consulte un libro de taxonoma. Tarea 2-15 Si la especie A tiene ms DNA por ncleo que la especie B, tienen A necesariamente ms genes que B? Explique. Qu factores determinan la cantidad de genes o de DNA de una especie?

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Tarea 2-16 Imagine que tiene cuatro variedades de maz. Los nmeros 1, 2 y 3 son de color azul, y el nmero 4 es blanco. Las cruzas siguientes fueron hechas y la progenie obtenida fue evaluada: 1x2 1x3 1x4 todo azul azul y blanco azul y blanco

Qu fenotipo es dominante, el azul o el blanco? Ahora ponga los genotipos de los cuatro maces progenitores en una lista. Use la siguiente nomenclatura: A para azul y a para blanco. Prediga los tipos de progenie y proporciones de la cruzas 2x3, 2x4 y 3x4. Tarea 2-17 Dibuje el ciclo de vida de una planta con flores. Explique el fenmeno de la doble fecundacin. Tarea 2-18 Defina la palabra dimorfismo sexual Est relacionado con el trmino polimorfismo gentico? Cul es la importancia del dimorfismo en la evolucin? Tarea 2-19 Cules son las diferencias entre individuos, familias, poblaciones y comunidades? Si no lo sabe, postule una hiptesis y defindala con argumentos. Tarea 2-20 Para hacer entre profesor y alumnos. Escoja una poblacin de plantas y animales que conozca cerca de donde usted vive. Enliste las diferencias morfolgicas entre individuos, y encuentre los dimorfismos si es que los hay.

2.2.4.

Seleccin

La seleccin natural afecta de gran manera la cantidad y la calidad de la variabilidad gentica. En realidad no es un proceso por el cual se produzcan nuevas variantes, sino todo lo contrario. Por medio de la seleccin se reduce y se restringe enormemente la diversidad gentica. Casi el 99% de la diversidad de especies que han existido en nuestro planeta se han extinguido a causa de la seleccin natural. Es decir, la seleccin es una fuerza que elimina, y de esta a forma moldea la diversidad gentica que sobrevive y puede multiplicarse y reproducirse. Podemos decir entonces que las mutaciones son parte de una fuerza creativa, mientras que la seleccin es una fuerza destructiva, y que la evolucin se da por el balance entre estas dos grandes fuerzas que en cierto sentido son opuestas (ver Figura 2-22).

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Gen 6 Gen 5 Gen 4

Mu tac ion es
Gen 1 Gen 2 Gen 3 Gen 1 Gen 2 Gen 2 Gen 3

in lecc Se

Creacin de variantes

Eliminacin de variantes

X X
Gen 1 Gen 2

Gen17

Generacin de nuevas variantes

Recombinacin
Figura 2-22. Fuerzas evolutivas de mutacin, recombinacin y seleccin. La seleccin natural puede dividirse en varias categoras: La sexual, ocurre cuando los organismos son ms atractivos para el sexo opuesto debido a sus caractersticas. Los alelos favorables se reproducen ms y aumentan la frecuencia de estas caractersticas en el patrimonio gentico comn. La ecolgica, ocurre en el resto de las circunstancias (habilidad para obtener o procesar alimento, capacidad de esconderse, huir o de defensa, capacidad para resistir fluctuaciones ambientales, etc.)
La seleccin en muchos casos implica una muerte antes de llegar a la etapa reproductiva. Cabe recalcar que la muerte del individuo despus de la etapa reproductiva no se puede considerar como seleccin natural. Cuando un individuo ya ha procreado, sus alelos ya se han transferido a la siguiente generacin. La muerte de individuos sin capacidad de reproduccin (por ejemplo abejas y hormigas trabajadoras) tampoco se considera seleccin natural.

El papel central de la seleccin natural en la teora de la evolucin ha dado origen a una fuerte conexin entre ese campo y el estudio de la ecologa. Las interacciones ecolgicas entre diferentes organismos son uno de los factores determinantes para el fitness y el xito evolutivo. Esto es lo que Darwin llamo struggle for life y Haeckel despus describi como survival of the fittest. La seleccin natural altera las frecuencias de los alelos de diferentes formas: La seleccin negativa elimina las mutaciones perniciosas de una poblacin. A este fenmeno tambin se le ha llamado seleccin purificadora, porque slo permite que sobrevivan un nmero limitado de variantes. La seleccin positiva aumenta la frecuencia de variantes benficas. Esto se debe a que los organismos portadores tienen ms xito y producen ms descendencia, que a su vez sobrevive y puede reproducirse, y por consiguiente, esa ventaja selectiva de generacin en generacin causa un cambio en las frecuencias gnicas de la poblacin. La seleccin de balanceo mantiene ciertas variaciones dentro de una poblacin. Esto se debe, a que los alelos, en algunos casos tienen un efecto de fitness positivo y en

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otros casos un efecto de fitness negativo. La seleccin de balanceo se da a travs de mecanismos tales como: La sobredominancia o vigor hbrido. Este fenmeno se debe a que un alelo en estado heterocigoto puede ser ventajoso, pero cuando se encuentra en estado homocigoto puede ser desfavorable. La seleccin dependiente de la frecuencia. Esto se puede deber a que el efecto de un alelo puede ser ventajoso cuando solo est presente con muy baja frecuencia, pero cuando est presente con mayor frecuencia en la poblacin, ese alelo ya no confiere una ventaja de fitness. Las mutaciones que no se ven afectadas por la seleccin natural, son llamadas mutaciones neutras. Su frecuencia en la poblacin est dictada por su tasa de mutacin, por la deriva gentica y el flujo gentico. Se entiende que la secuencia de DNA de un organismo, en ausencia de seleccin, sufre una acumulacin de mutaciones neutras. El efecto probable de las mutaciones es la diversificacin. Un gen que no est bajo seleccin ser destruido por las mutaciones acumuladas. ste es un aspecto de lo que se pudiera llamar degradacin genmica.

2.2.5.
2.2.5.1.

El azar
Un fenmeno universal

El azar tiene muchos nombres y muchas caras. En nuestras vidas nos confrontamos diariamente con fenmenos de incertidumbre. Va a llover hoy? Y si me deja el autobs? Llegar tarde al trabajo por un accidente de trnsito? Existe un dicho alemn que establece que en nuestras vidas no podemos tener certeza de nada; slo la muerte es cierta, necesaria e inevitable. En la naturaleza, qu tanto se da por azar y qu tanto se da por necesidad? En un sentido cientfico, podemos decir que el azar es el fenmeno que se interpone a las leyes mecansticas de la naturaleza. El azar es el error que interfiere con la repetibilidad. El azar es la incertidumbre que rompe con la regularidad de los resultados. Por ejemplo, si partimos exactamente de las mismas condiciones y repetimos un experimento con las mismas variables, nuestra expectativa es que el resultado sea exactamente el mismo. Las mismas premisas bajo las mismas reglas deben de dar las mismas conclusiones. Es como en las matemticas: uno ms uno siempre da dos. El azar es ese fenmeno observable de la vida real que rompe con esa regularidad. El azar es como la excepcin a la teora de las matemticas. Si no fuera por el azar, todo sera mucho ms fcil de pronosticar. El azar es algo inesperado e impredecible, generando variantes en los resultados, de forma que un da, uno ms uno dan dos, mientras que en otra ocasin, uno ms uno dan tres. Por lo regular decimos que esa variacin del resultado se da de forma espontnea. Pero a qu se debe esa espontaneidad? Cul es la causa? Es un capricho de la naturaleza? Es algo mgico? Si analizamos los fenmenos de espontaneidad con cuidado, podemos concluir que son igual de misteriosos que el azar. Tal vez sea solo otra palabra para el mismo fenmeno Podramos decir que las fluctuaciones se dan por una fuerza real que no entendemos del todo, pero que llamamos azar? No suena tan descabellado. El azar Es la causa inicial? S, tal vez si la sea. Es una fuerza que rompe con la inercia de los resultados siempre iguales. Es una fuerza inicial, que a su vez no tiene fin, motivo o razn? Podramos decir de forma trascendental, que es una causa inicial sin causa, o podramos simplemente decir, que es azar.

2.2.5.2.

Fuerza innovadora y fuente de diversidad

En la fsica, el concepto de fuerza est definido como la capacidad de alterar el estado de un objeto. Por ejemplo, si un automvil se encuentra en reposo (velocidad cero) una fuerza aplicada a lo largo de una distancia (una cantidad de energa), es capaz de cambiar el estado de

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reposo, generando as una variacin en la velocidad del automvil. La aceleracin del automvil ser directamente proporcional a la fuerza que se aplique, e inversamente proporcional a la masa inerte del automvil. En la fsica, el concepto de inercia refleja esa nocin de que todo permanece igual hasta que se aplica una fuerza que logra un cambio. Usando los mismos conceptos de inercia y fuerza, podemos entonces aplicarlos al fenmeno molecular del azar. Un tomo radioactivo no va a cambiar su estado, hasta que la fuerza del azar causa un efecto cuntico inesperado e impredecible. Ese cambio azaroso hace que el tomo se descomponga emitiendo una partcula radioactiva y transformndolo en otro elemento. Es as como un tomo de carbono 14 se puede convertir en un tomo de nitrgeno 14 al emitir una partcula radioactiva beta. Podemos entonces decir que el azar es la fuerza que rompe con la inercia del tomo? Es la fuerza que genera un cambio de estado. Sin el azar no habra los decaimientos radioactivos. Si no fuera por esa fuerza misteriosa, el tomo de carbono 14 seguira siendo un tomo de carbono 14 por toda la eternidad. Si no fuera por el azar, todo se quedara en el mismo estado inerte. Sin una fuerza externa, no puede haber cambios de inercia. Es por ello que en la fsica, el azar debe considerarse como una fuerza. Que se puede decir del azar en el contexto qumico y biolgico? Es el azar la fuente de diversidad? Podramos decir que el azar es una fuerza diversificadora de los elementos qumicos en el universo? Tal vez si. Por ejemplo, el azar evita que todos los tomos del universo sean solo de helio o de carbono, sino que constantemente se estn generando tomos de diferentes elementos y no siempre los mismos. Si hubiera una ley universal sobre la formacin de los elementos, entonces todas las partes del universo deberan tener la misma composicin qumica. Pero las observaciones que se han hecho es que si hay grandes diferencias entre los elementos que estn presentes en una regin u otra del espacio. Porque la Tierra tiene una composicin qumica tan diferente de Venus o de Marte? Si continuamos analizando otros ejemplos de la cosmologa o de la fsica cuntica, nos sorprenderamos de la multitud de fenmenos que tienen que ver con el azar y la incertidumbre. En la biologa, el azar tambin tiene un papel predominante. Un alelo va a seguir siendo el mismo alelo, hasta que un agente causante, es decir una fuerza mutagnica haga que ese alelo cambie. Es decir, si la ley de la complementariedad de los nucletidos del DNA debe de generar copias idnticas de los genes durante la replicacin, el azar es esa fuerza, que interrumpe esa regularidad y genera variantes diferentes a las esperadas. El azar es la fuerza que altera la inercia de un gen a no cambiar. Actualmente la visin que predomina en la comunidad cientfica es que todas las mutaciones biolgicas se dan por el azar. Esas mutaciones son las que generan polimorfismos genticos que se van acumulando con el tiempo, y de esa forma van incrementando la diversidad. Es decir, si analizamos el origen de la diversidad biolgica, llegaremos tarde o temprano a la conclusin de que el azar es una fuerza innovadora que genera cambios continuos e impredecibles. Cmo surgi la vida en nuestro planeta? Tal vez s fue un evento qumico y biolgico bastante improbable. Se dio de manera espontnea? Se dio por necesidad a causa de una ley universal? Hasta ahora no hay evidencias cientficas de que el inicio de la vida sea repetible. En el famoso experimento de Miller se generaron diversas molculas orgnicas, pero ni una sola molcula de DNA y mucho menos una clula viva. Fue un milagro el inicio de la vida en la Tierra primitiva? Pudo haber sido por un capricho del azar? Tal vez no podamos contestar todas esas preguntas de manera cientfica, pero si podemos formular una hiptesis bastante tangible: el azar es el origen de la diversidad en el universo. Podemos darle muchas vueltas al asunto como filsofos, pero lo que nos correspondera como cientficos, es hacer experimentos para comprobar o descartar esa hiptesis.

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Tarea 2-21 Para realizar entre profesor y alumnos, se sugiere trabajo en equipos y discusin plenaria. Se le ocurre algn experimento que se pueda hacer para comprobar esa hiptesis? Piense en algn sistema modelo, disee un experimento, escriba el protocolo y hgalo. Si no puede hacer el experimento en la vida real, concbalo en su imaginacin. Discuta sus ideas con otros compaeros; estudiantes y maestros.

2.3. Evolucin
2.3.1. Evolucin biolgica
Generalmente se denomina evolucin a cualquier proceso de cambio en el tiempo. La palabra evolucin se usa en el mbito social, econmico y biolgico. Esto no implica que sea un cambio para bien o para mal, ni para mejor o peor. Es simplemente cambio. Es por ello que la evolucin no debe tener ninguna connotacin hacia una direccin fija o especfica. Una de las mejores formas de representar el camino impredecible de la evolucin es por medio de una famosa caricatura sobre la evolucin del hombre.

Figura 2-23. Caricatura de la evolucin que representa un cambio de apariencia a lo largo del tiempo. La evolucin puede ser hacia una direccin como hacia otra. En el contexto de las ciencias de la vida, la evolucin es un cambio, que puede llevar a la aparicin de nuevas especies, a la adaptacin a distintos ambientes o a la aparicin de novedades morfolgicas. La evolucin biolgica es el proceso continuo de transformacin de las especies a travs de cambios producidos en sucesivas generaciones, y que se ve reflejado en el cambio de las frecuencias allicas de una poblacin. Es decir, es un cambio en el perfil gentico de una poblacin de individuos. A menudo existe cierta confusin entre hecho evolutivo y teora de la evolucin. Se denomina hecho evolutivo a un suceso que est sustentando por abundante evidencia. Se refiere a hechos observables, comprobables, independientes y complementarios. Por ejemplo, el hecho de que los seres vivos estn emparentados entre s y han ido transformndose a lo largo del tiempo. Esto por lo tanto se le llama hecho cientfico. La teora de la evolucin es el modelo cientfico que describe la transformacin evolutiva y explica sus causas. La evolucin como teora puede tener algunas imperfecciones, pero la evolucin como hecho es bastante obvia e irrefutable. Por ejemplo, puede ser que las teoras evolutivas actuales todava le asignen pesos diferentes a las diferentes causas de la evolucin, es decir, que le asignen una importancia diferente a las diversas fuerzas motrices, como seleccin natural, seleccin artificial, seleccin

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sexual, migracin, mutacin, deriva gentica, azar, etc. Pero por otro lado, es un hecho evolutivo que los perros y los lobos tuvieron un ancestro en comn. Hay suficiente evidencia para sustentarlo y se puede comprobar de manera experimental.
Casi nada en la biologa tiene sentido, si no se mira desde la perspectiva de que los organismos se originaron unos de otros, y que las especies se transforman con el tiempo. Si no se tiene esa nocin de que cada generacin hereda ciertas caractersticas de sus progenitores, pero que estn acompaadas de algunos cambios, no tendra sentido intentar hacer mejoramiento gentico. Las personas que dicen tener dudas sobre la teora de la evolucin, no es que no crean en la evolucin, sino ms bien que tienen dudas sobre los procesos causales y las razones finales. Por ejemplo, la evolucin tiene un fin? Existe una razn superior? Hay diseo en la naturaleza? Podemos hablar de un propsito? Es el azar o una voluntad misteriosa? Puede haber una inteligencia divina dirigiendo la evolucin?

Tarea 2-22 Para realizar entre profesor y alumnos. Conoce algunos ejemplos de evolucin de algn organismo? Haga una bsqueda bibliogrfica y presente algunos indicios de evolucin. Discuta la evidencia de manera crtica con otros compaeros, estudiantes y maestros. Tarea 2-23 Busque informacin sobre alguna teora cientfica sobre el origen de la vida. Puede empezar por la propuesta por Oparin y Haldane. Qu es lo que propusieron?, En qu se basaron para hacer sus afirmaciones? Con qu experimentos se podra confirmar esta teora? Tarea 2-24 Qu aportaciones hizo Stanley L Miller y Harold Urey al conocimiento sobre el origen de la vida? Investigue los detalles sobre su famoso experimento. Tarea 2-25 Qu obras ha escrito el bilogo mexicano Antonio Lazcano Araujo sobre el origen de la vida? Investigue ms sobre sus artculos y comprtalo con sus compaeros.

2.3.1.1.

Teoras originales

El Creacionismo, es la visin de que en un grado u otro, los seres vivos tienen un creador personal, consciente y divino (lase Dios). El Creacionismo original asume que las especies son inmutables, es decir, que no cambian con el paso de las generaciones. En algn momento se di un solo acto de creacin que gener a todas las especies que conocemos actualmente. Es una posicin religiosa o filosfica que no puede probarse experimentalmente, y por tanto no es una teora cientfica. No obstante, en el marco de la cultura popular anglosajona, algunos se esfuerzan por presentarla como tal. Pero la comunidad cientfica en su conjunto considera tales intentos como una forma de propaganda religiosa de carcter medieval en pleno siglo XXI. Una vertiente mas avanzada del Creacionismo, parte de mltiples actos de intervencin divina, a partir de cuales se van creando nuevas especies de forma continua, a la par de que otras especies van desapareciendo por medio de seleccin y catstrofes. El Lamarkismo es la suposicin de que el fenotipo de un organismo puede dirigir de alguna forma el cambio del genotipo en sus descendientes. Es una posicin terica ya casi indefendible, en la medida en que es incompatible con lo que sabemos sobre la herencia; y tambin porque todos los intentos por hallar pruebas de observacin o experimentales, han fracasado. Sin embargo, a nivel molecular, todava existen algunas dudas sobre la capacidad de las clulas de alterar su informacin gentica para adaptarse al medio. Como ejemplos se pueden mencionar la induccin de mutaciones en las bacterias expuestas a condiciones ambientales adversas, o el

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sistema inmunolgico de los humanos, en donde se inducen ciertos cambios en las regiones hipervariables para la formacin de anticuerpos ms selectivos despus de la exposicin previa con un antgeno patgeno. Todava no se puede contestar con certeza si existe o no algn fenmeno de adaptacin en la naturaleza, es decir, que se d una modificacin de los genes en dependencia del medio o la experiencia previa del organismo. Robert Chambers fue el primer cientfico en postular una hiptesis que contradeca la nocin generalizada de su poca. La visin que predominaba era que el universo, y en lo particular las especies biolgicas eran inmutables. Esta hiptesis de cambios continuos la postul en su libro Vestiges of the natural history of creation que fue publicado en Londres en 1844, mucho antes que el libro famoso de Darwin. Este libro fue un bestseller de la poca. Contena ideas tan radicales para ese entonces, que su autor decidi publicarlo de manera annima, para no ser vctima de una inquisicin del tipo religiosa. El problema ms grave de las teoras de este tipo era que ponan en peligro la justificacin divina del orden establecido; de ah que, en general, los conservadores se opusieran con uas y dientes a ellas. Fue slo hasta despus de su muerte que se supo quien haba sido el autor original de esa obra. Charles Darwin y Alfred Russel Wallace propusieron la seleccin natural como principal mecanismo de la evolucin. El ms famoso libro de Darwin On the Origins of species by means of Natural Selection, fue publicado en 1859, mucho despus de que Darwin hubiera publicado sus memorias del viaje a Suramrica en los barcos de su majestad inglesa durante los aos 1826-1836 (Voyages of the Adventure and Beagle. Darwin 1839). Hoy en da se ha generado el mito de que Darwin invent la teora de la evolucin durante su estancia en las islas Galpagos. Si uno lee las memorias de su viaje en el Beagle publicadas en 1839, son pocas las alusiones a su posterior teora. Es probable que Darwin haya sido mucho mas inspirado por los mejoradores y los criadores de pichones de la poca. Darwin tambin fue apresurado por la carta de otro naturalista que trabajo en lo que hoy en da es Nueva Guinea, Java, Borneo e Indonesia. Es notable que el joven Wallace se le adelantara a Darwin en la publicacin de sus ideas. En 1855 Wallace public un artculo titulado "On the law which has regulated the introduction of new species" donde defenda el hecho de la evolucin, aunque sin atribuirle una causa. Tres aos ms tarde, un nuevo artculo "On the tendency of varieties to depart indefinitely from the original type" propona la seleccin natural como el mecanismo explicativo de la transmutacin de las especies. Wallace remiti el artculo a Darwin para su revisin. Cuando ste lo ley, se encontr con lo que calific como el mejor resumen imaginable de las ideas que l mismo llevaba gestando trabajosamente desde haca ms de veinte aos. Tras consultar con Charles Lyell, Darwin realiz una presentacin pblica de su manuscrito ante la Sociedad linneana de Londres el 1 de julio de 1858, acreditando a Wallace como codescubridor. Cita completa del trabajo original: Darwin, C. R. and A. R. Wallace. 1858. On the tendency of species to form varieties; and on the perpetuation of varieties and species by natural means of selection. [Read 1 July] Journal of the Proceedings of the Linnean Society of London. Zoology 3 (20 August): 46-50. Communicated by Sir CHARLES LYELL, F.R.S., F.L.S., and J. D. HOOKER, Esq., M.D., V.P.R.S., F.L.S Es interesante notar que el trmino de evolucin originalmente se usaba para referirse a la historia humana en un contexto social. El trmino que se usaba para el cambio de las especies biolgicas a lo largo del tiempo era transmutacin. En esa poca el concepto de mutacin se refera al cambio en la geologa, y no como se usa actualmente en contexto biolgico. Hoy en da nadie habla ya de transmutacin, aunque en esencia, las mutaciones son las verdaderas causantes de que se formen nuevas especies, y no la seleccin natural como postul Darwin originalmente. La seleccin natural solo se limita a eliminar individuos que no sobreviven en la lucha por la vida (struggle for life), y por consiguiente, no se puede eliminar algo que no se ha creado anteriormente. En otras palabras: sin previa mutacin que genera diversidad, no puede haber seleccin.

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En la poca de Darwin, los cientficos no conocan cmo se heredaban las caractersticas. No se saba nada de los genes ni del DNA. Darwin tampoco conoca la fuente de las variaciones en los organismos individuales, pero s observ que siempre estaban presentes, y adems, que parecan ocurrir aleatoriamente. En trabajos muy posteriores otros cientficos atribuyeron la mayor parte de estas variaciones a las mutaciones en los genes. Es por ello que hoy en da, un ttulo mas adecuado para un libro de evolucin sera algo como: On the origins of species by means of transmutation, and the mecanism of adaptation by means of natural selection. La Teora de la Evolucin de Darwin ha sido enriquecida desde su formulacin en el siglo XIX, por avances en otras disciplinas relacionadas, como la biologa molecular, la gentica del desarrollo, embriologa o la paleontologa. Wallace y Darwin fueron los primeros en postular un mecanismo evolutivo por medio de la seleccin natural. La teora ms popular hoy en da es la sntesis de las ideas de muchos cientficos.
En la actualidad sabemos que en algunos aspectos Darwin se equivoc. Darwin fue un pionero del pensamiento para su poca, aunque en realidad Robert Chambers fue mucho ms adelantado con su libro de Vestiges. Hoy en da sabemos que las ideas en el libro Chambers tuvieron muchas fallas. De igual forma sera errneo e impreciso decir que Darwin tuvo razn en todo. De hecho, ms que los bilogos, son los socilogos e historiadores que entienden como algunos de los grandes cientficos tuvieron razn en parte, pero que sus teoras originales mostraron algunos errores que poco a poco se han ido modificando y refinado. Cmo iba a saber Darwin algo sobre las mutaciones del DNA, si ni siquiera se conoca nada de los genes en su poca? Es importante tener presente que los grandes descubridores, pensadores o sabios, fueron y son humanos, capaces de equivocarse, y con frecuencia lo hacen. Nos podemos dar cuenta de ello si despus de varios siglos estudiamos todos los aspectos de sus teoras con mximo detalle. Lo mismo que Lineus o Darwin en la biologa podemos decir de Kepler, Copernico o Newton en la fsica. Eso no significa que las teoras originales sean errneas, simplemente que estuvieron incompletas y que algunos hechos hoy en da se pueden interpretar mucho mejor.

Tarea 2-26 Consiga el libro o en su caso por internet el texto original de Charles Darwin (On the origins of species by means of natural selection). Puede encontrarlo en la pgina web del proyecto Gutenberg (www.gutenberg.org). Otro sitio donde puede encontrar todas las obras originales de Darwin es: http://darwin-online.org.uk Lea cuidadosamente la introduccin de Origins y el resumen y trate de ver si encuentra algunas diferencias con respecto a la teora actual. Cul es el verdadero papel de la seleccin natural? Es una fuerza creadora que genera nuevas especies o es una fuerza destructiva que elimina variantes? A qu se refiere Darwin cuando habla de mutacin? A quin le dara ms crdito cientfico: a Chambers, a Darwin o a Wallace? Por qu? Es interesante notar que gran parte de la argumentacin del texto de Darwin no proviene de las islas Galpagos como generalmente se cree, sino principalmente de la domesticacin de animales y del mejoramiento gentico. Es decir, Darwin us el concepto de seleccin artificial que ya se conoca en su poca y postul que un mecanismo similar funcionaba en la naturaleza. Eso, fue a lo que le llamo seleccin natural. Lo revolucionario de su texto no fue el concepto de seleccin per se, sino que que dijo que exista una seleccin sin la supervisin del ser humano (seleccin natural). Para muchas personas de la poca esto era inconcebible, ya que el concepto de seleccin implicaba que alguna inteligencia superior deba estar supervisando este proceso, as como los mejoradores escogan sus pichones favoritos y tomaban decisiones de cmo deban hacer las cruzas entre individuos. Histricamente, el ser humano tiene mayor experiencia emprica sobre el mejoramiento artificial que sobre la evolucin natural. Esto est documentado, puesto que Darwin dedic varios libros y captulos a la crianza de palomas, ovejas, etc.

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Tarea 2-27 Consulte la pgina http://darwin-online.org.uk y haga una lista de los trabajos originales de Darwin que tuvieron como tema la domesticacin y el mejoramiento de las especies.

2.3.1.2.

Teora actual (sntesis moderna)

Actualmente, la teora de la evolucin combina las propuestas de Darwin y Wallace, las interpretaciones de Huxley, con las leyes de Mendel y otros avances genticos posteriores; por eso es llamada Sntesis Moderna o Teora Sinttica de la Evolucin. Los principales contribuyentes a esta sntesis fueron Thomas Hunt Morgan, R. A. Fisher, Theodosius Dobzhansky, J.B.S. Haldane, Sewall Wright, William Donald Hamilton, Cyril Darlington, Julian Huxley, Ernst Mayr, George Gaylord Simpson, y G. Ledyard Stebbins. Tarea 2-28 Consiga y lea algunas de las publicaciones que definieron la sintess moderna de la evolucin: Qu aportaciones hizo cada uno? Fisher, R. (1930) The Genetical Theory of Natural Selection ISBN 0-19-850440-3. Haldane, J. B. S. The Causes of Evolution, Longman, Green and Co., 1932; Princeton University Press reprint, ISBN 0-691-02442-1 Huxley, J. S. Evolution: The Modern Synthesis, Allen and Unwin, 1942 ISBN 0-02846800-7 En el seno de esta teora, la evolucin se define como un cambio en la frecuencia de los alelos en una poblacin a lo largo de las generaciones. Este cambio puede ser causado por uno o varios mecanismos diferentes: seleccin natural, deriva gentica, mutacin, migracin (flujo gentico). La evolucin biolgica es un fenmeno natural, real, observable y comprobable empricamente. La Sntesis Evolutiva Moderna es una teora robusta y ampliamente aceptada por la comunidad cientfica. Aunque algunos detalles son cuestionados por algunos investigadores. Actualmente proporciona explicaciones y modelos matemticos sobre los mecanismos generales de la evolucin o los fenmenos evolutivos, como la adaptacin o la especiacin. Como cualquier teora cientfica, sus hiptesis estn sujetas a constante crtica y comprobacin experimental. Dobzhansky, uno de los fundadores de la sntesis evolutiva moderna, la defini del siguiente modo: "La evolucin es un cambio en la composicin gentica de las poblaciones. El estudio de los mecanismos evolutivos corresponde a la gentica poblacional." La sntesis moderna de la evolucin se basa en tres aspectos fundamentales: La ascendencia comn de todos los organismos a partir de un nico ancestro. El origen de nuevos caracteres en un linaje evolutivo. Los mecanismos por los que algunos caracteres persisten mientras que otros desaparecen. Las mutaciones introducen nuevas variaciones genticas, siendo la principal fuente de diversificacin y de evolucin. En la teora sinttica, la mutacin tiene el papel de generar diversidad gentica sobre la cual acta la seleccin natural, y tambin la deriva gnica. Las mutaciones que afectan a la eficacia biolgica del portador, y por tanto son objeto de la seleccin natural, pueden ser deletreas (negativas), beneficiosas (positivas), o bien neutras. Las mutaciones beneficiosas son las menos frecuentes, aunque se conocen muchos ejemplos que afectan a rasgos especficos, como la resistencia a enfermedades o a estrs, la longevidad, el tamao, la capacidad para metabolizar nuevas sustancias, etc. La mayor parte de las

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mutaciones son neutras; no afectan las oportunidades de supervivencia y reproduccin de los organismos, y se acumulan con el tiempo a una velocidad ms o menos constante. Algunas mutaciones son deletereas, por ejemplo, cuando se interrumpe un gen que es importante para mantener a una celula viva. En esos casos se dice que la mutacion es letal, y por consiguiente, desaparace rpidamente del fondo gentico de la poblacin por la presin selectiva tan alta. La mayora de los bilogos creen que la adaptacin ocurre fundamentalmente por seleccin natural en etapas, mediante la acumulacin de variaciones genticas ventajosas con efectos relativamente pequeos. Las macromutaciones, por el contrario, producen efectos drsticos, fuera del intervalo de variacin normal de la especie. Se ha propuesto que quiz hayan sido responsables de ciertos rasgos adaptativos o de la aparicin de novedades evolutivas, aunque, dado que algunas mutaciones suelen tener efectos muy nocivos o letales, esta va se considera actualmente poco frecuente, pero no por eso menos importante. La duplicaciones gnicas ocurren cuando las familias multignicas estn presentes en muchos genomas; por ejemplo en las globinas. Pueden surgir por duplicacin de todo el genoma, o pequeos bloques o genes. Los mecanismos de duplicacin incluyen: entrecruzamiento desigual, errores de replicacin, transposicin, poliploida, etc. Por ejemplo, el 45% del genoma humano est compuesto de transposones. En maz, se cree que el genoma se duplic antes de ser domesticado, por lo que se dice que es una especie autotetraploide. La seleccin natural tambin consiste en la reproduccin diferencial de los individuos, segn su dotacin gentica, y generalmente como resultado del ambiente. Existe seleccin natural cuando hay diferencias en eficacia biolgica entre los individuos de una poblacin, es decir, cuando su contribucin en descendientes es desigual. La eficacia biolgica puede desglosarse en componentes como: la supervivencia (la mortalidad diferencial es la tasa de supervivencia de individuos hasta la edad de reproduccin), la fertilidad, la fecundidad, etc.

2.3.2.

Evolucin dirigida

Algunas personas tienen una visin progresista de la evolucin. Por ejemplo, de que el destino de las bacterias primitivas es la de evolucionar hacia convertirse en organismos multicelulares complejos. Es decir, de que la evolucin consiste en progresar de lo simple como una bacteria a lo complejo como un ser humano. Algunos consideran a la especie humana como la cspide de la evolucin, y muchas veces esto est tan arraigado dentro de nosotros que lo reflejamos en nuestra religin y cultura.

Figura 2-24. Caricatura de la evolucin progresiva de Darwin.

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Sin embargo, otros piensan que esto es un punto de vista antropocntrico, ms que cientfico. La evidencia cientfica actual no es suficiente para sacar una conclusin definitiva. Sin embargo, la evolucin natural no parece tener una direccin especfica, ni un camino predeterminado. No sabemos si la evolucion tiene una direccin, pero si es que la tiene, entonces no tiene un rumbo fijo predeterminado. Es decir, no es un rumbo definido para siempre, sino que el rumbo puede cambiar con el tiempo y segn las circunstancias. La historia evolutiva esta llena de accidentes, cataclismos y sorpresas. No se puede decir que exista una presin selectiva universal. Hay organismos que con el tiempo se han hecho ms complejos o grandes, pero tambin hay muchos casos contrarios de organismos que se han hecho menos complejos o pequeos. Lo que si se puede constatar es que existe una fuerza continua de innovacin que genera siempre nueva diversidad gentica. Esta diversidad biolgica tiende a ocupar todos los nichos ecolgicos libres (Figura 2-25).

Hace 3 mil millones de aos

Bacterias

Evolucin

Hoy
Sin tendencia evolutiva Evolucin por difusin

B A
Organismos superiores Complejidad

Complejidad
Con tendencia evolutiva Evolucin con direccin

Nivel mnimo

C
Complejidad

Figura 2-25. Curvas de distribucin segn diferentes tendencias evolutivas. El panel A muestra la situacin original hace mas de mil millones de aos. El panel B muestra un ejemplo de evolucin sin una tendencia fija, es decir, evolucin por difusin. En este caso el promedio no cambia. El panel C muestra un ejemplo de cmo se comportara la distribucin, si existiera una tendencia evolutiva que hiciera que todas las especies se vuelvan cada vez ms complejas. En este caso, el promedio si cambia. Idea basada en los argumentos de Stephen Jay Gould (Full House: The spread of excellence from Plato to Darwin).
Many people wrongly believe that the process of evolution has a preferred directiona tendency to make organisms more complex and more sophisticated as time goes by. Those who believe in evolution's drive towards progress often demonstrate it with a series of organisms that appeared in different eons, with increasing complexity, e.g., "bacteria, fern, dinosaurs, dog, man". Gould explains how these increasingly complex organisms are just one

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hand of the complexity distribution, and why looking only at them misses the entire picturethe "full house". He explains that by any measure, the most common organisms have always been, and still are, the bacteria. The complexity distribution is bounded at one side (a living organism cannot be much simpler than bacteria), so an unbiased random walk by evolution, sometimes going in the complexity direction and sometimes going towards simplicity (without having an intrinsic preference to either), will create a distribution with a small, but longer and longer tail at the high complexity end.

Tarea 2-29 Trate de recabar informacin biolgica que le permita distinguir si la curva de distribucin de las especies se comporta ms como el recuadro de arriba o el de abajo en la Figura 2-25. Es decir, trate de responder por si mismo si existe alguna tendencia evolutiva universal que aplique para todos los seres vivos.
Si existiera una tendencia evolutiva universal, entonces uno debera ver que todos los organismos se han desarrollado en esa direccin, y es por eso que el promedio tambin debera de cambiar con el tiempo. Es decir, la evolucin con direccin se debe observar por medio de la comparacin de los promedios y no de los extremos. Mediante la evolucin por difusin el promedio general no cambia. Simplemente es que la curva de distribucin se hace ms amplia. La evolucin por difusin se debe observar a travs de la comparacin de los lmites de los extremos. Si antes no haba organismos tan complejos, con el tiempo han surgido algunos cuantos por el simple hecho de que estn tratando de ocupar nuevos nichos ecolgicos que antes estaban libres. La curva de distribucin se amplia hacia la derecha, mientras que no puede ensancharse para la izquierda porque existe un mnimo de complejidad ms abajo del cual un organismo biolgico no puede reproducirse (barrera de mnima complejidad). Esta barrera mnima posiblemente est representada por algunas bacterias o micoplasmas, que son las clulas ms simples que se conocen. Un nicho ecolgico que todava est libre, es el de un organismo tolerante que sepa desarrollarse de manera sustentable y no se autodestruya. La especie humana puede acabar extinguindose como los dinosaurios o transformarse para seguir ocupando un nicho ecolgico privilegiado, en nuestro limitado planeta.

2.3.3.

Mejoramiento: evolucin en accin

La meta de un mejorador es obtener plantas o cultivos diferentes. El mejorador quiere lograr un cambio, de preferencia, benfico. Por lo regular se trata de obtener una mayor produccin en trminos de cantidad y calidad. La evolucin biolgica es un cambio a lo largo de millones de aos, sin embargo, es un cambio que se da al azar y no tiene direccin. A diferencia, el mejorador quiere lograr un cambio independientemente del azar, y adems, s quiere darle una direccin especfica, y por si fuera poco, no quiere esperar miles de aos para lograrlo. Es por eso que podemos decir, que el mejoramiento gentico es un proceso de evolucin dirigida, en donde la eficiencia y la rapidez son parmetros importantes.
Es interesante recalcar que el mismo Darwin cuando exhibi su famoso libro sobre el "Origen de las Especies", bas gran parte de sus argumentos en la seleccin artificial de los mejoradores genticos de la poca. En sus libros dedic varios captulos a la seleccin artificial y la domesticacin de animales y plantas por la mano del hombre. Hay que recordar que la idea novedosa que postul Darwin, es que tambin exista un proceso de seleccin en la naturaleza, y que ese proceso -al que llam seleccin natural- era responsable de que los organismos silvestres pudieran cambiar tan drsticamente a lo largo del tiempo.

El mejoramiento gentico es un proceso iterativo, con ciclos repetitivos de mutacin, recombinacin y seleccin. Es por eso que en realidad el mejoramiento no es otra cosa ms que evolucin en accin. La evidencia histrica indica que se ha logrado un gran avance, ya que a partir de la revolucin verde en los aos 50, la produccin de trigo y de maz en pases desarrollados se ha incrementado a un ritmo promedio de alrededor del 10% por dcada (ver Figura 2-26).

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Figura 2-26. Rendimiento de maz en Estados Unidos. Se indican los periodos dominados por variedades de polinizacin libre (OPVs), hbridos dobles e hbridos simples junto con los coeficientes de regresin. Crow, J. F. (1998) Genetics: 148 p923-928. Existen diferentes tipos de bushels en Estados Unidos (los hay de 60, 56 y de 48 libras), pero posiblemente en esta figura se refieren a los bushels de 60 libras. 1 Bushel por Acre equivale aproximadamente a 0.067 toneladas por hectrea. En 2008 el rendimiento promedio de maz en Mxico fue de 2.4 ton/ha lo que equivale a 36 bushels per acre. Estos bajos rendimientos se deben a las pobres prcticas agronmicas y tambin a que en Mxico actualmente predominan los materiales criollos ms que los materiales hbridos. Para incrementar el rendimiento en Mxico, es necesario hacer ms trabajos cientficos y desarrollos tecnolgicos. Sin embargo es importante resaltar, que cuando una tecnologa se importa, sin adecuarla a las condiciones del lugar, puede traer graves consecuencias desfavorables, como ocurri con la revolucin verde en la mayora de los pases de frica. Es por ello que la transferencia de tecnologa se debe hacer con criterios cientficos, ecolgicos, econmicos y sociales. En trminos globales, se puede decir que el mejoramiento ha sido todo un xito por el incremento en la productividad. Durante los ltimos 50 aos ha habido un aumento continuo y constante de los rendimientos por hectrea. Los datos los podemos consultar en las bases de datos de la FAO (ver siguientes figuras). El impacto que esto ha generado en la alimentacin mundial es innegable.

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Yield
Maize World
6 y = 0.063x - 121.7 R2 = 0.9598 4

Rice World Wheat World

y = 0.0524x - 100.87 R2 = 0.9838 y = 0.0404x - 78.03 R2 = 0.9716

Mg/ha
2 0 1960
FAOSTAT 2009

1970

1980

1990

2000

2010

year

Figura 2-27. Rendimiento promedio global de los 3 cereales ms importantes del mundo: maz, arroz y trigo. Se puede ver que la productividad ha aumentado de forma lineal desde hace ms de 40 aos. Fuente de datos: Faostat 2009. Este logro se debe al trabajo combinado de los mejoradores y los agrnomos. La curva de regresin muestra que los incrementos para cada cereal han sido diferentes. El maz tiene la tasa ms alta con una ganancia promedio de 63 kg/ha*ao, seguido por el arroz con un incremento de 52 kg/ha*ao y el trigo con 40 kg/ha*ao. El mayor rendimiento de grano se obtiene con maz (>4 ton/ha), debido a su fotosntesis ms eficiente. El maz es C4, mientras que el arroz y el trigo tienen fotosntesis tipo C3.

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World Cereal Production

800 750

Maize World Rice World Wheat World

ton Millones

700 650 600 550 500 450 1989

1994

1999

2004

2009

year
FAOSTAT 2009

Figura 2-28. Produccin global de los 3 cereales ms importantes del mundo: maz, arroz y trigo. Se puede ver que en 1989 el cereal ms producido en el planeta era el trigo, seguido por el arroz y por ltimo el maz. A partir del ao 2000 hubo una inversin en la jerarqua. Hoy en da (20032009), el cereal ms importante del mundo es el maz, seguido por el arroz y en tercer lugar por el trigo. El hecho de que el maz haya rebasado a los 2 otros cereales en los ltimos 20 aos se debe al xito en el mejoramiento gentico del maz, principalmente por el aprovechamiento del fenmeno de la heterosis en esta especie. Sin embargo, los incrementos en la productividad han sido variables en diferentes pases. En algunos pases, el rendimiento ha incrementado ms rpido que en otros. Los valores los podemos consultar en la base de datos de la FAO (ver siguientes figuras).

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Yields in USA
10 y = 0.1154x - 222.25 R2 = 0.8716

Maize Rice Sorghum

Wheat y = 0.0735x - 140.01 R2 = 0.9154 y = 0.0268x - 49.558 R2 = 0.443

Mg/ha

y = 0.0243x - 45.899 R2 = 0.7979 1970 1980 1990 2000 2010

0 1960
FAOSTAT 2009

year

Figura 2-29. Rendimiento de cereales en Estados Unidos. La pendiente indica la tasa de incremento en los rendimientos por hectrea. Se puede ver que en Estados Unidos, la pendiente para maz es mucho mas pronunciada que la de trigo.

Yields in China
10

Maize Rice Sorghum

y = 0.0967x - 187.04 R2 = 0.9454

Wheat

Mg/ha

y = 0.0972x - 189.45 R2 = 0.9598 y = 0.0784x - 152.74 R2 = 0.903 y = 0.0882x - 172.51 R2 = 0.9744 1970 1980 1990 2000 2010

0 1960
FAOSTAT 2009

year

Figura 2-30. Rendimiento de cereales en China. Se puede ver que en China, la pendiente es muy similar para todos los cereales. Esto refleja el enorme esfuerzo de mejoramiento gentico para todos los cereales.

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Yields in Mexico
10

Maize Rice Sorghum

Wheat y = 0.0595x - 114.28 R2 = 0.8495

Mg/ha

y = 0.0617x - 118.92 R2 = 0.9139 y = 0.0226x - 41.884 R2 = 0.5111

y = 0.0438x - 85.026 R2 = 0.9438

0 1960
FAOSTAT 2009

1970

1980

1990

2000

2010

year

Figura 2-31. Rendimiento de cereales en Mxico. Se puede ver que en Mexico los rendimientos y las tasas de incremento son mas bajas que en los otros pases, sobre todo, para maz y sorgo. A diferencia de Estados Unidos y China, en Mxico el maz no es el primer cereal en rendimiento, sino el ltimo. Por lo regular el maz es de los cereales ms productivos del mundo. Sin embargo, en Mxico se da un fenmeno muy particular. Mxico es relativamente competitivo en la produccin de trigo, sorgo y arroz. Por ejemplo, los rendimientos por hectrea de trigo que se obtienen en Mxico (>4 ton/ha), estn por arriba de lo que se obtiene en promedio en Estados Unidos (<3 ton/ha). En sorgo y arroz, Mxico tampoco esta tan mal. En el caso de maz, Mxico si esta muy por debajo de muchos pases del mundo. En Estados Unidos se cosechan en promedio 9 ton/ha, en China se obtienen 5 ton/ha, mientras que en Mxico se producen menos de 3 ton/ha. Por qu? Para entenderlo mejor, debemos verlo desde una perspectiva evolutiva, considerando algunos trends histricos. A continuacin se muestra una tabla que indica las tasas de incremento de los rendimientos.

Kg/ha*ao

Mxico 43.8 61.7 22.6 59.5

Maz Arroz Sorgo Trigo

Estados Unidos 115.4 73.5 26.8 24.3

China 97.2 94.5 78.4 88.2

Tabla 2-1. Incremento por ao de los rendimientos en kilogramos por hectrea. Los datos corresponden a la pendiente de las lneas de regresin de las figuras anteriores. El valor corresponde a la pendiente promedio (en kg/ha*ao) durante los ltimos 40 aos. En Estados Unidos se le ha dado mucho nfasis al mejoramiento de maz. Durante las ltimas 4 dcadas se ha logrado un incremento promedio de 115 kg por ao. China es lder en arroz, pero tambin ha logrado incrementar los rendimientos de todos los cereales a un ritmo acelerado. Sin embargo, en Mxico, no solo el rendimiento promedio es bajo ( < 3 ton/ha ), sino que adems el

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incremento en la productividad del maz por ao es mas bajo que el promedio mundial. El progreso que se obtiene en Mxico (43.8 kg/ha*ao) es menos de la mitad de lo que se obtiene en China Por qu? Cul es la causa de que en Mxico se de una velocidad de incremento menor para el maz, a pesar de que es el pas con el mayor recurso gentico para esta especie? Les podemos echar la culpa a los polticos, a los mejoradores, o a los agricultores. Pero tal vez haya razones aun ms enigmticas que los propios diputados. Algunos cientficos han observado que los centros de origen biolgicos estn positivamente correlacionados con la diversidad de alelos, genes y variedades, sin embargo, tambin han notado que esos centros estn negativamente correlacionados con la productividad.
Los rendimientos ms altos se obtienen fuera de los centros de origen. Por ejemplo, la mxima productividad del maz se da en otros pases fuera de Mxico. Una baja productividad de maz se obtiene en el centro y sur de Mxico, donde hay una gran diversidad de razas y variedades de maz. En trigo, la mxima productividad se da fuera de Medio Oriente. En Irak e Irn el centro de origen los rendimientos de trigo son relativamente bajos comparados con el promedio mundial. En papa, la mxima productividad se da fuera de Per. Se cosechan ms tubrculos por hectrea en los valles de los Alpes (Europa) que en los valles de los Andes (Amrica), de donde se origin la papa y donde todava hay mucha diversidad de solanceas. Y como esos hay muchos otros ejemplos de especies vegetales y animales que sugieren que, el origen de la diversidad, y la mxima productividad, son como polos opuestos. Podra ser un fenmeno universal? Tal vez no sea coincidencia que en la especie humana, que tiene sus races en el continente Africano, el mximo desarrollo social, cultural, cientfico y econmico tambin se ha dado fuera del centro de origen.

Se podra postular la hiptesis de que la diversidad gentica es como un lastre que impide que se alcancen los ms altos niveles de rendimiento. Es como si la diversidad y la productividad fueran fenmenos opuestos. A qu se puede deber esto? Por un lado, las mutaciones por el azar generan diversidad, y por otro lado, la seleccin limita las variantes que sobreviven. Es un equilibrio dinmico que siempre esta en transicin y movimiento. La biologa no es un fenmeno esttico. La evolucin se da por un balance de fuerzas opuestas. El mejoramiento consiste en la seleccin de los mejores alelos, genotipos y variedades. Para ello se deben descartar variedades que no son tan productivas bajo las mismas condiciones. Para obtener el mximo rendimiento solo se debe sembrar la variedad que es ms rendidora. La productividad se compra a costa de la prdida de un cierto porcentaje de diversidad. La disminucin de la diversidad solo se puede compensar por medio de cruzas y recombinaciones que generan nuevas variantes de alelos. Sin embargo, un mejorador que no esta dispuesto a descartar genotipos, nunca lograr obtener los ms altos rendimientos. Es el precio que se debe pagar para hacer mejoramiento.
Los centros de origen se pueden considerar como incubadoras de diversidad gentica. En esas regiones, la presin selectiva debe de ser relativamente baja, para que la tasa de mutacin y recombinacin puedan ser altas, lo que permite un alto grado de innovacin y creatividad gentica. Una vez incubados en los centros de diversidad, los genotipos pueden ser exportados a otras regiones del mundo donde son expuestos a condiciones selectivas ms exigentes. Solo los genotipos ms rendidores tendrn xito en un ambiente competitivo. En esos ambientes exigentes habr una baja diversidad (muy pocos genotipos exitosos), pero con muy alta productividad.

El origen de los rendimientos tan altos en China y Estados Unidos se fundamenta en cierta medida en aquellos genes que alguna vez fueron preincubados en el centro de diversidad del maz, en Mxico. Cuando los espaoles conquistaron y colonizaron Amrica, nunca hubieran imaginado que las pocas semillas de maz que se llevaron en sus barcos, iban a ser mucho ms valiosas que todos los lingotes de oro y plata que se llevaron a Europa. El valor comercial del maz que se produce fuera de Mxico es tan cuantioso que alcanzara a financiar el sistema educativo y cientfico de todo un pas. El trabajo de incubacin gentica por los indgenas mesoamericanos durante cientos de aos dio a lugar un sinnmero de razas y variedades de maz, que hoy en da representan un acervo

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biolgico para toda la humanidad. Esa diversidad gentica es la razn por la que hoy en da, el maz se haya convertido en el cereal ms importante de todo el planeta (ver Figura 2-28). De ah radica la importancia y la perdurabilidad del mejoramiento gentico: He who can make one ear of grain grow where none grew before renders an endurable service to whole humankind Las anteriores evidencias evolutivas nos inspiran a hacer una reflexin ms extensa en torno a la diversidad y la productividad. Para ello usaremos algunas analogas. Una regin de origen biolgico puede ser considerada como un centro de incubacin gentica. Es como un vivero. Se debe fomentar la creatividad y la imaginacin para permitir as la generacin de nuevas variantes y alelos.
Los centros de incubacion son como las escuelas a las que enviamos nuestros hijos para que aprendan y puedan ser creativos. Debemos permitir que descubran y que hagan sus propias experiencias. Debe ser un ambiente ptimo de baja presin. Debemos ser tolerantes con los errores de los jvenes, ya que solo a travs de la experimentacin aprendern a desarrollar sus habilidades. Una vez que fueron incubados, los jvenes debern salir al mundo exterior para demostrar sus aptitudes. As se pondrn a prueba. Una persona que nunca sale al exterior, difcilmente alcanzar su mxima productividad. Por otro lado, un joven que nunca se preincub en ese ambiente creativo y libre de presiones, nunca lograr lo mismo que una persona que haya disfrutado de ese privilegio. El fomento la diversidad, es un privilegio, que si tiene un costo para los dems. En las familias, los padres son los que trabajan para pagar la formacin acadmica de sus hijos. En las empresas, el departamento de ventas es el que financia las operaciones del departamento de innovacin y desarrollo. Ms que un costo, es una inversin a largo plazo. Sin innovacin no habr nuevos productos, y sin ellos, tarde o temprano no habr ms ventas. Seria ridculo pedirle a un beb, que apenas camina, que trabaje para comprar su leche y sus paales. Seria absurdo exigirles a los maestros que financen el sistema escolar. No se puede pedir que los cientficos paguen los experimentos que deben hacer para generar nuevos conocimientos. La innovacin y el desarrollo tecnolgico debe ser un esfuerzo de toda la sociedad. Todos debemos poner nuestro granito de arena. Los empresarios que ganan ms deben apoyar (financiar) a los investigadores que quieren hacer ciencia de alto nivel. La historia de la evolucin nos ensaa el valor que tiene la diversidad. El costo de la ignorancia es trivial comparado con el gasto en educacin e investigacin. La diversidad del conocimiento es la nica forma de reducir el peligro de fracasar a largo plazo.

Lo que debemos preguntarnos en Mxico es: Qu valor le damos a la diversidad? Qu tan cretivos queremos ser? Cmo podemos incrementar la productividad agrcola para ser autosuficientes en la produccin de maz, con el mnimo costo posible de diversidad gentica? Quin debe pagar las investigaciones que se requieren en maz? Cmo podemos evolucionar para progresar? Qu es lo que se requiere hacer? Lo que mas necesita Mxico, y Latinoamrica, son mejores polticos y mejores estudiantes. Este libro sobre Fundamentos de Mejoramiento Gentico solo pretende remediar una de muchas necesidades. Un buen gobierno es aquel que tiene la suficiente visin a largo plazo para estar convencido de que la ciencia y la investigacin no es un gasto sino una inversin. Un buen estudiante es aquel que le dedica suficiente tiempo y esmero al aprendizaje, porque sabe que el conocimiento es una buena inversin para su futuro. Un buen libro es aquel que transmite conocimientos pero tambin permite incrementar la creatividad de los jvenes para fomentar la diversidad de sus propios pensamientos. Por un lado, el razonamiento lgico debe ayudarles a analizar crticamente los datos. Deben descartar muchas ideas que no fueron confirmadas por la evidencia cientfica. La ciencia avanza

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por la falsificacin de hiptesis. Esto significa que hay que descartar ciertos pensamientos. Esto disminuir la diversidad. Pero por otro lado, la creatividad y la imaginacin deben ayudarles a unir pensamientos aislados, para generar conclusiones y desarrollar soluciones novedosas que permitan incrementar la eficiencia de nuestra tecnologa y economa. La combinacin de dos ideas seleccionadas puede dar lugar a decenas de otras ideas recombinadas. El mejoramiento gentico no solo es evolucin en accin, sino que tambin es un conjunto de diversas disciplinas que requieren el desarrollo de habilidades de muy diversa ndole. Los mejoradores no solo deben seleccionar y recombinar genes, sino tambin deben recombinar y seleccionar ideas y teoras, y no solo eso, sino tambin deben aplicar y desarollar nuevas metodologas y estrategias.

2.3.4.

Mejoramiento: ciencia, ingeniera y filosofa

Es imprescindible que el fitomejorador sepa escoger las herramientas para incrementar la diversidad. Debe tener la capacidad de medir los parmetros que usar para seleccionar. Debe ser eficiente para hacer mucho con pocos recursos. Un buen fitomejorador tiene una mano prodigiosa para dirigir la evolucin, en la direccin adecuada y por el camino ms viable. Ese es un talento que, muy pocos tienen de manera innata, pero que muchos pueden adquirir por medio del aprendizaje y la dedicacin. El mejoramiento moderno es tanto un arte como una ciencia, es ingeniera y prctica, pero tambin incluye teora y filosofa (Figura 2-32).

Cientfico
experimentos

preguntas

Filsofo

Mejorador resultados

Ingeniero
Figura 2-32. reas de inters intelectual para los fitomejoradores. El mejorador tiene que ser cientfico, ingeniero y filsofo al mismo tiempo.

62

2.4. El DNA
2.4.1.
2.4.1.1.

Nociones bsicas de los cidos nucleicos

Analoga de la biblioteca

Empezaremos con una analoga para explicar el concepto de informacin gentica y la relacin que existe entre cromosomas, genes y protenas. Podemos imaginar la forma en que trabajamos en la cocina. Analicemos el flujo de informacin y los procesos que utilizamos para preparar un pastel. Ahora comparmoslo con los procesos que usa la clula para obtener una protena. La Figura 2-33 muestra este ejercicio al que llamaremos: la analoga de la biblioteca y el pastel:

Figura 2-33. Analoga de la biblioteca y el pastel. Se muestra la correspondencia de la informacin que est en un ncleo, cromosoma, gen o protena. Esta forma de imaginarlo, es un excelente inicio para adentrarse en el mundo de los cidos nucleicos y as, entender mejor las bases del mejoramiento gentico. Tarea 2-30 Explique con esta analoga lo que sucedera si usted arrancara una pgina de la biblioteca de un restaurante chino y se la agregara a un libro de un taller mecnico alemn. Qu tan importante es el hecho de que los mecnicos y los cocineros hablen el mismo idioma? Si el texto estuviera en chino y usted solo hablara alemn, de qu sabor le saldra el pastel? Escriba un cuento sobre ello. Mustrele el cuento a un familiar y despus disctalo con sus dems compaeros de clases. Qu tanto sirvi su cuento para que una persona comn entienda mejor la ingeniera gentica? Tarea 2-31 Explique la relevancia cientfica y tecnolgica de que el cdigo gentico sea universal. Podra haber ingeniera gentica si el lenguaje gentico fuera diferente para cada especie? Postule una hiptesis de por qu el lenguaje humano ha cambiado tanto en pocos miles de aos, mientras que el lenguaje gentico no ha cambiado nada en miles de millones de aos.

2.4.1.2.

Nucletidos

Existen cuatro nucletidos bsicos del Acido DesoxiriboNucleico (ADN, DNA): la adenina (A), timina (T), citosina (C) y guanina (G). La diferencia entre los ribonucletidos y los

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desoxirribonucletidos es que la pentosa puede tener o no un grupo hidroxilo en el carbono 2. Una diferencia entre el DNA y el Acido RiboNucleico (ARN, RNA) es que por lo regular el DNA casi siempre se presenta como una doble cadena, mientras que el RNA por lo regular es de cadena sencilla. Otra diferencia importante entre los nucletidos que forman al DNA y el RNA es que la timina (T) se substituye por uracilo (U) (qumicamente, la timina es un uracilo metilado en el carbono 5). A la base nitrogenada con la pentosa se le llama nuclesido, y dependiendo del nmero de grupos fosfatos esterificados en el carbono 5 del azcar se le puede llamar mono-, dio tri- fosfatos. La regla de apareamiento por cuestiones de tamao es que las purinas (la A y la G con dos anillos cclicos) se pueden aparear con las pirimidinas (la C, T o U con un solo anillo) (ver Figura 2-34.).

Figura 2-34. Nucletidos

Figura 2-35. Estructura de dATP Tarea 2-32 En la figura anterior se muestra una molcula de dATP, dibuje ahora una molcula de ATP. Use tambin las frmulas que se muestran en esa figura para dibujar una molcula completa de GTP. Puede aprender a dibujar las cuatro bases de memoria? Explique las diferencias de reactividad qumica entre el ATP y el dATP. Qu consecuencias tiene la funcionalidad hidroxilo para la estructura y estabilidad de las molculas de RNA y de DNA? D ejemplos de los usos que tienen esas dos nucletidos dentro de la clula. Si no hubiera CTP, pero si hubiera dCTP, Se podra replicar el DNA? Se podra transcribir el RNA? Justifique sus respuestas.

2.4.1.3.

Doble hlice

El DNA es una cadena lineal que tiene dos hebras enrolladas en forma de doble hlice. Nos podramos preguntar: cada una de las hebras tiene la misma informacin? En realidad no es exactamente la misma, sino informacin complementaria. La complementariedad est dada por la forma en que los cuatro nucletidos se aparean, la A con la T, y la G con la C. Entre las bases se forman puentes de hidrgeno que estabilizan el apareamiento complementario. El par de AT est formado de dos puentes de hidrgeno, mientras que el par GC forma tres (Figura 2-36). El nmero de puentes de hidrgeno tiene repercusiones sobre la temperatura a la que la doble hebra se separa. Por ejemplo la temperatura de empareamiento (Tm) para la PCR

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(Reaccin en Cadena de la Polimerasa, por sus siglas en ingls: Polymerase Chain Reaction) depende del porcentaje de GCs. Entre mayor proporcin de GCs mayor ser la Tm.

Figura 2-36. Complementariedad de las bases del DNA. La convencin establece que la secuencia de DNA siempre se debe de escribir del 5 prima al 3 prima (5 y 3, respectivamente). De cualquier forma, es una buena prctica siempre incluir el nmero prima cuando se escribe una secuencia dada. Sobre todo cuando uno la escribe en orden inverso. Tarea 2-33 Si en un genoma bacteriano tenemos 15% de timina, qu porcentaje de citosina tendremos? Diga si existe alguna regla que sea universal. Averige si en todos los virus esta regla de proporcionalidad entre diferentes bases tambin aplica. Averige que familias de virus tienen DNA de cadena sencilla. Explique las excepciones a esas reglas.
Respuesta: si hay 15% de timina en una cadena de DNA doble, entonces habr 15% de adenina, y por consiguiente habr 35% de citosina de 35% de guanina.

Tarea 2-34 Para discutir entre profesor y alumnos Que hubiera pasado si Watson y Crick hubieran considerado la proporcin variable de A, T, G y C en ciertos organismos? Considere esta hiptesis: La postulacin de la doble hlice del DNA slo fue posible al ignorar los resultados sobre la proporcin variable de A, T, G y C en los virus de una sola cadena. Haga una tabla en defensa y en contra de la prctica cientfica de darle ms peso a ciertos resultados e ignorar otros resultados. Tarea 2-35 Una secuencia escrita en la nomenclatura estndar: ATGTCTGCGAT Indique ahora cuales molculas de las siguientes siete opciones si corresponden o no a esa misma doble cadena de DNA: Secuencia corresponde: Si No 3-ATGTCTGCGAT-5 O O 5-ATGTCTGCGAT-3 O O 3-ATCGCAGACAT-5 O O 5-ATCGCAGACAT-3 O O 5-TAGCGTCTGTA-3 O O 3-TAGCGTCTGTA-5 O O 3-TACAGACGCTA-5 O O

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Respuesta: Esta pregunta parece fcil, pero nuestra experiencia, es que menos del 20% de los estudiantes pueden contestar a todas las opciones correctamente. Tmese el tiempo necesario para responderla y entenderla bien. Para resolver este problema, lo mejor es escribir la doble cadena de la secuencia en cuestin, y tambin de cada una de las 7 opciones. Hecho esto ahora vea cuales son iguales o diferentes considerando la orientacin y la hebra. Lea las secuencias siempre del cinco prima al tres prima. La segunda, la cuarta, la penltima y la ltima si corresponden a la misma doble cadena que la secuencia en cuestin. Las dems no. Si no pudo responder esta pregunta o se equivoc en alguna opcin, debe estudiar ms sobre el DNA y sobre todo, entender los conceptos de la orientacin, y tambin de lo que es reverse complement (complemento inverso).

2.4.1.4.

Replicacin

La informacin que est contenida en el DNA se copia por medio de un mecanismo que se llama replicacin semiconservativa. Esto se refiere a que el DNA se duplica formndose dos copias, en las cuales cada una contiene una hebra molde (cadena templado) y una hebra nueva (Figura 2-37).
Cadena templado A
5 3 T A 3 G C C G C G A T G C T A 5

Cadena A
5 T A 3 G C C G C G A T G C T A 5 3

Nueva cadena B

Cadenas Hijas
Nueva cadena A
5 3 C G A T G C T A 5

Cadena B

Cadena Parental

T A

G C

C G

Cadena templado B

Figura 2-37. Replicacin semiconservativa de DNA. La hebra de color naranja representa la hebra parental, mientras que la de color rojo es una nueva hebra que se forma durante la replicacin.
Cuando usamos una fotocopiadora para copiar un documento, lo que hacemos es transferir la informacin de una hoja vieja a una hoja nueva. Al final obtenemos dos hojas con la misma informacin, pero una de las hojas es nueva, y la otra es la vieja original. A esta forma de copiar se le llama conservativa. Para generar dos hojas de papel de manera semiconservativa lo que tendramos que hacer es partir la hoja original en dos, despus fotocopiar cada una de ellas en una mitad de hoja, y despus volver a pegarlas de forma que obtengamos dos hojas con informacin idntica, pero que cada una de las copias tengan tanto papel nuevo, como papel viejo.

Tarea 2-36 Supongamos que quisiera averiguar si el DNA se copia de manera conservativa (como una fotocopiadora normal) o de manera semiconservativa (mitad nueva y mitad original). Reflexione sobre esto y disee el experimento que debera hacer para demostrar la forma en que se replica el DNA. Como herramientas puede usar nucletidos con una masa molecular mayor a lo normal y de esta forma distinguir las hebras de DNA viejas y nuevas que se generan in vitro con una polimerasa. Disee el protocolo del experimento y dibuje el resultado que esperara. Qu grficas usara para convencer a una audiencia cientfica de sus resultados? Haga las grficas o figuras y presente sus conclusiones a su maestro de clases. Realice una bsqueda bibliogrfica

66

y averige la forma en que los cientficos de los aos 50 hicieron los experimentos para contestar esta pregunta (Experimento de Meselson y Stahl)

2.4.1.5.

Sntesis direccional

Un concepto importante del DNA es que la sntesis de los cidos nucleicos se lleva a cabo de manera direccional, del 5 prima al 3 prima. Esto tiene como consecuencia, que una de las hebras se puede copiar de manera continua, pero la otra se copia de manera discontinua en forma de pequeos tramos. Estos pequeos tramos se llaman fragmentos Okazaki (Figura 2-38). La replicacin inicia en un zona del DNA con secuencias regulatorias, que en el caso de los plsmidos de bacterias se llama ori (del ingls origin of replication). A partir del ori se forma una burbuja de replicacin que se va extendiendo hasta que se ha copiado la totalidad del DNA.

Leading strang

5 3 3
Lagging strang

5 Fragmentos de Okazaki

Burbuja de Replicacin
3 Fragmentos de Okazaki 5 5

Inicio de Replicacin

Figura 2-38. Burbuja de replicacin con el leading y el lagging strand.

2.4.1.6.

El gen

El concepto de gen surgi durante la poca de Gregor Mendel, mucho antes de que se supiera del DNA. Hoy en da, decimos que un gen es un segmento lineal de DNA que puede contener informacin funcionalmente revelante, codificada por la secuencia de los nucletidos. Se dice que el gen es la unidad bsica de la herencia, ya que es responsable de un cierto carcter fenotpico unitario. Sin embargo, as como el tomo result ser divisible, el gen tambin est formado de elementos de menor tamao. La Figura 2-39 muestra un gen tpico de una bacteria.

Gen bacteriano
Promotor Operador Terminador

DNA mRNA

Transcripcin
5

ORF 1
Shine Dalgarno +ATG Start Stop Start

ORF 2
Stop Start

ORF 3
Stop

Traduccin
COOH NH3 NH3

NH3

Protena 1

Protena 3

COOH

Protenas

Protena 2

COOH

Figura 2-39. Estructura y expresin de un gen bacteriano. Por lo regular, se dice que un gen es un segmento de DNA que codifica para una protena. En ese caso, algunos genes bacterianos pueden codificar para varias protenas, ya que el RNA

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tiene varios marcos de lectura abiertos (ORF por sus siglas en ingls: open reading frame). A diferencia de los genes bacterianos, los genes de las clulas eucariticas son un poco ms grandes y complejos. Adems, se requiere de una edicin del RNA mediante un proceso de splicing y maduracin que es necesario para que el RNA mensajero (mRNA) pueda ser exportado del ncleo al citoplasma donde se da la traduccin (ver Figura 2-40).

Gen eucaritico
Silencer Enhancer

Promotor

Exon 1

Intron 1

Exon 2

Intron 2

Exon 3

Terminador

DNA

Transcripcin
5

Exon 1

Intron 1

Exon 2

Intron 2

Exon 3

Edicin
GCap

5 UTR Exon 1 Exon 2 Exon 3 3 UTR

ATG Start Stop

AAAAAA 3

Traduccin
NH3

Protena 1

COOH

Protena

Figura 2-40. Estructura y expresin de un gen eucaritico Tarea 2-37 Realice un dispositivo o una frmula que relacione el tamao del mRNA con el tamao del gen, el nmero de intrones, el tamao medio de intrones, y el tamao de la regin reguladora.

68

2.4.1.7.

Dogma central

Uno de los primeros conceptos que se postularon en la biologa molecular fue el hecho de que el flujo de informacin era en una sola direccin a partir del DNA, pasando al RNA y despus a las protenas. Digamos que, aunque en la replicacin s hay un flujo de informacin bidireccional, la trascripcin y la traduccin es un flujo unidireccional (ver Figura 2-41.).

Replicacin de DNA

DNA
5 T A 3 G C C G C G A T G C T A T A G C C G C G A T G C T A

Sntesis de RNA (Transcripcin)

RNA
C A G U

5 U G C C A G U U G C

Sntesis de Protena (Traduccin)

Protena
H2N

COOH

Aminocidos

Figura 2-41. Flujo unidireccional de informacin: Dogma central de la biologa molecular.

Para explicar eso a manera de una analoga, diramos que el DNA es una molcula dictadora que no escucha ni tiene en cuenta la informacin que puedan adquirir sus molculas sbditas como el RNA y las protenas. Otra forma de verlo, es parecida al debate entre la visin Lamarkista y la visin Darwinista de la evolucin. Lamark deca, que la experiencia y las caractersticas aprendidas durante la vida de un organismo eran heredables. Hoy en da, sabemos que la educacin que tuvieron nuestros padres no la heredamos en forma de genes, y es por eso que todos los nios y jvenes tenemos que aprender muchas cosas desde cero.

Tarea 2-38 Para discutir entre profesor y alumnos. Trate de reflexionar un poco ms sobre las consecuencias ms amplias del dogma central de la biologa molecular. Tratemos de hacerlo con una analoga sobre el aprendisaje. Por ejemplo, el canto de los pjaros, que tanto depende de los genes que heredan y de lo que aprenden durante jvenes? Elabore una tabla en donde mencione las ventajas y desventajas de aprender algunos conocimientos desde el inicio. Qu tipo de habilidades es ventajosa heredarlas de manera innata y que otras son mejores adquirirlas durante nuestro desarrollo? Por qu a veces no escuchamos a nuestros paps o maestros? Algunas cosas tenemos que aprenderlas por

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nuestras propias experiencias, ya que no solemos aprender mucho de los errores de nuestros antecesores. Discuta esto con sus compaeros de clases. Presenten sus conclusiones a su maestro de curso. El postulado central de la biologa molecular se hizo cuando todava no se tena informacin experimental suficiente que pudiera sustentar o refutar esta hiptesis de manera universal, y es por eso que se le llam dogma. Actualmente sabemos que el dogma no es tan estricto como se postul al inicio. Existe una enzima llamada transcriptasa reversa que a partir RNA s puede formar DNA. Entonces, a ese DNA se le llama cDNA (del ingls copied DNA). De hecho, esta enzima es la base de muchsimas aplicaciones de la ingeniera gentica. Hoy en da todava nos falta aprender mucho sobre las protenas, pero ya hay indicios de que algunas protenas pueden hacer cambios substanciales a la informacin del DNA y del RNA, ya sea en forma de edicin de RNA, splicing diferencial, exon shuffling, metilacin, mutacin inducida, etc. Tarea 2-39 En su cuaderno de trabajo prepare un glosario en donde defina lo que es: hiptesis, objetivo, teora, ley, dogma, fe, evidencia, resultados, datos, anlisis, sntesis, informacin. Ponga especial nfasis en las similitudes y diferencias entre estas palabras y los conceptos a los que se refieren. Use ejemplos de las ciencias biolgicas para explicar de manera concreta estos trminos.

2.4.1.8.

Sntesis de protenas usando el cdigo gentico universal

La sntesis de las protenas a partir de un RNA mensajero se llama traduccin. El RNA se lee de 5 prima al 3 prima, y la protena naciente se va formando del trmino amino, al trmino carboxilo (ver Figura 2-42.).

Figura 2-42. Ribosoma. Este proceso se lleva a cabo en el ribosoma con ayuda de los RNA de transferencia (tRNA), que asignan un aminocido a cada una de las 64 combinaciones posibles de tres bases. La informacin de los cidos nucleicos se lee en forma de tripletes (grupo de tres bases contiguas). Ese cdigo de tripletes se ha encontrado casi inalterado en todos los organismos vivos y es por eso que se le ha llamado cdigo gentico universal (ver Figura 2-43).

70

Figura 2-43. Cdigo gentico universal. Una de las evidencias ms contundentes de que todos los seres vivientes actuales compartimos a un slo ancestro comn, se deriva de la forma en que se lee el DNA. Ese cdigo es el idioma gentico que habl la clula primognita de la cual se derivaron todos los organismos y especies que sobrevivieron despus de miles de millones de aos de seleccin y evolucin. Una de las premisas ms importantes para la ingeniera gentica es precisamente esa, la universalidad del cdigo gentico. Si el DNA no se leyera de la misma forma en diferentes organismos, entonces no tendra ningn sentido aislar un gen de una bacteria y tratar de meterlo en el genoma de una planta. Si usamos una analoga diramos que es como si todos los seres humanos hablaran el mismo idioma y de esta forma fuera ms fcil intercambiar informacin entre personas de diferentes culturas. Por ejemplo, podramos usar los mismos libros que los griegos, estadounidenses y los chinos y no tendramos tanto trabajo de hacer traducciones entre los diferentes libros de texto. Tarea 2-40 Elabore una presentacin explicando que son los tripletes y como se lee el cdigo gentico universal.

2.4.1.9.

Abreviaturas de los aminocidos

Los estudiantes que pretendan trabajar con genes y protenas, tarde o temprano tendrn que aprender las abreviaturas de una letra de los diferentes aminocidos que conforman las protenas. Los que deseen ser expertos, adicionalmente tendrn que tener una buena nocin de los grupos qumicos funcionales que estn presentes en cada uno de los aminocidos.

Abreviacin 1 letra 3 letras

Nombre completo cido asprtico

Triplete tpico

Molcula
HOOC-CH2-CH(NH2)-COOH

Asp

GAT

71

E A R N C F G Q H I L K M

Glu Ala Arg Asn Cys Phe Gly Gln His Ile Leu Lys Met

cido glutmico Alanina Arginina Asparagina Cisteina Fenilalanina Glicina Glutamina Histidina Isoleucina Leucina Lisina Metionina

HOOC-(CH2)2-CH(NH2)-

GAG GCT CGT AAC TGC TTT GGG GAG CAT ATA CTC AAG ATG

COOH CH3-CH(NH2)-COOH HN=C(NH2)-NH-(CH2)3CH(NH2)-COOH H2N-CO-CH2-CH(NH2)COOH HS-CH2-CH(NH2)-COOH

Ph-CH2-CH(NH2)-COOH

NH2-CH2-COOH H2N-CO-(CH2)2-CH(NH2)COOH NH-CH=N-CH=C-CH2CH(NH2)-COOH CH3-CH2-CH(CH3)-CH(NH2)COOH (CH3)2-CH-CH2-CH(NH2)COOH H2N-(CH2)4-CH(NH2)-COOH CH3-S-(CH2)2-CH(NH2)COOH

72

P S Y T W V

Pro Ser Tyr Thr Trp Val

Prolina Serina Tirosina Treonina Triptfano Valina

CCC AGT TAC ACG TGG GTT

NH-(CH2)3-CH-COOH

HO-CH2-CH(NH2)-COOH HO-p-Ph-CH2-CH(NH2)COOH CH3-CH(OH)-CH(NH2)COOH Ph-NH-CH=C-CH2-CH(NH2)COOH (CH3)2-CH-CH(NH2)-COOH

Tarea 2-41 Traduzca al idioma de las protenas la siguiente secuencia nucleotdica. Use la abreviatura de una letra de los aminocidos. atggtgaaggccgtggtggtgggcgcggcg gtcgtggcgtgcgcggcggtgggggtggcg __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ gcggtgctggtgcaccgccggcgcaggcgc gacgccgcgctcctggggtccgcggaggcg __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ gagaggaggcggcgcgcggccgccgtgatc gaggaggtggagcgcagcctcgccacgccc __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ acggcgctgctgcggggcatcgcggacgcc atggtcgccgagatggagcgcggcctgcgc __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ ggggacatccacgcgcagctcaagatgctc attagctacgtcgacaacctccccaccgga __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ gatgaacatgggctgttttatgcactggat cttggagggaccaacttccgtgtgctgcga __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ __ Tarea 2-42 Qu significa que el cdigo gentico est degenerado? Usando el cdigo gentico (Figura 2-43) Traduzca la siguiente secuencia proteca a su respectiva secuencia nucleotdica: _______________________________________________________________ M D F E S L N P G E Q I Y E K M I S G M __________________________________________________________ Y L G E I V R R I L L K L A H D A S L F __________________________________________________________ G D V V P T K L E Q P F I L R T P D M S

73

__________________________________________________________ A M H H D S S H D L K T L G S K L K D I __________________________________________________________ V G V A D T S L E V R Y I T R H I C D L __________________________________________________________ V A E R G A R L A A A G I Y S I L K K I

Tarea 2-43 Considere el siguiente fragmento de DNA: 5 GCTTCCCAAGGT 3 3 CGAAGGGTTCCA 5 Si la cadena superior es la cadena de la plantilla usada por la polimerasa de RNA. a) Dibuje el RNA transcrito. b) Etiquete sus terminos 5and 3. c) Escriba las tres posibles cadenas correspondientes de aminocidos. d) Etiquete sus extremos amino y carboxilos. e) Repita los pasos a-d asumiendo que la cadena inferior es la cadena de la plantilla. En caso que tenga dificultades o quiera profundizar ms, responda los problemas del captulo 2 y 3 de Griffiths et al, modern genetic analysis. Tarea 2-44 Aprenda ms sobre gentica. Consulte la pgina: http://www.ucm.es/info/genetica/grupod/ Tarea 2-45 Aprenda ms sobre gentica. Consulte la pgina: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?call=bv.View..ShowTOC&rid=mga.TOC&depth=10 Introdusza una palabra clave en la ventana de bsqueda de esa pgina. Despues saldrn los links a los captulos en donde viene explicado ese trmino. Tarea 2-46 Consulte los diversos libros electrnicos que estan disponibles en la pgina del NCBI: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=books Libros recomendados para consulta: Griffiths AJF, Gelbart WM, Miller JH, Lewontin RC. Modern Genetic Analysis. WH Freeman & Company. Watson, J.D., Caudy, A. A., Myers, R.M. and Witkowski, J.A.; Recombinant DNA: Genes and Genomes A Short Course; Third Edition; Cold Spring Harbor Lab. Press; CSH New York; 2007. Baum, S. J., Scott-Ennis, R. J., and Hill, J W; Chemistry and Life: An Introduction to General, Organic and Biological Chemistry; Prentice Hall; 1999. Crothers, D. M., Kill, J., Tinoco, I., Hearst, J. E., Wemmer, D. E., and Bloomfield, V. A.; Nucleic Acids: Structures, Properties, and Functions; University Science Books; 2000. Gait, M. G., and Blackburn, G. M.; Nucleic Acids in Chemistry and Biology; Oxford University Press Inc.; 1995. Van Holde, K.E., Johnson, W.C., and Ho, P.S.; Principles of Physical Biochemistry; Prentice Hall Inc.; 1998 Creighton, T. E.; Proteins: Structures and Molecular Properties; W.H. Freeman & Co., 1992.

74

2.4.2.
2.4.2.1.

Nociones avanzadas
Conformaciones del DNA

La doble hlice del DNA puede estar en diferentes conformaciones. La que ms se conoce es la conformacin B, que es la que primero se descubri por Watson, Crick y Wilkins. Sin embargo, existen otras conformaciones como la Z y la A, que tambin se presentan in vivo dentro de las clulas. Todava no se sabe la relevancia de este fenmeno, pero se intuye que tiene importancia para la forma en que las protenas se pueden unir al DNA, y as, influyen en la forma en que se expresan los genes en una determinada regin. Aunque todava no se sabe si la conformacin es heredable, la conformacin A, B, Z del DNA puede ser considerado un factor epigentico, ya que puede afectar la expresin de los genes, pero no es directamente atribuible a la secuencia de los nucletidos per se. (Figura 2-44).

Figura 2-44 Diferentes Conformaciones de DNA.

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Cromosoma
Clusters de Genes Centrmero Telmero

Gen

Gen

Gen

Doble hlice de DNA

Promotor Exones Intrones

RNA inmaduro
5

Transcripcin

3
Splicing y Edicin de RNA
CAP AAAAAAA

mRNA

Protena
H2N

Traduccin
COOH

Figura 2-45 Estructura de cromosomas y genes. Se muestra trambin el proceso de maduracin del RNA y la conversin final en una protena. Tarea 2-47 Qu es un gen? Cmo se expresa una protena? Elabore un ensayo explicando con detalle todos los pasos moleculares que se llevan a cabo, desde el DNA con su estructura de promotor y exones, pasando del RNA inmaduro, al RNA maduro, hasta la protena. Use la Figura 2-40 y la Figura 2-45 como gua y explique todos los procesos que estn involucrados. Indique tambin en que compartimento celular se lleva a cabo cada proceso, ya sea ncleo, citoplasma o retculo endoplasmtico.

76

2.4.2.2.

Complejo de replicacin
Hebra Lder

Complejo Replisoma Protenas SSB

Topoisomerasa

DNA Polimerasa
3

Complejo Primosoma
Primasa 3 5

Helicasa
Hebra retrasada

Replicacin

Ligasa

Figura 2-46 Complejo de replicacin. Una serie de diversas protenas y enzimas se agrupan en grandes complejos protecos que permiten as la replicacin del DNA. Tarea 2-48 Explique la funcin de las diferentes enzimas que participan en la replicacin del DNA. Que hace la polimerasa? Cul es la funcin de la helicasa? Qu hace la topoisomerasa? Para que sirven las protenas SSB? En qu momento acta la ligasa? Por qu la replicacin es diferente para cada hebra del DNA? En la Figura 2-46 cul es el leading strand y cul es el lagging strand? Tarea 2-49 Aprenda ms sobre la replicacin. Consulte la pgina: http://www.ucm.es/info/genetica/grupod/Replicacion/Replicacion.htm

2.4.2.3.

Intrones y exones

Gen
ATG Start AGGU AGG AGG AGGU AGG AGG TGA Stop

DNA

Regin promotora

Regin codificante (Exon)

Regiones NO codificantes (Intrones)

Figura 2-47. Promotor, intrones y exones.

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Tarea 2-50 Cul es la diferencia entre un exon y un intron? Qu repercusiones genticas, moleculares y evolutivas puede haber? Tarea 2-51 Averige ms sobre las secuencias cortas para las seales de: start, stop, slice-start, splice-end. De que sirve esto para las predicciones de genes por metodos bioinformticos?

2.4.2.4.
Exn 5

Mecanismo de splicing
Intrn
A G GU

Exn
A
AG G

A
A

AG GU

Estructura Lazo
UG

A
AG G

AG

UG

+
A G

A G G

Figura 2-48. Formacin de un lazo de splicing.

78

2.4.2.5.

Splicing diferencial
Gen de tropomiosina DNA

splicing diferencial
mRNA 1 variante en msculo estriado

mRNA 2

variante en msculo liso

mRNA 3

variante en fibroblastos

mRNA 4

variante en clulas cerebrales

Figura 2-49. Ejemplo de splicing diferencial. Gen humano de tropomiosina. Denz et al., (2004) Biochem. Biophys. Res. Commun. 320(4):1291-7

2.4.2.6.

Mecanismo de recombinacin

La recombinacin comienza como dos molculas de DNA que se unen para formar una sinapsis de recombinacin. Uno de cada hebra duplex se une a la enzima recombinasa, el 3 terminal de cada uno de las hebras desenrolladas, est vinculada a un residuo de tirosina (Y) de la enzima recombinasa. Unos nuevos fosfodiester se agregan, y se forman. Cuando un 5 es cortada de otra hebra en el complejo. De estos ataques tirosina-aductos de DNA. Despus de isomerizacin, estos pasos se repiten para formar el producto de la recombinacin (Figura 2-50).

Figura 2-50. Mecanismo de recombinacin.

79

2.4.3.

Gentica Forward y Gentica Reversa

Histricamente, la gentica forward es la metodologa ms antigua. Por lo regular, primero se observaba un fenotipo, y si era muy interesante se buscaba entonces el gen o los genes que eran responsables de esa caracterstica. Esto se lograba por medio de mapeo hasta encontrar el locus gentico, para despus determinar la secuencia del gen responsable. A esa forma de proceder se le llama gentica forward (de direccin hacia delante, en ingls) (Figura 2-51). Cuando los costos de secuenciacin bajaron, porqu se us cotidianamente por su mayor rapidez, exactitud y se empez a producir mucha informacin nucleotdica, entonces se identificaron muchos ms genes que fenotipos. As inicia la gentica reverse. sta parte de un gen determinado con una funcin desconocida, y trata de ver cual es el efecto de ese gen cuando se interrumpe o se cambia su patrn de expresin. Una forma de alterar el gen es a travs de mutagnesis qumica, con metilsulfonato (EMS) o transgnesis insercional (transposones o T-DNA), o tambin por medio de la sobreexpressin con un promotor diferente. Algunos cientficos usan los conceptos de gentica directa y gentica reversa. Sin embargo, los trminos en ingls son mucho ms comunes en los artculos cientficos. Ms alla del idioma, lo importante es entender las diferencias entre las metodologas que se utilizan para cada una de esas dos estrategias genticas.

Variabilidad natural

Mutant screens, QTLs, chromosome walking Gentica Forward

Secuenciacin

Fenotipo

Genotipo
atggctagctagcgatc gatttgagctggatatta ccctgagatggggcgc gtggtagaagggaata gcagatagcatgctga

Gentica Reversa Mutagnesis EMS, T-DNA

Figura 2-51. Gentica forward y gentica reverse.

80

3. Herramientas Moleculares
3.1. PCR
3.1.1. Historia y Principios
La reaccin en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en ingls (Polymerase Chain Reaction), es una tcnica para obtener un gran nmero de copias de un fragmento de DNA en particular. Fue descrita en 1986 por Kary Mullis. Una de las primeras referencias fue:
Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, Scharf SJ, Higuchi R, Horn GT, Mullis KB, et al.(1988) Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 239: 487491

Para realizar la tcnica de PCR se necesitan: DNA polimerasa que sea estable a temperaturas altas. La ms comn es la Taq polimerasa que resiste los 100C. Mezcla de cuatro desoxinucletidos trifosfato (dNTPs), que son los sustratos para polimerizar el nuevo DNA. (dATP, dTTP, dCTP y dGTP) DNA molde (DNA template) con la regin que se va a amplificar. Dos primers (oligos, iniciadores o cebadores) complementarios al DNA molde. Son secuencias cortas, normalmente de 20 a 25 nucletidos, que son reconocidos por la polimerasa para iniciar la reaccin de elongacin. Deben estar orientados correctamente (antiparalelos mostrndose uno hacia el otro) para que puedan amplificar exponencialmente. Iones divalentes como el magnesio (Mg2+). El magnesio se une a los nucletidos estabilizando los enlaces disteres de fosfato. Acta como cofactor de la polimerasa. Iones monovalentes, como el potasio. Una solucin amortiguadora que mantiene el pH 8-9. Termociclador, el aparato que va a mantener la temperatura necesaria en cada una de las etapas que conforman un ciclo. Hoy en da los nuevos termocicladores tienen todos una tapa caliente para evitar la evaporacin-condensacin del lquido, pero de todos modos en algunos casos se suele se agregar una gota de aceite para evitar la evaporacin.

La PCR normalmente se realiza con un volumen de reaccin de 20-50 l en pequeos microtubos de polipropileno estriles que se colocan en el termociclador. Por lo regular se hace un master mix de la reaccin de PCR (agua, amortiguador, dNTPs y Taq agregados en ese orden). Ese master mix se reparte en varios tubos a los que posteriormente se les agrega ya sea 1 l de templado de DNA y el par de primers especficos. Por lo regular se usa Tris como buffer y cloruro de magnesio (MgCl2) y cloruro de potasio (KCl) como sales. Ciclo de amplificacin El proceso de PCR por lo general consiste en una serie de 20 a 35 ciclos; cada ciclo suele consistir de dos a tres pasos de temperaturas diferentes. Las temperaturas usadas y el tiempo

81

aplicado en cada ciclo dependen de una gran variedad de parmetros. Estos incluyen la enzima usada para la sntesis de DNA, la concentracin de iones divalentes, la cantidad y proporcin de dNTPs en la reaccin, y la temperatura de unin de los primers. Inicializacin Este paso consiste en llevar la reaccin hasta una temperatura de 95C, que se mantiene durante 1-9 minutos. Esto es necesario para las DNA polimerasas (hot start) que requieren activacin por calor. Est paso tambin es til cuando se esta usando DNA genmico que requiere de ms tiempo para desnaturalizarse completamente. Sin embargo, solamente es necesario agregar este paso de inicializacin antes del primer ciclo. Desnaturalizacin Este paso se realiza tambin por medio de calentamiento a 95C. La alta temperatura (energa cintica molecular) rompe los enlaces de hidrgeno y hace que las dos hebras se separen (el DNA se desnaturaliza). Unin del primer A continuacin se producir la hibridacin del primer. Este se une a su secuencia complementaria en el DNA molde. Para ello es necesario bajar la temperatura a 50-65C (segn el valor Tm de los primers) durante 20-40 segundos permitiendo as el alineamiento. Los puentes de hidrgeno estables entre las cadenas de DNA (unin DNA-DNA) slo se forman cuando la secuencia del primer es muy similar a la secuencia del DNA molde. La polimerasa une al pedazo de doble cadena formado por el primer y el DNA molde, y empieza a sintetizar DNA. Los primers definirn los lmites de la regin de la molcula que va a ser amplificada. Extensin/Elongacin de la cadena En esta fase, la DNA polimerasa se une al fragmento de doble cadena que forma el DNA molde y el primer e inicia la sntesis. La polimerasa sintetiza una nueva hebra de DNA complementaria a la hebra molde aadiendo los dNTP's complementarios en direccin 5' 3', uniendo el grupo 5'- fosfato de los dNTPs con el grupo 3'- hidroxilo del final de la hebra de DNA creciente (la cual se extiende). La temperatura para este paso depende de la DNA polimerasa que usemos. Para la Taq polimerasa, la temperatura de mxima actividad es de 72C. Como regla general se le da 1 min por cada mil bases de fragmento que se piensa amplificar. Elongacin final Etapa nica que se lleva a cabo a una temperatura de 72C entre 5-15 minutos tras el ltimo ciclo de PCR. Con ella se asegura que cualquier DNA de cadena simple restante es totalmente ampliado. Tambin se le da tiempo a la Taq-polimerasa para que agregue un nucletido terminal de A que puede servir despus para clonar el fragmento en vectores con overhang T (Vectores tipo TOPO como pGEM) Para verificar que la PCR ha generado el fragmento de DNA previsto, se emplea electroforesis para separar los fragmentos de PCR de acuerdo a su tamao. Tpicamente se emplean geles de agarosa horizontales para fragmentos grandes; y geles de acrilamida verticales para los ms pequeos. El tamao de los productos de la PCR se compara con marcador de peso molecular conocido, que se corren en una de las lneas del gel (1) (Figura 3-1). Es una buena prctica poner un control positivo y un control negativo para todos los PCRs que uno realiza en el laboratorio. Uno debe anotar las condiciones exactas del ciclo de temperaturas, as como los volmenes de reactivos y las muestras que se usaron para cada experimento.

82

Figura 3-1. Productos de PCR despus de diferente nmero de ciclos Tarea 3-1 Un estudiante pipete los siguientes componentes: 10 L 10x PCR buffer solution (500 mM KCl, 100 mM Tris-Cl, 30 mM DTT, 15 mM MgCl2, 1 mg/ml BSA) 10 L 10x dNTP stock (2mM of each dNTP in TE buffer) 1 L Oligo primer 5' stock (50 M) 1 L Oligo primer 3' stock (50 M) 76 L sterile H2O 1 L Template DNA Cuando corri el PCR se dio cuenta que no amplifico nada. Podra decir por qu no funciono? Qu le hizo falta? Tarea 3-2 Otro estudiante program el termociclador de la siguiente manera: Step Temperature Time (seconds) 1 95 C 300s 2 55C 30s 3 72C 60s 4 Go to step 1 for 30 cycles 5 4C Hold Cuando dej corriendo su reaccin de PCR se dio cuenta de que la mquina tard mucho en terminar todo el programa. Sin embargo, el equipo era un poco viejo y por eso pens que era lento. Cuando corri su gel, la amplificacin no fue muy buena. Podra usted postular una hiptesis de porque la maquina tardo tanto, y al final se dio tan mala amplificacin?
Respuesta a tarea 1: se le olvido agregar 1 L Taq polymerase (2.5 units/mL) Respuesta a tarea 2: el paso 1 de desnaturalizacin a 95C por 300s solo se debe de hacer la primera vez por tanto tiempo. Ya despus en los ciclos repetitivos es suficiente hacerlo por solo 30s. La Taq polimerasa pierde actividad a altas temperaturas prolongadas y adems se corre el riesgo de que los nucletidos se degraden y la muestra se evapore. Mejor seria realizar un programa como: Step Temperature Time (seconds) 1 95C 270s 2 95C 30s 3 55C 30s 4 72C 60s 5 Go to step 2 for 30 cycles 6 4C Hold

83

3.1.2.

Tcnicas y Aplicaciones

La PCR es hoy en da una de las tcnicas ms importantes para un laboratorio de biologa molecular. Se usa tanto para las amplificaciones de genes y las clonaciones, como para la deteccin de los niveles de expresin (PCR en tiempo real por sus siglas en ingls RT-PCR), como para la secuenciacin de genes (Mtodo Sanger). La PCR es la tcnica que primero debe dominar cualquier estudiante que pretenda hacer algo de biologa molecular. Existen muchos libros y manuales que explican los trucos y los secretos del PCR. Tambin existen muchos sitios web en donde podrs encontrar mayor informacin. Sin embargo, nicamente con la prctica en el mismo laboratorio se puede hacer al maestro. Hacer una PCR puede ser muy fcil, pero tambin puede ser un dolor de cabeza. No es fcil optimizar las variables para una buena amplificacin (obtener suficiente DNA, pero sin que salgan otras bandas inespecficas). Tarea 3-3 Busque algunas aplicaciones de PCR. Haga un resumen de dos posibles aplicaciones para el mejoramiento gentico. Para ms informacin, consulte el siguiente link: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=hmg.section.580 Tarea 3-4: Haga una busqueda en Genebank para encontrar el gen de la hexocinasa de maz y disee unos primers para amplificar un fragmento de 100 pares de bases. La informacin de cmo usar esta base de datos se encuentra en el capitulo 7. Ponga los dos primers, el forward y el reverse, en su orientacin estndar del 5 prima al 3 prima.

3.2. Modificadores del DNA

Para poder hacer cambios dirigidos en el material gentico de una especia se necesitan herramientas que puedan modificar el DNA de una manera predecible. Por ejemplo, para cortar un gen de un cromosoma y despus insertarlo en algn otro sitio en el genoma de otra especie. Para ello se necesita un cierto tipo de enzimas que cortan y pegan la cadena de cidos nucleicos en sitios especficos. Podemos decir que para hacer ingeniera gentica primero necesitamos tener, a nivel molecular, unas tijeras y tambin un pegamento. A continuacin se describen con ms detalle algunas de esas enzimas que hacen ese trabajo.

3.2.1.

Enzimas de restriccin

Las enzimas de restriccin cortan el DNA en regiones especficas. Por lo regular son secuencias correspondientes a palndromos invertidos de 4 6 bases. El corte puede resultar en una doble cadena con terminacin simple (blunt, o extremos romos) o resultar en una terminacin de cadena sencilla complementaria (sticky end, o extremos cohesivos). Esto tiene enorme relevancia para la clonacin de genes en sitios especficos y en una orientacin determinada.

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Sitio de corte

Enzima de restriccin N N Hae III N N N N C G C G

Blunt cut
5 3 G 5 C G C N N

N N

N N

C G

C G

G C

G C

+
3

Sitio de corte 3
G C A T A T T A T A C G G

EcoR I

Sticky end cut

5

C G

+
T T A A

Sitio de corte

Figura 3-2. Ejemplos de cortes de restriccin. Arriba se muestra la enzima HaeIII que hace un corte tipo blunt, mientras que abajo la enzima EcoRI hace un corte tipo sticky end.

3.2.2.

Ligasas

Si las enzimas de restriccin son las tijeras microscpicas, entonces las ligasas son el pegamento molecular. El uso combinado de estos dos tipos de enzimas permite hacer el cut & paste de la ingeniera gentica. Esto se usa para reemplazar genes o para generar nuevas variantes quimricas de ellos. Las ligasas usan ATP para fosforilar los extremos 5 de la cadena de DNA, y de esta forma se puede unir dos pedazos de DNA que antes estaban separados. Las DNA ligasas catalizan la formacin de un enlace fosfodister entre el 5' de un fosfato y el 3' de un nucletido. Se usan para unir covalentemente cadenas de DNA. Por ejemplo, un fragmento dentro de otro. La DNA ligasa usada ms habitualmente es la T4 DNA ligasa, que requiere ATP como cofactor. La ligacin de molculas de DNA puede realizarse de mltiples maneras (Figura 3-3).

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Ligacin intermolecular

Ligacin intramolecular

T4 DNA Ligasa + ATP

T4 DNA Ligasa + ATP

DNA lineal

DNA circular

Figura 3-3. Ligacin intermolecular: entre dos cadenas distintas de DNA. Ligacin intramolecular: entre los dos extremos de la misma cadena de DNA. La ligacin en principio se producir o bien entre extremos romos o bien entre extremos de DNAs digeridos con la misma enzima de restriccin (Eco RI) y que, por tanto, pueden aparearse. Sin embargo, en ocasiones, tambin pueden producirse entre molculas digeridos con enzimas diferentes si los extremos que generan son compatibles (BamHI, BglII, Bcl, XhoII).

3.2.3.

Recombinasas

La enzima recombinasa cataliza la recombinacin homloga basada en unas secuencias de reconocimiento attB1 y attB2. En los laboratorios de biologa molecular mas avanzados, la BP clonasa y la LR clonasa estn sustituyendo cada vez msa las enzimas de restriccin y a las ligasas, para la clonacin de genes y construccin de vectores (Figura 3-4).

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Figura 3-4. Estrategia de clonacin por recombinacin. Tarea 3-5: En internet haga una bsqueda sobre la Recombinasa y la Tecnologa Gateway de Invitrogen. Averige que es un Vector Gateway, y cules son los que ms se usan hoy en da. Visite la pgina de Invitrogen para averiguarlo: http://www.invitrogen.com Tarea 3-6: Descargue el manual pdf de CloneMiners de Invitrogen. Averige para qu sirve la tcnica, cmo funciona, cuales son los pasos a seguir? Prepare una presentacin para que lo explique en un seminario a sus compaeros de clases: http://tools.invitrogen.com/content/sfs/brochures/710-02224-Tb%20CloneMiner%20.pdf

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Figura 3-5. Tecnologa Gateway para subclonacin entre diferentes vectores.

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3.3. Mtodos de secuenciacin

Hoy en da existe una gama muy amplia de mtodos para determinar la secuencia nucleotdica de los genes. En los ltimos 5 aos ha habido una gran explosin de plataformas tecnolgicas de secuenciacin. Estas permiten secuenciar genomas completos en una sola corrida. A continuacin presentamos algunos de los mtodos clsicos y explicamos los principios en que se basan las tecnologas modernas.

3.3.1.

Sanger

El mtodo Sanger moderno se basa en la separacin por electroforesis capilar de una sola reaccin de PCR con nucletidos dideox marcados con fluorforos. Antes se usaba radioactividad, y adems se usaban cuatro reacciones separadas en donde se le agregaba solo un nucletido dideox, el cual terminaba la amplificacin y no dejaba que se extendiera al final la cadena con ese nucletido en especfico. Cada una de estas cuatro reacciones se cargaba en un carril por separado y despus se corra en geles de acrilamida. Con el tiempo se mejor la tcnica al usar nucletidos marcados con cuatro fluorforos diferentes que pueden ser distinguidos por el uso de laser con diferentes longitudes de excitacin y la deteccin con varios filtros de emisin. De esta forma, se puede correr la reaccin en un solo tubo capilar, mejorando mucho la resolucin y la economa del mtodo (Figura 3-6).

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Figura 3-6. Secuenciacin por Sanger con nucletidos fluorescentes.

3.3.2.

Pirosecuenciacin

Secuenciacin en tiempo real ms rpido, eficiente y masivo que el mtodo Sanger. El mtodo de pirosecuenciacin se basa en la liberacin de PPi por cada nucletido incorporado por la polimerasa durante el proceso normal de la sntesis de DNA. La enzima Sulfurilasa usa el PPi y un anlogo de ADP (adenosina 5fosfosulfato o APS) para formar ATP. Este ATP despus es usado por la luciferasa para producir fotones. La luz producida es la seal que se detecta con una cmara CCD. A la pirosecuenciacin tambin se le llama mtodo basado en sntesis en tiempo real, porque la sntesis de DNA y la deteccin de los nucletidos se hacen al mismo tiempo (no como en Sanger que los dos procesos estn temporalmente separados). La especificidad en Sanger se basa en el marcaje fluorescente especfico de cada nucletido. Esto permite agregar todos los dNTPs al mismo tiempo durante el PCR. En la Pirosecuenciacin, el PPi liberado no permite distinguir los nucletidos, y es por eso que cada dNTP se tiene que agregar por separado (sistema de microfluidos para agregar secuencialmente los nucletidos. Ciclo repetitivo: dATP, lavado, dGTP, lavado, dCTP, lavado, dTTP, lavado, etc.) . La pirosecuenciacin se lleva a cabo en varios pasos que a continuacin vamos a describir en ingls. Esto nos ayudar a practicar ste idioma.

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Step 1 A sequencing primer is hybridized to a single stranded, PCR amplied, DNA template, and incubated with the enzymes, DNA polymerase, ATP sulfurylase, luciferase and apyrase, and the substrates, adenosine 5 phosphosulfate (APS) and luciferin. Step 2 The rst of four deoxyribonucleotide triphosphates (dNTP) is added to the reaction. DNA polymerase catalyzes the incorporation of the deoxyribo-nucleotide triphosphate into the DNA strand, if it is complementary to the base in the template strand. Each incorporation event is accompanied by release of pyrophosphate (PPi) in a quantity equimolar to the amount of incorporated nucleotide. Step 3 ATP sulfurylase quantitatively converts PPi to ATP in the presence of adenosine 5 phosphosulfate (APS). This ATP drives the luciferase mediated conversion of luciferin to oxyluciferin that generates visible light in amounts that are proportional to the amount of ATP. The light produced in the luciferase-catalyzed reaction is detected by a charge coupled device (CCD) camera and seen as a peak in a Pyrogram. The height of each peak (light signal) is proportional to the number of nucleotides incorporated. Step 4 Apyrase, a nucleotide degrading enzyme, continuously degrades ATP and unincorporated dNTPs. This switches off the light and regenerates the reaction solution. The next dNTP is then added. Step 5 Addition of dNTPs is performed one at a time. It should be noted that deoxyadenosine alfathio triphosphate (dATPaS) is used as a substitute for the natural deoxyadenosine triphosphate (dATP) since it is efciently used by the DNA polymerase, but not recognized by the luciferase. As the process continues, the complementary DNA strand is built up and the nucleotide sequence is determined from the signal peaks in the Pyrogram.

Fig A

Fig B

Fig C Figura 3-7. Etapas de la Pirosecuenciacin.

Fig D

Tarea 3-7: Asigne las figuras a las explicaciones anteriores en ingls. De cada panel de figura, a qu paso (step) corresponde?

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Figura A B C D

Step

Preguntas: 1) Para qu se usa la enzima apirasa? 2) Qu reaccin cataliza la sulfurilasa? 3) Qu reaccin cataliza la luciferasa? 4) Qu qumicos y enzimas se necesitan para la pirosecuenciacin? 5) La luciferasa usa ATP como substrato principal, pero tambin puede usar dATP como substrato alternativo. Para secuenciar los nucletidos G, T y C no hay problema ya que estos trinucleotidos no interfieren con la reaccin de la luciferasa. Pero si se agrega dATP, la luciferasa generara una seal de luz muy alta, que no sera proporcional a la cantidad de PPi que liber la polimerasa. Explique cmo se solucion este problema de interferencia para que la tcnica de secuenciacin funcionara sin problemas? Respuestas:
A2, B4, C3, D5 1) La apirasa degrada los deoxinucleotidos que no se han incorporado y acelera el proceso de lavado entre cada ciclo de diferentes nucletidos. 2) La sulfurilasa usa el PPi para convertir el APS en ATP. 3) La luciferasa usa el ATP para emitir luz. La cantidad de luz emitida refleja la cantidad de ATP presente, y esto es proporcional a la cantidad de PPi que haba antes, que a su vez es proporcional a la cantidad de nucletido que la polimerasa incorporo. 4) Necesitamos 4 enzimas: DNA Polimerasa, ATP Sulfurilasa, Luciferasa y Apirasa. Se necesitan los sustratos APS y Luciferina. tambin se deben de agregar los dNTPs que a su vez liberaran el PPi que necesita la sulfurilasa. 5) Se escogi entonces un substrato anlogo al dATP que la polimerasa si pudiera usar para liberar PPi, pero que la luciferasa no pudiera usar para generar luz. La luciferasa no puede usar deoxyadenosine alfathio triphosphate (dATPaS), pero la polimerasa afortunadamente si.

Figura 3-8. Pirograma mostrando el efecto de un SNP en la intensidad de los picos de fluorescencia en los ciclos secuenciales de la pirosecuenciacin. Pirosecuenciacin masiva Genome sequencer GS20: La tcnica de Pirosecuenciacin aprovecha los avances de la nanotecnologa, al utilizar esferas atrapadas en una placa que contiene 1,600,000 microceldas de 44m de dimetro, como se explica arriba, de tal suerte que al ingresar una esfera por cada celdilla, permite realizar una reaccin de secuenciacin individual, basada en la sntesis complementaria de un DNA de cadena sencilla, el cual ha sido amplificado por una reaccin de PCR y alineado a cada esfera. La incorporacin de cada nucletido durante la polimerizacin de DNA, libera una molcula de pirofosfato (PPi), que al interaccionar con algunas enzimas presentes en el medio (luciferasa, entre otras) produce una seal quimioluminiscente que es capturada por una cmara de deteccin de fotones y que con el soporte de un poderoso programa de computo, es traducida como la adicin de un nucletido determinado, generando una secuencia individual por cada celda

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Es una tecnologa que ahora distribuye la compaa Roche. En lugar de secuenciar hebras individuales, el mtodo de luminiscencia permite detectar ms de trescientas mil reacciones de secuenciacin al mismo tiempo. Esto se hace en nanoesferas dentro de una nanorejilla hexagonal. El punto crtico es que se hace PCR de un trozo pequeo de DNA dentro de una pequea gota. A esto se le llama PCR de emulsin o ePCR por sus siglas en ingls. Previamente se debe romper el DNA en trozos pequeos (tcnica de nebulizacin), ligarlo a adaptadores, desnaturalizarlo y unirlo a nanoesferas, de forma que una bola se encuentre con un fragmento. Para qu sirve la emulsin PCR? Las microgotas de emulsin capturan la bola junto con la mezcla de enzimas necesarias para hacer PCR, entonces el DNA de las bolas se amplificar. Cada nanoesfera tiene solo una secuencia de DNA. Es decir, en cada microgota hay una sola molcula molde, por lo que la amplificacin crear muchas copias de esa molcula solamente. Decimos entonces que es una amplificacin clonal. Seguidamente se distribuye las nanoesferas en los pozos de una nanoplaca. Dentro del tubo estarn los reactivos de pirosecuenciacin y se aaden los nucletidos. En 5 horas podemos leer 200 mil secuencias de 100-250 nt. En una corrida de pirosecuenciacin obtendremos informacin de 20-50 millones de nucletidos. Estas secuencias cortas se tendrn que ensamblar. Para ello se requiere de una supercomputadora con una capacidad muy grande de memoria. Por lo regular se usan clusters computacionales de varias docenas de nodos, cada uno con un procesador independiente. El cluster reparte el trabajo a los diferentes nodos de forma paralela, y as se reduce el tiempo requerido para hacer los cmputos de ensamblaje. La tecnologa de pirosecuenciacin fue desarrollada por la empresa 454 Life Sciences, la cual comercializ el primer equipo de secuenciacin masiva (Secuenciador GS 20), con una capacidad para descifrar 20 millones de bases por corrida (4 hrs), en secuencias individuales de 100 bases. Tan solo 3 aos despus la capacidad de secuenciacin se ha ampliado para fragmentos de 400 bases.
En CINVESTAV Irapuato estamos explorando el potencial de esta nueva tecnologa, al utilizarla con genomas mucho ms complejos que el de las bacterias, y as poder implementar herramientas poderosas para proyectos genmicos de mayor envergadura. En el LANGEBIO se tiene montada la tcnica de pirosecuenciacin. Ya se ha descifrado un genoma bacteriano ancestral, perteneciente al gnero Bacillus, el cual fue aislado de una de las fosas de Cuatro Cinegas. Con seis corridas (Secuenciador GS 20), se descifraron 129.6 Mb se secuencia, que corresponden a una cobertura mayor a 20x de su genoma. Tambin se trabaja en la pirosecuenciacin de maz palomero conico toluqueo, usando bancos genmicos de DNA total y bancos genmicos de DNA enriquecido en regiones codificantes. A estas regiones se les llama MAGIs (Maize Assembled Gene Islands). Para ello se utilizan estrategias para el enriquecimiento de regiones de DNA no metiladas. Los procesos de ensamblado y de anotacin se tratan de llevar acabo de manera paralela, pero estas representan el cuello de botella, ya que tardan mucho ms tiempo que las propias corridas de secuenciacin.

Tarea 3-8 Revise estas referencias bibliogrficas y haga un resumen de su contenido. Schaefer, B. 1995. Revolutions in Rapid Amplification of cDNA Ends: New Strategies for Polymerase Chain Reaction Cloning of Full-Length cDNA Ends. Anal Biochem. 227, 255-273. Jordan, B.; DNA Microarrays: Gene Expression Applications; Springer-Verlag; 2001 y Schena, M.; Microarray Biochip Technology; Eaton Publishing Company/Bio Techniques Books Division; 2000.

3.3.3.

Mtodo de apareamiento y ligacin

En esta seccin explicaremos el sistema de secuenciacin usando la plataforma SOLiD de Applied Biosystems. El sistema de SOLiD es un equipo de secuenciacin masiva de ltima generacin. Es an ms avanzado que el mtodo de pirosecuenciacin descrito en la seccin

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anterior. La Figura 3-9 muestra el equipo que est instalado dentro del CINVESTAV Campus Guanajuato. A diferencia de los dems mtodos de secuenciacin, el sistema SOLiD puede generar muchos millones de secuencias. La limitante es que son secuencias muy cortas de slo 50 bases. Tabla comparativa de mtodos de secuenciacin: Longitud de Mtodo lectura de cada secuencia Sanger Pirosecuenciacin 454 SOLiD 800-1500 bases 100-500 bases 50 bases Nmero de secuencias por cada corrida 1-384 250 mil 30 millones Cantidad de informacin nucleotdica por corrida 576 kb 20 Mb 4 Gb

Figura 3-9 Equipo de SOLiD de Applied Biosystem Los procesos necesarios de la metodologa SOLiD se dividen en varias etapas (Ver Figura 3-10.): La preparacin de la muestra es dependiente de la aplicacin. Se puede iniciar a partir de DNA o de RNA. La librera puede hacerse ya sea de fragmentos cortos (fragment library), o de fragmentos largos con trminos apareados (mate-paired library). Ver Figura 3-11.. La librera se tiene que amplificar en microesferas usando PCR en emulsin. Las clonas de cada microesfera se depositan de manera aleatoria sobre la superficie de una laminilla de vidrio. Ah se inmovilizan por medio de enlaces covalentes. La laminilla de vidrio se inserta en la mquina donde se procesa por un sistema robtico de microfluidos (ver Figura 3-9). Las clonas se secuencian por la tcnica de ligacin. Ver Figura 3-13. Esto consiste en mltiples ciclos de apareamiento, ligacin, lavado, deteccin, corte y lavado. Con eso se obtienen los datos primarios que tienen que ser interpretados para obtener la secuencia. Para ello se usa una codificacin de cuatro colores para cada dos bases (dibases) (ver Figura 3-14.). El anlisis de datos posterior esespecfico para cada tipo de

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aplicacin. Existen diversos programas bioinformticos propios de la empresa y tambin algunos de uso libre. Para mas detalles visite la pgina: http://solid.appliedbiosystems.com

Figura 3-10. Etapas secuenciales de la plataforma SOLiD. Tanto la preparacion inicial de la muestra como el anlisis de datos son especficos para cada tipo de aplicacin. En cambio, la parte central del proceso (enmarcada en amarillo) es comn y universal para todas las aplicaciones. Se pueden hacer dos tipos de libreras de fragmentos de DNA. Cada tipo de librera se puede usar de manera ptima para diversas aplicaciones.

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Figura 3-11. Tipos de libreras que pueden ser secuenciadas por el sistema SOLiD Principio de secuenciacin por ligacin: La secuenciacion se lleva a cabo en ciclos repetitivos cada uno de varias etapas: 0. Adicin de primer universal de secuenciacin. 1. Adicin de sondas fluorescentes y enzima ligasa. Empareamiento de sondas. Formacin de union covalente por ligacin. Lavado de sondas no unidas. 2. Deteccin del fluorforo con excitacin laser. 3. Desfosforilacin de hebras no extendidas por el primer. 4. Corte del fluorforo. Se quitan tres nucletidos z unidos al fluorocromo dejando tres nucletidos n con un fosfato libre en el 5 prima. Lavado de agente cortante. 5. Repeticin de etapas 1-4 para extender la secuencia. La extensin se hace de cinco en cinco bases (2 bases detectoras y 3 bases n). 6. Reseteo de primer de secuenciacin. Desnaturalizacin y lavado. 7. Repeticin de etapas 1-5 con el nuevo primer que esta desplazado por una base. 8. Se hacen en total 5 rondas de secuenciacin (etapas 0-6) con los respectivos primers de inicio universales n, n-1, n-2, n-3 y n-4.

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Figura 3-12. Principio de secuenciacin por ligacin. Etapas cclicas dentro del sistema robtico.

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Figura 3-13. Principio de secuenciacin usando la enzima ligasa y deteccin con el sistema SOLiD.

Figura 3-14. Principio de codificacin de cuatro colores para cada dos bases (dibase). Existen 16 posibles combinaciones de dibases nucleotdicas. Si slo se usan 4 fluorforos diferentes entonces slo se pueden reconocer 4 grupos de dibases. Por ejemplo, el color rojo puede ser para las dibases AT, CG, GC o TA. No podemos decir para cual de esas 4 dibases corresponde el color rojo. Esto significa que una secuencia de 4 colores no es suficiente para dedicir cual es la secuencia exacta de nucletidos. Habra cuatro opciones de secuencias posibles con esos colores. Se necesita informacin adicional para distinguir entre las cuatro versiones posibles. La siguiente figura muestra un ejemplo de una secuencia de color y sus cuatro posibles versiones nucleotdicas:

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Secuencia color dibases Secuencias nucleotdicas

AT CG GC TA

AA GA AT CC TC CG GG AG GC TT CT TA

AC AC GA AA CA CA TC CC GT GT AG GG TG TG CT TT

Opcin 1 Opcin 2 Opcin 3 Opcin 4

Figura 3-15. Secuencia en cdigo de colores, y sus posibles versiones nucletidicas. Por ejemplo, si de la secuencia de color mostrada en la Figura 3-15 se sabe que la primera base es A, entonces eso nos indica que el rojo es para la dibase AT y no para las otras opciones. Por consiguiente, la siguiente dibase que es azul, slo puede ser para AA, y la siguiente que es amarilla, es para GA y as sucesivamente (opcin 1). Es decir, con la secuencia de colores y el conocimiento de al menos una base de esa secuencia, podemos traducir el cdigo de colores (sistema de dibase) al cdigo nucletidico (sistema de monobase). As es como el sistema SOLiD convierte un cdigo de 16 opciones a un cdigo de cuatro opciones. En la prctica, lo que se hace es alinear la secuencia de colores con una secuencia referencia, de forma que la secuencia referencia nos ayuda a definir las opciones nucleotdicas posibles. Una vez alineada con una referencia dada, se puede distinguir muy bien si hay algunas mutaciones como deleciones, inserciones o SNPs con respecto a la referencia. Esto se logra con una altsima precisin, ya que el sistema de dibase puede distinguir entre mutaciones reales y errores tcnicos de secuenciacin (ver Figura 3-16). Est precisin se da por la caracterstica de que cada base est representada por dos colores contiguos, de forma que para que un SNP sea real debe de haber un cambio en dos colores contiguos. Si en cambio, slo se detecta un solo cambio de color, esto indica que fue un error de secuencacin.

Figura 3-16. Opciones de deteccin de errores falsos o de confirmacin de cambios reales, por ejemplo SNPs, deleciones o inserciones de una base. Es por ello que el sistema de SOLiD es ideal para resecuenciar genomas ya conocidos en busqueda de polimorfismos. Para lo que es menos indicado, es para secuenciar de novo cuando

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no existe suficiente informacion de referencia. La dificultad radica en que las secuencias cortas (<50 bases), que adems tienen ambigedad por sus colores dibases (para cada secuencia de color existen 4 secuencias nucleotdicas posibles). Todo esto hace mucho mas difcil el ensamblado de novo de un genoma eucaritico desconocido. Toda esta traduccin complicada entre diferentes cdigos se podria evitar si se pudieran usar 16 fluorforos diferentes para las 16 dibases posibles. Sin embargo, actualmente no existen tantas molculas fluorforas que tengan un espectro de absorcin y de emisin lo suficientemente diferente para distinguir 16 colores diferentes. Tal vez, en un futuro prximo si las haya, y de esta forma, se pueda mejorar an ms los sistemas tipo SOLiD. Tarea 3-9: Lea el siguiente texto en ingls y conteste las siguientes preguntas: Qu combinacin de caractersticas son las que permiten la alta confiabilidad de los datos generados con este sistema?
Ligase enzymology provides significantly higher selectivity than polymerase-based approaches and dramatically reduces errors associated with mis-incorporated bases. Two base encoding interrogates each base twice during sequencing allowing for rare SNP detection with extremely high confidence. The built-in primer reset function automatically caps system noise at given intervals to yield lower background and error rates compared to polymerase-based chemistries. A mate-paired technology that allows for a tight distribution across a range of insert sizes enables the accurate analysis and assembly of complex genomes. It is ideal to utilize larger insert sizes for detection and fine resolution of de novo genomic aberrations, such as inversions, translocations and duplications. Smaller insert sizes do not allow the same level of resolution as larger insert sizes.

Tarea 3-10: Lea el siguiente texto en ingls y conteste las siguientes preguntas: Cules son las ventajas del sistema SOLiD? El sistema de SOLiD para qu etapa de secuenciacin es adecuado de manera nica? Cunta informacin genera cada corrida? Qu tan confiables son los datos generados con este sistema?
De novo sequence analysis has traditionally been conducted by shotgun approaches using automated capillary electrophoresis (CE) systems. When the initial sequence scaffold for a particular genome is available, it is then possible to perform deep sequencing to fill in the gaps or to identify polymorphisms, mutations, and structural variations between organisms. Large scale resequencing projects require a highly parallel system to provide the depth of coverage required for variation detection. A highly accurate system is also critical to reduce false positive rates and provide the sensitivity necessary to detect mutations in heterogeneous samples. With increased sensitivity, the SOLiD System enables pooling of samples, as well as the detection of minor alleles. Automated CE sequencing remains the gold standard for de novo analysis in which long read lengths are desired, and for smaller targeted resequencing experiments. The Applied Biosystems SOLiD System for next generation sequencing is uniquely suited for finishing or large scale resequencing projects. The system generates up to 4 gigabases of mappable data in a single run (dual slide), providing the coverage and statistical resolving power required to correctly identify low frequency SNPs and structural variations across a large number of amplicons. The combination of 2-base encoding, high fidelity ligase, and primer reset functionality result in an overall accuracy of 99.94%, and a consensus accuracy at 15x coverage of 99.9999%.

Tarea 3-11. Lea el siguiente texto en ingls y despus, decriba con sus propias palabras en espaol para qu aplicaciones se puede usar el sistema SOLiD.
Targeted Resequencing The high accuracy inherent in the SOLiD System is required for targeted resequencing. The SOLiD System technology is amenable to region-specific pullout methods and barcoding, that when coupled with alignment against a known reference sequence, will yield a very flexible format for region-specifi c resequencing.

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Gene Expression The massive amount of sequence tags generated in a single run can be used to identify and quantify exon sequences associated with alternative splicing and promoter usage. Simple tag counting allows for digital readout of expression levels and the ability to detect lowly expressed genes with greater sensitivity. MicroRNA Discovery MicroRNAs (miRNAs) are highly conserved, small, RNA molecules encoded in the genomes of plants and animals. The SOLiD System technology will enable the identification and quantification of large numbers of small RNAs from diverse species. Chromatin Immuno-precipitation (ChIP) The vast number of sequencing reads generated by the system coupled with high accuracy and matepaired technology enable a whole new way to study ChIP with unmatched specifi city and accuracy. Whole Genome Sequencing The SOLiD System enables a new level of whole genome sequencing with massive throughput and mate-paired technology. The systems throughput allows for high coverage levels and the ability to sequence multiple genomes in a single run. These and other features dramatically reduce the time and cost required by other technologies.

Tarea 3-12 Lea las siguientes explicaciones en ingls, y elabore su propio diagrama de flujo con sus respectivas explicaciones en espaol. A. LIBRARY PREPARATION The SOLiD System can use two types of librariesfragment or mate-paired. The type of library used depends on the application and information needed.

B. Emulsion PCR/Bead Enrichment Clonal bead populations are prepared in microreactors containing template, PCR reaction components, beads and primers. After PCR, the templates are denatured and bead enrichment is performed to separate beads with extended templates from undesired beads. The template on the selected beads undergoes a 3 modification to allow covalent bonding to the slide.

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C. Bead DEPOSITION 3 modified beads are deposited onto a glass slide. Deposition chambers offer the ability to segment a slide into one, four or eight chambers during the bead loading process. A key advantage of the system is the ability to accommodate increasing densities of beads per slide, which will result in a higher level of throughput from the same system.

D. Sequencing by Ligation /DATA ANALYSIS Primers hybridize to the P1 adapter sequence within the library template. A set of four color dyelabeled probes compete for ligation to the sequencing primer. Specificity of probe ligation is achieved by interrogating every 4th and 5th base during the ligation series. Five to seven rounds of ligation, detection and cleavage record the color at every 5th position with the number of rounds determined by the type of library used. Following each round of ligation, a new complimentary primer offset by one base in the 5 direction is laid down for another series of ligations. Primer reset and ligation rounds (57 ligation cycles per round) are repeated sequentially five times to generate 2535 base pairs of sequence for a single tag. With matepaired sequencing, this process is repeated for the second tag. The use of color space for two base encoding makes it easy for the system to quickly and accurately discriminate between system errors and true polymorphisms.

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3.3.4.

Mtodo de sntesis con fluorforos

Tarea 3-13. Consulte las paginas web de Ilumina para aprender mas sobre la tecnologa que implementa esa compaa. Trate de explicar el sistema de secuenciacin Solexa con sus propias palabras. http://www.illumina.com/pages.ilmn?ID=203 http://www.illumina.com/downloads/SS_DNAsequencing.pdf

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4. Deteccin de polimorfismos genticos

4.1. Marcadores
4.1.1. Caractersticas de los marcadores
A los polimorfismos genticos tambin se les llama marcadores moleculares por la posibilidad de distinguir una variante de DNA de otras. Un buen marcador molecular tiene las siguientes caractersticas ideales: Inferencia no destructiva: Permite analizar al individuo sin perder su integridad o descendencia. El DNA se puede extraer de una muestra o de un tejido sin matar al organismo. Ser frecuente. El tipo de marcador tiene que ser abundante en el genoma para tener suficientes marcadores a lo largo de todos los cromosomas sin permitir muchos huecos. Ser polimrfico: Debe tener como mnimo 2 variantes. No nos da informacin analizar un marcador que es igual en toda la poblacin. Presenta herencia mendeliana. Est basado en una secuencia de DNA especfica y se hereda por medio de los cromosomas del ncleo. Ser de carcter codominante: Para distinguir entre el homocigoto y el heterocigoto. Los marcadores moleculares puramente dominantes no permiten identificar a los heterocigotos. Esta es una de las desventajas de los marcadores fenotpicos que tampoco detectan a los heterocigotos. Requerir poca cantidad de DNA: Esto es importante, sobretodo cuando las muestras son pequeas (por ejemplo a partir de semillas). La cantidad de DNA de buena calidad es muy limitante para los RFLPs. Los microsatlites requieren de muchos menos DNA para funcionar. Fcilmente analizables, interpretables e intercambiables entre laboratorios: Para evitar resultados diferentes. Una electroforesis con errores de 5 pb puede dar resultados poco reproducibles y errneos. Adems se pueden sumar errores de la PCR, sobretodo si se usan muchos ciclos. Al copiar fragmentos repetitivos la polimerasa Taq puede tener problemas. Es necesario hacer intercambios entre laboratorios y muestras control con el fin de validar los resultados de microsatlites. Automatizables: Los RFLPs, AFLPs y microsatlites requieren de nuestra interpretacin manual, ya que todava no existe un software que haga la evaluacin computarizada. Los SNPs s son automatizables, sobre todo si se usan microarreglos (por ejemplo, la tecnologa de Illumina).

4.1.2.

Tipos de marcadores genticos

Marcadores Tipo I (basados en caracteres expresados) Antes se usaban slo estos porque se pueden detectar fcilmente (color de semilla, forma, tamao, etc.). Por lo general se trataba de marcadores monognicos dominante-recesivos para caractersticas fenotpicas muy simples, por ejemplo, el color y forma de los chcharos de Gregor Mndel o el color de los ojos y la forma de las alas de las mosquitas de Thomas Morgan. Marcadores fenotpicos: forma de la hoja, color de la flor, semilla, presencia de lgulas, tricomas, etc.

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Marcadores bioqumicos: carotenos, antocianinas, clorofila, almidn tipo waxy, etc.

Marcadores Tipo II (basados en protenas) Patrn de Protenas Se puede hacer extractos y hacer electroforesis de las protenas. Con ello se pueden detectar diferencias entre genotipos (polimorfismos). No es tan eficaz ya que en los geles SDS de una dimensin slo se pueden diferenciar relativamente pocas protenas por tamao y abundancia. Los extractos totales de protenas no permiten detectar muchos cambios. Solamente los cambios mayores del tipo ausencia-presencia o modificacin sustancial en el peso molecular. Se ha propuesto el uso de MALDI-TOF para detectar cambios en patrones protenas, pero en la prctica se usado poco para mejoramiento gentico. Isoenzimas Las isoenzimas o isozimas son enzimas que difieren en la secuencia de aminocidos, pero que catalizan la misma reaccin qumica. Estas enzimas suelen mostrar diferentes parmetros cinticos (i.e. diferentes valores de Km), o propiedades de regulacin diferentes. La existencia de las isoenzimas permite el ajuste del metabolismo para satisfacer las necesidades particulares de un determinado tejido o etapa del desarrollo. Pueden encontrarse diferentes isoenzimas en los diversos compartimientos intracelulares. Muchas protenas, y no slo las que tienen actividad cataltica, pueden presentarse en formas mltiples en las clulas. En bioqumica, las isoenzimas son isoformas (variantes estrechamente relacionadas) de las enzimas. En muchos casos, son codificadas por genes homlogos que han divergido con el tiempo. Aunque de forma estricta, las aloenzimas representan enzimas de diferentes alelos de un mismo gen y las isoenzimas representan enzimas de diferentes genes cuyos productos catalizan la misma reaccin, los dos trminos se suelen usar indistintamente. Las isoenzimas permiten una deteccin fcil y muy especifica por medio de la actividad enzimtica que se visualiza en un gel nativo. Al realizarse en condiciones no desnaturalizantes, es posible detectar variantes con ligeros cambios en la secuencia y la carga neta de la protena. Muchas veces las isoenzimas no tienen cambios drsticos de la masa total. La ventaja es que es un mtodo muy sensible. Las enzimas amplifican la seal que es detectada en geles de actividad. En algunos casos las enzimas tambin tienen algo que ver con alguna funcin molecular, por lo que pueden estar muy ligados con caracterstica fenotpica deseada. Hoy en da, muy pocos laboratorios miden isoenzimas, aunque en el pasado se usaron mucho en la investigacin de la base molecular de la diferenciacin celular y de la morfognesis. Marcadores Tipo III (basados en secuencias de DNA) Tipo IIIa Marcadores no-neutrales (Genes estructurales que codifican para algo): Son secuencias de DNA que s codifican para alguna protena, y por lo tanto, los polimorfismos que observamos si estn sujetos a una presin directa por seleccin natural o artificial. Tipo IIIb Marcadores neutrales: (DNA que no codifica para nada): Son polimorfismos de DNA que no estn sujetas a una seleccin directa. Por lo regular son secuencias annimas que se encuentran en regiones intergnicas. Estos marcadores son tiles cuando estn ligados cercanamente a los genes de inters (menos de 5 cM). En el transcurso de la historia, se ha pasado de marcadores polimrficos del tipo fenotpico, a los de tipo bioqumico y de isoenzimas, hasta los basados en DNA directamente, que son los que ms se usan hoy en da. Tarea 4-1. Observe el video en la pgina web http://www.slideshare.net/lautorresm/pcr-marcadoresmoleculares, y despus explquelo con sus palabras. Consulte los siguientes sitios para mayor

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informacin: http://www.angelfire.com/magic2/bioquimica/enzimas9.htm http://es.wikipedia.org/wiki/Marcador_gen

4.1.3.
4.1.3.1.

Ejemplos de marcadores
Single Nucleotide Polymorphism (SNP)

Los Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) se originan de las mutaciones puntuales. Los polimorfismos de nucletido nico (SNPs) son variaciones de secuencia del ADN que ocurren por un cambio en solo nucletido (A, T, C, o G) de la secuencia. La mayora de SNP, (dos de cada tres SNP), se originan de la sustitucin de la citosina (C) con timina (T). Esta mutacin se da a raz de la metilacin de las citocinas. Los SNPs son evolutivamente estables ya que no cambian mucho de una generacin a otra, lo que facilita algunos estudios de poblaciones. Los SNPs tambin tienen elevada facilidad de anlisis porque admiten diferentes tipos de genotipaje. Existe un amplio abanico de tcnicas para analizarlos. Algunas de estas pueden ser automatizadas y usadas en masa a gran escala. Un ejemplo es la plataforma de Illumina que se explica mas adelante. Una ventaja de los SNPs es que son muy abundantes en el genoma. Las estimaciones actuales es que hay aproximadamente un SNP por cada 100-300 bases en el genoma humano. En algunas plantas el promedio es de uno cada mil bases. Esto implica por ejemplo, que en todo el genoma humano hay aproximadamente 10 a 30 millones de potenciales SNPs. Ms de 4 millones de SNPs se han identificado y la informacin se ha puesto a disposicin del pblico en internet. Tarea 4-2 Revise las siguientes pginas web y haga un resumen de lo que tenga que ver con los marcadores moleculares: www.intl-pag.org/10/abstracts/ www.terralia.com/revista12/pagina43.htm http://www.bioline.org.br/request?la05005 http://bcs.whfreeman.com/mga2e/bioinformatics/ch01/index.htm Problemas de los SNPs: Los SNPs ofrecen menos informacin que los microsatlites. El punto dbil es la capacidad de discriminacin; un SNP puede tener solo 4 alelos (4 bases diferentes) pero en la prctica slo hay 2 (biallicos). Los cambios ms frecuentes de los SNPs son los cambios de C a T, o de G a A. Un microsatlite puede tener muchos ms alelos que slo 4. En algunos casos hay hasta 20 diferentes variantes. Es por ello que es necesario utilizar ms marcadores SNPs a comparacin de los microsatlites. Ejercicio: Algunos investigadores han determinado empricamente que la cantidad de informacin que pueden dar 4 SNPs es similar a la de un microsatlite. Cuntos SNPs necesitamos para una prueba de paternidad, por ejemplo? Teniendo en cuenta que hacan falta ocho microsatlites para pruebas de paternidad, entonces si usamos SNPs necesitaramos analizar al menos 32 SNPs para poder decir con mayor certeza si el individuo es o no es el padre.

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Figura 4-1. Grfico-SNPs dada una N para que todos los individuos puedan ser discriminados. Ejemplo:
Segn vemos en la grfica hacen falta ms SNPs para distinguir dos individuos consanguneos que para los no consanguneos. Si tuviramos la certeza de que en nuestro set de SNPs los alelos, como mnimo estuvieran en una frecuencia (F0.2), entonces con un set de 30-40 SNPs sera suficiente y significativo. Pero, cul es el problema de est aproximacin? Garantizar que todos los SNPs se encuentran con una frecuencia (0.2). Esto no es tan fcil. Lo ideal sera diferenciar a estos dos individuos entre el intervalo de 106 a 109 individuos. Pero para obtener estos valores es preciso disponer de un rango entre 50-100 SNPs. Se analizaron 40 SNPs para ver si cumplan el requisito de 0.2 usando como ejemplo cuatro poblaciones. Existen SNPs donde no hay polimorfismo. Es decir, su frecuencia era F = 1. Por consiguiente su poder de discriminacin era cero. Otros SNPs se vio que en alguna de las poblaciones no cumplan F > 0.2. De los 40 SNPs, en el mejor de los casos, hay 20 que sirven. Conclusin: Para una poblacin en particular es relativamente fcil conseguir un set de 40 SNPs. Pero si es necesario que stos se puedan utilizar para diversas poblaciones, entonces uno necesita analizar un mnimo de 90 SNPs por lo que de stos tenemos la esperanza de que 35-40 cumplan con la regla F = 0.2.

Cuntos SNPs necesitamos si el alelo ms raro tiene una frecuencia de 0.2? Lo ideal es que cada alelo fuera 0.5 = p = q Aa dndonos as la mxima informacin. Pero en la prctica, para un P 2 = 0,8 2 2 PQ Q 2 = 0,2 2 mismo SNP las frecuencias son diferentes entre diferentes 14444 244444 4 3 poblaciones. Averige ms sobre la funcin de Hardy-Weinberg = ( P + Q )2 =1 para resolver la pregunta. Cuanta ms informacin puede dar un alelo con frecuencia 0.5 en comparacin con un alelo de frecuencia 0.2?
A = 0,8 AA a = 0,2 aa

Tcnicas de genotipaje econmico y fiable con SNPs: En la dcada de los ochentas estos anlisis se realizaban por Southern Blot ya que no existan secuenciadores. Cuando se pudo secuenciar DNA, tras la aparicin de la PCR (1989), surgen los arrays o chips que permiten realizar anlisis masivos: Mtodos basados en hibridacin: Ensayos de genotipaje para discriminar y genotipar. Diagnstico de variabilidad por polimerizacin: Primer + Polimerasa que hace crecer la cadena. Discriminacin por ligacin: De variantes allicas en funcin de si 2 oligos son combinables (OLA, RCA, LCR, DOL). Discriminacin por corte: Se discrimina en funcin de si se rompe o no el DNA. Se usa una enzima de restriccin y depuse se tiene que analizar el tamao del fragmento. Secuenciacin de DNA: Al margen de estas cuatro tcnicas hay mucha gente que prefiere ms secuenciar el trocito de DNA; si ven dos picos ser heterocigoto y si se ve un pico, ser homocigoto. Esto antes era impensable porque los kits de secuenciacin eran muy caros. La secuencia se hace con el mtodo didexido en secuenciadores

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automticos basados en electroforesis capilar. Podemos secuenciar DNA pero adems genotipar. Tarea 4-3. Lea el siguiente texto en ingls y comente con sus compaeros lo que comprendi.
The discovery of single nucleotide polymorphisms (SNPs) and insertions/deletions, which are the basis of most differences between alleles, has been simplified by recent developments in sequencing technology. SNP discovery in many crop species, such as corn and soybean, is relatively straightforward because of their high level of intraspecific nucleotide diversity, and the availability of many gene and expressed sequence tag (EST) sequences. For these species, direct readout of SNP haplotypes is possible. Haplotype-based analysis is more informative than analysis based on individual SNPs, and has more power in analyzing association with phenotypes. The elite germplasm of some crops may have been subjected to bottlenecks relatively recently, increasing the amount of linkage disequilibrium (LD) present and facilitating the association of SNP haplotypes at candidate gene loci with phenotypes. Whole-genome scans may help identify genome regions that are associated with interesting phenotypes if sufficient LD is present. Technological improvements make the use of SNP and indel markers attractive for high-throughput use in marker-assisted breeding, EST mapping and the integration of genetic and physical maps.

4.1.3.2.

Microsatlites

Los satlites son regiones del genoma repetidas en tndem, que no transcriben y estn ampliamente distribuidos en los diferentes cromosomas. Cuando se fragmenta y se desnaturaliza el DNA, la mayor parte del DNA se convierte a monocadena. Sin embargo, tambin se observa un porcentaje de DNA que queda separado del resto. Este corresponde a DNA repetitivo y renaturalizado (doble cadena) que en ese entonces se le llamo DNA satlite. Es en las regiones telomricas y centromricas donde se concentra la mayor parte de los satlites. Los satlites son de 500-1000 bases, mientras que los microsatlites son secuencias repetidas ms cortas (2-10 bases). Los microsatlites tpicos son nucletidos AT repetidos en tndem de cinco a veinte veces. A los microsatlites tambin se les llama SSRs (Simple Sequence Repeats). Su polimorfismo viene dado por el nmero de veces que se repite su matriz. Se pueden disear primers que amplifiquen estas regiones para discriminar las diferentes variantes allicas. Se efecta entonces un PCR y despus se corre una electroforesis de agarosa o acrilamida para separar las variantes por su tamao. En el genoma de maz, la abundancia de los microsatlites es elevada, sus polimorfismos son mltiples y su distribucin es ms o menos uniforme a lo largo de los cromosomas. Son marcadores codominantes, lo que permite distinguir heterocigotos de homocigotos. Normalmente se encuentran en regiones no codificantes, son marcadores neutros. (Figura 4-2).

Figura 4-2. Ejemplo de microsatlites Los marcadores SW240, SO357 y SO101 (verdes) y el SW 26 y SO005 (azules) presentan dos picos separados. El SO386 (negro) es el nico homocigtico ya que presenta un solo pico. Si en este rango no hay ningn otro marcador significa que no hay heterocigosis. Cuanto ms repeticiones en tndem, ms separados estarn los alelos.

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Cmo se generan los polimorfismos de microsatlites? La polimerasa va replicando el DNA, al trabajar con tndems puede ser que se forme un loop (vuelta) con lo que al unirse con la cadena complementaria habr un nmero elevado de repeticiones. Si este loop se forma en la cadena molde sucedera que el fragmento que se generara tendra una repeticin menos. A esto se le llama un deslizamiento slippage de la replicacin (Figura 4-3).

Figura 4-3. Modelo de slippage de la polimerasa Aplicaciones de los microsatlites: Gracias a su polimorfismo y su rpida evolucin (dan lugar a muchos alelos), existen muchos en el genoma. Muchos son de locus nico y neutros (no codificantes). Adems, se encuentran en el genoma de casi todos los organismos. Pruebas de paternidad: Normalmente se evalan unos 15 microsatlites. Si dos o ms no coinciden se puede descartar la paternidad. Pero tambin sirve para encontrar altos grados de parentesco o bien saber de quin proviene un cierto material gentico. La tcnica se basa en la amplificacin de los microsatlites mediante PCR (utilizando cebadores especficos para cada uno de los 15 microsatlites utilizados). Al ser secuencias nucleares, cada individuo posee dos copias de cada marcador, una de origen paterno y otra de origen materno, que pueden ser iguales o diferentes entre si. Los 15 marcadores poseen de 5 a 22 variantes cada uno (es prcticamente imposible encontrar 2 individuos iguales). La identificacin es inequvoca y es independiente del tipo de muestra que se utilice. Accede directamente al genotipo de los individuos y, por tanto, no se ve afectado por las relaciones de dominancia ni por las variaciones de penetrancia o expresividad ya que estos marcadores se heredan de forma codominante permitiendo as, determinar tambin el genotipo (Figura 4-4).

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Figura 4-4. Prueba de paternidad con marcadores Estudio del origen de poblaciones (migraciones humanas): Se analizan diferentes poblaciones y se intenta encontrar caminos lgicos para explicar cmo han pasado de un lugar a otro. Cunta diversidad hay en una poblacin determinada? Qu individuos pertenecen a una subespecie o a otra? Los marcadores moleculares pueden dar respuestas a este tipo de preguntas. Problemtica de los microsatlites: Son relativamente difciles de encontrar en una especie nueva. Las colecciones que se tienen ahora ha sido una labor de muchos aos. Antes se hacan en geles de agarosa, pero era muy difcil diferenciar entre 5 pb. Hoy muchos se hacen en geles de acrilamida. Algunos SSRs son complicados de interpretar por lo que aparecen otras bandas inespecficas. Muchas veces no es posible automatizar por lo que se necesita anotacin manual.

4.1.3.3.

Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD)

Se disean primers cortos (10-16 bases) con una secuencia aleatoria. Con cada par de primers escogidos al azar se hace un PCR con DNA genmico a una temperatura de alineamiento (Tm) bastante baja (35-40 C) y despus se corre en un gel de agarosa. Los RAPDs son tiles cuando no hay informacin previa del genoma ni de los genes. Como los primers son pequeos habr cientos de sitios en el genoma donde hibridarn. Con suerte puede ser que los primers se unan a regiones del genoma no muy lejanas. Si se unen en una orientacin complementaria habr amplificacin. Si la orientacin no es correcta, entonces no habr amplificacin exponencial. La metodologa se ha aplicado ms a DNA de plantas, que de animales. Por lo regular los RAPDs dan a lugar de 5 a 20 bandas que muchas veces no son muy especficas, es decir, que varan bastante segn las condiciones de cada experimento. Bajo condiciones ideales, se usa un par de primers con DNA de muchas variedades diferentes y se obtienen bandas de diferente tamao para cada variedad. Muchas veces son las mismas bandas en las muestras, pero a veces en una s se amplifica y en la otra no. Ventajas: Problema: Para disear los primers no hace falta tener informacin previa del genoma del organismo. De hecho, se pueden usar los mismos primers para diferentes especies. Al hacerlo a menor temperatura hay problemas de repetibilidad en PCR. Por ejemplo, la amplificacin vara mucho en funcin de la cantidad de DNA genmico. En los RAPDS a veces aparecen o desaparecen bandas, y muchas veces esto no tiene que ver con la secuencia del DNA. Es una tcnica poco robusta. Por eso, en el momento en el que se encuentre 1 banda consistente se disearn unos primers ms especficos y se har una PCR normal.

Tarea 4-4: Calcule cuntas variantes posibles existen para un primer de 10 bases. Asumiendo un tamao de genoma como el del arroz (450Mb), cuntas veces en promedio se pegar un primer aleatorio de 10 bases?
Respuesta: Existen 410=1048576 variantes diferentes de un primer de 10 bases.

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Para calcular las veces que se pega asumimos que el primer se puede unir a cualquiera de las dos hebras del ADN. Es decir, tenemos dos formas de escanear el genoma (2*450Mb=900Mb) En promedio, un primer de 10 bases se pegara (900000000/1048576) = 858 veces

4.1.3.4.

Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)

A finales de los aos 80, los marcadores moleculares ms usados fueron los RFLPs. El procedimiento es el siguiente: Se extrae el DNA genmico y se hace una digestin con enzimas de restriccin. Despus se hace una electroforesis y se transfiere el DNA a un filtro de nylon. Se hace un marcaje e hibridacin del DNA digerido con una sonda radiactiva. Se observan diferentes patrones de bandas entre individuos. Los polimorfismos de DNA tenan ventajas sobre los polimorfismos bioqumicos porque permitan descubrir muchas ms diferencias; el nivel de variabilidad de polimorfismo aument mucho. Individuos que se vean muy parecidos a nivel del fenotipo, podan ser muy bien distinguidos con marcadores de DNA. Se acu entonces el trmino de fingerprinting. Dos individuos diferentes no comparten el mismo patrn de bandas (Figura 4-5.).

Figura 4-5. Pasos para realizar una prueba de RFLP

4.1.3.5.

Amplified Fragment Length Polymorphism (AFLP)

Los AFLPs tratan de superar las limitaciones prcticas de otras tcnicas. De la falta de robustez y repetitividad de los RAPDs por un lado, y de la cantidad de DNA necesario para los RFLPs por otro lado. Son parecidos a los RFLPs, pero en lugar de usar enzimas de restriccin se usa amplificacin por PCR. Se hacen dos rondas de PCR con primers anidados. En la primera ronda de PCR se usan primers universales, y en la segunda se usan primers con extensiones especficas. La ventaja de los AFLPs es que se requieren de mucho menos DNA de buena calidad para empezar. Primero se usan enzimas de restriccin para digerir DNA. Por ejemplo EcoRI (reconoce 6 bases) y M (reconoce 4 bases). Una de las enzimas lleva la etiqueta de corte frecuente y la otra de corte menos frecuente. Este es un punto crtico de la tcnica, porque E y M dejan extremos cohesivos, de forma que hecha la digestin, usaremos adaptadores (fragmentos de DNA de doble cadena que sern cohesivos en los extremos generales para E y M, de forma que en 3 y 5 tendrn secuencias que conocemos).

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Con esto conseguimos millones de fragmentos de los que conocemos secuencias de los extremos 3 y 5 y que tienen tamaos variables. Gracias a esto podemos amplificar diseando primers especficos de M y E. Si hacemos PCR con estos primers ser un fracaso porque habr demasiados fragmentos. Por esto an metiendo primer E + M tampoco podramos ver nada. Todos los fragmentos digeridos quedan unidos por los extremos a los adaptadores. Se conoce su secuencia porque la ha diseado el investigador. Obtenemos un conjunto de fragmentos con secuencias de los extremos conocidos. Podremos hacer un PCR especfico. Los primers de este PCR sern complementarios a la secuencia de los diferentes adaptadores. No slo amplificaremos los fragmentos que tienen los dos tipos de adaptadores diferentes sino amplificaremos mucho y en el PCR veremos un barrido de bandas. Tarea 4-5. The gene for the autosomal dominant disease shown in this pedigree is thought to be on chromosome 4, so five RFLPs (1-5) mapped on chromosome 4 were tested in all family members. The results are also shown in the diagram; the superscripts represent different alleles of the RFLP loci.

(a) Explain how this experiment was carried out. (b) Decide which RFLP locus is closest to the disease gene (explain your logic). (c) How would you use this information to clone the disease gene?

Mtodo: Se hace un PCR pero diseando cuatro primers E de la misma secuencia excepto por el nucletido en 3 que en un caso ser A, en otro T, C y G. Se hace lo mismo con los primers de M. Se hacen 4 alcuotas de primer E y cuatro de los primers M. En total se hacen 16 PCR diferentes con las combinaciones de primers. As en cada PCR se logra amplificar un subconjunto de fragmentos. Al hacerlo, comenzarn a intuirse bandas pero seguirn habiendo demasiados fragmentos. Fue la PCR pre-selectiva donde habramos enriquecido un subconjunto de molculas del DNA genmico del que habamos partido. Entonces se disea un nuevo subconjunto de primers que adems de tener secuencia complementara a E y la A, dos nucletidos ms adicionales, ms la secuencia complementaria a los adaptadores, igual con los otros 3 primers de E. As, se tendrn 16 combinaciones, 16 primers dEA, 16 de EC, 16 de ET y 16 de EG logrando 64 PCRs diferentes en total. Por tanto 64 primers MSEI. Estamos ante la

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PCR selectiva. Ahora s que el nmero de bandas era discreto (100-200 bandas) y haca falta usar gel acrilamida o bien marcar primers fluorescentemente. Ventajas: A diferencia de RAPD, obtenemos 10-20 veces ms bandas y es una tcnica muy robusta y muy repetitiva ya que usa oligos largos y el Tm es ms alto y especifico. Da mucha informacin. Tampoco es necesario conocer el genoma, incluso se puede hacer fingerprinting de un DNA desconocido. Buena tcnica para obtener marcadores. Es obligatorio hacer las dos PCRs porque sino habr demasiada amplificacin. Veremos banda tanto para homocigoto dominante y hetero. Todava no hay ningn software que permita automatizar las lecturas. Pruebas de paternidad: El hijo debe tener una banda del padre o de la madre, si no tiene ninguna banda de los dos no es hijo suyo. El problema es que se tardaba ms tiempo comparando el gen del hijo con el de los padres. Si hubiera softwares mejores los AFLP se haran ms. Si el DNA est degradado o de mala calidad generar problemas en la tcnica, ya que el 1er paso de la tcnica es hacer la digestin del DNA genmico, si este ya viene cortado o est en muy mal estado, no funcionar bien, no ser tan robusta ni repetitiva.

Problema:

4.1.4.
4.1.4.1.

Estrategias de genotipaje
Tcnica de extensin de primers

Unas de las ms usadas son las que utilizan un secuenciador. Usa el primer que queremos extender. Diseamos un primer que en 3 tenga el nucletido adyacente a la posicin de la mutacin del DNA. Dejamos hibridar, colocamos la DNA polimerasa y 4 dideoxido nucletidos con fluorescencias diferentes.

Figura 4-6 Heterocigoto: 2 picos. La DNA polimerasa pondr ddG y a otros ddA. Pero cabe recordar que al ser dideox, slo podr aadir 1 nucletido dd ms a continuacin del primer. Se pueden detectar diferencias de migracin debido a las marcas fluorescentes. Se puede usar una extraccin rpida de DNA (15-20) en condiciones alcalinas para degradar el RNA. Seguidamente PCR (1:30) y tratamiento con fosfatasa y exon (ExoSAP = cctel de las dos enzimas). Tan slo 30 minutos de digestin. Ponemos el cctel con los dideox (1:20) inactivadas previamente las otras enzimas. El paso CIP es para cuando analizamos muchos SNPs (elimina los dideox no hibridados). Si nos lo saltamos, no slo veremos el primer del pico, sino tambin otras seales que son los dideox. La eficiencia con la que la DNA polimerasa incorpora un dideox, no es la misma de que los picos tengan la misma altura. Las diferencias de migracin en las grficas son debido a las fluorescencias. Todo este proceso tarda unas 12 horas/placa (384 muestras/placa). Ventajas: Problema: Tcnica muy rpida. Es necesario purificar primers: Si no, al ponerlos con los dideox stos igualmente se alargaran por lo que veramos muchos picos con muchas

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fluorescencias. Eliminacin qumica: Enzimas exonucleasas para eliminar los primers y fosfatasa alcalina para eliminar los nucletidos. La ventaja es que podemos hacerlo in situ pero despus ser necesario inactivar estas enzimas para que se pueda realizar la siguiente reaccin. Eliminacin fsica: Columna donde quedar retenido el DNA y se eluirn primers y nucletidos.

4.1.4.2.

PCR en tiempo real con sondas TaqMan

Este mtodo requiere del monitoreo de la cantidad de producto en cada ciclo del PCR. La fluorescencia se puede detectar: Por mtodo ptico normal con un solo filtro tipo highpass: Se estimula con una lmpara a varias longitudes de onda simultneamente a una molcula marcada fluorescentemente y se detecta la fluorescencia total. Esta tcnica no permite detectar varios tipos de fluorescencia a la vez, y es por eso que solo se puede ver una sola marca por carril. Por secuenciadores automticos: Se usan diferentes lser con diferentes longitudes de onda de excitacin. Esto permite leer varias fluorescencias dentro del tubo de forma continua y simultanea. Adems, el lser de fluorescencia permite ser lo suficientemente sensible para trabajar con volmenes muy pequeos dentro de tubos de vidrio capilares.

Fluorescencia absorbida Sonda Taq Man OligoFw Taq Pol R Q

OligoRv
Figura 4-7. Fluorescencia absorbida son una sonda Taq Man Sondas Taqman: La polimerasa Taq, adems de extender, elimina, pues la sonda est marcada en 5 por un fluorocromo y en 3 por otro. Cuando la Taq extienda el primer se acabar encontrando con la Taqman que tendr activo exon y la separar (los fluorocromos quedarn separados no anulndose entre si). La cantidad de fluorescencia que se detecta es directamente proporcional al nmero de molculas molde que se estn extendiendo. Es una tcnica cuantitativa. Tambin se utiliza para genotipar en tiempo real (Figura 4-7). Mtodo para genotipar: Aadimos dos sondas TaqMan diferentes en el PCR y deben contener el nt que estoy genotipando y cada una ser complementaria a uno de los dos alelos, adems, cada uno tendr una fluorescencia diferente, por tanto, en esta reaccin tendremos 4 primers; 2 primers R y Q y 2 sondas TaqMan. Al final del PCR slo queremos saber qu fluorescencia ser mayoritaria. Este mtodo lo podemos hacer con PCR normal y despus PCR cuantitativa para que lea la fluorescencia. Homocigoto: Hibridar una de las dos sondas porque ser totalmente complementaria. 90/10 fluorescencia. Heterocigoto: Habr un 50% de eficiencia de hibridacin para cada sonda. 50/50 fluorescencia.

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Ventajas: Problema:

No se requiere purificacin. En esta se hace todo en un tubo sin purificar. Es eficiente y rpida. No se genotipan mas de 1 SNP. Sera difcil que la hibridacin sea correcta si se usan ms. Es necesario comprar 2 sondas TaqMan con 2 fluorocromos diferentes. Esto resulta muy caro. Slo vale la pena si se tiene que genotipar muchas muestras con el mismo marcador. Las sondas deben llevar modificacin qumica (MGB) en el segundo fluorocromo por lo que aumenta la Tm (gana especifcidad). Muy importante con las sondas TaqMan porque son muy pequeas y es mejor aumentar su especifcidad a la hora de hibridar. No tiene sentido aplicarla si tenemos poca muestra o muchos SNPs.

4.1.4.3.

PCR en tiempo real con sondas FRET

Las sondas FRET emiten fluorescencia cuando dos fluorocromos estn juntos. Se disean dos primers adyacentes a la posicin de los SNPs a genotipar, si los dos primers ligan y se enganchan emitirn fluorescencia. Aqu volvemos a tener 4 primers, los dos de la PCR y los dos que discriminarn un alelo de otro. El extremo 3 de la sonda reportero est bloqueado y no se extiende. Tambin podemos hacer RT-PCR a tiempo real mediante cintica de desnaturalizacin del producto amplificado. Un solo nucletido cambiado hace suficiente diferencia entre la Tm como para que la cintica cambie.

Figura 4-8. Ejemplo de una sonda FRET Ventajas: No es necesaria la degradacin porque se emite fluorescencia. Tan slo es necesaria hibridacin.

4.1.4.4.

PCR alelo-especfica

Sistema de PCR que permite la amplificacin de uno alelo especfico individual y no del resto de alelos posibles. Esto debido a que el primer forward es complementario solo a uno de los dos alelos del gen. Con fluorforos intercalantes (SYBR Green) la calidad de la deteccin depende de la especificidad de los primers, de la interaccin entre primers. La fluorescencia se emite cuando se intercala en el surco menor del DNA de doble cadena (dsDNA). Por lo que hay que disear un primer forward que en 3 acabe con el nucletido que se est evaluando. Sabemos que si esta ltima base del primer no se complementa la PCR bajar mucho su eficiencia.

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SYBR Green Molcula intercalante

Figura 4-9. SYBR Green II es una molcula que flurese cuando se une a DNA de doble cadena. Homocigoto: Habr amplificacin y slo fluorescencia en un tubo, de lo contrario ser heterocigoto y con fluorescencia en ambos tubos. Podra ser homocigoto mutante. Para comprobarlo se tiene que hacer un segundo PCR con un nuevo primer.

Figura 4-10. Se muestra una molcula verde intercaladora que se une a la doble hlice del DNA SYBR Green I emite fluorescencia cuando se une al DNA de doble cadena. Es decir, no reacciona con el DNA de cadena sencilla. Si hacemos PCR en un medio donde hay SYBR est se podr unir al DNA en los momentos que esta presente como doble cadena, y as podemos ver la amplificacin del DNA dndonos una seal fluorescente en tiempo real. Ventajas: Se puede hacer con solo 2 primers: Ya que SYBR sirve para todos los SNPs ya que se intercala inespecficamente en cualquier secuencia de DNA de doble cadena, por lo que sirve para cualquier genotipado. Permite ahorrarse el marcaje fluorescente de los primer Taqman o FERT, que

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Problema:

son sondas especficas muy caras. Es difcil poner a punto las 2 PCRs.
Comentario [ATF1]: No entiendo este prrafo

Mtodos de genotipaje: Sabiendo la secuencia flanqueante al SNP queremos genotipar un polimorfismo A-G; Homocigoto: Para A esperaramos un pico el doble de alto. Heterocigoto: Esperamos un pico bajo porque slo se elonga una de las dos cadenas. Despus de interrogar (A) lo hago con (G) por lo que lanzo (C), si vemos un pico equivalente a 1 incorporacin nos indica que se alarga la cadena y que por tanto es heterocigoto. Segundamente interrogamos (C) (tendremos (G)); por lo tanto esperaremos pico doble ya que este nucletido est en ambas dos cadenas. Podremos elaborar un pictograma terico porque conocemos la secuencia flanqueante. Si en el alelo 2, en vez de (G) fuese (C), al aadir (G) veramos un pico que sera el triple de (A) por lo que se incorporaran 3(G). Secuenciar cadena simple: Puedo analizar haplotipos (si encontramos 2 SNPs muy cercanos entre s con el dideox no podramos saber que el individuo es doble heterocigoto ya que no distinguira. En los 2 casos existe doble heterocigoto pero no podemos decir en qu orden y qu fase est el haplotipo. Con esta tcnica s podremos saberlo: Pedigr a T C T G travs de probabilstica en la poblacin: Con las frecuencias allicas de los marcadores. Pueden influir los haplotipos siempre y cuando las 2 posiciones de los SNPs estn ms lejos de 100 pb (ya que la muestra no puede ser ms larga). Mezcla de muestras de DNA e interrogamos SNP: Si vemos una altura muy diferente entre el grupo control y el grupo enfermo podemos inferir que esa mutacin est en la enfermedad. Patrones de metilacin diferencial en el DNA: Las Cs pueden estar metiladas y estos patrones de metilacin son importantes para determinar el inprinting. El gene inprinting se refiere cuando individuos para un gen determinado, slo expresa uno de los dos alelos, ya sea el paterno o el materno. Pero, cmo se estudia el patrn de metilacin? Se hace una reaccin con bisulfito que transfiere la C metilada en un anlogo de base, despus se hace pyrosequencing y en funcin del patrn y se determina si aquella C estar o no metilada. Ventajas: Puede discriminar mezclas de 400 muestras (patologas, expresin) pero el DNA mezclado debe estar bien cuantificado. Se supone que hay la misma cantidad de cada muestra. Si no es as, el genotipaje de la cual aadamos ms cantidad estar ms representado. Longitud de informacin baja comparada con dideox. Como mximo evala 100pb y en el otro 600-700 pb. Pero ha ofrecido una alternativa al dideox para anlisis masivo de DNA.
CG CC

Problema:

4.1.4.5.

SNPlex

Para genotipar simultneamente 48 SNPs en una muestra de DNA. En realidad no estamos obligados a hacer un PCR para cada par de primers. Para cada SNP diseo 3 primers; uno en 5 que comenzar en la posicin 3 del SNP complementario al molde, pero su extremo 3 ser universal. Los otros dos primers tendrn el ltimo nucletido en 3; esto es, que uno ser complementario al primer alelo, y el otro al segundo. La discriminacin de los dos alelos de un SNP se realiza mediante una ligacin especfica del alelo (OLA), en la que se utilizan dos oligos con el nucletido del SNP en el extremo 3 y un oligonucleotido comn que se une a la regin adyacente al SNP. Los productos de la ligacin se

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amplifican mediante una reaccin de PCR mltiplex, que utiliza como primers las secuencias universales presentes en los oligonucletidos. Tras la reaccin de PCR, los amplicones se hibridan a una mezcla de sondas fluorescentes (sondas ZipChute), complementarias a las secuencias ZipCode (tambin presentes en los oligonucletidos, y que muestran movilidades nicas y pre-optimizadas en una electroforesis capilar). La identificacin de las sondas ZipCute que han hibridado se realiza en un analizador de DNA y los resultados se analizan con el software GeneMapper. Todas las reacciones se realizan en placas de 384 pozos, genotipndose hasta 48 SNPs simultneamente en una muestra. Si hacemos esto en 48 muestras, todas tendrn en comn las 2 regiones universales, los Zips sern diferentes para los 48 SNPs. Homocigoto para C: Los 2 primers se podrn enganchar pero el de A no al ltimo. La ligasa no lo permitir. Con el PCR se amplificarn las seales de los primers ligados. Pero deberemos saber para cada uno de los 48 qu nt se ha ligado, si A o el primer G. Ahora slo ser necesario observar las diferentes fluorescencias pero no hay 48 parejas de fluorescencias si no que se combinan con la movilidad electrofortica. Veramos 48 puntitos. Heterocigoto para los 48 SNPs: Veremos 96 puntitos. Ventajas: Problema: Las 48 sondas utilizadas servirn para cualquier tipo de muestra, humana, animal, etc. Actualmente la plataforma puede producir unos 200,000 genotipos a la semana. Como hacemos (OLA, ligacin) necesitamos grandes cantidades de DNA genmico pero es econmico porque podemos genotipar muchas muestras a la vez. Adems, las reacciones de ligacin entre dos regiones del genoma pueden ser muy discordantes, por ello un 5%, al hacer la reaccin de ligacin e hibridacin, sern SNPs que no son compatibles entre si.

4.1.4.6.

Sistema de Illumina

Explicar ms sobre las plataformas de ILLUMINA Una alternativa con mucho rendimiento, es la tecnologa de Illumina. Esta permite genotipificar muchos SNPs simultneamente de la misma muestra. Es una tcnica de microarreglo (microesferas unidas a primers de secuencia artificial). Estas microsferas con diversos primers unidos (todos ellos de la misma clase para una bola) se colocan en unos tubos con filtros. Si tenemos 1536 bolas diferentes y en la superficie del arreglo hay unos 30 filtros, los filtros se unen entre si formando fibras ms grandes. Cada arreglo engloba 50,000 fibras pticas por lo que tendremos 90,000 arreglos/mm2.

Figura 4-11. Microarreglos, microbolas que se enganchan los oligos. Mtodo de genotipaje: Para cada SNP se disean tres oligos (dos sern idnticos excepto en el ltimo nucletido que ser complementario 1 a cada variante), una parte de estos primers forward ser una secuencia universal. El primer que situaremos al 3 del SNP tiene una regin completamentaria

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al DNA, seguida de una secuencia complementaria a la secuencia de la microesfera bola y una 3 regin que ser universal. Con el genmico y el tro de 1,500 oligoelementos haremos PCR, (slo harn falta los 2 primers hibridados) gracias a las 2 secuencia universales de los P1 y P2. Con una fluorescencia distinta cada uno y un tercer primer que ser complementario a la universal de reverso.

Figura 4-12. Homocigoto: Slo se amplificar a partir de un primer (una nica fluorescencia). Cmo se ver? Hay que pasar el producto amplificado por los filtros con esferas, en funcin de la secuencia. El que lleve el primer se unir con unas esferas u otras (ser necesario no perder de vista en aquel arreglo en qu la fluorescencia es mayoritaria y el software nos indica el genotipo). Heterocigoto: Veremos dos fluorescencias. Las Fases: Extensin del alelo especfica por PCR. Esto se puede sofisticar en una misma esfera donde se pueden colocar diferentes secuencias, aumentando as el nmero de SNPs que se puede genotipificar. Ilumina igual que SNPlex tiene dopantes, es decir, algunos SNPs que no hibridan correctamente. Utilizando est aparato se pueden hacer un milln de SNPs al da. Ms recientemente, ha salido un chip de Illumina donde las esferas se colocan de forma distinta. Ventajas: Problema: Es barato ya que salen a unos 0,05-0,10 USD/ SNP que genotipamos y 400 USD por array, pero el equipo es caro. Se considera como tcnica muy potente. Si hay mutaciones alrededor de los SNPs. Los primers no hibridarn bien y por eso hay algunos que no funcionan.

4.1.4.7.

SNP Chips

Comentario [ATF2]: Esta muy difcil de entender

Los chips ms conocidos los maneja Affimetrix, aunque tambin existen de otros proveedores. Se colocan oligos de 15 nucletidos sintetizados en un punto determinado por fotolitografa. Gracias a un lser se pueden colocar muchos oligos por unidad de superficie. As, se pueden hacer arreglos con decenas de miles de oligos. Son servicios comerciales. Los cientficos en los laboratorios slo deben aislar mRNA, pasar a cDNA, marcar con fluorescencia y dejar hibridar, para ver cules de aquellos genes se expresan ms o menos. La tcnica no est limitada por el nmero de oligos, no consiste en una sola hibridacin y slo hace falta una PCR (con primers universales). Mtodo de genotipaje: Se pueden colocar 2 oligos que nicamente varen por el SNP, pero hay que tener en cuenta que los oligos son cortos y la hibridacin podra ser muy sutil. Otra manera, es que, por cada SNP se disee un conjunto de oligos diferente, en el que haya 0 missmatch, 1, 2, 3, asegurando as, que en aquel oligo no haya tan slo una diferencia de un SNP. Entonces, se puede obtener un patrn de intensidad de hibridacin dependiente del genotipo de la muestra. La mquina interpretar este patrn (gracias a que en esta tcnica no hay limitacin de espacio) y nos dir cul es el genotipo. Actualmente se cuenta con un GeneChip para 100,000 SNP.

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Figura. 4-13. SNP-Chip-Based www.hematology.org/publications/hematologist http://www.mun.ca/biology/scarr/DNA_Chips.html

Genome-Wide

Analysis

Es necesario fraccionar el DNA genmico (a partir de 250 ng de buena calidad) y unir adaptadores en cada extremo. Se hace un PCR universal y se rescata la regin de inters; despus estos se vuelven a fragmentar y se marcarn con fluorescencia. Al hacer PCR, slo los fragmentos pequeos amplificarn bien (reduccin de complejidad). Para prevenir esto, se pueden prever los tamaos de la restriccin, haciendo esta, in silico, es decir, en programas especializados. De esta manera, se asegura que el SNP quede en un fragmento de longitud adecuada Ya han salido al mercado chips que genotipifican todas las mutaciones conocidas por ciertos genes en especfico, por ejemplo, el gen CYP2C19 y CYP2D6 en los humanos. Estos genes estn relacionados con el metabolismo de frmacos y su estudio ha permitido reducir en un 20% los efectos adversos. Mtodo MIP (Universal): por cada SNP se disea una sonda (oligo muy largo, en 5 y 3 con regiones complementarias a las regiones flanqueantes del SNP a genotipificar). Cuando la sonda hbrida forma un semicrculo, dejando un espacio libre (SNP a analizar), el cual se rellena con nucletidos (todos con fluorescencias distintas). Se usa la enzima exonucleasa. La secuencia semicrculo tiene dianas. Las secuencias adyacentes son conocidas y entonces, se puede disear el primer, abrir el crculo y amplificar por PCR. Con el producto diseamos un chip donde introduciremos la secuencia del oligo. El producto de la PCR hibridar y se podr observar la fluorescencia. En estas sondas del chip no sern complementarias al SNP, sino a la secuencia bioinformtica generada (diferente para cada sonda MIP, color verde). Si diseamos 12,000 sondas con 12,000 secuencias bioinformticas, en funcin del SNP que queramos analizar le aadiremos una regin roja a otra, as que el chip no tan slo valdr para humanos sino para cualquier especie. Tenemos cuatro tubos (cada uno con un crculo no cerrado). En el primero aadimos (A), en el segundo (C) no marcados. Entonces amplificaremos por PCR.

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Homocigoto: Slo habr amplificacin en un tubo si es homocigoto, en dos si es heterocigoto. Para discriminar esto, en funcin de qu fluorescencia se est amplificando. Como nosotros ya sabemos si el SNP est entre A y C, slo se usan 2 fluorescencias. Dispondremos del mismo primer marcado con fluorescencias diferentes que se unir, y en el chip las sondas sern complementarias a estos primers. Ventajas: Problema: Podemos disear sondas diferentes que tan solo difieran de la regin flanqueante por el SNP pero manteniendo el mismo blanco de ER y secuencia flanqueante a la diana. Los arreglos no poseen oligos especficos de los SNPs. Se vio que marcar cada nucletido con una fluorescencia no era eficiente. Ahora las sondas que se aaden para hacer PCR tienen marcaje fluorescente.

4.1.4.8.

Espectrometra de masas (MALDI-TOF)

Se coloca una microgota con DNA en un chip. Por lo regular se usa una solucin de algn compuesto que absorba la energa lser como el acido frmico (matriz). El chip se expone al vaco y con la energa de un rayo lser se volatiliza y se ionizan las molculas. De ah el nombre de Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI). Las molculas con cargas elctricas positivas o negativas puedan ser aceleradas hacia al detector de masas. Ah son clasificadas en un espectrmetro de masas por su tiempo de vuelo, Time of Flight (MS-TOF). Con el mismo campo elctrico aplicado a molculas con diferente masa, se generan diferentes aceleraciones o velocidades, y esto se mide por el tiempo que tardan en recorrer la longitud del detector. Los dos trozos de DNA de igual longitud pero con un nucletido diferente, tendrn una masa diferente, y por tanto, diferente tiempo de vuelo. Ventajas: Problema: Analiza fragmentos amplificados por PCR El equipo de MALDI-TOF es costoso, y adems no todos los modelos de MALDITOF se pueden manejar de manera automtica, ya que muchos necesitan la interaccin manual del usuario para apuntar el lser en el punto correcto.

4.2. Tcnicas de comparacin genmica

4.2.1. Differential Display (DD)

Por medio de esta tcnica se comparan genes de expresin diferencial. Es parecida a los AFLPs, pero en lugar de partir de DNA genmico, se inicia con RNA, que se transcribe a cDNA usando un oligodT con nucletidos especficos adicionales. Se buscan bandas de marcadores que distingan a las variedades. Con esta tcnica se encuentran genes con expresin diferencial entre dos muestras. Tarea 4-6 Lea el siguiente texto en ingles. Con base en ese texto, explique ahora con sus propias palabras en espaol como funciona la tcnica de diferential display.
Differential Display allows rapid, accurate and sensitive detection of altered gene expression (Liang, P. and A.B. Pardee. 1992. Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of the polymerase chain reaction, Science 257, 967-971). The mRNA Differential Display technology works by systematic amplification of the 3' terminal portions of mRNAs and resolution of those fragments on a DNA sequencing gel. Using anchored primers designed to bind to the 5' boundary of the poly-A tails for the reverse transcription, followed by PCR amplification with additional upstream primers of arbitrary sequences, mRNA sub-populations are visualized by denaturing polyacrylamide electrophoresis (See schematic illustration of differential display). This allows direct side-by-side comparison of most of the mRNAs between

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or among related cells. The differential display method is thus far unique in its potential to visualize all the expressed genes in a eukaryotic cell in a systematic and sequence-dependent manner by using multiple primer combinations. More importantly, the new method enables the recovery of sequence information and the development of probes to isolate their cDNA and genomic DNA for further molecular and functional characterizations. Because of its simplicity, sensitivity, and reproducibility, the mRNA Differential Display method is finding wide-ranging and rapid applications in developmental biology, cancer research, neuroscience, pathology, endocrinology, plant physiology, and many other fields.

Ejemplo: Se parte de una extraccin de mRNA que se pasa a cDNA va RT-PCR. Para ello se usan primers aleatorios de secuencia corta (decmeros) junto con un primer de oligodT12MN, y se le agrega la transcriptasa reversa. De cada muestra se hacen cuatro alcuotas, y como primer se usa un oligodT12 con dos nucletidos extras como la G. Slo las molculas que tengan dos C (complementarias de las dos G) antes de la cola poliA sern eficientemente transcritas. En la primera alcuota estar pasando de los RNAs a cDNA que antes tengan C, en las otras alcuotas se usan otros primers con un nucletido adicional G, A o T. Todo esto se hace con las dos muestras en paralelo. Las molculas de RNA que estn en A y B se transcribirn en los 2 tubos. Una vez hecho esto, para cada una de las tres parejas de tubos se hace una amplificacin y se usa un oligo de secuencia aleatoria de 10 nucletidos. Se hacen geles y se analizan bandas que estn en A y no en B o viceversa. Esto se repite con ms primers aleatorios y con todas las alcuotas. Se recomienda usar geles de poliacrilamida para poder ver bien las bandas. La separacin eficiente de fragmentos es necesaria para distinguir las bandas de inters. Tambin cabe decir, que est tcnica nos puede indicar, no tan slo genes que se expresan en uno y en el otro, sino tambin genes que se expresan ms en A que en B o a la inversa. Toda banda candidata se puede recortar del gen y ser verificada usando tcnicas convencionales como northern, RT-PCR. Es una tcnica de arreglos para pobres, porque un chip de expresin es muy caro. Ventajas: Permite comparacin mltiple de las muestras y permite partir de pequeas cantidades de RNA que vendrn limitadas por las alcuotas necesarias. Tambin permite identificar fragmentos gnicos aumentando o disminuyendo la regulacin. Esta tcnica puede dar pistas sobre genes que estn expresados diferencialmente entre muestras mediante la intensidad de la banda (tcnica cualitativa). Falsos positivos, por lo que se recomienda hacerlo por duplicado.

Problema:

4.2.2.

Representational Diference Analysis (RDA)

La tcnica de RDA, permite comparar muestras de dos genomas e identificar regiones que presentan diferencias entre ellas. Se llama as, porque se usa exclusivamente una fraccin del DNA (representativo). Antes de hacer el PCR, se hace una substraccin por hibridacin con un DNA tester. Esto permite amplificar la fraccin del DNA que tiene los adaptadores correctos. Se ha usado para comparar DNA de tejido tumoral con DNA del mismo paciente de tejido sano. Lisitsyn N, Lisitsyn N, Wigler M. (1993), cloning the differences between two complex genomes. Science, 259, 946-951 Metodolgicamente, la tcnica se basa en hibridacin substractiva de cidos nucleicos. Se tienen 2 DNAs, uno es el DNA prueba o tester (en el que se pretende identificar las diferencias), el otro es el driver (o DNA de referencia). Inicialmente, ambos DNA son digeridos y ligados a adaptadores. Los adaptadores del tester tienen que ser diferentes a los del driver (aunque los 2 DNAs hayan sido preparados con la misma enzima de restriccin). As pues, en el tester habr algn fragmento que no se encuentre en el driver, o al revs. Por esto se recomienda hacerlo en

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paralelo y que en uno, el primer caso el tester sea tester y en el otro el tester pase a ser el driver. Como digerimos con la misma enzima de restriccin, la mayora de fragmentos tienen una longitud promedio similar. No es recomendable usar enzimas que corten con frecuencias diferentes.

Representational Difference Analysis RDA

Tester
Extraccin de ADN

Driver (exceso)

Restriccin PCR (seleccin del tamao del fragmento 1501500bp) Adaptadores

Hibridacin sustractiva

* ** * + * * * * * * * *

Desnaturalizacin Alineacin

PCR

* * * * Crecimiento
exponencial

Crecimiento lineal

Sin producto

Figura 4-14. Representational Diffrerence analysis (RDA). Si el DNA viene del mismo individuo no habr polimorfismos de restriccin, pero si los driver y tester son de individuos diferentes, s que podremos obtener fragmentos de diferente tamao, porque puede haber polimorfismos de restriccin. No solamente habr deleciones e inserciones que nos podemos encontrar si son del mismo individuo. Despus de poner adaptadores, se tiene el driver en exceso, por lo que habr hibridacin entre la cadena sencilla del driver y la cadena sencilla del tester. Si el fragmento est en las dos muestras, es ms probable que hibride el driver con el tester que el tester con l mismo, porque el driver est en exceso. Como resultado, los fragmentos que solo estn en el tester no encontrarn ninguna cadena driver complementaria, y por tanto volvern a hibridar con su cadena complementaria. Esto implica que aquellos fragmentos de tester-tester son los que no estn presentes en el driver. Se hace un PCR con primers complementarios a los adaptadores del tester, de tal manera que slo estos amplifican de manera exponencial. Cabe decir que puede ser que un fragmento que est en los dos se haya colado porque haya vuelto a hibridarse con tester en lugar de driver. Por eso es que la hibridacin substractiva y el PCR se tienen que repetir varias veces. Despus se corren las bandas en geles, se recortan y se mandan secuenciar. Seguro que habr una fraccin del genoma que no ser amplificable por PCR debido a que los fragmentos son ms grandes de la cuenta, por lo que se recomienda digerir el DNA con diferentes enzimas.

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Ventajas: Problema:

Es una tcnica potente. Muchos falsos positivos, pero se pueden disminuir haciendo alcuotas del producto de PCR y hibridarla otra vez con un exceso de DNA driver, porque as descartamos las posibles molculas que han hibridado y que tambin estn presentes en el DNA driver.

SSH Es equivalente a la RDA, pero a diferencia de este, se parte de RNA y no sobre DNA genmico. Tambin se habla de tester y driver. En esta tcnica se tienen 2 alcuotas diferentes de tester, cada una con adaptadores de secuencias diferentes. Al driver no se le liga ningn adaptador. Se desnaturalizan las muestras y se hibrida el tester A y B con exceso de driver en diferentes tubos. Despus se juntan ambos tubos, se desnaturalizan y se vuelven a hibridar. De todas las molculas que se formen, interesarn aquellas que contengan una cadena de tester A con 1 cadena de tester B. Si ahora se hace PCR, en estos dos tubos, aquellos tester que no estn presentes en los drivers, no hibridarn con ellos y quedarn en forma de cadena sencilla, de tal manera, que si juntamos los dos tubos e hibridamos de nuevo, el tester de los dos tubos que no haban hibridado, hibridarn entre ellos y los que estaban hibridados. Finalmente se hace PCR con un primer complementario al adaptador A y otro al B, para que slo se amplifique el tester A+B. Ventajas: Problema: Resultados normalizados, se amplifica cDNA expuesto diferenciado, pequeas cantidades de RNA. Expresin diferencial no cuantitativa.

4.2.3.

Genome Missmatch Scanning (GMS)

A veces interesa encontrar fragmentos de DNA comparables para dos muestras, y que los hayan heredado de los antecesores. El objetivo de esta tcnica es encontrar secuencias idnticas de DNA. Se debe analizar el pedigr y cuatro o cinco generaciones atrs encontar al individuo afectado. Probablemente pensemos que han recibido del antepasado ese fragmento de DNA. As que se necesita una tcnica que permita identificar los fragmentos de DNA que estos dos hijos tengan en comn (fragmentos iguales,) candidatos de la enfermedad y que por lo tanto, habrn heredado. Adems este fragmento compartido no tendr que tener SNPs porque tan slo han pasado tres o cuatro generaciones, lo que se considera poco para que surjan SNPs. Se Quiere una coleccin de fragmentos de identidad por descendiente, identity by descent (IBD) que no presenten cambios nucleotdicos. El GMS descarta secuencias con nucletidos diferentes y se queda con las secuencias iguales (Griffiths, et al. 2004) Se parte de dos DNA genmicos (A y B), de los cuales, uno sera metilado y el otro no (tan solo tendr dos molculas de DNA genmico metiladas las regiones normales). Enseguida, se utilizan enzimas de restriccin como PstI (que puede corta tanto secuencias hipermetiladas como no) se Mezclan las 2 digestiones, se desnaturaliza y se renaturaliza, del tal manera que se hibride el DNA A con DNA B. Puesto que nos interesan los DNA mixtos (pero molculas de igual secuencia), se debe descartar los homohbridos. Cmo lo hacemos? Aprovechando el mismo grado de metilacin que tienen los homohbridos. Se digiere con DpnI (reconoce cuatro nucletidos y slo corta cuando las dos cadenas estn metiladas) y MboI (reconoce la misma secuencia que DnpI y corta las dos cadenas cuando no hay metilacin). Usando estas dos enzimas digeriremos homohbridos (las enzimas de restriccin no se usan, porque son de mayor frecuencia de corte). Los heterohbridos que no presenten ningn cambio de nucletidos no se cortarn eficientemente, ni por una enzima ni por la otra y quedarn en un tamao mayor, por lo que sern molculas candidatas a ser responsables de esa caracterstica fenotpica. Ahora se

Comentario [ATF3]: No hay contexto

124 compara cuales no presentan missmatch de estas molculas grandes (missmatch = no IBD)1. Cmo haremos est discriminacin? Si se incuba los heterohbridos con enzimas de reparacin estos buscarn missmatch, si lo encuentran harn nicks en la molcula, y por tanto, si despus de hacer esto quedan fragmentos largos, estos sern candidatos a ser el heterohbrido sin missmatch. Despus har falta recuperar estas molculas de doble cadena grandes que sern candidatas a ser IBD.

4.3. Ejemplos de aplicaciones

4.3.1. Demostracin de Pedigr
Anteriormente, las pruebas de descendencia (entre ellas las de paternidad) se hacan con marcadores microsatlites, pero ahora se est utilizando ms los SNPs. Los microsatlites tienen un grado de polimorfismo mas elevado que los SNPs. Con 8 microsatlites es suficiente para discriminar un individuo en las pruebas de paternidad. Se necesitan ms de 40 SNPs para lograr una discriminacin con el mismo grado de confiabilidad. Pruebas de paternidad con microsatlites: Algunos laboratorios recomiendan usar un par concreto de marcadores, para que todo el mundo los haga igual. Suelen ser paneles de 12 marcadores. Cuando se hace la prueba de paternidad y se compara el par padre-hijo, no se puede hacer la exclusin de paternidad solo por un microsatlite que no coincida, como mnimo hacen falta 2. Si medimos 12 microsatlites y slo sale 1 diferente, ampliaremos la batera de marcadores a comparar hasta 16. La pregunta es: si realmente el individuo es del padre Cmo puede ser que el microsatlite no coincida? Porque -4 hubo mutacin en la lnea germinal (P= 10 ). Hay microsatlites en donde la tasa de mutacin es ms elevada que las ordinarias. Cuando la DNA polimerasa se encuentra con repeticiones puede haber un deslizamiento en la replicacin, lo que no ser reconocido por los sistemas de reparacin. Los sistemas de reparacin de la clula si reconocen una mutacin de SNP y en la mayora de los casos la reparan. Por eso hay una tasa de mutacin ms elevada en los microsatlites que en los SNPs. Criterios de seleccin de microsatlites: Cuando elegimos marcadores para hacer pruebas de paternidad, se escogen estos de algunas listas estndares. Por ejemplo, para animales se usa la de la Internacional Society of Animal Genetics (ISAG). Esta tiene unos 32. Los criterios que se siguen para la seleccin de marcadores de DNA son: Que no den problemas de lectura. Puedan amplificar en mltiplex. Evitar aquellos que tengan alelos nulos. Estos son individuos que tienen mutacin justo donde se empareja el primer, que no tiene nada que ver con el microsatlite. Si el individuo es Aa y pasa esto, uno de los 2 alelos no amplifica y el otro s: pensaremos que es (AA) y en realidad es (Aa). Evitar utilizar marcadores demasiado cercanos en un mismo cromosoma. Tratar de que tengan segregacin independiente.

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4.4. Haplotipos
4.4.1. Desequilibrio por ligamiento
Un haplotipo es un conjunto de alelos ligados por su proximidad en un cromosoma. Los genes que estn en loci cercanos (menos de 5 centimorgans) se heredan en bloque ya que son pocas las recombinaciones que se realizan entre ellos. A mayor distancia fsica entre los genes, mayor tasa de recombinacin. El trmino de haplotipo se emplea para referirse a ese bloque de polimorfismos ligados. Por ejemplo, si los abuelos paternos tienen el haplotipo ABCDEF mientras que los abuelos maternos tienen el haplotipo abcdef, los nietos tendrn uno de esos dos haplotipos. Sern muy pocas las veces en que los nietos tengan un haplotipo combinado tipo abcDEF o ABCdef. Solo cuando las distancias entre los genes son mayores a 10 centimorgans es cuando se da un desligamiento entre genes. En ingls a esto se le llama linkage disequilibrium. Al estudiar un trozo de DNA, secuenciarlo y alinearlo con una secuencia referencia encontramos varias posiciones polimrficas. Cada una de estas combinaciones de polimorfismos ligados recibe el nombre de haplotipo. En una escala de tiempo evolutiva, los haplotipos se rompen en los alelos individuales que los conforman, por lo que decimos que se heredan de forma independiente e individual. Sin embargo, en escalas de tiempo cortas (menos de 20 generaciones) los polimorfismos se agrupan en haplotipos. Tarea 4-7 Un mejorador hizo una cruza entre dos padres, despus autofecundo la F1 y la F2 para generar una poblacin segregante de familias F3. Usando esa poblacin genotipeo las diferentes lneas para 3 genes de inters. Los alelos que detecto eran: Gen 1: A y a. Gen 2: B y b, Gen 3: C y c. Obtuvo los siguientes resultados: abc aBC Abc Abc Abc Abc ABC abc aBC Abc Abc Abc Abc ABC ABC aBC aBC abc Abc Abc ABc Abc abc ABC ABC abc Abc ABC En la tabla anterior cada celda representa el genotipo de un individuo de esa poblacin. Un padre tena el genotipo ABC y el otro padre el genotipo abc. Calcule las distancias genticas entre los diferentes genes A, B y C en unidades centimorgan.

4.4.2.

Proyecto HapMap

El proyecto HapMap fue Iniciado en 2002 con el objetivo de describir las variaciones en la secuencia de DNA de la poblacin humana. Debido a que estas variaciones se dan en bloques, la meta entonces es definir los diferentes haplotipos del genoma humano y de esta forma facilitar el estudio de algunas enfermedades.
Al secuenciar cromosomas de diferentes personas se encontr que en ciertas regiones de genoma humano haba combinaciones de SNPs que son ms frecuentes que otras. Esto se debe al ligamiento de secuencias de DNA que estn muy cercanas y que casi siempre se heredan en grupo. Es decir, los genes no se segregan cada uno independientemente, sino que en bloques. Un haplotipo es un conjunto de polimorfismos que se conservan juntos an despus de muchas generaciones. Por lo regular, un haplotipo abarca de 10 a 1000 genes.

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Cuntos SNPs son suficientes para darnos informacin de los diferentes haplotipos? No hace falta genotipar todos los polimorfismos: analizando tan slo 3 SNPs podremos determinar cul de los haplotipos tenemos.

4.5. Pros y contras de las herramientas moleculares

4.5.1.
4.5.1.1.

Ventajas de las herramientas moleculares

Rapidez

El uso de marcadores moleculares se traduce en una rapidez mucho mayor en comparacin con los mtodos convencionales. Por ejemplo, con marcadores moleculares se pueden lograr la introgresin por retrocruza de un gen en tan solo 3 4 generaciones, mientras que con el mtodo sin marcadores esto mismo llevara hasta 6 8 generaciones. Esta rapidez en muy importante para las compaas de semillas, y es por eso que no es de sorprender que las empresas privadas como Monsanto o Pioneer usen los marcadores moleculares muchsimo ms que las instituciones de investigacin pblica como el INIFAP o la Universidad Antonio Narro. Mismo en una institucin internacional de mejoramiento como el CIMMYT los marcadores moleculares slo se usan en casos especiales y de manera espordica, muy lejos de la rutina masiva que usan las compaas semilleras de maz. Time is money. Muchas veces los investigadores no tienen mucho dinero de fuentes de financiamiento generosas, y es por que eso que suelen tardarse un poco ms para lograr las mismas metas de mejoramiento en comparacin con sus colegas en las empresas.

4.5.1.2.

Alta heredabilidad

Los marcadores moleculares ofrecen la oportunidad de obtener informacin de manera ms precisa que al medir el fenotipo. El fenotipo es muy variable, ya que depende del ambiente y del estado de desarrollo. Si decimos que el genotipo es una informacin digital con valores discretos (A, T, G o C), el fenotipo es informacin anloga con valores continuos que dependen de muchos otros factores y circunstancias. Un marcador molecular por consiguiente, tiene un valor de heredabilidad mximo (cercano a 100%), ya que toda la varianza se debe al polimorfismo y no hay influencia del ambiente. En cambio, el fenotipo puede tener una heredabilidad mucho ms baja, por ejemplo el rendimiento de grano bajo sequa suele tener una heredabilidad de menos de 30%. La heredabilidad es un trmino que se usa para describir la proporcin de la varianza que puede atribuirse a los genotipos, en relacin con la varianza fenotpica total, que incluye la varianza ambiental, y el error residual. La heredabilidad puede tambin entenderse como repetibilidad de la medicin del carcter de inters, en nuestro caso, el rendimiento de grano bajo sequa.

4.5.2.
4.5.2.1.

Limitaciones de las herramientas moleculares

Costos

Un argumento muy vlido en contra de los marcadores moleculares es que actualmente los costos son demasiado altos. Muchas veces, su uso no se justifica por simples razones econmicas. Las herramientas moleculares pueden requerir una inversin inicial muy elevada y un costo de operacin muy alta, lo que impide su uso de manera general para todos los cultivos y todas las caractersticas. La inversin inicial implica la compra de equipos sofisticados de secuenciacin o de genotipaje, que en la mayora de los casos cuestan ms de dos cientos mil

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dlares. Tambin se requiere de personal calificado y entrenado, ya que las metodologas no son tan fciles y no siempre funcionan a la primera. El costo por datapoint de los marcadores moleculares puede ser de 3 a 10 dlares, lo que es mucho ms caro que sembrar varios genotipos en el campo para evaluarlos. Muy pocas instituciones pblicas aplican rutinariamente los marcadores moleculares para el mejoramiento gentico. El uso de los marcadores moleculares nicamente se justifica en algunos casos en que las metodologas tradicionales no han funcionado muy bien, o cuando la velocidad es lo mas crtico y el costo no importa tanto (p. ej. empresas de semillas transnacionales). Uno de los retos ms grandes para el futuro es desarrollar metodologas que sean mucho ms econmicas y eficientes. Para que valgan la pena, los costos tendran que bajar entre dos a tres rdenes de magnitud.

4.5.2.2.

Escepticismo de los mejoradores clsicos

Algunos genetistas clsicos piensan que no es necesario utilizar las herramientas moleculares modernas. Su justificacin es que con sus tcnicas clsicas han conseguido incrementar la produccin sin ninguna necesidad de secuenciar el DNA o usar la informacin genmica. El xito histrico del mejoramiento clsico, as como los resultados contundentes que obtienen de forma continua les da la razn. En promedio, el avance gentico que se ha obtenido en el mejoramiento de maz es de 10% por dcada aproximadamente. Sin embargo, se debe tener en cuenta que no en todos los caracteres se ha conseguido lo mismo, y que en algunos casos, el progreso gentico se podra acelerar al usar la informacin molecular. Es decir, hoy en da no solo importa el resultado, sino tambin la velocidad y la eficiencia. Todava no existen muchos casos documentados que demuestren que con marcadores moleculares se logr un progreso gentico mas rpido y mas eficiente que sin los marcadores. La eficiencia hay que medirla en trminos de una relacin de costo-beneficio. Pocos fitomejoradores han dicho que ahorraron dinero por usar marcadores. Por otro lado, si hay varios que han invertido bastante dinero en marcadores sin realmente tener muchos beneficios en trminos genticos. Actualmente se estn realizando estudios comparativos para demostrar la superioridad de los marcadores, pero todava no hay mucha evidencia publicada. Hay que recordar que los marcadores moleculares se propusieron hace mas de dos dcadas, y sin embargo, hasta la fecha no han dado tan buenos resultados como muchos investigadores prometieron desde el inicio. Algunos piensan que todava es cuestin de tiempo demostrar que los marcadores funcionan eficientemente en la prctica de un fitomejorador de campo. Otros piensan que todo lo molecular suena muy bonito e interesante en teora, pero que ya en la prctica es muy diferente. Algunos han llegado a pensar que los marcadores son una promesa que se quedar en los laboratorios pero que nunca llegar realmente a tener impacto en el campo. Las opiniones varan segn las experiencias de los grupos y la participacin de las instituciones. Una de las limitantes ms grandes de la aplicacin de los marcadores es la brecha tan grande que existe entre los cientficos y los diferentes usuarios. Por lo regular los fitomejoradores trabajan solo en el campo, mientras que los investigadores lo hacen en el laboratorio. Existen muy pocos investigadores que realmente sepan hacer bien las dos cosas: hacer ensayos de campo con evaluaciones fenotpicas por un lado, y por otro lado hacer experimentos de laboratorio y anlisis bioqumicos o moleculares. Son actividades que requieren de diferentes destrezas. Hay muy pocas personas con vocacin y talento en las dos reas.
Muchas veces, los dos grupos se echan mutuamente la culpa. Es tpico escuchar de algunos investigadores que dicen que los fitomejoradores no hacen caso de los descubrimientos que ellos han publicado en las revistas. Por otro lado, algunos fitomejoradores dicen que los agricultores no se van a comer el papel de las publicaciones. Otros piensan que los moleculares viven encerrados en sus laboratorios y que no saben realmente de que estn hablando cuando se trata de los problemas del campo. Es muy fcil hacer promesas en teora, pero no es tan sencillo cumplirlas en la realidad. Algunos dicen que a partir de un genoma

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secuenciado ya automticamente se pueden generar mejores variedades. Otros piensan que el desarrollo de toda la tecnologa de secuenciacin de los ltimos 20 aos fue una tarea relativamente sencilla, comparado con el grandsimo reto de generar variedades mejoradas a partir de la informacin de una secuencia.

Es un camino mucho ms largo y sinuoso la del gen a la semilla, de la semilla al campo, y del campo al plato, que del modelo de la doble hlice de Crick al genoma secuenciado de Watson Cita annima Nunca sabremos quien tiene ms razn, ni se trata de eso. Lo que si es verdad es que se necesitan ms personas calificadas en los dos temas, agrcolas y moleculares, para que un ejrcito de estudiantes jvenes, motivados y capacitados se conviertan en verdaderos puentes de unin, para que lleven los logros de la ciencia de vanguardia a todos los rincones del medio rural. Sin esos jvenes y sin esa educacin de calidad, todos los sueos de la biotecnologa agrcola se quedarn solo en papel.

4.5.2.3.

El vnculo entre el laboratorio y el campo

Hay muchos cientficos que saben hacer PCR. Hay otros que saben tomar datos agronmicos. Sin embargo, no existen muchos cientficos que quieran hacer las dos cosas, aislar un gen y calificar mazorcas. Hay muchos estudiantes que prefieren ponerse la bata y los guantes, y muchos mas los que deciden ponerse las botas y el sombrero para trabajar bajo el sol. Hay muy pocos que saber hacer las dos cosas. Y mucho menos los que realmente son buenos en las dos reas. Necesitamos ms cientficos que puedan publicar en las ms altas revistas cientficas, y a su vez estn generando semilla mejorada de alguna variedad vegetal.
Pareciera que existie una barrera psicolgica entre los cientficos y los mejoradores que evita que los dos se complementen de una manera eficiente. Por un lado los cientficos reclaman: es que los mejoradores no aplican nuestros conocimientos sobre el ADN. Por otro lado los agrnomos contestan: es que los cientficos investigan lo que les interesa a ellos. Despus de graduar y publicar, ya no se esfuerzan en aterrizar las cosas. A su vez los cientficos responden yo publico en revistas para que los dems lean mis artculos y apliquen el conocimiento. El problema es que a veces no hay gente capacitada para hacerlo, y otras veces, los resultados que se generaron son demasiado costosos para una aplicacin de campo. Los cientficos se guan por el inters y se motivan por la curiosidad de responder preguntas, mientras que los mejoradores se guan por la necesidad y la urgencia de resolver problemas. Un cientfico busca contestar las preguntas de una manera novedosa, mientras que un mejorador trata de resolver un problema de la manera ms rpida y con el menor costo posible. Si un cientfico no responde la pregunta inicial, no importa porque habr aprendido mucho, y tal vez haya contestado muchas otras preguntas muy interesantes. Si un mejorador no logra su objetivo de incrementar el rendimiento, o la calidad, entonces ha fracasado. Es decir, la eficacia y la eficiencia son parmetros primordiales para el mejorador, mientras que para el cientfico no tanto. Un ejemplo muy caracterstico son los marcadores moleculares. Se pueden realizar estudios sofisticados sobre la funcin de los genes para identificar QTLs y generar marcadores moleculares. Eso se puede publicar muy bien. Sin embargo, muy pocas veces resulta til esa informacin para el mejoramiento en trminos prcticos, debido a que los QTLs son especficos de las poblaciones experimentales que se utilizaron, y por lo regular no aplican para las generaciones mas avanzadas de los materiales elite de los mejoradores. La complejidad de algunas caractersticas, como el rendimiento de grano bajo sequa, es tal que resulta muy poco eficaz utilizar marcadores para un gen que solo contribuye con menos del 1% de la variabilidad gentica. Adems, todo se complica aun ms, con los fenmenos de heterosis, epistasis, interaccin genotipo-ambiente, etc. Bajo esas circunstancias resulta mucho ms rpido, barato y eficaz confiar en un buen fenotipeo y un anlisis bioqumico, que gastar demasiados recursos en el genotipeo y seleccin por marcadores. En teora, los marcadores suenan muy bien, pero ya en la prctica resultan ms costosos y menos confiables para lograr los objetivos de mejoramiento deseados. En teora, la secuenciacin de un genoma es una noticia fabulosa, pero en la prctica, no se necesita tanto esa informacin. Ms servira desarrollar protocolos

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de fenotipeo ms eficientes, confiables y baratos. Sin embargo, no hay suficiente dinero, ni apoyo para esos trabajos, ni tampoco hay recursos humanos capacitados.

Hoy en da es muy fcil secuenciar miles de genes. Lo que es difcil es encontrar la forma de aprovechar la informacin nucleotdica para generar una variedad mejorada. Lo que se necesita es una oleada de estudiantes inteligentes y motivados para que se pongan a trabajar en esos temas para que resuelvan los problemas que estn pendientes. Lo que se requiere es formar un ejrcito de futuros fitomejoradores para que trabajen con los diversos cultivos, y se enfoquen en desarrollar variedades adaptadas para los diferentes suelos, climas y ambientes. Slo as se lograrn avances significativos para satisfacer las necesidades de los agricultores y los consumidores.

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5. Genmica y regulacin
5.1. Antecedentes de la genmica
La genmica surgi en 1990 con el proyecto del genoma humano (HUGO). El objetivo era caracterizar todos los genes de la especie humana. Se saba que algunas mutaciones en determinados genes eran responsables de algunas enfermedades o padecimientos. Debido a que los genes solo representan una pequea parte del genoma, secuenciar todo el DNA, incluyendo los fragmentos repetitivos, implicaba un gran esfuerzo de tiempo y dinero. El inters de curar y diagnosticar algunas de estas enfermedades fue lo que finalmente moviliz los recursos financieros para lograrlo. El objetivo era obtener tanto el mapa gentico, como el mapa fsico y la secuencia de DNA. Se redujeron los costos y aument la velocidad de secuenciacin. Despus de HUGO se trataron de incluir a muchas ms especies diferentes. Se introdujo el concepto de especies modelo. El primer genoma bacteriano secuenciado fue el de Haemophilus influenzae. En 1996 se secuenci la levadura Saccharamyces cerevisiea. Este fue el primer eucariota secuenciado con 6,000 genes. En el 1998 se secuenci un nemtodo (Caenorhabditis elegans) que ya posee diferenciacin celular. En el 2001 se public el genoma de Arabidopsis con 23 mil genes. Entre los genomas secuenciados figuran los cloroplastos, las mitocondrias de mamferos, diferentes organismos de laboratorio como levaduras, nematodos, la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster la planta Arabidopsis thaliana, el ratn, Mus musculus. Tambin se han secuenciado una gran variedad de patgenos, como las bacterias causantes del clera, la tuberculosis, la sfilis, la gonorrea, la enfermedad de Lyme, el virus de la viruela y el del mal de Epstein-Barr. Con la conclusin de estos y muchos otros proyectos genomas se espera lograr una mejor comprensin sobre el mecanismo de accin de los organismos patgenos, para disminuir su virulencia, o lograr erradicarlos. Los proyectos genmicos se pueden dividir en tres fases: Genmica estructural: Es una caracterizacin fsica. Por ejemplo qu tamao?, cuntos cromosomas?, cuntos genes?, cuntas secuencias repetitivas? Se desarrollan mapas genticos, mapas fsicos, BACs, marcadores, se averigua como estn organizados los genes en clusters, centrmeros, telmeros, bandeo, etc. Secuenciacin: Es la determinacin del orden de las letras del DNA. Esto incluye la secuenciacin (ya sea por Sanger, Pirosecuenciacin, Solid o Solexa), el ensamblado bioinformtico en contigs y almacenaje de las secuencias en bases de datos. La secuenciacin se puede hacer en fragmentos por azar (mtodo shot-gun) o de manera organizada por YACs, BACs o contigs (mtodo tradicional). Genmica funcional: Ya una vez que se tiene la secuencia, se tienen que identificar los genes (exones e intrones), y despus anotar las protenas con sus respectivas secuencias regulatorias. Despus se debe de determinar la funcin de cada gen por medio de mutantes, transgnicos, expresin heterloga, etc. Finalmente se pretende entender la funcin de cada uno de los elementos del genoma (promotor, gen, etc.).

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Figuras 5-1. Yeast Artificial Chromosomes. PYAC con DNA blanco

5.2. Estrategias de ensamblaje genmico

Para la secuenciacin de un genoma de manera tradicional, primero se tienen que obtener clonas que estn ordenadas dentro de un mapa fsico. Primero necesitamos tener el genoma clonado en forma redundante en cromosomas artificiales. Despus, necesitamos obtener un mapa fsico preferentemente de traslape mnimo, minimum tilling y finalmente, necesitamos obtener la secuencia de cada uno de los clones elegidos. Otra forma es buscando los pasos apropiados chromosome walking. Comenzando con un clon, se clona solamente un extremo y se busca en la biblioteca otro(s) que traslapen. Este proceso se repite, avanzando pasos en el cromosoma. Los mapas de restriccin de los vectores son una alternativa al Chromosome walking. Se pueden hacer mapas de restriccin de los vectores para identificar secciones parcialmente traslapadas. Con ello se puede ordenar la biblioteca de manera que se obtengan grupos traslapados que pertenezcan al mismo cromosoma. Los vectores son plsmidos, microcromosomas bacterianos. Sus principales caractersticas es que tienen un origen de replicacin y son estables, es decir deben poseer secuencias que permitan su propagacin dentro de una clula bacteriana. Los vectores tienen sitios especficos para insertar el DNA a clonar y sitios con secuencias nicas para varias enzimas de restriccin. Los vectores tambin deben tener marcadores de seleccin; que confieren propiedades fenotpicas que permiten seleccionar a los portadores. Se tiene varios tipos de vectores clonados, tales como: a) Plsmidos; cuyo lmite de clonacin es de 0.1 a 10 kb. b) Fagos; derivados del bacterifago lambda, de 8 a 20 kb. c) Csmidos; combinacin de fago I y plsmido, de 35 a 50 kb d) BAC: por sus siglas en ingls Bacterial Artificial Chromosome, derivado de plsmido F (plsmidos de fertilidad) de E. coli, que interviene en el control de la replicacin. El sitio de clonacin en el gen LacZ (seleccin azul/blanca). Su transformacin es por electroporacin. De 75 a 300kb. e) Vectores derivados de bacteriofago P1; de 100 kb. f) YAC; por las siglas en ingls, Yeast Artificial Chromosome. Cromosoma artificial de levadura, Hablaremos un poco ms de los YACs. Son segmentos largos (ms de 100 kb), se ligan con los dos brazos, y cada brazo termina con un telmero de hongo, de manera que el producto puede ser estabilizado en la clula fngica. Los YACs ms largos son tambin ms estables. Los

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brazos tiene una secuencia de replicacin autnoma (ARS), un centrmero (CEN) y un marcador de seleccin ( trp1), el otro brazo tiene otro marcador de seleccin (ura3) esto asegura que la clula ha recibido un cromosoma artificial con ambos telmeros, dada la complementariedad de los mutantes, y el cromosoma artificial el ADN insertado. Los problemas con los YACs: El ms importante es que de 40 al 60% de ellos sufren rearreglos, el 40% de los YACs se pierden, tienen baja eficiencia de transformacin y son extremadamente difciles de de manipular

Figura 5-1 Esquema del vector YAC en Escherichia coli.

Figuras 5-2. Secuenciacin basada en mapas y secuenciacin por Shotgun.

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Figuras 5-3. Mtodo de Shotgun. Figura tomada de los artculos de Craig Venter sobre shotgun (Nature 1996)

Figura 4 2: Historia de los mapas genticos y secuenciacin genmica.

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5.3. Ejemplos de proyectos de genmica

Son proyectos de caracterizacin global de los genes de una especie. Se trata de determinar la secuencia, el nmero de genes, la posicin de los mismos dentro de los cromosomas, la estructura intrn-exn, las secuencias regulatorias, promotores, la funcin de los genes, su patrn de expresin en diferentes tejidos, estados de desarrollo e influencia de los factores ambientales. Los organismos modelo que se han escogido para los proyectos de genmica suelen ser aquellos con un genoma relativamente pequeo, ya que entre menos nucletidos, mas barato resulta secuenciarlos.

Figura 5-2 Tamao del genoma haploide de varias especies

Figura 5-3 Nmero de genomas completos en las bases de datos de Genbank

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Tarea 5-1: Usando los datos de las figuras anteriores conteste las siguientes preguntas: Qu son los dominios taxonmicos?, Por qu en la actualidad se usan ms que los 5 reinos?, Cules son estos? y cules son las caractersticas de cada uno? En qu tipo de organismos existen ms genomas completos? Puede usted postular algunas razones de ello?

5.3.1.
5.3.1.1.

Genomas vegetales
Arabidopsis

Tarea 5-2: Lea el siguiente texto en ingls y conteste las siguientes preguntas: Por qu se escogi Arabidopsis como modelo genmico? Cuntos genes nuevos se agregaron en la versin TAIR8?

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Arabidopsis thaliana is a small flowering plant of mustard family, brassicaceae. It was selected as a model organism for genome sequencing in plants based on the fact that it has (1) a small genome of ~120 Mb with a simple structure having few repeated sequences and high gene density (2) short generation time of six weeks from seed germination to seed set (3) produces large number of seeds, and (4) is easy to transform. The sequencing was done by an international collaboration, collectively termed the Arabidopsis Genome Initiative (AGI). It consisted of research groups in the U.S., Europe and Japan. The project was initiated in 1996 and completed in 2000 (Nature, 408:796-815). The Arabidopsis Information Resource (TAIR) has announced the release of the latest version of the Arabidopsis genome annotation (TAIR8) at TAIR and NCBI. The latest release builds upon the gene structures of the previous TAIR7 release. The TAIR8 release contains 27,235 protein coding genes, 4759 pseudogenes or transposable elements and 1288 ncRNAs (33,282 genes in all, 38,963 gene models). A total of 1291 new genes and 2009 new gene models were added. Thirteen percent (4330) of Arabidopsis genes now have annotated splice variants. Updates were made to 3811 gene structures of which 625 gene models had CDS updates; a total of 4007 exons were modified and 683 new exons incorporated. There were 33 gene splits and 41 gene merges. Overall 23% of all existing TAIR7 genes (7380 genes) were updated (includes split, merged and deleted genes as well as locus type changes, structural updates and sequence updates) for TAIR8. Changes to chromosome sequences include removal of vector/Ecoli contamination and 1425 single nucleotide substitutions. Additional details can be viewed at the TAIR website. Texto tomado de: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/map_search.cgi?taxid=3702

5.3.1.2.

Arroz

Tarea 5-3 Lea el siguiente texto en ingls y conteste las siguientes preguntas: Cuntas veces ms grande es el genoma de arroz comparado con el de Arabidopsis? Cuntos proyectos genmicos de arroz existen actualmente?
Rice is one of the most important food crops in the world and feeds more people than any other crop. The international community decided to use rice as the model monocot plant to study cereal genomics for two reasons: 1) the small genome size, ~450 Mb, and 2) the understanding that many of the commercially important cereals have genomes that are very syntenic with rice. There have been commercially funded efforts as well as publicly funded efforts to determine the nucleotide sequence of rice. The first commercial effort, by Monsanto, resulted in a database of genomic sequence and SSR objects. The genomic sequence has been shared with the International Rice Genome Sequencing Project members. The second commercial effort, a collaboration between Myriad Genetics and Syngenta, used the whole-genome shotgun method. Despite a press release in January 2001 noting the completion of the "rice genome map", little if any genomic sequence from this project has been deposited into the public domain. A response to the impediments and shortcomings of this is available. The two publicly funded rice genomic sequence projects have each produced draft genome sequence. The International Rice Genome Sequencing Project is a collaboration of publicly funded investigators. The project began at the 1997 meeting of the International Symposium on Plant Molecular Biology in Singapore and is described. All of the PAC and BAC libraries for the effort have been produced from DNA prepared from seeds from a single plant of Oryza sativa ssp. japonica c.v. Nipponbare. The work has been apportioned among the various collaborators. The current status of sequence acquisition by the contributors to the sequence acquisition is routinely updated at the coordination organization, IRGSP. As the Monsanto sequence is brought to phase 2 qualities by IRGSP members, this material is published in public databases. The nucleotide sequence for twelve chromosome assemblies has been deposited in DDBJ by IRGSP. Various groupings of subsets of the IRGSP have deposited in GenBank the nucleotide sequence for four alternative assemblies. The other publicly funded project, directed by the Chinese Academy of Sciences, Beijing, China, is to sequence the genome of O. sativa ssp. indica and O. sativa ssp. japonica by the whole genome shotgun (WGS) method. This project began in April 2000, as a WGS project to sequence the Oryza sativa L. ssp. indica genome. The first peer-reviewed report was in the April 5, 2002 issue of Science. This has been deposited at GenBank/EMBL/DDBJ under the project accession AAAA00000000. The revision history for this data is available. Sequence data are retrievable through Entrez. The collection of contigs is available as a BLAST database for public query. This project has expanded to include the WGS sequencing of the Oryza sativa L. ssp. japonica genome. This has been deposited at GenBank/EMBL/DDBJ under the project

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accession AACV00000000. The revision history for this data is available. Sequence data are retrievable through Entrez. The collection of contigs is available as a BLAST database for public query. Texto tomado de: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/map_search.cgi?taxid=39947

5.3.1.3.

Maz

El maz no solo es una especie econmicamente importante, sino que tambin puede ser un buen modelo para los estudios de evolucin genmica. Existe mucha informacin sobre esta especie debido a que muchos genetistas clsicos y moleculares han trabajado con esta especie desde hace ms de un siglo. Si bien su secuencia completa no ha sido aun publicada, ya se han identificado gran parte de los genes. No fue secuenciado con anterioridad debido al gran tamao de su genoma. El maz tiene 10 cromosomas (2n=20). Tarea 5-4: Lea el siguiente texto en ingls y conteste las siguientes preguntas: Cules es el tamao mnimo del genoma de maz? Cuntos mapas genticos de maz estn pblicamente disponibles actualmente?
The maize nuclear genome is thought to be amphidiploid - a fusion of two diploid genomes (Helentjaris T, Weber D, Wright S. Genetics 1988 118:185-188) - or allopolyploid - (Wilson et al. 1999) with knob heterochromatin. The knob heterochromatin has been characterized as a duplication of a 185-bp element (Peacock et al. Proc Natl Acad Sci, USA 1981; 78:4490-4494) and a 350-bp element (Ananiev et al. 1998) with the amount of duplication varying up to 3 to 4 orders of magnitude between different races of corn. This leads to a wide range of genome sizes among corn. The minimum size is estimated to be 2400 Mbp with a high proportion of repetitive DNA. At a NSF sponsored workshop it was decided that sequencing maize genes and placing them on a cross-referenced physical-genetic map is important to improving the agronomic characteristics of the plant. The effort to deterimine the nucleotide sequence of the Zea mays subspecies mays (maize) has begun. Currently there are seven genetic maps available. The data for six maps were provided by MaizeDB. The data are currently available from MaizeGDB. These six are 1) the IBM interim genetic map of 2000, 2) version 2 of the IBM genetic map from 2002, 3) the Emerson genetic map, 1935, and the 4) UMC-98 map with the two maps with map coordinates dependent upon the UMC-98 map, 5) QTL map and 6) bin-mapped loci. Gardiner J et al. (1993) described the UMC-98 map and the use of loci on the map to create a framework to localize non-Mendelian loci or incompletely positioned Mendelian loci. The IBM map was presented in Sharpova N et al. (2001). The initial data for the 1999 Wilson maize map [Wilson WA et al. (1999)] was provided by RiceGenes with input from MaizeDB/MaizeGDB used to complete the display. As data for other maps are requested or new map data are made available, these maps will be displayed. Texto tomado de: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/map_search.cgi?taxid=4577

Un pariente del maz, el sorgo, tiene un contenido mucho menor de DNA (800Mb). Gaut y Doebley (1997), utilizando 14 pares de genes que se encuentran duplicados en el maz, lograron fechar la duplicacin hace entre 16,5 y 11,4 millones de aos. Sin embargo, esta poliploidizacin no explica totalmente el incremento del genoma del maz. En el maz son muy abundantes los elementos mviles (McClintock, 1946; Fedoroff, 2000). Estos elementos mviles contribuyen al gran tamao del genoma del maz. Por ejemplo, Hake y Walbot (1980) estimaron que entre 60 y 80% del total del genoma del maz se encuentra constituido por elementos mviles, alrededor del 20% est formado por elementos altamente repetitivos con hasta 80,0000 copias, y 40% est dado por elementos moderadamente repetitivos, con ms de 1000 copias. Un estudio detallado de la dinmica de los elementos mviles fue realizado por San Miguel et al. (1998) en el cual analizaron una regin de 240kb que incluye al gen Adh1. Alrededor del 62% del total de esta seccin est formado por transposones y 6% por repeticiones de bajo nmero. En

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est seccin del genoma encontraron 23 retrotransposones pertenecientes a 10 familias distintas. De estos 23 elementos, 10 se encontraban a su vez insertos dentro de otro elemento. La edad del elemento mvil ms antiguo en esta regin, segn aproximaciones de reloj molecular, sera de hace unos 5.2 millones de aos, aunque el promedio es de alrededor de 3 millones de aos. Dado que esta regin en el sorgo carece de retrotransposones, se considera que la proliferacin de stos en el maz ha sido reciente y posterior al evento de tetraploidizacin. Los datos con que se cuenta indican que la situacin de la regin de la Adh1 es representativa de la mayor parte del genoma del maz. As estimaron que el 50% del total del genoma del maz est constituido por las familias de retrotransposones que se encuentran en esta regin, y que su distribucin a lo largo de los diferentes cromosomas es bastante uniforme. De hecho, tres de estas familias representara algo as como el 25% del total del genoma de esta planta {Aldridge, 2009 #176}. Gaut et al. (2000) y Tenaillon et al. (2001) realizaron experimentos para explorar a fondo la variacin gentica a nivel de secuencias en el maz. Como ya se mencion, los niveles de variacin gentica son muy altos en esta especie. As, en el cromosoma 1 en 25 colectas, encontraron una q =0.0144 para 4 genes cerca del centrmero y una q =0.0170 para 11 genes ms alejado del centrmero. q es un estimado de 4Ne que depende del total de sitios polimrficos y del largo de la secuencia, y si la evolucin del gen es neutra, debe de ser igual a p y se interpreta de manera parecida, (Cummings y Clegg, 1998). Otro patrn interesante en el maz y sus parientes silvestres cercanos del mismo gnero y conocidos como teosintles, es la falta de congruencia entre las filogenias obtenidas para diferentes genes. Por ejemplo, las secuencias derivadas de plantas de diferentes localidades pertenecientes al teosintle Zea luxurians forma un grupo muy bien definido con los genes glb1 y adh1. Estos genes se encuentran cercanos en el cromosoma 1, pero las mismas plantas presentan secuencias ms parecidas a las de otros taxa del gnero Zea para la adh2 (del cromosoma 4) y para c1 (del cromosoma 9), sugiriendo una historia evolutiva compleja mediada por diferentes tipos de seleccin natural y patrones de flujo gnico, que posiblemente sean comunes en la mayor parte de las angiospermas con polinizacin cruzada.

5.3.1.4.

Tomate

Tarea 5-5: Lea el siguiente texto en ingls y conteste las siguientes preguntas: Ya se secuenci totalmente el genoma de tomate? Qu pases estn participando? Entre que especies de tomate se hicieron cruzas para determinar QTLs y para hacer mapas genticos?
The genus Solanum includes the cultivated tomato, S. lycopersicum, together with its wild relatives. Tomato has long been used as a model system for plant genetics. It has been used for a number of firsts in molecular genetics of plants. The use of RFLP (restriction fragment length polymorphism) to generate a linkage map of a complete plant genome was done with tomato (Bernatzky and Tanksley. Genetics 1986; 112:887-898). Tomato was the organism where quantitative traits were resolved into Mendelian factors (Paterson et al.). The use of allelic variation of RAPD (random amplification of polymorphic DNA) to facilitate map-based walking to agronomically pertinent loci was first done in tomato (Wing et al. and Martin et al.). The creation of a high-density molecular linkage map and the use for comparative genomics were done with tomato and potato (Tanksley et al.). There is an NSF-funded effort to create an ordered collection of BACs that is to be superimposed upon the tomato genetic map. This resource will more rapidly allow access to the underlying genetic and functional basis of the extensive collection of alleles of already known loci affecting fruit development and ripening, interactions between plants and pathogens, and other biological processes of plants. International consortiums of researchers as part of the Solanaceae Genomics Project are in the process of sequencing the gene rich regions of all 12 chromosomes on a BAC-by-BAC basis and annotate it. In US, majority of the research is funded by NSF and USDA-NRI Plant Genome program. It will be sequencing chromosomes 1, 10, and 11. Other participating

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member countries are Korea (chromosome 2), China (chromosome 3), UK (chromosome 4), India (chromosome 5), The Netherlands (chromosome 6), France (chromosome 7), and Japan (chromosome 9). Map Viewer Data There are four maps currently available. The gene genetic map is from the data presented by Tanksley et al. The other three are maps built with loci where the allelic state is determined by examining the nucleic acid of the genes. These maps are built using backcross populations from an interspecific cross between Solanum lycopersicum and Solanum pennellii. For all the maps the data either are publicly available or have been published in a peer-reviewed journal. The 1986 map data are from Bernatzky and Tanksley (Genetics 1986; 112:887-898). The 2000 map data are entirely from the Solanaceae Genome Network. Texto tomado de: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/map_search.cgi?taxid=4081

Tarea 5-6: El nombre cientfico del tomate era Lycopersicum esculentum, mientras que hoy en da se le trata de llamar Solanum lycopersicum. Haga una busqueda bibliografica y averigue ms sobre el tema, y d una razn de este cambio. Qu experimento hara usted para demostrar que la papa (Solanum tuberosum) es un pariente muy cercano del tomate? Es decir, porque no se justifica tener un gnero separado para el tomate (Lycopersicum) y para las diferentes especies de papa (Solanum). Haga un rbol taxonmico para explicarlo. Tabla 5-1. Lista de especies y el nmero de genes tentativos consenso y secuencias unicas (singletons). Datos sacados el 14 de enero 2009 de la pgina http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/cgi-bin/tgi/tc_count.pl?category=plant Species Malus x domestica Aquilegia Arabidopsis thaliana Hordeum vulgare Beta vulgaris Brassica napus Chlamydomonas reinhardtii Citrus clementina Theobroma cacao Coffea canephora Phaseolus vulgaris Gossypium Gossypium raimondii Vitis vinifera Mesembryanthemum crystallinum Euphorbia esula Lactuca sativa Lotus japonicus Zea mays Medicago truncatula Ipomoea nil TCs Singletons 28,148 26,317 13,556 7,389 34,155 47,671 41,206 39,517 4,784 12,367 47,634 42,693 11,139 20,469 10,269 29,614 843 1,972 7,420 10,212 5,351 8,738 49,233 65,161 9,508 15,383 33,638 45,338 3,627 10,727 12,505 15,472 85,624 29,273 11,754 6,772 15,769 17,380 18,793 151,387 38,190 9,760 TC + Singletons

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Physcomitrella patens Nicotiana benthamiana Allium cepa Citrus sinensis Prunus persica Capsicum annuum Petunia hybrida Pinus Populus Solanum tuberosum Lactuca serriola Oryza sativa Secale cereale Sorghum bicolor Glycine max Picea Saccharum officinarum Helianthus annuus Festuca arundinacea Nicotiana tabacum Solanum lycopersicum Triphysaria Triphysaria versicolor Triticum aestivum

28,254 5,861 4,063 26,081 8,439 4,661 2,230 34,181 49,638 31,567 8,047 77,158 1,471 23,442 42,647 42,051 40,016 12,347 6,686 26,151 25,764 17,442 7,165 91,464

35,527 10,266 8,182 72,817 15,690 9,588 6,499 27,683 50,013 29,805 13,958 104,638 4,116 22,583 40,856 38,443 76,572 24,616 13,251 56,932 21,085 17,043 5,647 124,988

5.3.2.
5.3.2.1.

Genomas animales
Genoma Humano

El proyecto HUGO inici en 1990 con el objetivo de obtener el mapa gentico completo del genoma humano, que no se consigui hasta el 1996 con 5264 marcadores y 1,6 cM de distancia. En 1998 se consigui el mapa fsico con 30.075 STS localizados en contig maps. En el 2000 se anunci el primer borrador de la secuencia completa del genoma humano y en 2001 se public este borrador con el 90% de la secuencia. En 2003 se dio por acabada la secuencia del genoma humano. Paralelamente a los esfuerzos pblicos de HUGO, una compaa privada (Celera Genomics de Craig Venter) secuenci el genoma de varios humanos (mujeres y hombres de diferentes razas) en un tiempo rcord. Esto se debi a que el grupo de Venter escogi una estrategia de secuenciacin masiva a partir de fragmentos de DNA aleatorios. La secuenciacin tipo shot gun no necesita generar mapas genticos previos. Sin embargo si necesitaba un software muy poderoso de ensamblado. Hoy en da se han desarrollado programas muy sofisticados de ensamblado que pueden usar fragmentos tan cortos de 100 bases para generar contigs de millones de bases.

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Figura 5-4. Menos del 2% de los 3400 millones de bases del genoma humano codifican para protenas. Tabla 5-2: Tabla de estadsticas sobre el Genoma Humano
Topic Statistic Total size of the genome: approximately 3,200,000,000 bp Percentage of adenine (A) in the genome: 54% Percentage of cytosine (C) in the genome: 38% Percentage of bases not yet determined: 9% Highest gene-dense chromosome: chromosome 19 with 23 genes per 1,000,000 bp Least gene-dense chromosomes: chromosome 13 and Y with 5 genes per 1,000,000 bp Percentage of DNA spanned by genes: between 25% and 38% Percentage of exons: 1.1 to 1.4% Percentage of introns: 24% to 37% Percentage of intergenic DNA: 74% to 64% The average size of a gene: 27,000 bp The longest gene: dystrophin (a muscle protein) with 2,400,000 bp Average length of an intron: 3,300 bp Most common length of an intron: 87 bp Occurrence rate of SNPs: roughly 1 per 1,500 bp Occurrence rate of genes: about 12 per 1,000,000 bp

Tarea 5-7 Usando los datos del genoma humano mostrados en la tabla anterior, conteste las siguientes preguntas: Cul es el porcentaje de bases de guaninas (G) en el genoma humano? Dedzcalo. La longitud promedio de los intrones es de 3300 bp pero la longitud ms comn es de tan slo 87 pb. Explique por qu? Para ello dibuje una grafica tipo histograma con la distribucin de la longitud de los intrones. Tarea 5-8 Observe el video de las siguientes pginas web para que comprenda mejor los datos anteriores. http://www.elmundo.es/especiales/2001/02/ciencia/genoma/grafico http://www.virtual.unal.edu.co/cursos/ciencias/2000088/lecciones/Foros/Genoma/GenomaHuman http://es.wikipedia.org/wiki/Proyecto_Genoma_Humano

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Tarea 5-9 Cuntos cromosomas hay en una clula humana diploide? Hay diferencias entre el sexo masculino y femenino? Investigue en otros seres vivos (mnimo 10), haga un cuadro comparativo y explquelo. Tarea 5-10 Cmo se explica que en la mitocondria tengamos material gentico? Postule una hiptesis de porque se ha podido acumular DNA que no tiene funcin aparente? El genoma haploide humano tiene 23 cromosomas con 3200 millones de pares de bases. La cantidad de informacin en el ncleo es muy elevada: si punteramos cada nucletido de una clula abarcaramos una longitud de Norteamrica a Londres. Dentro de la mitocondria tenemos un genoma muy pequeo (16 kb en mamferos) que slo codifica para el rRNA y tRNA propios de la mitocondria y para unos pocos genes ms. Se podra dividir en sus componentes: Genes y secuencias relacionadas y DNA intergnico (64%). Los genes representan el 1.4% del genoma (regiones codificadas), y el resto son intrones, transposones, etc. El DNA intergnico engloba elementos repetidos, copias dispersas, etc. El genoma es muy grande, pero las regiones codificantes son muy pequeas. Al parecer hemos acumulando DNA que no tiene una funcin aparente. Por eso se ha querido caracterizar una parte muy pequea del genoma: los genes. Dentro del conjunto de los genes, a los mejoradores les interesan principalmente aquellos con una repercusin en el fenotipo. Hace falta un mapa para no perderse, as naci el concepto de mapa gentico: es una descripcin de la posicin y la distancia relativa de los genes y otros marcadores en los cromosomas de una especie. Tambin se introdujo el concepto de Haplotipo {Aldridge, 2009 #176; Gallais, 2009 #175}.

5.3.2.2.

Genoma del perro

Algunas especies domsticas se han secuenciado gracias al proyecto Tree of Live (http://www.tigr.org/tol/). Este proyecto pretende secuenciar los genomas de diferentes especies que pertenezcan a diferentes ramas del rbol evolutivo de la vida. Cuando es muy costoso obtener la secuencia completa se plantea obtener secuencias con una cobertura de tan solo 2X. Esto es suficiente para hacer un anlisis comparativo del genoma. La empresa Celera Genomics secuenci el genoma del perro y lo public como un borrador en el 2003, pero con una redundancia 1.5X (78% del genoma). Pese a esto fue til para comparar tamao, genes ortlogos y ver que el 5% del genoma est conservado entre el perro y el ratn. Se vio pues que un 2-3% eran genes y 2-3% no lo eran, pero estaban igualmente conservados. En el proyecto pblico se adelantaron y en el 2004 depositaron los datos en las bases pblicas. Desde que el perro, un descendiente de los lobos asiticos, se convirti (hace al menos 15.000 aos) en un animal domstico, los criadores han desarrollado varios cientos de razas. El que fuera cazador, guardin o ayudante del ser humano se convirti cada vez ms en un perro faldero. Hoy existen en el mundo cerca de 400 millones de perros de compaa. El perro fue el primer genoma de especie domstica en estar secuenciado: hay una gran variabilidad en las razas de perros. Aproximadamente hay 300 razas con caractersticas morfolgicas y de comportamiento diferentes. Muchas de estas razas derivan de unos pocos fundadores provocando aumento de la consanguinidad y por tanto son muy similares entre s, pero muchas diferencias con las otras especies (hay homogeneidad dentro de la raza). En perros se han descrito 360 enfermedades hereditarias muy similares a las humanas. Los simpticos y ladradores mejores amigos del hombre, como hemos dicho, presentan variaciones de tamaos de 50 a 1, 100 a 1 o incluso ms. Era necesario averiguar por qu. El responsable de averiguar la causa de este extraordinario fenmeno fue Nate Sutter, un genetista del Instituto Nacional de Investigacin del Genoma en Bethseda, Maryland.

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Comenz tomando radiografas de los huesos de 500 perros de aguas portugueses y haciendo prolijas mediciones de 91 partes crticas de sus esqueletos. Hecho esto, caracteriz a cada ejemplar como pequeo o grande con respecto al promedio de su propia raza. Por ltimo, quedaba solamente averiguar en qu difera el ADN de un perro de aguas grande del de uno pequeo. Este trabajo era fcil: el mismo Sutter es uno del los responsables del mapeo completo del genoma de Tasha, as que no tuvo que esforzarse mucho. La diferencia entre un perro pequeo y uno grande consista en... un solo gen! El gen en cuestin, previsiblemente, ocupaba una posicin en las zonas del genoma que presentan muchas variaciones entre ejemplares de la misma especie (Figura 5-5). Cuando se descubri que el hgado era un rgano productor de hormonas, se identificaron tres sustancias secretadas por l: una de ellas era el Factor de Crecimiento Similar a la Insulina (IGF1, segn su sigla ms usual). El descubrimiento del IGF-1 demostr que la hormona de crecimiento o somatotrofina, secretada por la hipfisis, no activaba el crecimiento corporal por s misma. En realidad, la somatotrofina disparaba la secrecin de IGF-1, responsable, en ltima instancia, del crecimiento y regeneracin de los tejidos. El nombre de la hormona proviene de la enorme similitud estructural de su molcula con la de la hormona insulina, secretada por el pncreas.

Figura 5-5. Evolucin gentica del perro a partir del Lobo www.clarin.com/diario/

5.3.2.3.

Genoma de la gallina

La revista "Nature" present en 2004 la secuencia del genoma de la gallina, el primero decodificado de un ave y de un animal de granja. Este logro de cientficos de una docena de pases. El DNA analizado fue el de un ejemplar "red jungle fowl" (Gallus gallus), especie salvaje asitica de la que derivan todas las variantes de gallinas domsticas. El animal fue criado en la Universidad de Michigan y se trata de una hembra. Estas tienen los dos tipos de cromosomas sexuales, mientras que los machos slo tienen uno. "Esta investigacin ha revelado que gallinas

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y humanos comparten ms de la mitad de sus genes. La secuenciacin de este genoma nos ayudar a descubrir los genes que aumentan la resistencia a enfermedades en las aves", asegura Jerry Dodgson, genetista que ha trabajado en el proyecto durante los ltimos 17 aos. "Somos ms parecidos a los pjaros de lo que creamos. Alrededor del 60% de los genes que codifican protenas en la gallina tienen su equivalente en el hombre", afirma Peer Bork, del Laboratorio Europeo de Biologa Molecular, una de las 49 instituciones que han participado en el proyecto. La gallina es un importante modelo de investigacin biomdica porque es fcil de mantener, se reproduce rpidamente y es fcil determinar sus linajes por las caractersticas fsicas. Es un animal ideal para investigar el desarrollo embrionario -mucho de lo que se sabe del desarrollo de nuestras extremidades se debe al estudio de gallinas dentro del huevo-, y se han creado estirpes que sufren patologas genticas propias de humanos, como la distrofia muscular. Adems, como gallinas y mamferos tienen respuestas inmunitarias muy parecidas, el genoma de est ave ayudar a luchar contra enfermedades que saltan entre especies, como la gripe aviar. Los investigadores dicen que la secuenciacin permitir a los productores saber por qu algunas gallinas ponen ms huevos y la carne de ciertos pollos asados contiene menos grasa. "Si sabemos los genes que influyen en esas caractersticas, podremos seleccionar las gallinas que mejor cubran las demandas de los consumidores y que lo hagan de una manera ms sana", dice Dodgson (Figura 5-6). El ltimo ancestro comn del hombre y la gallina vivi hace unos 310 millones de aos. Desde ese momento, los antepasados de ambas especies emprendieron caminos separados en la evolucin. "El genoma de la gallina llena un hueco crucial del conocimiento cientfico. Localizada entre los mamferos y los peces en el rbol de la vida, la gallina est bien colocada para proporcionarnos nuevas perspectivas de la evolucin del genoma y la biologa humana", seala Francis Collins, del Instituto Nacional para la Investigacin del Genoma Humano.

Figura 5-6.El genoma del pollo aportar datos de enorme valor para mejorar la productividad, aunque no de inmediato. El genoma de la gallina est compuesto por 1,000 millones de pares de bases -un tercio de los del hombre- que se reparten en 39 pares de cromosomas, uno de los cuales determina el sexo: los machos tienen dos cromosomas Z, mientras que en las hembras ese par est formado por uno Z y uno W. Esta ave de corral tiene entre 20,000 y 23,000 genes, cuyos primeros estudios ya han dado algunas sorpresas. As, se ha descubierto que la gallina presenta un importante nmero de receptores olfativos en su ADN, cuando hasta ahora se crea que su sentido del olfato era muy pobre. En cambio, apenas tiene sentido del gusto. El genoma de la gallina se obtuvo con una redundancia de 6,63X. En China hubo un proyecto con gallina que permiti determinar 2, 000,000 de SNPs. Una conclusin preliminar del genoma de la gallina es que aunque es tres3 veces ms pequeo que el humano (tiene unas 1000 Mb)

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no es menos complejo: es ms compacto porque hay menos secuencias repetitivas, menos intrones.

5.3.3.
5.3.3.1.

DNA extranuclear
Genoma Mitocondrial

El DNA mitocondrial esta presente como estructura circular de 17,000 pb. Se dice que es DNA citoplasmtico o extracromosmico, es decir, no esta en los cromosomas del ncleo. La comparacin de secuencias y deteccin de cambios en determinadas posiciones del genoma mitocondrial es til para estudios evolutivos sobre DNA antiguo debido a su tamao, estabilidad y grado de conservacin. Adems, el DNA mitocondrial es abundante ya que hay alrededor de 1,000 mitocondrias por clula. Una caracterstica adicional es que se transmite por va materna dando informacin sobre la dispersin de linajes maternos antiguos. DNA pequeo y circular: mayor estabilidad frente degradacin. Regiones muy conservadas: Ejemplo de 16s de RNA ya que los cambios no son muy tolerantes evolutivamente aunque suelen producirse ciertos cambios tiles para comparar poblaciones. Origen materno. Permite establecer el linaje materno. Todos los humanos compartimos un solo ancestro femenino. La Eva mitocondrial. (Contraparte masculina: El Adn del cromosoma Y) No recombina. El DNA de una mitocondria paterna no se mezcla con el de las mitocondrias maternas. La tasa mutagnica es diferente. El mecanismo de reparacin del DNA es diferente a los nucleares. Con menos mutaciones se dan menos polimorfismos. Ediciones especiales. En la mitocondria en algunos genes se dan procesos frecuentes de edicin de RNA antes de ser traducidos a una protena, y adems, en algunos casos tambin se presentan variantes al cdigo gentico universal. Regiones hipervariables: Su replicacin es en forma de D-Loop (replica una cadena antes que la otra), la regin cercana a este inicio de replicacin (D-Loop) acostumbra a ser muy variable (muy til). Poco DNA: Es el nico marcador que se puede utilizar con poqusimo DNA (cadveres antiguos...)

Aplicaciones del DNA mitocondrial: Inferir relaciones entre poblaciones y especies: Para el conocimiento del origen de razas animales domsticas. Se usan regiones del Citocromo B del DNA mitocondrial para estudiar por ejemplo el origen de razas animales: Ejemplo - Distincin de razas de cerdos: Queremos saber si tres especies de cerdo; Ibrico, canario y mallorqun estn relacionados. Para ello, obtenemos muestras biolgicas de un grupo de individuos, extremos DNA, amplificamos con PCR y lo secuenciamos. Al comparar los polimorfismos nos damos cuenta que el cerdo ibrico y el mallorqun slo tiene haplotipos europeos, mientras que la raza canario posee haplotipos tanto europeos como asiticos. De esta forma podemos inferir de dnde vienen estas poblaciones porcinas. Ejemplo Lugar de domesticacin del cerdo: La domesticacin del cerdo se pudo dar independientemente en Europa, Asia y otros lugares al mismo tiempo. El estudio del DNA mitocondrial permiti confirmar la existencia de mltiples centros de domesticacin y que ha habido poca migracin de estos cerdos domesticados hacia otros lugares. Esto se comprob gracias a que el DNA mitocondrial del cerdo asitico

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domesticado se pareca ms al del cerdo asitico salvaje, mientras que el cerdo europeo se pareca mas al cerdo europeo salvaje. Tarea 5-11 Busca otros ejemplos de especies animales como de plantas en donde se haya usado el DNA mitocondrial para conocer sus ascendencia. Cmo se explica la evolucin del Hombre?, Dnde se supone que se origino y por qu? Comparacin de especies y subespecies: Tambin permite realizar estudios de filogentica y taxonoma. Se estudia una regin no codificante en la que las mutaciones se pueden considerar neutras (no intervienen en la seleccin). Esto permite calcular las tasas de divergencia entre especies. Para cada gen se estima una tasa de mutacin por unidad de tiempo. Est anlisis tambin puede ser respaldado por fsiles, para realizar una calibracin molecular de la tasa evolutiva. Las evidencias de un grupo de genes se pueden contrastar comparndolas con otras secuencias independientes. Modelo rbol: Relacin entre diferentes haplotipos. Cuanta ms diferencias polimrficas mayor ser la distancia evolutiva, y esto se representa con una rama ms larga. Son rboles de parsimonia que intentan agrupar las muestras de par en par de la mejor manera. Tanto un rbol de parsimonia y uno de distancias (ME) para el mismo set de datos produce Topologas y longitudes de ramas idnticas. La diferencia radica en que el rbol de parsimonia identifica qu sitio del alineamiento contribuye cada paso mutacional en la longitud de cada rama. Como criterio de optimizacin de se usa la (mxima) parsimonia. Esto involucra la identificacin de la(s) topologa(s) con la menor longitud total del rbol, es decir, que requiere(n) el menor nmero de cambios evolutivos (transformaciones en estados de base) para explicar las diferencias observadas entre OTUs. El modelo de mxima parsimonia se justifica en filogentica dado que: 1) se asume que los cambios de estado de base (sustituciones) son poco frecuentes y 2) no se puede conocer con exactitud el camino evolutivo de dichos cambios, por lo que se busca maximizar la similitud evolutiva que se puede explicar como homloga (por ancestra compartida). De esta manera se busca de minimizar la homoplasia (similitud no heredada directamente del ancestro), ya que las hiptesis de homoplasia (convergencia, evolucin paralela...) pueden ser juzgadas como intentos ad hoc de explicar por qu determinados datos no encajan en una hiptesis evolutiva (rbol filogentico) particular.

Comentario [ATF4]: No s si sea adecuado cambiar carcter por base

. Figura 5-7. Tarea 5-12. En la pgina de Internet www2.uah.es/biologia_animal/EFyC2008/Practica%205.pdf realiza la prctica para la construccin de un rbol de parsimonia. Mapas de migracin: Estudio del origen de poblaciones (por ej. migraciones bovinas). Se intentan encontrar caminos lgicos para explicar cmo han pasado de un lugar a otro. Las alturas de las barras nos indican la diversidad nucleotdica. En los lugares donde hay mayor diversidad se cree que son los centros de origen, y de ah es dnde provienen las migraciones. Por ejemplo, los

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bovinos europeos entraron desde Turqua y no frica, que adems coincide con las migraciones humanas. En el mapa de rutas cada color indica una especie diferente. Vemos un foco amarillo importante con ciertas rutas de migracin bovina. El rojo y negro representan orgenes de domesticacin independientes.

Figura 5-8. Mapas de migracin bovina.

5.3.3.2.

Genoma plastdico

Los cloroplastos son un tipo de plastos, orgnulos exclusivos de las clulas vegetales. Tienen una forma alargada y presentan una organizacin similar a la de las mitocondrias. Su importancia se debe a que son los orgnulos donde se realiza la fotosntesis. Estructura Presentan tres sistemas de membranas, dos de los cuales forman la envoltura externa. Estas membranas son: La membrana externa, que contiene porinas que le proporcionan una gran permeabilidad. La membrana interna, menos permeable. Junto con la membrana anterior forma la envoltura externa. La membrana tilacoidal, se localiza en el interior del cloroplasto y est altamente plegada para formar los tilacoides. Estos se apilan unos sobre otros para formar grana. En esta membrana se localizan los fotosistemas, responsables de la captacin de la energa solar, los componentes de una cadena de transporte electrnico y una ATP sintasa. Esta membrana es muy fluida debido a que contiene una elevada proporcin de cidos grasos.

Figura 5-9. A) El cloroplasto presenta tres compartimentos diferentes: un espacio intermembranoso, un espacio interno, ocupado por el estroma o matriz del cloroplasto, y un espacio tilacoidal. El espacio intermembranoso se localiza entre las dos membranas que constituyen la envoltura externa del cloroplasto, y posee una composicin semejante a la del citosol. El estroma est situado entre la membrana interna y la membrana tilacoidal. En l se encuentran ribosomas, enzimas, varias molculas de ADN, distintos tipos de ARN, grnulos de almidn y gotas de

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lpidos. B) El espacio tilacoidal corresponde al espacio interno de los tilacoides que, al estar interconectados, delimitan un nico compartimento comn. Las mitocondrias y los cloroplastos son orgnulos celulares autnomos, ambos poseen ADN que es capaz de replicarse, transcribirse y traducirse independientemente del nuclear. A la vista de este hecho, podramos pensar, si esos genes contenidos en el cromosoma de mitocondrias y cloroplastos, tuvieran o no influencia en el fenotipo de un individuo. De ser as, su herencia no sera de tipo mendeliana. Los genes nucleares segregan en meiosis, pero los genes de estos orgnulos segregaran en mitosis, cuando se produce la distribucin al azar de los orgnulos celulares. En la fecundacin la aportacin citoplsmica del gameto masculino es muy pequea, s no nula, por lo tanto hemos de pensar que los individuos reciben slo aportacin de mitocondrias y cloroplastos va materna, es decir slo recibe los genes extranucleares de la madre. Un ltimo aspecto a considerar es que si el individuo empieza su desarrollo en el citoplasma del vulo, tendrn influencia las protenas (productos gnicos de genes nucleares maternos) all presentes sobre el fenotipo del individuo? Es un genoma circular, filogenticamente muy cercano al genoma de las cianobacterias, como demuestra gran cantidad de estudios de evolucin molecular. En plantas con flores el cloroplasto se hereda de manera casi exclusiva por va materna, y por lo tanto, es un genoma haploide (cada organismo solo tiene una copia de este genoma). Es interesante notar que en conferas (Gimnospermas) usualmente los cloroplastos se heredan por va paterna as, mientras que en las angiospermas el cloroplasto describe la historia evolutiva por parte de la funcin femenina (patrones de dispersin de las semillas), en conferas se relaciona con la funcin masculina (patrones de dispersin del polen). Existen varias secuencias completas del genoma del cloroplasto en plantas con flores, incluyendo especies monocotiledneas como el arroz (O. sativa) y el maz (Zea mays), y varias dicotiledneas, como el tabaco (Nicotiana tabacum), la espinaca (Spinacia oleracea), la especie experimental de la familia de la mostaza Arabidopsis thaliana y la planta parsita no fotosinttica Epifagus virginiana. El cloroplasto en las plantas con flores tiene una estructura muy conservada. Generalmente mide entre 120 y 217kb (miles de pares de bases de DNA), aunque en E. virginiana mide tan solo 70kb. Esta planta, al ser parsita, no necesita de la maquinaria fotosinttica y ha perdido muchos de los genes involucrados en este mecanismo. El nmero de genes presente en el cloroplasto es tambin muy conservado, entre 110 a 113 (Tabla 5-3), aunque E. virginiana slo tiene 42 genes. As, el nmero de genes del cloroplasto es menos del 25% del que presentan los genomas bacterianos ms pequeos, posiblemente debido a la prdida de una elevada cantidad de los genes que tenan inicialmente las bacterias que dieron origen a los actuales cloroplastos Por ejemplo, la bacteria con genoma "mnimo" M. genitalium, tiene 470 genes que codifican para protenas.

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Tabla 5-3. Comparacin de http://www.scielo.org.ve/scielo.php?pid

genomas

terminados

de

cloroplastos

Los cloroplastos eucariticos derivan evolutivamente de las cianobacterias, su DNA es una molcula circular, bicatenaria y que contiene entre 120 y 160 kbp. Este contenido en DNA es inferior al que presentan las algas verdes, por lo que se supone que a lo largo de la evolucin se ha reducido el tamao del mismo, bien por prdida de material o bien por integracin de genes dentro del genoma eucaritico. El nmero de molculas de DNA por cloroplasto es muy variable. En plantas este nmero oscila entre 20 y 60 molculas por cloroplasto, mientras que en algas superiores el nmero es mayor. La organizacin es muy sencilla ya que apenas posee secuencias repetidas, aunque en la mayora de las especies vegetales se ha demostrado la presencia de una duplicacin invertida que incluye genes de tRNA. La secuenciacin del DNA de los cloroplastos ha revelado que existen alrededor de 150 genes. Adems de los tRNA y los rRNA hay unos 90 genes que estn implicados en la fisiologa de los cloroplastos, principalmente en la fijacin fotosinttica del carbono. Estos genes suelen agruparse en pequeos nichos cuya organizacin se ha mantenido a lo largo de la evolucin. El orden de estos genes dentro del genoma del cloroplasto, no se ha mantenido constante en todas las especies estudiadas, lo cual indica que en el proceso evolutivo han existido variaciones cromosmicas estructurales. El cloroplasto, es el asiento de la fotosntesis en una clula, contiene su propio genoma conocido como plastome. El plastome incluye los genes que cifran para el RNA ribosomal, el RNA de transferencia y varias protenas que alternadamente controlan fotosntesis as como otros rasgos. Un desarrollo reciente en la manipulacin de los genes del plstido es la introduccin de genes extraos en los cloroplastos y esta tcnica se conoce como ingeniera del Plastome. La transformacin de plastome primero fue divulgada por Boynton y sus colegas en 1988 en Chlamydomonas reinhardtii. Esto fue logrado, bombardeando las clulas con las partculas de

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tungsteno cubiertas con el DNA. Ahora, las lneas transplastmicas (sas que tienen un transgen) se han sintetizado ya en el tabaco, la soja, la colza, la espinaca, la patata dulce, etc. El conocimiento del plastome completo puede ser til para entender los procesos fundamentales de la biologa del plstido y de la interaccin del plastome con genoma nuclear y del proceso fotosinttico. La diversidad gentica de los cloroplastos de varias cosechas (en los niveles intervarietal, interespecficos o intergenrico) puede ser revelada realizando el anlisis de las secuencias. Los genes fotosintticos codificados por el plastome se pueden manipular para lograr el nivel deseable de la eficacia fotosinttica, as como la productividad. Puesto que los genes del plstido maternal se heredan los genes nuevamente incorporados no conseguirn transmitidos a los parientes o a las malas hierbas salvajes a travs del polen. Esto es especialmente atractivo para los genes de tolerancia a herbicidas, puesto que el desarrollo de malas hierbas estupendas (las malas hierbas tolerantes a los herbicidas) se evita. Una vez que introduzcamos un gene nuevo en un solo plastome de una clula, consigue amplificarla varias veces durante la divisin y la multiplicacin de plstidos. Los genes para producir las protenas tiles se pueden transferir en los cloroplastos para las expresiones mltiples y su produccin enorme. Las lneas transplastmicas pueden ser desarrolladas para fines farmacuticos.

5.3.3.3.

DNA nuclear Vs. DNA citoplsmico

Ventajas del DNA nuclear frente al DNA mitocondrial: El DNA nuclear por lo regular pose dos alelos; Esto permite hacer pruebas de paternidad. La variabilidad del DNA nuclear es ms alta que la del DNA mitocondrial (mitDNA) y dan mayor capacidad de discriminacin: En una poblacin muy parecida es difcil la discriminacin, con suerte dos a tres haplotipos diferentes. Con el DNA nuclear se pueden hacer dibujos ms finos ya que si analizamos un nmero elevado de microsatlites tendremos una fuerza de discriminacin muy alta. Esto nos sirve cuando por ejemplo queremos averiguar cun diferentes son dos poblaciones, una salvaje y otra domesticada.

Figura 5-10. Diversificacin entre el perro y lobo

Ejemplo de lobos y perros: Se quiere ver las poblaciones de perros en lugares donde tambin hay lobos. Se analizaron 74 muestras (lobos del zoo europeo; azul, Lobos en cautividad; amarillo, Perros; rojo). La pregunta que nos hacemos es si los lobos en cautiverio son de amplia diversificacin y si solo representan un grupo gentico muy reducido. Las manchas amarillas estn bastante distribuidas (muestras representativas de la diversidad gentica ya que adems stas estn intercaladas con lobos salvajes; verdes). En general vemos clara diferenciacin gentica entre perro y lobo (entre azul y rojo).

Elevado margen de confianza con pocos marcadores: Si utilizamos microsatlites cuntos debemos utilizar? Queremos tener un nivel de confianza elevada de que los individuos no salgan iguales. Estamos entonces frente a cifras de 3 a 20 marcadores. Adems, tenemos que tener en cuenta el grado de consangueneidad. Para estimar divergencias genticas entre individuos muy cercanos es difcil tener capacidad de discriminacin con DNA mitocondrial. Los marcadores

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buenos son aquellos con suficientes nmero de alelos por Locus. Sin embargo, algunos marcadores son un poco delicados por las diferencias que pueden aparecer entre laboratorios.

5.3.4.

Genomas comparativos

Cuando se habla de genmica comparativa se puede decir que se tiene un cromosoma (por ejemplo arroz) donde se ha identificado ciertos genes. Si estos genes se han encontrado tambin en maz y trigo podramos preguntarnos en qu cromosomas estn repartidos esos genes. Puede ser que algunos genes estn agrupados similarmente en especies cercanas? Al establecimiento de correspondencias entre genomas se le llama anlisis de sintenia. Si el cromosoma nueve del arroz es homlogo a parte del cromosoma ocho del maz es debido a que estas especies tuvieron un ancestro comn en donde los genes estaban organizados de esa forma, pero con la evolucin se han reorganizado en las diferentes especies. Podemos notar que esta reorganizacin es mayor en algunos gneros que en otros. La comparacin entre especies de cereales puede ser buena, mientras que la comparacin entre maz y frjol puede ser no tan buena. A los genes que supuestamente tienen la misma funcin en dos especies se les llama ortlogos. Cuando hablamos de comparar genomas queremos buscar similitudes o diferencias en el orden de los genes ortlogos. La sintenia es la similitud en la distribucin de genes ortlogos a lo largo de cromosomas de especies diferentes.
Cuando hablamos de secuencias, es mucho ms exacto hablar de similitudes que de homologas. Homologa es un trmino que se usa en la evolucin con una connotacin muy especfica. Las manos de los humanos y las alas de los murcilagos son rganos homlogos. Pero las alas de los pjaros y las alas de los insectos son rganos anlogos y no homlogos. Los genes ortlogos, son genes que no solo son similares a nivel de secuencia, sino que adems, cumplen todava la misma funcin enzimtica o estructural.

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6. Factores de Transcripcin
6.1. Qu son?
Las clulas necesitan adaptarse constantemente a cambios ambientales, modificando los patrones de la expresin gnica. Los mismos genes estn presentes en todas las clulas de una especie, pero no todos estn activos al mismo tiempo. En la modulacin de la expresin gnica es necesaria la presencia de secuencia reguladoras y protenas capaces de direccionar la expresin de los genes. La regulacin de la expresin gnica es uno de los eventos ms importantes en el control del desarrollo y de las respuestas a cambios ambientales. Las protenas maestras en la regulacin de la expresin gnica son conocidas como factores de transcripcin. {Carpita, 2008 #625; Casati, 2008 #628} Los factores de transcripcin son protenas que se unen al DNA para controlar los genes. Estas protenas regulatorias, estimulan o reprimen la tasa transcripcional de sus genes blanco al unirse a regiones promotoras especficas (i.e. elementos cis). Esto activa o desactiva cascadas de sealizacin de genes. Los factores de transcripcin tienen funciones fundamentales en casi todos los procesos biolgicos (desarrollo, crecimiento y respuestas a factores ambientales) y se asume que tienen un papel preponderante en la evolucin de las especies. En plantas, los factores de transcripcin han sido empleados para manipular varias rutas metablicas, de crecimiento y desarrollo, y de respuestas al estrs. La comparacin entre especies y la identificacin de mdulos regulatorios relacionados con los factores de transcripcin, permitirn disear plantas con mayor produccin de biomasa o ms tolerantes a diversos factores adversos del medio como la sequa, o incluso manipular rutas de biosntesis de metabolitos. Por ejemplo, en maz, las inserciones de los transposones Mutador y Spm modifican la expresin del gen a1, el cul codifica la enzima deshidroflavonol reductasa (involucrada en la formacin de los pigmentos flobafeno rojo y antocianina prpura) y es indistintamente regulado por los factores de transcripcin C1 y P de la familia MYB, determinando as la coloracin del maz (ver Figura 6-1) {Chuck, 2008 #627}.

Figura 6-1 Inserciones de transposones en el promotor del gen a1 afectan diferencialmente la transcripcin mediada por los factores de transcripcin P y C1 de la familia Myb (MaizeGDB) Existen dos tipos de factores de transcripcin: los basales o generales, y los regulatorios o especficos.

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6.2. Factores de transcripcin basales

Los factores de transcripcin basales o generales pertenecen a un conjunto mnimo de protenas requeridas para la iniciacin de la transcripcin (protenas de unin a la caja TATA). Junto con la RNA polimerasa II, estas protenas forman el aparato transcripcional bsico, representando el ncleo de cada proceso transcripcional en plantas. Para iniciar la transcripcin del gen codificador de cualquier protena, los factores de transcripcin basales se unen a la RNA polimerasa II. Estos factores de transcripcin son llamados TFIIA, TFIIB, y as sucesivamente. El promotor del gen a transcribir contiene una secuencia de DNA llamada caja TATA, la cual est localizada 25 nucletidos corriente arriba del punto de iniciacin de la transcripcin. La caja TATA es reconocida y ligada al factor de transcripcin TFIID, el cul permite la unin al factor TFIIB. El resto de los factores generales de transcripcin, as como la RNA polimerasa se ensamblan al promotor. El factor TFIIH usa ATP para separar la doble hlice en el punto de inicio de la transcripcin, lo que da lugar al comienzo del proceso. El factor TFIIH tambin fosforila a la RNA polimerasa II, liberndola del complejo y con ello puede iniciar la elongacin de la transcripcin. Tambin se requiere de otros factores (protenas) que activen o desactiven este proceso. En eucariontes, el aparato molecular que controla la transcripcin est integrado por cuatro componentes. Los factores de transcripcin basales o generales son esenciales para la transcripcin, pero no pueden por si mismos incrementar o disminuir la tasa de transcripcin. Esto lo llevan a cabo molculas regulatorias conocidas como activadores y represores. Los activadores, y posiblemente los represores, se comunican con los factores basales a travs de protenas co-activadoras que estn asociadas en un complejo a las protenas que se unen a la caja TATA. El reclutamiento de la RNA polimerasa al sitio de inicio de la transcripcin es controlada por la regin promotora localizada al lado 5 del sitio de inicio de la transcripcin, la cual contiene el promotor basal. Esta secuencia es contigua al sitio de inicio de la transcripcin y se une a un nmero de factores generales de transcripcin que forman el complejo de iniciacin de la transcripcin necesario para el reclutamiento de RNA polimerasa y el inicio de la sntesis de mRNA. Adems de la regin promotora basal que contiene la caja TATA y que est localizada a 30 o 40 pares de bases corriente arriba, existe la regin promotora proximal, entre los 40 y los 200 nucletidos corriente arriba, y la regin promotora distal, ms all de los 200 pares de bases corriente arriba, que puede estar separada hasta por miles de pares de bases del sitio de inicio de la transcripcin. Estas regiones promotoras incluyen las secuencias de los potenciadores y de los silenciadores. Los potenciadores se unen a factores de transcripcin que regulan la expresin de uno o varios genes. Los factores que se unen a los potenciadores median su respuesta interactuando directamente con el complejo de pre-iniciacin de la transcripcin en la regin promotora del gen, o travs de protenas intermediarias llamadas co-activadores para iniciar la transcripcin (Figura 6-16). ({Zhang, 2008 #629})

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Figura 6-2 Complejo RNA polimerasa II-factores generales de transcripcin. Este complejo es suficiente para realizar transcripcin especficamente en regiones que contienen un promotor en genes que codifican protenas (Alberts et al., 2004).

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Figura 6-3. Aparato molecular que controla la transcripcin en eucariontes {Hatzis, 2002 #115}. En el modelo se explica la manera en que un complejo activador se forma a partir de la unin de varios factores de transcripcin al potenciador y hacen contacto directo con el promotor gracias a la flexibilidad de la cadena de DNA, que permite el acercamiento fsico de los tres tipos de secuencias promotoras (basal, proximal y distal). Las secuencias de los potenciadores localizadas en cis respecto a la regin codificadora del gen se unen a factores de transcripcin que conforman el complejo activador (Figura 6-2) {Griffiths, 2003 #109}. Este complejo entonces interacciona con factores de transcripcin basales ensamblados al promotor al plegarse y entrar en contacto con las secuencias que intervienen en el proceso. Esta interaccin puede ocurrir directamente o a travs de un complejo de co-activadores que transmiten la seal desde uno o ms complejos activadores a la maquinaria de transcripcin basal para iniciar la transcripcin (Figura 6-3).

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Figura 6-4. Plegamiento y flexibilidad del DNA que permite el inicio de la transcripcin en eucariontes. En 2006, el Premio Nobel de Qumica fue otorgado a Roger Kornberg por sus aportaciones en torno a las bases moleculares de la transcripcin en eucariontes. Con sus contribuciones en el estudio de la cromatina y el descubrimiento del mediador, un complejo de alrededor de 20 protenas, cuya funcin es transmitir seales positivas o negativas desde los factores de transcripcin regulatorios especficos de ciertos genes hasta la RNA polimerasa II y los factores de transcripcin generales, se pudo establecer un nuevo modelo que incluye tres componentes esenciales de la regulacin gentica y transcripcional en eucariontes: los factores de transcripcin generales, el mediador y la RNA polimerasa (Figura 6-4). En bacterias, los activadores y represores de la transcripcin interaccionan directamente con la RNA polimerasa y afectan su unin al promotor. En eucariontes, la cromatina y el mediador

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constituyen nuevas etapas en la regulacin entre factores de transcripcin regulatorios de genes especficos y la RNA polimerasa II, lo que conduce a una mayor complejidad en la regulacin {Liu, 2008 #626}.

Figura 6-5. Complejo de iniciacin de la transcripcin en eucariontes que incluye una secuencia de DNA, los factores de transcripcin generales TBP, TFIIB, E, F y H, el mediador, la RNA polimerasa II y un factor de transcripcin regulatorio unido a un potenciador. Tarea 6-1. Consigue la perspectiva de Roger Kornberg (Kornberg 2007, PNAS vol 104, no.32) y haz un ejercicio reflexivo de cmo se fue dando el desarrollo del actual modelo de la transcripcin en eucariontes. Cul fue el inicio del concepto? Cmo se fue avanzando conforme transcurrieron los aos? Cules fueron los descubrimientos ms notables que han permitido llegar al modelo actual? Qu es lo que falta por hacer?

6.3. Factores de transcripcin regulatorios

En contraste con los factores de transcripcin generales o basales, los factores de transcripcin regulatorios o especficos se unen de manera proximal y distal (corriente arriba o corriente abajo) al aparato de transcripcin basal y actan, ya sea como factores constitutivos o inducibles. Estas protenas afectan la iniciacin de la transcripcin al entrar en contacto con componentes del aparato basal de la transcripcin. Los factores de transcripcin regulatorios ejercen funciones especficas hacia genes o tejidos y modulan la tasa transcripcional de sus genes blanco en respuesta a diferentes estmulos. En este captulo el concepto factor de transcripcin se refiere nicamente a los regulatorios (Figura 6-5).

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Figura 6-6. Los factores de transcripcin pueden activar la transcripcin a partir de su interaccin con los promotores de mltiples genes, cada uno de los cuales puede estar involucrado en diferentes respuestas (A). De manera coordinada, los factores de transcripcin regulan la expresin de mltiples genes involucrados en una ruta metablica (B) (basado en Yanagisawa et al., 2004). La gran diversidad de factores de transcripcin y de elementos cis a los que se unen es la fuente de una enorme complejidad de combinaciones que permite el control de la expresin especfica de genes y produce un gran espectro de fenotipos fisiolgicos y del desarrollo. Por lo tanto, no es sorprendente que la manipulacin de la expresin de los factores de transcripcin con frecuencia resulte en cambios fenotpicos drsticos en el organismo, lo cual les hace muy interesantes candidatos para enfoques biotecnolgicos (Figura 6-7).

Figura 6-7. Resistencia al ataque de larvas del insecto Bradysia impatiens en plantas de Arabidopsis sobreexpresan el gen que codifica el factor de transcripcin HAHB4. A la derecha se presentan hojas de tres lneas transgnicas que sobreexpresan el factor de transcripcin, mientras que a la izquierda se muestran hojas de tres lneas transformadas solo con el vector Las fotografas fueron tomadas un da despus del ataque de las larvas. (Basado en Manavella et al., 2008). Se sabe que la evolucin de las redes regulatorias es un importante actor en el desarrollo de innovaciones evolutivas y en consecuencia en la constitucin de la diversidad biolgica. El registro y anlisis de los factores de transcripcin en eucariontes inici hace ms de una dcada. Hoy en da, las secuencias de los genomas de varios cientos de organismos se encuentran disponibles y la secuenciacin de otros tantos est en proceso. Actualmente se dispone de un anlisis completo de cinco especies de plantas: arroz (Oryza sativa), arabidopsis (Arabidopsis thaliana), olmo (Populus trichocarpa), el musgo (Physcomitrella patens) y las algas (Ostreococcus tauri y Chlamydomonas reinhardtii), y de 18 especies ms cuya secuenciacin de

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sus genomas va avanzando rpidamente. Los factores de transcripcin pueden ser agrupados en diferentes familias de acuerdo a la estructura primaria o tridimensional de sus dominios de unin a DNA o de multimerizacin. En la Tabla 6-1 se indica el nmero de factores de transcripcin encontrados hasta ahora en los genomas de las especies citadas y el nmero de familias en las que se agrupan. Tabla 6-1. Factores de transcripcin encontrados en los genomas secuenciados de plantas. -Especie

Ostreococcus tauri Chlarrydomonas reinhardtii Oriza sativa Arabidopsis thaliana Populus trichocarpa Physcomitrella patens Zea mays Triticum aestivum Hordeum vulgare Sorghum bicolor Saccharum officinarum Gosspium hirsutum Nicotiana tabacum Solanum tuberosum Lycopersycon esculentum Vitis vinifera Malus domestica Citrus sinensis Lotus japonicus Glycine max Medicago truncatula Helianthus agnus Pinus taeda Pinus glauca

No. total de Protenas 8236 15256 30690 45555 62827

> 20000

Factores de Transcripcin 174 (173) 229 (228) 2516 (2352) 2304 (2147) 2723 (2697) 1274 (1264) 764 1127 618 397 1177 1567 2513 1341 998 867 1025 599 467 1891 1022 53 950 440 33 38 66 68 66 59 55 57 55 54 54 54 64 61 62 59 62 60 55 53 60 53 58 50

Familias de factores de transcripcin

% de factores de transcripcin 2.1 1.5 4.0 7.5 6.0 6.3 -

Los nmeros en parntesis indican secuencias nicas de protenas (basado en Riao-Pachn et al., 2007 y {Guo, 2008 #110}. Existen grandes familias de genes que codifican factores de transcripcin, las que a su vez y en ocasiones estn compuestas por subfamilias. En plantas se han identificado 68 familias de factores de transcripcin, siendo las ms numerosas las siguientes: MYB-(R1), R2R3, AP2/EREBP, bHLH, NAC, C2H2 (Zn), HB, MADS, bZIP, WRKY (Zn), GARP, Dof (Zn), CO-like (Zn), y GATA (Zn). Tomando el genoma de Arabidopsis thaliana como referencia, en el siguiente esquema se ilustran algunas de estas familias

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Figura 6-8. Relaciones y cambios de dominios en las principales familias de factores de transcripcin en plantas. Las familias de genes estn representadas por crculos, cuyo tamao es proporcional al nmero de miembros de la familia. Los dominios que han sido cambiados y que conectan diferentes grupos de factores de transcripcin estn indicados con rectngulos, cuyo tamao es proporcional a la longitud del dominio. Los dominios de unin a DNA estn coloreados; otros dominios (usualmente dominios de interacciones protena-protena) se indican en cuadros achurados. Las lneas punteadas indican que un dominio dado es caracterstico de una familia o subfamilia con la cual se conecta. Los nombres de los genes estn escrito en cursiva {Riechmann, 2000 #181}. Tarea 6-2. Consigue los artculos originales de Riao-Pachn et al. (2007) y (2008) y de Guo et al. (2008) sobre bases de datos y anlisis de factores de transcripcin. Discute los mtodos de anlisis de dichos factores y analiza las diferencias que reportan los autores. Qu hay sobre la evolucin de los factores de transcripcin desde las algas hasta las plantas superiores? Existen todas las familias en los genomas secuenciados de las seis especies reportadas? Cul es la mayor diferencia en nmero de genes que codifican factores de transcripcin entre angiospermas y gimnospermas? Y entre monocotiledneas y dicotiledneas?

Comentario [EVO5]: Cules ?

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6.4. Bases de datos sobre factores de transcripcin en maz

La base de datos de los factores de transcripcin predichos en maz se encuentra disponible en la direccin electrnica: http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/web/index.php?sp=zm Esta base de datos establece que en el genoma de maz se han identificado hasta el momento 764 factores de transcripcin, distribuidos en 55 familias diferentes de la manera siguiente:

Esta prediccin se basa en la comparacin de las secuencias descritas recientemente por RiaoPachn et al. (2007), y la funcin biolgica de los mismos est siendo descifrada. Se puede apreciar que las familias ms numerosas predichas en maz son C3H, MYB-related, bHLH, MADS, NAC, AP2-EREBP, AUX-IAA y bZIP. En adelante se hace una descripcin de estas familias de genes, incluyendo los avances en los estudios de las funciones en la biologa de la planta. En algunos casos se ilustra el efecto de la actividad de algn gen en la fisiologa y el fenotipo de la planta.

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Tarea 6-3 Analiza y compara las familias de factores de transcripcin que se han identificado en el genoma del maz con los reportados en arabidopsis y en arroz. Cules son los ms numerosos en arroz? Existe alguna similitud con lo que se tiene en maz? A qu crees que se deba?

6.5. Descripcin de algunas familias

6.5.1.1. Factores AB13/VP1
En el genoma del maz se han predicho 18 genes que codifican factores de transcripcin ABI3VP1. Las protenas ABI3/VP1 son miembros de un gran grupo de factores de transcripcin que actan como intermediarios en la regulacin de genes inducidos por la hormona cido abscsico (ABA) durante el desarrollo de la semilla. Alteraciones en las secuencias de estos genes afectan etapas posteriores en el desarrollo de la semilla y tienen efectos adversos en muchos procesos importantes tales como almacenamiento de reservas, dormancia y tolerancia de la semilla a la desecacin. El factor ABI3 acta en coordinacin con varios factores de transcripcin como LEC1, LEC2 and FUS3 en el control de la maduracin de semillas; estas interacciones evitan que los genes asociados a la germinacin y el crecimiento se activen con antelacin. El factor de transcripcin del maz Viviparous1 (VP1) y el de Arabidopsis ABI3 son ortlogos. El factor ABI3/VP1 es una protena que contiene varios dominios, que funciona tanto como activador como represor, dependiendo del contexto que haya en el promotor. Los dominios bsicos B1, B2, y B3, se encuentran muy conservados entre los factores ABI3/VP1 de varias especies de plantas. El dominio B3 en el extremo carboxilo terminal (C-Terminal) del factor VP1 se une especficamente al elemento Sph en el promotor C1 del maz, mientras que los dominios B1 y B2 localizados en el extremo amino terminal (N-Terminal) estn implicados en la localizacin nuclear y la interaccin con otras protenas. El dominio localizado en el N -terminal, que funciona como activador y como represor es necesario y suficiente para activar o reprimir la expresin de VP1/ABI3 dependiente de ABA, en tanto que el dominio B3 localizado en el Cterminal es requerido para activar al gen blanco (Figura 6-9) {Lazarova, 2002 #146; Chen, 2007 #84}.

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Figura 6-9. Embriones del mutante vp1 (viviparous 1). Los embriones vp1 germinan antes de la maduracin. Las semillas mutantes no tienen coloracin (derecha), a menos que la cubierta de la mazorca sea removida (izquierda) para permitir la entrada de luz del sol (cortesa de S. McCormick y MaizeGDB). El factor de transcripcin IDEF1 del arroz, se une especficamente a IDE1, un elemento en cis que responde a deficiencia de hierro. IDEF1 pertenece a la familia de factores de transcripcin ABI3/VP1. Plantas transgnicas de arroz que sobreexpresan el gen IDEF1 exhiben mayor tolerancia a deficiencia de hierro tanto en hidropona como en suelos calcreos.

Figura 6-10. Tolerancia a la deficiencia de hierro conferida por la expresin inducida del gen IDEF1 en arroz. A, fenotipos de plantas transgnicas tolerantes a deficiencia de hierro transformantes (lneas I2p-IDEF1 9 y 13) despus de 5 das de tratamiento. B, Fenotipos de

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plantas tranegnicas (lneas I2p-IDEF1 9, 12, y 13) 17 despus de la siembra (Kobayashi et al., 2007).

6.5.1.2.

Factores Alfin

La secuencia rica en cistenas Cys-X2-Cys-X11-Cys-Cys-X2-Cys-X4-His-X2-Cys-X9-His-X5-CysX2-Cys- codificada por el gen Alfin1 contiene un dedo de zinc y una estructura His/Cys y forma parte de un factor de transcripcin asociado con tolerancia a NaCl en alfalfa (Medicago sativa L.). La protena Alfin1 se une de manera especfica al promotor del gen MsPRP2, el cual es inducible por NaCl. Los callos de alfalfa que sobreexpresan el gen Alfin1 muestran mayor resistencia a la inhibicin del crecimiento que ejerce la concentracin de 171 mM NaCl y crecen ms, en comparacin con callos testigo transformados con el vector vaco. Los callos que portan la construccin del gen Alfin1 en antisentido muestran ms sensibilidad a NaCl y crecen menos. La protena Alfin1 acta como un regulador transcripcional en plantas y media la expresin del gen MsPRP2 en alfalfa en condiciones de estrs por salinidad. En maz se encuentran 20 genes que potencialmente codifican factores de transcripcin de esta familia.

6.5.1.3.

Factores AP2/EREBP

Esta familia de factores de transcripcin es nica en plantas. Las protenas prototipo de esta familia son AP2 (APETALA2) y EREBPs (ethylene-responsive element binding proteins). Su caracterstica distintiva es que contienen denominado dominio AP2 de unin a DNA. Algunas protenas que contienen una copia del dominio AP2 incluyen EREBPs/ERFs (ethylene response factor), rplica-C/protenas de unin a elementos que responden a la deshidratacin (C-repeat/dehydration response element binding proteins o CBFs/DREBs), ABI4 y TINY. Otras protenas contienen dos copias del dominio AP2, como AP2, ANT y los productos de la actividad de los genes spikelet1 (ids1) y Glossy15 (Gl15) en maz. Los genes AP2/EREBP conforman una familia muy extensa y tienen papeles importantes a travs del ciclo de vida de la planta, desde ser reguladores clave de numerosos procesos del desarrollo como la determinacin de la identidad de rganos florales o el control de la identidad celular en la epidermis de la hija, hasta formar parte de los mecanismos usados por las plantas para responder a varios tipos de estrs tanto bitico como abitico. En maz, el gen branched silkless1 (bd1, el cual codifica un facto de transcripcin tipo ERF) controla la identidad del meristemo de la espiga {Fujita, 2005 #107; Hirota, 2007 #117}.

Figura 6-11. Jilotes de plantas tipo silvestre y mutantes bd1-N. (A): Mazorca tipo silvestre con iniciacin del primordio del pistilo. La mazorca no est ramificada. (B) Mazorca del mutante bd1 mostrando el desarrollo de mltiples ramas {Chuck, 2002 #88}. El genoma del maz contiene 33 genes que potencialmente codifican factores AP2/EREBP.

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6.5.1.4.

Factores ARF

Los factores de transcripcin ARF (auxin-response factors) se unen con especificidad a elementos que responden a auxinas con secuencias TGTCTC, los cuales son encontrados en los promotores de genes que responden a auxinas. Las protenas ARF1 contienen un dominio de unin a DNA en el extremo N-terminal (DNA-binding domain o DBD), el cual tiene cierta similitud con el dominio B3 del extremo C-terminal del factor de transcripcin VIVIPAROUS 1 (VP1) de maz. El factor ARF1 contiene un dominio en el extremo C-terminal(carboxyl-terminal domain o CTD) relacionado con los motivos III y IV encontrado en los CTD de protenas inducidas por auxinas y citocininas (Aux/IAA proteins). Los CTDs en ARF1 y protenas Aux/IAA facilitan la dimerizacin entre miembros tanto de ARF como de protenas Aux/IAA. Algunas ARF contienen regiones intermedias (que separan los dominios DBD de los CTD) que funcionan como motivos de activacin transcripcional y la potencian. En arabidopsis, miembros de la familia de genes KANADI regulan la identidad abaxial y el crecimiento laminar de rganos laterales. Mutaciones en el gen ETTIN (ETT; tambin conocido como Auxin Response Factor3 o ARF3) potencian la sobreexpresin de KANADI. Mutantes dobles de los genes ett y ARF4 muestran transformaciones de los tejidos abaxiales a adaxiales en toda la parte area, con fenotipos muy parecidos a mutantes KANADI. En maz existen 16 genes ARF.

6.5.1.5.

Factores ARID

Las protenas ARID constituyen una familia de dominios de unin a DNA homlogos. Debido a que las primeras protenas ARID caracterizadas interactan con secuencias especficas ricas en AT, el motivo fue denominado dominio de interaccin rico en AT o ARID (del ingls AT-rich interaction domain). Los dominios ARID ocurren en una amplia variedad de especies, desde plantas hasta levaduras, nematodos, insectos y mamferos. Todas las protenas ARID caracterizadas muestran actividad de unin al DNA, pero no muestran ninguna similitud con otros motivos de unin a DNA previamente caracterizados. Los genes que codifican estas protenas estn implicados una gran variedad de procesos biolgicos, incluyendo desarrollo embrionario, regulacin gentica del linaje celular, y control del ciclo celular. Estas protenas regulan tanto positiva como negativamente la transcripcin, y participan en la modificacin de la estructura de la cromatina. En leguminosas, la seal del factor Nod del rizobio es percibido por receptores tipo cinasa como SymRK. El gen NIN (Nodule Inception) en Lotus japonicus es requerido para permitir la entrada del rizobio en las clulas de la raz y para la organognesis del ndulo. El factor de transcripcin SIP1 interacta con la protena SymRK y contiene un dominio ARID. La protena SIP1 se une especficamente al promotor del gen NIN y reconoce dos de tres dominios ricos en AT en el promotor del gen NIN. Este factor de transcripcin es requerido para activar la expresin del gen NIN y est involucrada en las etapas iniciales de comunicacin entre el rizobio y la clula husped de la raz. El genoma del maz contiene solo un gen ARID. ({Kortschak, 2000 #137})

6.5.1.6.

Factores AS2/LOB

El gen ASYMMETRIC LEAVES2 (AS2) de arabidopsis est involucrado en el establecimiento del sistema de nervaduras en la hoja, el cual incluye la nervadura central y el desarrollo de una lamina uniforme. El factor de transcripcin codificado por este gen es una protena con rplicas de cistena (llamadas motivo-C) y una secuencia tipo-cierre de leucina en el extremo N-terminal. El genoma de arabidopsis contiene 42 genes putativos que potencialmente codifican protenas que conservan el motivo-C y los cierres de leucina y constituyen as, la familia AS2. Una variante de esta familia es la ASL (AS2-like proteins). Transcritos del gen AS2 se encuentran en los dominios adaxiales de primordios cotiledonales. La sobreexpresin del cDNA del gen AS2 en plantas transgnicas de arabidopsis ocasiona enchinamiento hacia arriba en las hojas, muy diferente al que ocasiona la represin de la expresin del gen, con fenotipos con hojas enchinadas hacia abajo. En maz solo dos genes codifican este tipo de protenas, relacionadas

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con embriognesis. El desarrollo del saco embrionario en angiospermas da inicio con una fase de divisin libre del ncleo, seguida por celularizacin y diferenciacin celular. El gen indeterminate gametophyte1 (ig1) de maz restringe la fase proliferativa del desarrollo del gametofito femenino. La mutante ig1 muestra una fase prolongada de divisin libre del ncleo conducente a una variedad de anormalidades del saco embrionario, incluyendo un nmero excesivo de clulas huevo, ncleos polares y sinrgicas que dan origen a semillas deformes (Figura 6-12). El gen ig1 codifica una protena LOB (LATERAL ORGAN BOUNDARIES) con alta afinidad al gen ASYMMETRIC LEAVES2 de arabidopsis, ambos miembros de la familia de genes AS2/LOB.

Comentario [ATF6]: Esto est bien?

Figura 6-12. Fenotipos de mutantes ig1. A, mazorca de planta tipo silvestre; B, mazorca del mutante ig1-O/ig1-O; C, mazorca del mutante ig1-mum/ig1-mum ({Evan, 2007 #104})

6.5.1.7.

Factores AUX/IAA

Los genes Aux/IAA representan una de las familias ms grandes de factores de transcripcin en maz, con 32 miembros. Estos genes muestran una rpida induccin en respuesta a la auxina cido indolactico o IAA). Este tipo de genes parecen ser nicos en el reino de las plantas, encontrndoseles tanto en monocotiledneas (maz y arroz) como en dicotiledneas (chcharo, soya, Medicago truncatula, arabidopsis, tomate, tabaco y algodn) y en ginmospermas (pinceas). Las protenas Aux/IAA cannicas comparten cuatro motivos de aminocidos conservados llamados dominios I, II, III y IV. El dominio II se encuentra bien conservado y las mutaciones que ocurren en l incrementan la actividad de las protenas correspondientes, estabilizndolas. Los dominios III y IV pueden mediar homo- y heterodimerizacin entre protenas Aux/IAA y protenas ARF (las cuales comparten estos dominios). En Arabidopsis thaliana, mutaciones en el gen AXR3 ocasiona cambios en diversas respuestas a auxinas. Tanto el crecimiento de la parte area como de la raz son afectados por estas mutaciones (arx3-1, arx3-2 y arx3-3). La importancia funcional de este y otros genes de la familia AUX/IAA demuestran que las protenas AUX/IAA intervienen de manera determinante en la sealizacin por auxinas en plantas. En maz, la protena ABP (auxin-binding protein, tambin conocida como AUX y AXR) acta como receptor de auxinas. Mutaciones en los genes Abp1 y Ahp4 no ocasionan aberraciones fenotpicas, lo que sugiere redundancia funcional de esta familia de genes en maz {Leyser, 1996 #149; Rouse, 1998 #185}.

6.5.1.8.

Factores BBR-BPC

Las protenas BBR-BPC se unen a genes que contienen motivos (GA)8 o (GA/TC)8 en sus regiones promotoras. BPC1 deriva de BASIC PENTACYSTEINE1, un factor regulador de la expresin del gen hometico SEEDSTICK (STK), el cual controla la identidad de los vulos en arabidopsis. Por su parte, BBR deriva de barley b recombinant (BBR), protena que se une de manera especfica a secuencias (GA/TC)8 y activan los genes respectivos. La sobreexpresin de este gen en tabaco conduce a una modificacin muy pronunciada de la morfologa de la hoja. En arabidopsis, el motivo (GA/TC)8 ocurre entre las 1500 bp corriente arriba a partir del codn de

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inicio de algunos genes hometicos. Solo tres genes BBR-BPC son predichos en el genoma del maz {Kooiker, 2005 #135}.

6.5.1.9.

Factores BES1

Los brasinoesteroides (BR) sealizan a travs de receptores de cinasa localizados a nivel membrana plasmtica para regular el crecimiento y desarrollo en plantas. La protena BES1 (BRI1-EMS-SUPPRESSOR 1), se acumula en el ncleo en respuesta a BR, donde tiene una funcin en la expresin de genes regulados por BR. BES1 es un factor de transcripcin que se une a las regiones promotoras de genes regulados por BR y los activa. BES1 interacciona con una protena bsica hlice-bucle-hlice, la BIM1, para unirse sinrgicamente a la caja E (consenso CANNTG) presente en muchos promotores inducidos por BR. La sobreexpresin y la represin del gen BIM1 y los miembros cercanos de esta familia muestran fenotipos que responden a BR. En el genoma del maz existe slo un gen predicho que codifica potencialmente un factor de transcripcin de tipo BES.

6.5.1.10.

Factores bHLH

Las protenas bHLH (basic/helix-loop-helix) constituyen una superfamilia de factores de transcripcin con funciones regulatorias que controlan diversos procesos biolgicos, desde la proliferacin celular hasta el establecimiento del linaje celular. El dominio bHLH contiene 60 aminocidos con dos regiones funcionales distintas. La regin bsica, localizada en el extremo N-Terminal del dominio est involucrada la unin al DNA y contiene 15 aminocidos con un nmero considerable de residuos bsicos. La regin HLH, localizada en el extremo C-Terminal, funciona como dominio de dimerizacin y est constituida principalmente por residuos hidrofbicos que forman dos hlices alifticas separadas por una regin que forma un bucle de longitud y constitucin variada. Fuera del dominio conservado, estas protenas muestran amplia divergencia. En plantas, la organognesis es controlada por el transporte polar de auxinas. En maz, el gen barren inflorescence2 (bif2) codifica un co-ortlogo de la serina/treonina protena cinasa PINOID (PID), el cual regula el transporte de auxinas en arabidopsis. El factor de transcripcin BARREN STALK1 (BA1), un miembro de la familia bHLH, es el blanco de BIF2 (Tanto bif2 como ba1 son requeridos para la iniciacin de meristemos axilares durante el desarrollo de la inflorescencia en maz. La cinasa BIF2 fosforila al factor BA1 in vitro. Mutantes del gen ba1 muestran deformacin en el desarrollo de inflorescencias y mazorcas {Li, 2006 #151}.

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Figura 6-13. Fenotipo del mutante ba1 (baf1) que muestra deformaciones en el desarrollo de la mazorca debido a alteraciones en la secuencia de nucletidos del factor de transcripcin BARREN STALK1 (MaizeGDB). En el genoma del maz se predicen 34 genes bHLH

6.5.1.11.

Factores bZIP

Los factores de transcripcin bZIP (basic leucine zipper) contienen una estructura bipartida de unin a DNA, la cual es rica en aminocidos bsicos adyacentes a un cierre de leucina. La regin bsica es la que entra en contacto con el DNA, en tanto que el cierre de leucina media la homodimerizacin y heterodimerizacin de monmeros proticos. La familia de factores bZlP de arabidopsis que se unen a cajas-G (GBF1, GBF2, y GBF3) interaccionan con el motivo palindrmico de la caja-G (secuencia CCACGTGG) encontrado en numerosos promotores en plantas. La especificidad de unin a DNA del factor es afectada por la naturaleza de los nucletidos que flanquean la secuencia central ACGT. Existe una conexin entre la sealizacin por los factores bZIP y el cido saliclico (SA). Los factores bZIP se unen a elementos tipo-secuencia de activacin as-1 (activating sequence-1) que son elementos en cis que responden a SA, encontrados en promotores de genes inducibles por SA. TGA2.2 constituye el principal componente del factor-1 de unin a as-1 (as-1-binding factor-1 o ASF-1) en tabaco. TGA2.1, constituye una fraccin menor del complejo. Ambas protenas interactan con NPR1, una protena esencial para la induccin de genes por SA. La reduccin en la actividad de las protenas TGA2.2 y TGA2.1 se correlaciona con un decremento significativo en la actividad de ASF-1 y con una inducibilidad reducida de genes que responden a SA. En contraste, la sola reduccin de TGA2.1 no tiene efecto en la expresin de de los genes blanco. La expresin de la mutante TGA2.2 incapaz de formar heterodmeros con el reservorio endgeno de factores TGA conlleva a una inducibilidad reducida mediada por SA en el gen Nt103, lo que indica que el cierre de leucina nativo es importante para que la protena acte positivamente en la transcripcin. Plantas con una expresin reducida de TGA2.1 desarrollaron

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estambres tipo ptalo, lo que indica que esta protena ejerce un papel regulatorio sobre la definicin de la identidad de rganos en flores de tabaco. En maz, las zeinas son codificadas por una familia de genes expresados de manera coordinada en el endospermo de la semilla durante su desarrollo. La acumulacin de zeinas es regulada a nivel transcripcional por reguladores transcripcionales del tipo bZip, entre ellos Opaque-2 (O2). La protena O2 intreracciona directamente con el promotor de genes de zeina, y esta interaccin es mediada por su dominio bZIP de unin al DNA. En el genoma del maz existen 65 factores de transcripcin bZIP predichos.

Figura 6-14. Fenotipos de mazorca de maz con mutacin en el gen op-2 que codifica un factor de transcripcin tipo bZIP (MaizeGDB)

6.5.1.12.

Factores tipo C2C2-CO

Los genes CO (CONSTANS) actan entre los relojes circadianos y los genes que controlan la identidad meristemtica. En arabidopsis, los factores de transcripcin CO contienen dos dominios conservados. El primero es un dedo de zinc localizado cerca del C-Terminal, que asemeja una caja-B y el cual regula interacciones protena-protena. El segundo es una regin de 43 aminocidos cercana a la Terminal-C llamada dominio CCT (CO, CO-like, TOC1). Estos factores constituyen de manera importante a la regulacin de la floracin, conectando los relojes circadianos y las seales de luz con el tiempo para florecer. El gen CONSTANS-LIKE 9 (COL9) es un miembro de esta familia que codifica un factor de transcripcin de localizacin nuclear. La expresin den gen COL9 est regulada por relojes circadianos en la ruta fotoperidica. La sobreexpresin de este gen en plantas transgnicas de arabidopsis ocasiona retardo en la floracin, en tanto que la co-supresin y la insercin de T-DNA produce floracin temprana en condiciones de das largos. En comparacin con plantas tipo silvestre, la abundancia de transcritos de genes CO y FLOWERING LOCUS T (FT) es reducido en plantas transgnicas que sobreexpresan el gen COL9, lo que indica que dicho gen est involucrado en la regulacin de la floracin al reprimir la expresin de otros genes CO, y en consecuencia la del gen FT, retardando con ello la floracin. La floracin en el maz moderno no es afectada por el fotoperiodo. Sin embargo, el gen conz1 y otros dos genes homlogos a genes fotoperidicos exhiben expresin diurna muy similar a la de CONSTANS (CO) en arabidopsis lo que sugiere que el maz es capaz de discernir entre variaciones en fotoperodo y responder con expresin diferencial del gen conz1, el cul muestra gran homologa a los genes fotoperodocos CO de arabidopsis y Heading date1 (Hd1) de arroz, ltimo con el cual tambin muestra sintenia. En el genoma de maz se predicen 12 genes que codifican factores tipo C2C2-CO {Cheng, 2005 #85}.

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6.5.1.13.

Factores C2C2-Dof

La familia de protenas Dof (DNA binding with one finger), una clase particular de factores de transcripcin con dedos de zinc, caracterizada por una regin conservada de 50 aminocidos con una estructura de dedo C2-C2 asociada a la regin bsica, se une especficamente a secuencias de DNA con un consenso 5'-T/AAAAG-3'. Las protenas Dof participan en la regulacin de la expresin de genes en procesos como la sntesis de protenas de almacenamiento en el endospermo en desarrollo en semillas, genes regulados por la luz involucrados en el metabolismo de carbohidratos, mecanismos de defensa en plantas, germinacin de semillas, respuestas a gibberelinas en la aleurona despus de la germinacin, respuestas a auxinas y regulacin gentica en las clulas guarda de los estomas. En maz, el factor de transcripcin Dof1 (MNB1) se expresa me manera constitutiva en hojas, tallos y races, mientras que el Dof2 es expresado principalmente en tallos y races (ref). El factor Dof1 acta como activador transcripcional, en tanto que Dof2 lo hace como represor de la transcripcin. Otro factor de transcripcin tipo Dof de maz, la protena PBF activa la transcripcin del gen -zein durante el desarrollo de la semilla (ref). Tres genes en maz potencialmente codifican protenas C2C2-Dof.

6.5.1.14.

Factores C2C2-GATA

Los factores de transcripcin de unin a secuencias GATA comprenden una familia de protenas cuyos miembros contienen ya sea uno o dos dominios de unin a DNA tipo dedos de zinc bien conservados. En arabidopsis, estas protenas estn implicadas en la regulacin de la transcripcin en respuesta a estmulos de luz y medan la expresin de genes hometicos florales. La especificacin de la identidad de ptalos y spalos est determinada por la accin de dos protenas: APETALA3 (AP3) y PISTILLATA (PI). La induccin de la actividad del gen AP3 altera la expresin del gen GNC (GATA, nitrate-inducible, carbon-metabolism-involved), el cual codifica una protena GATA implicada en la regulacin de la biosntesis de clorofila y en el metabolismo del Carbono (C) y del Nitrgeno (N). El parlogo de GNC, el gen GNL (GNC-like), tambin es regulado negativamente por las protenas AP3 y PI. Anlisis de mutantes simples y dobles gnc y gnl indican que estos dos genes comparten roles redundantes en la promocin de la biosntesis de clorofila y actan para regular cascadas transcripcionales necesarias para integrar la energa necesaria que requieren los procesos de desarrollo y respuestas a estmulos ambientales para promover una diferenciacin apropiada de rganos florales. En el genoma del maz se predice solamente un gen C2C2-GATA {Shikata, 2004 #194}.

6.5.1.15.

Factores C2C2-YABBY

Los factores de transcripcin C2C2-YABBY contienen dos dominios conservados: un dominio C2C2 tipo-dedo de zinc en el extremo N-terminal y una secuencia hlice-bucle-hlice o dominio YABBY en el extremo C-terminal, el cual es similar a las primeras dos hlices de la caja HMG. Los genes YABBY estn expresados de una manera polarizada en todos los rganos laterales generados por los meristemos florales y apicales. La prdida de la expresin de estos genes resulta en ausencia de diferenciacin polar en clulas tipo en rganos laterales, en tanto que la sobreexpresin de los mismos ocasiona que los rganos laterales se hagan abaxiales. La expresin de estos genes est correlacionada con el destino abaxial de los rganos. Los miembros de esta familia de genes actan de manera redundante para especificar la identidad abaxial en rganos laterales producidos por meristemos apicales y florales. En maz se predicen 10 genes que potencialmente codifican factores de transcripcin C2C2-YABBY{Dai, 2007 #614; Siegfried, 1999 #193}.

6.5.1.16.

Factores C2H2-ZPT2

Numerosos factores de transcripcin con dominios C2H2 tipo dedos han sido caracterizados en plantas. La secuencia ZF (zinc finger) cannica (CX2-4CX3FX5LX2HX3-5H) contiene dos

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cisteinas y dos histidinas que coordinan un tomo de zinc, creando un dominio de unin DNA. Estos factores de transcripcin tienen funciones cruciales en el desarrollo de plantas y otros eucariontes. En arabidopsis, cuatro genes C2H2-ZPT2 codifican las protenas AZF1, AZF2, AZF3, y STZ). Las protenas AZFs y STZ se unen a secuencias A (G/C) T que se encuentran entre la secuencia EP2 conocida como secuencia blanco de algunas protenas ZPT2 de petunia (Petunia hybrida). Las cuatro protenas ZPT2 actan como represores transcripcionales que reducen la expresin de otros factores de transcripcin. La expresin de los genes AZF2 y STZ es inducida fuertemente por deshidratacin, alta salinidad y fro, as como por la aplicacin externa de ABA. Plantas transgnicas de arabidopsis que sobreexpresan el gen STZ muestran crecimiento retardado y tolerancia a estrs por sequa. Por lo tanto, las protenas AZF2 y STZ funcionan como represores transcripcionales, que incrementan la tolerancia al estrs retardando el crecimiento. En maz se predicen 14 genes que potencialmente codifican factores de transcripcin C2H2-ZPT2 {Li, 1998 #154; Chrispeels, 2000 #91}.

6.5.1.17.

Factores C3H/CCCH

Los genes de la familia C3H/CCCH codifican protenas con dedos de zinc que contienen un motivo con tres cistenas y una histidina. Tienen importantes funciones en el procesamiento del RNA como protenas de unin al RNA en animales. En arroz y arabidopsiss e han identificado ms de 65 genes de este tipo en cada especie, expresados de manera diversa en tejidos y en respuesta al estrs bitico y abitico (ABA, salinidad, fro, manitol, hipoxia y estrs osmtico), lo que sugiere que pueden tener funciones importantes en la tolerancia al estrs. Estos genes fueron aislados primeramente de embriones en arabidopsis. El gen PEI, codifica una protena que contiene un dominio de dedo de zinc tipo Cys3His y es expresado en el embrin desde la fase globular hasta la madurez del cotiledn. Estos genes estn presentes en arabidopsis, arroz, algodn, maz, olmo y pinceas y tienen funciones regulatorias. En el genoma de maz se predicen 57 genes que pueden codificar protenas C3H/CCCH.

6.5.1.18.

Factores CCAAT (CBT, CP, Dr1, HAP, NY-F)

El motivo CCAAT es un elemento ubicuo encontrado en los promotores de genes eucariontes. El factor nuclear Y (Nuclear Factor Y o NF-Y) es un complejo trimrico que se une al motivo CCAAT. En mamferos y levadura, las tres subunidades del complejo NF-Y (NF-YA, NF-YB y NFYC) estn representadas por genes simples. En plantas, numerosos genes codifican cada subunidad. El genoma del trigo contiene 37 genes NF-Y y Dr1 (10 genes NF-YA, 11 NF-YB, 14 NF-YC y 2 Dr1) expresados de manera predominante en el endospermo de la semilla. Tres de estos genes son inducidos por la sequa. En el genoma de arroz se encuentran 10 genes HAP2, 11 HAP3 y siete HAP5. Estos factores de transcripcin de la familia CCAAT tambin son conocidos como CBF, CP, Dr1, HAP o NF-Y indistintamente dependiendo de la especie, y controlan varios aspectos del crecimiento y el desarrollo en arroz. Tambin se encuentran representados en maz, arabidopsis, Medicago truncatula y Brassica napus. Los homlogos en arabidopsis regulan la floracin en condiciones de fotoperiodos largos y responden al estrs osmtico. La expresin del factor de transcripcin nuclear tipo Y (NF-Y), AtNF-YB1, confiere mejora la respuesta de plantas de Arabidopsis sometidas a sequa. El gen ZmNF-YB2, un ortlogo del AtNF-YB1 encontrado en maz, tambin confiere mayor tolerancia a sequa en plantas transgnicas de maz (Figura 6-15). En total se predicen cuatro genes CCAAT en maz {Cai, 2007 #80; Gusmaroli, 2002 #113; Li, 1992 #153}.

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Figura 6-15. Plantas tipo silvestre y transgnicas de maz en invernadero y en campo. Las plantas transgnicas que sobreexpresan el gen ZmNF-YB2 muestran evidencias visuales de mayor tolerancia a la sequa. En ambas fotografas las plantas tipo silvestre se encuentran a la izquierda (Nelson et al., 2007).

6.5.1.19.

Factores CPP

Los genes CPP codifican una pequea familia de protenas que presenta dos dominios conservados denominados CXC, los cuales son ricos en cistena. Ests protenas estn restringidas exclusivamente a plantas, en donde participan en procesos de desarrollo de tejidos reproductivos y control de la divisin celular. En soya, los genes Nodulin se expresan especficamente en los ndulos que fijan nitrgeno en la raz. El factor de transcripcin CPP1 interacta con la regin promotora del gen Gmlbc3 (Glycyne max leghemoglobin). El dominio de unin a DNA del factor CPP1 contiene dos motivos ricos en cistena con 9 y 10 residuos de este aminocido, respectivamente. Genes similares han sido identificados en Arabidopsis thaliana. El gen cpp1 es inducido en etapas tardas del desarrollo del ndulo. El factor CPP1 est involucrado en la regulacin de genes leghemoglobin en el ndulo simbitico de races de leguminosas. En el genoma del maz se predicen 10 genes que codifican factores CPP {Cvitanich, 2000 #94}.

6.5.1.20.

Factores E2F-DP

La familia E2F-DP (E2 promoter-binding protein-dimerization partner) de factores de transcripcin tiene un papel determinante en el control del ciclo celular al regular la transcripcin de genes involucrados en el desarrollo de la fase G1 a la fase S. En tabaco existen genes que contienen sitios de unin a factores E2F, los cuales funcionan como elementos en cis, esenciales para la expresin de genes que regulados por el ciclo celular. Nueve genes E2F-DP son los que se predice existen en el genoma de maz {De Jager, 2001 #97}.

6.5.1.21.

Factores EIN/EIL

El etileno es un regulador del crecimiento vegetal que controla diversas etapas del crecimiento y respuestas a estrs. Los factores de transcripcin de la familia EIN (ETHYLENE INSENSITIVE) estn involucrados en la regulacin de las respuestas de la planta a este regulador del crecimiento. EIN3 un factor de transcripcin clave que media la expresin de genes regulados por etileno. Los genes de Vigna radiata VR-EIL1 y VR-EIL2 (Vigna radiata EIN-like) codifican protenas tipo-EIN3. En presencia de etileno, se incrementan los niveles de la protena EIN3. En ausencia de etileno, la protena EIN3 es rpidamente degradada a travs de una ruta ubiquitina/proteosoma mediada por dos protenas caja-F, EBF1 y EBF2. Otra protena, la EIN5, antagoniza la regulacin negativa de EIN3, al promover la reduccin del la tasa de transcripcin

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de EBF1 y EBF2, lo que permite la acumulacin de la protena EIN3, que regula la respuesta a etileno. En maz, el endospermo de la semilla sufre de muerte celular programada al final de su desarrollo, de manera que, a excepcin de la aleurona, el tejido est muerto al final de la etapa de maduracin. Dos miembros de esta familia de factores de transcripcin, EIN2 y EIL, intervienen en la recepcin y transduccin de seales de etileno que medan la muerte celular programada. En total se predicen seis genes EIL en el genoma del maz {Lee, 2003 #147}.

6.5.1.22.

Factores FHA

El dominio forkhead (FH) es una regin de unin a DNA bien conservada que consta de 110 aminocidos, que se encuentra en los factores de transcripcin FHA. Estas protenas estn involucradas en el procesamiento de rRNA y en la regulacin del ciclo celular y el crecimiento. Adems del dominio forkhead, algunos factores de transcripcin forkhead tambin poseen un dominio forkhead asociado (forkhead-associated,domain FHA). En Arabidopsis, un gen FHA denominado DDL regula mltiples aspectos del desarrollo de la planta. Lneas transgnicas donde se reprime la expresin del gen por inserciones de T-DNA muestran retardo en el crecimiento, emisin de races, flores y tallos defectuosos, y menor produccin de semillas que las plantas tipo silvestre. En el genoma del maz se predicen 10 genes FHA.

6.5.1.23.

Factores GARP-ARR-B

El genoma de arabidopsis codifica 22 reguladores de respuestas (ARR), 12 de los cuales contienen un domino de unin a DNA tipo-MYB llamados ARRM (tipo B). El resto (tipo A) poseen solo un dominio de recepcin de seales que contiene dos aspartatos y una lisina (DDK) en una posicin fija, y sus genes son inducidos por citocininas sin que tenga lugar una sntesis de protenas de novo. Los miembros del tipo B llamados ARR1 y ARR2 se unen al DNA de manera especfica y trabajan como activadores transcripcionales. La protena ARR1 media seales de citocininas a travs de un dominio receptor de seales de citocininas localizado en el extremo Nterminal Un regulador de respuestas parlogo, ARR2, muestra funciones muy similares a ARR1,indicando redundancia. Las respuestas reducidas a citocininas observadas en la mutante arr1-1 pueden ser provistas por la actividad de ARR2. Adems de ARR6, otros miembros del tipo A, incluyendo ARR4, ARR5, ARR7, ARR8, y ARR9, tambin fueron activados por DEX, lo que sugiere que todos los genes que responden a citocininas de manera inmediata y que pertenecen a este grupo son directamente activados por ARR1. En maz se predicen slo tres genes de esta familia.

6.5.1.24.

Factores GARP-G2

Las protenas GLK son miembros de de superfamilia GARP de factores de transcripcin, que incluye a G2 en maz; las protenas ARR-B de arabidopsis (RESPONSE REGULATOR-B) y la protena PSR1 (PHOSPHATE STARVATION RESPONSE1) de Chlamydomonas. La protena G2 es capaz de transactivar la expresin de genes reporteros y puede homodimerizar o heterodimerizar con ZmGLK1. En arroz y arabidopsis, los factores GLK estn expresados en tejidos fotosintticos. Es posible que estas protenas funcionen como reguladores en el desarrollo de cloroplastos. En el genoma de maz, se predicen tres genes GARP.

6.5.1.25.

Factores GeBP

Los tricomas en arabidopsis son pelos de una sola clula que surgen de la epidermis. La iniciacin de tricomas requiere de la activacin del gen GLABROUS1 (GL1), cuya expresin en clulas de la epidermis y de los tricomas depende de la presencia de un elemento regulatorio 3'cis y la protena GeBP (GL1 enhancer binding protein) se une a este elemento regulatorio. GeBP y sus tres homlogos en arabidopsis comparten dos regiones: una regin central sin motivos conocidos y una regin en el xtremo C-terminal, con un motivo tipo cierre de leucina. La protena KNAT1, producto de un gen KNOX, es un activador transcripcional de GeBP, lo cual indica que

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GeBP acta como un represor del destino morfolgico de clulas en la hoja. No se han identificado protenas homlogas fuera del reino de las plantas. En maz se predice la existencia de dos genes GeBP {Chevalier, 2008 #86}.

6.5.1.26.

Factores GIF

Las protenas GRF o factores reguladores del crecimiento (growth-regulating factor) modulan el crecimiento y desarrollo en hojas y cotiledones en arabidopsis. La regin C- terminal de las protenas GRF presenta actividad de transactivacin. Otra familia de protenas, los factores que interactan con GRF (GRF-interacting factor o GIF), comprende tres miembros. La regin Nterminal de la protena GIF1 interacciona con GRF1. Al igual que los mutantes grf, el mutante gif1 y las plantas transgnicas desarrollaron hojas y ptalos ms pequeos que las plantas tipo silvestre. Las protenas GRF1 y GIF1 actan como activador y coactivador transcripcionales, respectivamente, y son parte de un complejo involucrado en la regulacin del crecimiento y la forma de hojas y ptalos, a travs de la promocin o el mantenimiento de la proliferacin celular en los primordios foliares o florales. En maz se predice nicamente un gen que codifica potencialmente un factor de transcripcin GIF.

6.5.1.27.

Factores GRAS

Mutaciones en el locus SCARECROW (SCR) en Arabidopsis ocasiona aberraciones en el patrn de distribucin radial de races y tallos. La protena que codifica este locus es un factor de transcripcin denominada SCARECROW-LIKE (SCL) y conforma una familia de protenas junto con otros factores similares, entre los que se encuentran la GAI (GIBBERELLIN-INSENSITIVE) y la RGA (REPRESSOR of ga1-3). De estas tres primeras protenas estudiadas (GAI, RGA, SCR) es que se ha derivado el nombre de GRAS para toda la familia. El gen Zea mays SCARECROW (ZmSCR) de maz es el ortlogo de SCR y es capaz de complementar el fenotipo de la mutante scr de arabidopsis, lo que sugiere, que las funciones entre mono y dicotiledneas se han conservado {Pysh, 1999 #179}.

6.5.1.28.

Factores GRF

El gen GROWTH-REGULATING FACTOR1 de arroz (OsGRF1) codifica un factor de transcripcin que desempea una funcin regulatoria en la elongacin del tallo en arroz. En arabidopsis, las protenas AtGRP estn compuestas de nueve miembros, los cuales contienen dos regiones caractersticas, una QLQ (Gln, Leu, Gln) y otra WRC (Trp, Arg, Cys). La mayora de los genes AtGRF son expresados fuertemente en tejidos en crecimiento activo. La sobreexpresin y la mutacin de los genes AtGRF1 y ATGR2 ocasionan alteraciones en el crecimiento de la raz, como resultado de un incremento o decremento del tamao de las clulas, respectivamente, lo que indica que las protenas AtGRF presentan un papel en la regulacin de la expansin celular en hojas. En el genoma del maz se predicen 50 protenas GRAS, mientras que en arroz este nmero asciende a 52.

Comentario [EVO7]: Estas no son las del apartado anterior?

6.5.1.29.

Factores HB

El dominio homeobox es una secuencia consenso de 180 pb presente en un nmero de genes involucrados en procesos de desarrollo. De acuerdo a la conservacin de secuencias, los genes que codifican dominios HB pueden ser subdivididos en diferentes familias, cada una con un nmero considerable de miembros. Estudios evolutivos indican que las diferentes subfamilias muestran divergencia anterior a la separacin de animales, plantas y hongos. De acuerdo con ello, miembros de diferentes subfamilias muestran propiedades estructurales y funcionales muy caractersticas y que les diferencian de los dems. Por ejemplo, los genes tipo-kn1 estn involucrados en diferentes aspectos del control de la determinacin del destino de la clula en meristemos apicales; los genes HD-Zip, que codifican protenas que contienen motivos de cierre de leucina adyacentes a dominio HB, operan en etapas tardas del desarrollo; y los genes tipo-

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gl2 estn involucrados en diferenciacin celular de la epidermis. En el genoma de arabidopsis existen 89 genes HB, los cuales pueden ser clasificados en diferentes grupos de acuerdo a la presencia de dominios conservados. De ese total, 48 codifican protenas HD-Zip (homeodomainleucine zipper). Otras subfamilias son HD-PHD, Tale-HD y tipo-WUS. En maz, el gen Knox7, un miembro de la familia de la clase 2 de genes HB, es expresado en los embriones de la semilla durante la germinacin. En el mismo tejido, la expresin de este gen es estimulada por ABA, pero inhibida por cido giberlico (GA), dos hormonas que controlan el proceso de germinacin. En el genoma del maz se predicen 16 genes que codifican protenas HB {Manavella, 2008 #158}.

6.5.1.30.

Factores HMG

Las protenas del grupo de alta movilidad (High mobility group proteins (HMG) constituyen una familia de componentes de bajo peso asociadas a la cromatina. En plantas, estas protenas se presentan en dos subfamilias denominadas HMGA y HMGB. Las protenas HMGA (Figura 6-16) se caracterizan por la presencia de cuatro motivos AT-hook de unin a DNA, mientras que las protenas HMGB (Figura 6-17) contienen un dominio de unin a DNA de tipo caja HMG. Las protenas HMG estn involucradas en la regulacin de la transcripcin y otros procesos dependientes del DNA. En maz se ha identificado la interaccin de la protena recombinante HMGA y cinco protenas HMGB con mononucleosomas purificados a partir de cromatina de la semilla. En maz se predice la existencia de un total de 23 genes que potencialmente codifican protenas HMG {Launholt, 2006 #142; Launholt, 2007 #141; Lichota, 2003 #155}.

Figura 6-16. Estructura de factores de transcripcin HMGA

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Figura 6-17. Estructura del Dominio HMG

6.5.1.31.

Factores HSF

Durante las fases iniciales del estrs por calor, los factores de transcripcin HSF (heat shock transcription factor) son las primeras molculas en transmitir las seales de estrs al aparato transcripcional. Con base en el anlisis de sus dominios de unin a DNA (DBD) y la comparacin de sus dominios de oligomerizacin (OD), se ha determinado la existencia de dos clases principales de factores HSF: la clase A y la B. Estos dos grupos de HSF parecen ser nicos en plantas y no tienen relacin con otros encontrados en eucariontes. En arroz, los HSF participan en la regulacin de la expresin de las protenas HSP (heat shock proteins), las cuales son crticas en la proteccin del dao por estrs y muchos otros procesos biolgicos. La respuesta al choque trmico (heat shock response o HSR) es un mecanismo conservado por el cuAl los transcritos de los genes que codifican protenas de choque trmico (hsp) se acumulan como consecuencia de la movilizacin de factores de transcripcin de choque trmico (HSF) en respuesta a estrs trmico. Se ha identificado una protena de unin al factor HSF1 (heat shock factor-binding protein1 o HSBP1) que interacciona con el factor HSF1 durante la atenuacin de choque trmico. La protena HSBP1 funciona como un regulador negativo de HRS. En maz existen dos HSBP parlogos: EMP2 y HSBP2, los cuales exhiben acumulacin diferencial durante eventos de HSR y del desarrollo de la planta. Lal mutante recesiva letal para el embrin emp2, demuestra que EMP2 es requerida para la des-regulacin de la transcripcin de hsp durante la embriognesis, mientras que la acumulacin de HSBP2 es inducida en plntulas como consecuencia de choque trmico. En maz se reportan entre 11 y 22 isoformas de genes HSF, las cuales componen una de las tres clases estructurales: HSF-A, HSF-B y HSF-C. Las interacciones entre residuos hidrofbicos de las protenas son requeridas para la unin HSF: HSBP2 durante el desarrollo de la planta. El factor de transcripcin HSF en maz es activado por calcio, en tanto que la protena CaM regula la unin del factor de transcripcin al DNA. En maz se predice un total de 11 genes que codifican factores de transcripcin HSF. ({Fu, 2006 #106})

6.5.1.32.

Factores JUMONJI

Las protenas JUMONJI (JMJ) conforman una familia de factores de transcripcin de localizacin nuclear, algunos relacionados con la regulacin de la floracin. En el genoma de maz se predice

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la existencia de siete genes que codifican factores de transcripcin JMJ. En arabidopsis, la floracin es controlada por mltiples rutas, incluyendo la fotoperidica y la ruta FLC (FLOWERING LOCUS C). Los factores de transcripcin tipo-JMJ, ELF6 (EARLY FLOWERING 6) y REF6 (RELATIVE OF EARLY FLOWERING 6), desempean diferentes funciones en el control de la floracin. El factor ELF6 acta como represor durante la ruta fotoperidica, mientras que REF6, reprime la expresin de FLC. La actividad regulatoria de la transcripcin que desempean estos factores incluye la remodelacin de la protena y la modulacin de la expresin de genes regulados por brasinoesteroides. ({Kim, 2003 #131})

6.5.1.33.

Factores LIM

En eucariontes, las protenas LIM actan como reguladores del desarrollo en procesos celulares bsicos tales como la transcripcin o la organizacin del citoesqueleto. La familia de protenas LIM en plantas ha sido estudiada en girasol y en tabaco, en las cuales muchos miembros de esta familia exhiben patrones de expresin especficos en polen. En el genoma del olmo (Populus trichocarpa) existen 12 genes LIM predichos, mientras que en arabidopsis y en arroz existen seis en cada especie. Estas protenas contienen muchos motivos conservados involucrados en sus funciones. En maz existen 10 genes LIM. La lignina es un polmero fenlico complejo que es esencial como soporte mecnico, defensa y transporte de agua en plantas superiores. El motivo caja-Pal, rico en AC, es un elemento en cis importante para la expresin de genes involucrados en la biosntesis de fenilpropanoides. El gen Ntlim1 codifica una protena que se una a la caja-Pal, con secuencia muy similar a los miembros de la familia LIM que contienen un dedo de zinc. Adems, la protena Ntlim1 tiene una habilidad especfica para unirse al DNA y activar de manera temporal la transcripcin del gen betaglucuronidasa regulada por la caja-Pal en protoplastos de tabaco. La represin del gen Ntlim1 ocasiona menores niveles en la transcripcin de genes relacionados con la ruta de fenilpropanoides, tales como fenilalanina aminio-liasa, hidroxicinamato CoA ligasa y cinamil alcohol deshidrogenasa. Adems, se observa un 27 % de reduccin en el contenido de lignina en clulas de plantas transgnicas de tabaco con el antisentido del gen Ntlim1 {Arnaud D, 2007 #1; Arnaud D, 2007 #76; Kawaoka, 2000 #125}.

6.5.1.34.

Factores LUG

La regulacin de la expresin de genes hometicos (causantes de cambios inusuales en el desarrollo de un rgano o tejido) es crucial para lograr patrones de desarrollo apropiados tanto en animales como en plantas. El gen LEUNIG (LUG) es un regulador clave del gen hometico floral AGAMOUS en arabidopsis. Mutaciones en LEUNIG causan sobreexpresin del mRNA del gen AGAMOUS, provocando transformaciones hometicas del rgano floral y prdida de los rganos florales. El descubrimiento de la importancia fisiolgica de este gen tanto en plantas como en animales sugiere que los organismos eucariontes usan protenas represoras similares para regular procesos crticos del desarrollo. El gen LUG conecta las interacciones entre factores de transcripcin y reguladores de cromatina. La protena LUG es reclutada por ciertos factores de transcripcin con dominios MADS hacia las regiones promotoras del gen hometico AGAMOUS (AG) y reprime la expresin del gen AG. TOPLESS (TPL), una protena poco similar a LUG, desempea una funcin primordial en al patrn de desarrollo de embriones en arabidopsis. Mutaciones negativas dominantes en el gen TPL inactivan a los cinco miembros de la familia TPL en arabidopsis y convierten el polo apical en polo basal, lo que conduce a un fenotipo con doble raz. En el genoma de arabidopsis existe un homlogo de LUG, el gen LEUNIG_HOMOLOG (LUH), y ambos codifican dos protenas corepresoras altamente homlogas. Mutantes simples luh producen flores normales, pero los dobles mutantes luh producen embriones infrtiles. Adems, al recuperar la funcin en mutantes luh/+ se potencia y mejora el fenotipo floral de lug, lo que revela un papel menor de LUH en el desarrollo de la flor. La diversificacin funcional entre los genes LUH y LUG se hace evidente debido a la incapacidad de la sobreexpresin de la construccin 35S LUH para recuperar el fenotipo en los mutantes lug y por las tendencias opuestas en la expresin de LUG y LUH en

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respuesta a condiciones adversas de estrs bitico y abitico. En maz se han identificado slo dos genes LUG.

6.5.1.35.

Factores MADS

La caja-MADS (MADS-box en ingls) es un dominio de 58 aminocidos que se une a secuencias de DNA en secuencias consenso de reconocimiento conocidas como cajas CArG [CC(A/T) 6GG]. Los factores de transcripcin caja-MADS estn involucrados en la regulacin de la identidad de rganos florales. El modelo ABC de mutantes florales hometicos explica cmo la combinacin de funciones de tres clases de genes (A, B, y C) determina la funcin de los cuatro rganos florales. Arabidopsis tiene dos genes de la clase-A (AP1 y AP2), dos de la clase-B, (PI y AP3), y uno de la clase-C (AG). La actividad transcripcional de los genes de las clases B y C que controlan el desarrollo de ptalos, estambre y carpelo, depende de tres genes caja-MADS: SEP1, SEP2 y SEP3. Slo cuando los alelos de los tres genes se combinan en un mutante triple sep1 sep2 sep3 se observa la prdida de la identidad de ptalos, estambres y carpelo, lo que resulta en una flor que solo contiene spalos, lo cual es indicio de la redundancia funcional de estos genes. Los genes SHP ofrecen otro ejemplo de redundancia de los genes caja-MADS. Los mutantes shp1 y shp2 no exhiben ningn efecto fenotpico por s solos, pero cuando son dobles mutantes se observa una alteracin en el desarrollo de la zona dehiscente del fruto, lo que ocasiona incapacidad para liberar semillas. En plantas, animales y hongos existen por lo menos dos tipos de genes que codifican factores de transcripcin caja- MADS: tipo-I y tipo-II. En plantas, la mayora de los genes son tipo-II, los cuales tienen tres dominios ms que los tipo-I: el dominio de intervencin (intervening domain o I de ~ 30 residuos); el dominio tipo queratina (keratin-like coiled-coil domain o K de ~70 residuos); y el dominio del C- terminal (C-terminal domain o C, de longitud variada). Estos genes son denominados tipo-MIKC y son especficos en plantas. En maz se han identificado 47 genes MADS.

6.5.1.36.

Factores MBF1

El factor de unin a multiptotenas 1 MBF1 (multiprotein bridging factor 1) es un co-activador transcripcional que conecta la interaccin entre un activador y una protena de unin a la cajaTATA o TBP (TATA-box binding protein). Mutaciones en los genes MBF1 de arabidopsis (AtMBF1a, AtMBF1b y AtMBF1c) reduce parcialmente el tamao de los mutantes, lo cual indica que todos ellos funcionan como coactivadores. Cada uno de estos genes muestra un patrn de expresin diferencial de acuerdo al tejido y en respuesta a fitohormonas, lo que sugiere que no hay redundancia entre ellos. La expresin constitutiva del gen ATMBF1c en arabidopsis mejora la respuesta de plantas transgnicas a infecciones bacterianas, calor y estrs osmtico. Adems, la mayor tolerancia al estrs osmtico y al calor, se mantuvo an cuando ambos factores se combinaron, lo cual estuvo mediado por una alteracin en la ruta de transduccin de seales de etileno. En el genoma del maz se han identificado 19 genes MBF1.

6.5.1.37.

Factores MYB

Los factores MYB contienen el dominio MYB de unin a DNA, identificado por primera vez en la protena codificada por el oncogen v-Myb aislado del virus aviar de la mieloblastosis (avian myeloblastosis virus). La comparacin de secuencias revela que el oncogen v-Myb pudo haberse originado a partir de un gen de vertebrados, el cual mut una vez en el virus. Genes similares han sido identificados en vertebrados, insectos, plantas superiores, hongos y musgos. Las protenas codificadas son cruciales para el control de la proliferacin y la diferenciacin de clulas y conservan el dominio MYB de unin a DNA. Este dominio contiene hasta tres rplicas imperfectas, todas ellas formando una estructura hlice-vuelta-hlice de cerca de 53 aminocidos, con tres residuos regulatorios de triptofano espaciados, referidos como R1, R2 y

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R3. Las rplicas en otras protenas MYB son categorizadas de acuerdo a su similitud con sus residuos regulatorios R1, R2 o R3. Las protenas MYB pueden ser clasificadas dentro de tres subfamilias dependiendo del nmero de rplicas adyacentes en el dominio MYB una, dos o tres). As, las protenas MYB con una replica son referidas como MYB1R, las que contienen dos como MYBR2 y las que contienen tres como MYB3R. En el genoma de maz se han predicho 18 genes MYB {Stracke, 2001 #200}.

6.5.1.38.

Factores MYB-related

Hasta ahora, los genes Myb caracterizados en plantas, codifican factores de transcripcin involucrados en diversos procesos y son regulados por seales mltiples. El control de la biosntesis de pigmentos flavoniodes est controlado por genes Myb. Uno de los genes mejor caracterizados es el gen C1 del maz, el cual es activado tanto por cido abscsico como por luz. En total se han predicho 52 genes MYB-related en el genoma de maz. En maz se sintetizan dos grandes clases de flavoniodes: antocianinas rojas y prpuras y flobafenos rojos. La biosntesis de flobafenos est controlada por el gen p1, el cual codifica un factor de transcripcin tipo- Myb. En maz, el gen p1 (pericarp color1) regula la sntesis de flobafeno, el pigmento flavonoide rojo de rganos florales como el pericarpio de la semilla. El gen p1 codifica un factor de transcripcin R2R3 tipo-Myb que regula la expresin de los genes estructurales involucrados en la biosntesis de flavonoides, incluyendo el gen c2 (chalcone synthase), chi (chalcone flavonone isomerase), y a1 (por dihydroflavonol reductase. Ms de 100 alelos del gen 100 han sido descritos, cada uno de los cuales especifica un patrn de pigmentacin especfico y distinto a los dems. Los alelos que confieren distinta expresin de pigmentacin incluyen: P1-rr (red pericarp/red cob), P1-wr (white pericarp/red cob), P1-rw (red pericarp/white cob), p1-ww (white pericarp/white cob) (Figura 6-18) {Zhang, 2005 #223}.

Figura 6-18. Distintos patrones de pigmentacin de flobafeno como productos de la actividad de diferentes alelos del gen p1 que codifica un factor de transcripcin tipo-Myb. A, Patrones de pigmentacin de la mazorca madura especificados por los alelos P1-rr4B2, P1-wr, P1-rw1077, and p1-ww1112 del gen p1 (de izquierda a derecha). B, Patrones de pigmentacin de los alelos P1-rr4B2 y P1-rw1077 a los 16 y 28 das despus de la polinizacin {Zhang, 2005 #223}.

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6.5.1.39.

Factores NAC

Los factores de transcripcin NAC de la petunia y ATAF1 y CUC2 de arabidopsis contienen el denominado dominio NAC (NAM-ATAF1-CUC2). El dominio NAC est ampliamente distribuido en plantas, pero no en otros eucariontes. El dominio de unin a DNA (DNA-binding domain o DBD) est contenido en una regin de 60 aminocidos. El genoma de arabidopsis contiene ms de 90 genes que contienen el dominio NAC. Estos factores regulan los mecanismos de defensa contra patgenos y atenan las seales de ABA. Tambin regulan la formacin de paredes secundarias en los mrgenes de los frutos de arabidopsis, despus del establecimiento de la identidad del tejido. En arroz, la expresin del gen OsNAC6 es inducida por diferentes factores de estrs bitico y abitico incluyendo ataques por hongos e insectos, fro, sequa y alta salinidad. La sobreexpresin de este gen origina mayor tolerancia de las plantas a la sequa (Figura 6-19).

Figura 6-19. Respuestas fenotpicas de plantas de arroz tipo Silvestre (control) y plantas transgnicas que sobreexpresan el gen OsNAC6. Las plantas tenan 14 das de edad cuando fueron tratadas con 250 mm NaCl en la solucin nutritiva por tres das. Las plantas a la derecha de la barra negra sobrevivieron, mientras que se encuentran a la izquierda murieron {Nakashima, 2007 #169}. En el genoma del maz se han identificado un total de 30 genes que codifican factores de transcripcin NAC.

6.5.1.40.

Factores tipo -Nin

El inicio de la formacin de un ndulo depende en principio de la competencia celular en una zona de infeccin muy restringida, localizada justo abajo del punto de crecimiento de la raz. Los ndulos maduros regulan el nmero de nuevos ndulos en el sistema radical suprimiendo el desarrollo de primordios de ndulos. La protena Nin (nodule inception) es requerida para la formacin de la infeccin y el inicio del primordio. Contiene un motivo conservado en protenas de plantas cuyo crecimiento est controlado por el nitrgeno. Este motivo est involucrado en la regulacin de genes controlados por la disponibilidad de nitrgeno y en el genoma de maz se han predicho dos genes que codifican factores tipo-Nin.

6.5.1.41.

Factores PcG

Las protenas PcG (polycomb group) mantienen silenciamiento en loci blancos pero tambin participan en la activacin de ciertos loci hometicos. Mutantes PcG muestran transformaciones fenotpicas causadas por la des-represin de loci hometicos. Adems, las protenas PcG tambin regulan blancos no hometicos. Por otra parte, protenas trxG (trithorax group) son requeridas para el mantenimiento pero no la iniciacin de la activacin de loci hometicos. Los productos de los genes trxG suprimen el fenotipo de los mutantes PcG, deduciendo que las protenas trxG actan de manera antagonista a las protenas PcG. El anlisis estructural de los elementos de respuesta en los genes PcG y trxG muestra que las secuencias requeridas para la activacin dependiente de trxG y la represin dependientes de PcG estn separadas pero dentro de las 30 a 40 pb una de la otra. Ests protenas participan en

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la modificacin de y la condensacin de la cromatina, que ocurre antes de la mitosis. En maz se han identificado 16 genes PcG.

6.5.1.42.

Factores PHD

El homeodominio de plantas (Plant HomeoDomain o PHD), un dedo de zinc Cys4HisCys3, es encontrado en muchas protenas relacionadas con la regulacin transcripcional mediada por cromatina. En plantas, el desarrollo reproductivo requiere de un proceso normal de meiosis, con eventos bien coordinados, incluyendo mecanismos de control y verificacin transcripcional. El progreso del ciclo celular en la meiosis es una parte esencial del programa de desarrollo de la esporognesis en plantas. La actividad del gen DUET (que codifica un factor de transcripcin con un motivo PHD) es determinante para la organizacin cromosmica durante la meiosis masculina y su desarrollo. El mutante duet de arabidopsis es un macho estril que carece de polen y presenta de un proceso meitico aberrante. En arroz, el gen HAZ1 codifica una protena PHD, similar a las protenas PHD Zmhox1a (52% de identitidad) y a Zmhox1b (50% de identidad) encontradas en maz. HAZ1 est involucrada en la morfognesis de embriones en arroz. En maz, la sobreexpresin de las protenas ZmHox1a or ZmHox1b causan alteraciones pleiotrpicas en el desarrollo de rganos vegetativos y reproductivos. Adems de estos genes, en maz se han identificado otros 15 genes pertenecientes a esta familia.

6.5.1.43.

Factores PLATZ

El factor PLATZ1 (plant AT-rich sequence- and zinc-binding protein 1), contiene motivos especficos de cisteina e histidina que no varan, as como dos regiones distanciadas, una con la secuencia consenso C-x(2)-H-x(11)-C-x(2)-C-x((4-5))-C-x(2)-C-x((3-7))-H-x(2)-H y otra con la secuencia C-x(2)-C-x((10-11))-C-x(3)-C. La protena PLATZ1 se une de manera no especfica a secuencias ricas en A/T, incluyendo la regin corriente arriba de los genes pra2 de la GTPasa en chcharo y petE de la plastocianina. En el genoma del maz se han identificado solo tres genes PLATZ {Carbajosa, 1997 #82}.

6.5.1.44.

Factores SIF

Los factores de transcripcin S1F (spinach leaf nuclear factor) regulan algunas respuestas a la luz y al crecimiento en plantas. El gen nuclear rps1 que codifica la protena ribosomal del plastidio de espinaca CS1 (spinach plastid ribosomal protein CS1) exhibe un patrn de expresin tanto constitutivo como especfico en hoja. En hoja, la induccin del gen rps1 depende de la luz. El factor de transcripcin S1F (spinach leaf nuclear factor 1) interacta con el promotor del gen rps1 y regula su transcripcin. De hecho, el sitio de unin a S1F en el gen rps1 es un elemento negativo que reprime la actividad del promotor de rps1. En maz se han predicho seis genes S1F.

6.5.1.45.

Factores SPL

Los factores de transcripcin SPL (SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN LIKE) constituyen una familia de protenas estructuralmente diversas que se encuentran solo en plantas. En el genoma de maz se han identificado cuatro genes SPL. La caracterstica distintiva de los factores SPL es la caja-SBP que representa un dominio conservado de 76 aminocidos, el dominio SBP, responsable de la interaccin con el DNA. Estos genes muestran actividad en el control del desarrollo de las plantas, como se observa en las mutantes del gen Liguleless1 de maz, que presentan aberraciones en un gen SBP. El tomate, un gen SBP es determinante para el amarre de frutos, el desarrollo de la planta y la generacin de variacin natural. En arroz, el rea entre la parte ms elevada de la vaina y la parte ms baja de la lmina foliar contiene varios rganos tales como la aurcula y la lgula. El mutante del gen OsLIGULELESS1 (OsLG1) que codifica el factor de transcripcin tipo SBP es altamente homlogo al gen LIGULELESS1 (LG1) de maz y es expresado en regiones en desarrollo del punto de unin de la

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lmina con la vaina foliar, as como en las regiones meristemticas, en las que desempea un papel preponderante en la formacin de lgula y aurcula {Cardon, 1999 #83; Chuck, 2002 #88}.

Figura 6-20. Fenotipo de plantas de arroz tipo silvestre y transgnicas con expresin diferencial del factor de transcripcin oslg1. A, comparacin de las hojas en el lado abaxial; B, comparacin de las hojas en el lado axial (plntulas de 10 das de edad). li, lgula; au, aurcula; lj, unin de la lmina; bl, lmina foliar; sh, vaina foliar. Barra, 100 m ({Lee, 2007 #148}).

6.5.1.46.

Factores TCP

Los genes cycloidea (cyc) y teosinte branched 1 (tb1) codifican para protenas estructuralmente relacionadas implicadas en la evolucin de caracteres morfolgicos clave en plantas. En total se ha identificado solo un gen TCP en maz. Las protenas TCP mantienen conservado un dominio hlice-bucle-hlice no cannico (a non-canonical basic-Helix-Loop-Helix o bHLP). Este dominio tambin se encuentra en dos protenas que se unen a DNA, la PCF1 y la PCF2. Esta familia de factores de transcripcin que conserva el dominio bHLP ha sido denominada TCP (por las protenas TB1, CYC y PCFs que fueron primeramente identificadas). Dos de estas protenas se encuentran expresadas en los primordios florales en crecimiento, con actividad en el control de la divisin celular y en la evolucin de las plantas para generar nuevos caracteres morfolgicos. El gen PTC-1 de Beta palonga es un homlogo del gen TFL1/CEN en arabidopsis. Este gen regula la identidad meristemtica y el desarrollo floral en Beta palonga. En el maz, la mutante tb1 muestra deformacin de la mazorca y excesivos hijuelos o retoos.

Figura 6-21. Fenotipo del mutante tb1, que muestra el excesivo nmero de hijuelos en la fotografa de la izquierda y deformaciones de la mazorca en la figura de la derecha (cortesa de M. Johri y MaizeGDB).

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6.5.1.47.

Factores TLP

Los factores de transcripcin TLP (Tubby-like proteins) estn presentes en un amplio nmero de organismos multicelulares. En mamferos, la mutacin en estos genes causa una o ms de las siguientes enfermedades: obesidad (de la cual se deriva el nombre de tubby), degeneracin de la retina y prdida auditiva. En plantas, las protenas TLP poseen un dominio tubby y una caja-F. El dominio tubby contiene de 16 a 17 aminocidos y est localizado en la C-terminal. Por su parte, la caja-F es un dominio de 40 a 50 aminocidos en la N-terminal, encontrado por primera vez en la protena ciclina F, y de ah su nombre.En arabidopsis se encuentran 11 genes TLP, 14 en arroz, y 11 en olmo. En arroz, la mayora de los genes OsTLP contienen un dominio tubby en su terminal carboxilo y una caja-F en el dominio amino terminal. La expresin de los 14 genes es inducida por Xanthomonas oryzae pv. oryzae, causante de una de las principales enfermedades de esta gramnea. Ocho de los 14 genes TLP tambin responden a daos por heridas fsicas y todos ellos muestran expresin diferencial en tejidos y etapas de desarrollo de la planta. En el genoma del maz se han predicho 14 genes TLP {Lai, 2004 #140}.

6.5.1.48.

Factores Trihelix/GT

Los factores de transcripcin Trihelix o GT estn involucrados en las respuestas de las plantas a la luz y a su programa de desarrollo. El mutante PETAL LOSS (PTL) del gen GT-2 muestra fenotipos pleiotrpicos incluyendo enanismo, enrrollamiento de las hojas, crecimiento retardado y esterilidad masculina. La expresin constitutiva y ectpica de PTL no pudo restablecer el fenotipo del mutante ptl-D, y fue letal para algunas plantas transgnicas en la etapa de desarrollo del cotiledn, sugiriendo que la expresin precisa del gen PTL, tanto en tiempo como en espacio, es esencial para su propia implementacin funcional durante el desarrollo de la planta. La mutante ptl-D tambin tiene defectos en los mecanismos de accin de auxinas, lo que da lugar al enrrollamiento de las hojas. Tambin se presenta degeneracin de anteras que causan la esterilidad masculina de la flor. En maz se ha identificado solo un gen Trihelix {Brewer, 2004 #78}.

6.5.1.49.

Factores VOZ

Los factores de transcripcin VOZ (Vascular Plant Transcription Factors with a One-Zinc Finger) estn involucrados en el desarrollo del polen en arabidopsis. En maz se han identificado dos genes VOZ. Un elemento en cis especfico del polen de 38 pb que se encuentra en el promotor del gen AVP1 (arabidopsis vacuolar-type H+-pumping pyrophosphatase (V-PPase) 1) est involucrado en la expresin de la V-PPasa en arabidopsis, y dicho gen AVP1 es activado por la unin de los factores AtVOZ1 y ATVOZ2 al elemento en cis mencionado. El gen AtVOZ1 es expresado especficamente en el tejido del floema, en tanto que AtVOZ2 se expresa fuertemente en raz. El gen AtVOZ2 codifica una protena que se une a un dmero con secuencia palindrmica especfica GCGTNx7ACGC.

6.5.1.50.

Factores Whirly

La activacin del gen PR-10a (pathogenesis-related) de inducida por un evocador que requiere de una secuencia de 30 pb en el promotor denominada ERE (elicitor response element) que es unida por el factor nuclear PBF-2 (PR-10a binding factor 2). El factor PBF-2 es almacenado en el ncleo y se hace disponible para unirse al elemento ERE cuando ocurre el estmulo. Esta familia de factores de transcripcin es llamada tipo-PBF-2 o Whirly. La protena StWhy1 de la papa acta como activador transcripcional de genes que contienen el elemento del promotor de genes PB que se une al factor PBF2. El gen AtWhy1, el ortlogo de StWhy1, es inducido por cido saliclico (SA) y es necesario tanto para desarrollar resistencia a patgenos en una va dependiente de SA como para la expresin de un gen que responde a SA y que es inducida por la fitohormona. La protena NPR1, factor de transcripcin asociado a la respuesta, tambin es requerida para activar genes que responden a SA. El gen AtWhy1 es un componente crucial de

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las respuestas de resistencia a las enfermedades en las plantas en una ruta dependiente de SA. Tres genes Whirly se han identificado a la fecha en el genoma de maz {Desveaux, 2004 #99}.

6.5.1.51.

Factores WRKY

La familia de factores de transcripcin WRKY contienen un dominio conservado definido por dos secuencias de aminocidos: el motivo WRKYGQK (de unin a DNA) junto con un dedo de zinc en su extremo N-terminal. Estos factores de transcripcin estn involucrados en la regulacin de varios procesos fisiolgicos nicos en plantas, incluyendo mecanismos de defensa contra patgeno, senescencia y desarrollo de tricomas. En Arabidopsis, el gen WRKY25 codifica una protena que funciona como represor de los mecanismos de defensa mediados por cido saliclico; la sobreexpresin de este gen ocasiona mayor susceptibilidad de la planta a la bacteria Pseudomonas syringae, mientras que las mutantes con inserciones de T-DNA aumentan la tolerancia al patgeno. En arroz, 103 genes codifican factores de transcripcin WRKY. De entre ello, la mayora (77.7%) fueron localizados en regiones duplicadas. Bajo condiciones normales, 65 genes WRKY se expresan diferencialmente en cuanto a abundancia de transcritos o en su patrn de expresin. En condiciones de estrs abitico, (fro, sequa y salinidad), o en tratamientos con fitohormonas, 54 genes WRKY mostraron expresin diferencial en cuanto a abundancia de transcritos y de ellos slo tres se expresaron exclusivamente en condiciones de estrs, mientras que 13 de ellos se expresaron slo en respuesta a aplicaciones de fitohormonas. El resto (28 genes) es regulado por ambos factores estrs y fitohormonas), lo que sugiere que existe una interaccin entre la sealizacin del estrs abitico y de hormonas. En maz se predice la existencia de 13 genes WRKY {Eulgem, 2000 #90; Eulgem, 2000 #103}.

6.5.1.52.

Factores ZIM/TIFY

Recientemente reclasificada como TIFY, la familia de factores ZIM (Zinc-finger protein expressed in Inflorescence Meristem) est involucrada en el desarrollo de la planta. El gen ZIM de Arabidopsis codifica un factor de transcripcin que contiene dedo de zinc tipo-GATA con una secuencia espaciadora entre sus dos juegos de cisteinas conservadas (C-X2-C-X20-C-X2-C). La sobreexpresin del gen ZIM causa mayor elongacin de hipocotilos y peciolos en cualquier longitud de onda y aun en presencia de inhibidores de la sntesis de brasinoesteroides y de giberelinas. En el genoma de maz se han identificado 23 genes ZIM. Recientemente se ha reportado el desarrollo de una plataforma basada en RT-PCR cuantitativo para analizar el perfil de expresin de gran escala en el genoma del arroz ({Caldana, 2007 #81}). Con esta plataforma ha sido posible analizar la expresin de los cerca de 2500 genes que codifican factores de transcripcin en esta especie. Esta tecnologa facilitar el anlisis de estos genes en otras especies, como maz, una vez que se tengan los genomas completamente secuenciados. Tarea 6-4 Lea el siguiente resumen en ingles y describa cules son las principales similitudes y las principales diferencias entre los genes SCARECROW de maz y los de arabidopsis. Discuta cul es la importancia fisiolgica de los genes estudiados? Plant Molecular Biology (2005) 59:619630 Conservation and diversification of SCARECROW in maize. Jun Lim,*, Jee W. Jung, Chae Eun Lim2, Mi-Hyun Lee, Bong Jun Kim Miran Kim, Wesley B. Bruce and Philip N. Benfey
Abstract: The SCARECROW (SCR) gene in Arabidopsis is required for asymmetric cell divisions responsible for ground tissue formation in the root and shoots. Previously, we reported that a Zea may SCARECROW (ZmSCR) is the likely maize ortholog of SCR. Here we describe

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conserved and divergent aspects of ZmSCR. Its ability to complement the Arabidopsis scr mutant phenotype suggests conservation of function, yet its expression pattern during embryogenesis and in the shoot system indicates divergence. ZmSCR expression was detected early during embryogenesis and localized to the endodermal lineage in the root, showing a gradual regionalization of expression. Expression of ZmSCR appeared to be analogous to that of SCR during leaf formation. However, its absence from the maize shoot meristem and its early expresin pattern during embryogenesis suggest a diversification of ZmSCR in the patterning processes in maize. To further investigate the evolutionary relationship of SCR and ZmSCR, we performed a phylogenetic analysis using Arabidopsis, rice and maize SCARECROW-LIKE genes (SCLs). We found SCL23 to be the most closely related to SCR in both eudicots and monocots, suggesting that a gene duplication resulting in SCR and SCL23 predates the divergence of dicots and monocots.

Tareas 6-1. Lea el siguiente artculo y haga un resumen de la metodologa empleada para medir la expresin de genes que codifican factores de transcripcin en arroz. Reflexione sobre la posibilidad de utilizar esta metodologa para maz. Plant Methods (2007), 3:7doi:10.1186/1746-4811-3-7 A quantitative RT-PCR platform for high-throughput expression profiling of 2500 rice transcription factors. Camila Caldana, Wolf-Rdiger Scheible, Bernd Mueller-Roeber and Slobodan Ruzicic The electronic version of this article can be found online at: http://www.plantmethods.com/content/3/1/7
Abstract Quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) has been demonstrated to be particularly suitable for the analysis of weakly expressed genes, such as those encoding transcription factors. Rice (Oryza sativa L.) is an important crop and the most advanced model for monocotyledonous species; its nuclear genome has been sequenced and molecular tools are being developed for functional analyses. However, high-throughput methods for rice research are still limited and a large-scale qRT-PCR platform for gene expression analyses has not been reported

6.6. Resumen
Tarea 6-5 De todos los factores que se estudiaron en este captulo, en una tabla resumen, indique las funciones principales y los procesos que estn relacionados. Indique tambin genes blanco y dominios tpicos que presentan. Haga bsquedas bibliogrficas por su cuenta para actualizar la informacin. Ponga tambin las referencias principales para cada familia. Ejemplo:
Comentario [ATF8]: Ayuden me a completar y a corregir la tabla Algunos genes blanco: Dominios que presentan

TABLA RESUMEN
FAMILIAS DE FACTORES DE TRANSCRIPCIN
Factor Relacionados con procesos como:

TFIIA, TFIIB, TFIIH, TFIID AB13 / VP1 Alfin AP2/

Factores de trascripcin basales. Necesarios para cualquier proceso de transcripcin en el ncleo. Se unen a la RNA Polimerasa II. Desarrollo de la semilla Estrs salino (Tolerancia salinidad) Identidad celular

Todos los genes requieren estos factores para su expresin. Genes inducidos por ABA MsPRP2, inducido por NaCl Genes de respuesta a B1, B2, B3 Dedo de zinc (ZF) AP2

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EREBP ARF

ARID

Estrs bitico y abitico Identidad abaxial crecimiento laminar de rganos laterales Desarrollo embrionario Regulacin gentica del linaje celular Control del ciclo celular Establecimiento del sistema de nervaduras (A. thaliana). Embriognesis (maz) Crecimiento de parte area y raz (A. thaliana)

deshidratacin, entre otros Genes que responden a auxinas DBD Terminal) CTD (N

Dominio de interaccin rico en AT (ARID) Cierre leucina Genes de respuesta a auxinas genes con motivos (GA)8 y (GA/TC)8 Genes regulados por brasinoesteroides de

AS2 / LOB AUX / IAA BBR-BCP BES1 bHLH bZIP

Dominios I, II, III, IV

C2C2-CO

Proliferacin celular Establecimiento del linaje celular Sealizacin por cido saliclico (SA) Identidad de rganos florales (tabaco) Reloj circadiano Tiempo de la floracin Actividad meristemtica Mecanismos de defensa germinacin de semillas Respuesta a estmulos de luz (Arabidopsis) Desarrollo de rganos laterales Tolerancia al estrs Procesamiento de RNA (animales) Estrs bitico y abitico (Arabidopsis y arroz) Estrs abitico (sequa) Divisin celular Desarrollo de tejidos reproductivos ciclo celular Crecimiento Respuesta a estrs Ciclo celular crecimiento procesamiento de rRNA

bHLH Genes inducibles por SA Genes de zena (maz) Genes relacionados con la floracin Genes de fotoperodo Genes de metabolismo de carbohidratos regulados por luz Genes de respuesta a auxinas ZF y dominio CCT (arabidopsis) ZF

C2C2-Dof C2C2GATA C2C2YABBY C2H2-ZPT2 C3H /CCCH CCAAT CPP E2F-DP EIN / EIL FHA GARPARR-B GARP-G2

ZF ZF y dominio YABBY genes de otros factores de transcripcin ZF ZF CXC

genes del ciclo celular Genes que responden a etileno FH (cabeza de tenedor) FHA Genes que responden a citocininas Myb

Desarrollo de cloroplastos?

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GeBP GIF GRAS GRF HB HMG Factor HSF JUMONJI LIM LUG MADS

Desarrollo de tricomas Desarrollo y crecimiento de hojas (arabidopsis) Distribucin radial de races y tallos Crecimiento activo de algunos tejidos Destino celular Desarrollo Regulacin de la transcripcin Relacionados con procesos como: Estrs trmico Regulacin de la floracin Transcripcin Organizacin del citoesqueleto

Gen GLABROUS1

HB Algunos Genes Blanco son Genes de protenas de choque trmico (hsp) genes regulados por brasinoesteroides Genes hometicos Caja HMG Dominios que presentan DBD OD

Identidad de rganos florales

MADS De intervencin (I) De queratina (K) CTerminal (C) y genes involucrados en la sntesis de flavonoides NAC DBD genes controlados por disponibilidad de nitrgeno Genes hometicos ZF Cys4His Cys3 pra2 (GTPasa, petE (plastocianina) gen rps1 (inducido por luz) Caja SBP bHLP Tubby Caja F MYB

MBF1 MYB MYBrelated NAC Nin PcG PHD

Coactivadores Control de proliferacin diferenciacin celular Biosntesis de flavonoides Estrs bitico y abitico Defensa contra patgenos Formacin de ndulos

Silenciamiento de los genes blanco Control durante el proceso de meiosis Desarrollo de rganos reproductivos y sexuales Respuestas a la luz Crecimiento Desarrollo Evolucin de caracteres morfolgicos Divisin celular Respuesta estrs bitico Respuestas a la luz Desarrollo Desarrollo de polen (arabidopsis) Resistencia a patgenos

PlATZ SIF SPL TCP TLP Trihelix/GT VOZ Whirly

Genes de defensa

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WRKY ZIM / TIFY

Defensa a patgenos senescencia desarrollo de tricomas Desarrollo de la planta

Genes de respuesta a SA

WRKYGQK ZF

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7. Herramientas Bioinformticas
7.1. Qu es la bioinformtica?
Tal vez no se pueda dar una sola definicin de bioinformtica, ya que la percepcin de ella depende mucho de los tipos de usuarios. Por un lado estn los bilogos que usan la bioinformtica solo como algo accesorio, es decir, como un conjunto de herramientas para contestar preguntas biolgicas. Mientras que por otro lado estn los informticos, programadores y estadistas para los cuales la bioinformtica per se, es el tema central de su trabajo. Para algunos, la bioinformtica es solo un medio, ms no un fin, mientras que para otros, la bioinformtica se justifica como una disciplina cientfica emergente con una meta propia. Algunos consideran que la bioinformtica utiliza la tecnologa de la informacin para organizar, analizar y distribuir informacin biolgica con la finalidad de responder preguntas complejas en biologa. Esto incluye la coleccin, organizacin, almacenamiento y recuperacin de informacin en bases de datos. Otros consideran que la bioinformtica es un rea propia de investigacin multidisciplinaria, la cual puede ser ampliamente definida como la interfase entre dos ciencias: Biologa y Computacin. Involucra la solucin de problemas complejos usando herramientas de sistemas y computacin. Segn la definicin del NCBI (2001); la bioinformtica es un campo de la ciencia en el cual confluyen varias disciplinas tales como: biologa, computacin y tecnologa de la informacin. El fin ltimo de este campo es facilitar el descubrimiento de nuevas ideas biolgicas, as como crear perspectivas globales a partir de las cuales se puedan discernir principios unificadores en biologa. Aparte de las definiciones formales de organismos o instituciones de referencia, los manuales de esta materia aportan sus propias definiciones operativas, lgicamente vinculadas en mayor o menor medida con las ya mencionadas. En otras palabras, cada quien define los trminos segn su propio inters o su rea de trabajo. Dentro de este libro de texto, vamos a definir algunos trminos de la siguiente forma: Bioinformtica: Es un trmino difuso que enmarca de manera global todas las actividades, en donde la realizacin del experimento no es el elemento central, sino ms bien, el anlisis de datos y la interpretacin de la informacin de origen biolgico. Los bioinformticos: Hacen investigacin, desarrollo o aplicacin de herramientas computacionales y aproximaciones para la expansin del uso de datos biolgicos, genmicos, bioqumicos, agronmicos, mdicos o de salud, incluyendo aquellas herramientas que sirvan para adquirir, almacenar, organizar, analizar o visualizar tales datos. Biologa computacional: Es el desarrollo y aplicacin de mtodos tericos y de anlisis de datos, modelado matemtico, estadstica y tcnicas de simulacin computacional al estudio de sistemas biolgicos, bioqumicos, agronmicos, conductuales y sociales. Biocomputacin: Es la construccin y uso de computadores que contienen componentes biolgicos o funcionan como organismos vivos. Esto incluye a las redes neuronales, los sistemas cibernticos y la inteligencia artificial. La bioestadstica: Es una serie de herramientas matemticas que sirven para entender, interpretar y resumir mejor los datos a pesar de la grandsima influencia del azar en los sistemas biolgicos. Las pruebas de bioestadstica nos

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dan una idea cuantitativa de la probabilidad de que el azar es la causa principal de nuestros resultados. La bioestadstica tambin tiene la finalidad de ahorrarle recursos a los experimentadores para obtener ms datos confiables con menos repeticiones y experimentos. Bajo estas definiciones, la bioinformtica tiene ms que ver con la informacin, mientras que la biologa computacional lo hara con las hiptesis, y la bioestadstica con el azar. Por otra parte, el trmino biocomputacin suele enmarcarse en las actuales investigaciones con biocomputadores, es decir los dispositivos cibernticos que usan principios biolgicos u orgnicos para almacenar o procesar informacin. Durante los inicios de la genmica el concepto de bioinformtica se refera slo a la creacin y mantenimiento de bases de datos donde se almacenaba secuencias de nucletidos y aminocidos. El desarrollo de este tipo de base de datos no solamente significaba el diseo de las mismas, sino tambin el desarrollo de interfaces complejas donde los investigadores pudieran acceder los datos existentes, y suministrar o revisar datos por medio de la web. Toda esa informacin debe ser combinada para formar una idea lgica y razonable, de tal manera, que los investigadores pudieran estudiar cmo estas actividades se vean alteradas en estados de una enfermedad o en dependencia de un factor ambiental. De all viene el surgimiento de nuevos campos de la bioinformtica. El desarrollo de nuevos algoritmos (frmulas matemticas) y estadsticos, con los cuales se pueda relacionar partes de un conjunto enorme de datos, como por ejemplo, mtodos heursticos para localizar un gen dentro de una secuencia, predecir estructura o funcin de protenas, y poder agrupar secuencias de protenas en familias relacionadas. Por ahora el campo ms popular es el anlisis e interpretacin de secuencias de nucletidos y aminocidos, dominios de protenas y estructuras de protenas. Los principales esfuerzos de investigacin en estos campos incluyen el alineamiento de secuencias, la prediccin de genes, montaje del genoma, alineamiento estructural de protenas, prediccin de estructura de protenas, prediccin de la expresin gnica, interacciones protena-protena, y modelado de la evolucin. Los trminos bioinformtica, biologa computacional y biocomputacin son utilizados en muchas ocasiones como sinnimos. En realidad hacen referencia a campos de estudios interdisciplinarios muy vinculados, que requieren el uso o el desarrollo de diferentes tcnicas que incluyen informtica, matemtica aplicada, estadstica, ciencias de la computacin, inteligencia artificial, qumica y bioqumica, para solucionar problemas, analizar datos, o simular sistemas o mecanismos, todos ellos de ndole biolgica, y usualmente (pero no de forma exclusiva) en el nivel molecular. El meollo principal de estas tcnicas se encuentra en la utilizacin de recursos computacionales para solucionar o investigar problemas sobre escalas de tal magnitud que sobrepasan el discernimiento humano. La investigacin en biologa computacional se solapa a menudo con la biologa de sistemas. Una constante en proyectos de bioinformtica y biologa computacional es el uso de herramientas matemticas para extraer informacin til de datos producidos por tcnicas biolgicas de alta productividad, como la secuenciacin del genoma. Un problema comn en bioinformtica es el montaje o ensamblado de secuencias genmicas de alta calidad desde fragmentos mas o menos cortos obtenidos tras la secuenciacin del DNA a gran escala. Otros problemas comunes incluyen el estudio de la regulacin gnica para interpretar patrones de expresin gnica utilizando datos de microarreglos de cDNA o de oligonucletidos. Principales reas de investigacin: Anlisis de secuencias Anotacin automtica de genomas Genmica comparativa y ortologa

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Biologa evolutiva computacional Medicin de la biodiversidad Anlisis de la expresin gnica Anlisis de la regulacin Anlisis de la expresin de protenas Anlisis de la interaccin entre protenas Determinacin de la estructura de las protenas Prediccin del plegamiento de protenas Acoplamiento protena-protena Anlisis de mutaciones en el cncer Modelado de sistemas biolgicos Simulacin de rutas y redes metablicas Anlisis de imagen de alto rendimiento Herramientas de software Anlisis estadstico de datos

7.2. Anlisis de secuencias

7.2.1. BLAST
El Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) es un programa informtico de alineamiento basado en similitudes de tipo local. Las secuencias alineadas pueden ser de DNA o de protenas. El programa es capaz de comparar una secuencia problema (comnmente llamada query) contra una gran cantidad de secuencias que se encuentren en diversas bases de datos. El algoritmo encuentra las secuencias que tienen mayor parecido a la secuencia query y las alinea. Es importante mencionar que BLAST usa un algoritmo heurstico, por lo que no nos puede garantizar que ha encontrado la solucin correcta. Sin embargo, BLAST es capaz de calcular una probabilidad de error de que el alineamiento se deba meramente al azar. Por lo que el E value (valor E), es un parmetro estadstico que nos permite juzgar el grado de significancia de los resultados que se obtienen. El E value depende del nmero de identidades de nuestro query (hits perfectos) pero tambin del nmero de secuencias en las bases de datos analizadas. Normalmente el BLAST es usado para encontrar genes que tengan similitudes con nuestra secuencia en cuestin. Por lo general, cuando una nueva secuencia es obtenida, se usa el BLAST para compararla con otras secuencias que han sido previamente caracterizadas, para as poder inferir su funcin. La prediccin de funcin en base a similitud es el paradigma central de la bioinformtica, y por consiguiente, el BLAST es uno de los pilares de la genmica. El BLAST es la herramienta ms usada para la anotacin y prediccin funcional de genes o secuencias proteicas. BLAST fue desarrollado por los Institutos Nacionales de Salud del gobierno de EE. UU., por lo que es de dominio pblico y puede usarse gratuitamente a travs de un servidor del Centro Nacional para la Informacin Biotecnolgica (NCBI).

http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
El programa BLAST tambin puede ser instalado en una computadora personal para buscar secuencias en bases de datos de manera local. Algunas ventajas de usar el servidor del NCBI son que el usuario no tiene que mantener ni actualizar las bases de datos y que la bsqueda se hace en un cluster de computadoras, lo que otorga rapidez. Las desventajas son: no se permite hacer bsquedas masivas dado que es un recurso compartido, no se puede personalizar las

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bases de datos contra la que busca el programa y las secuencias son enviadas al servidor del NCBI sin ningn tipo de cifrado, lo que puede ser un problema para quienes quieran mantener sus secuencias privadas. La aplicacin local de BLAST tiene la ventaja de que permite manejar varios parmetros que en las bsquedas de NCBI estn estandarizados, por lo que provee una mayor flexibilidad para los usuarios avanzados.

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Consideraciones al usar BLAST: A pesar de que BLAST es un programa muy poderoso y casi siempre podemos confiar en sus resultados, se debe recordar que el programa es heurstico, y por lo tanto puede que no encuentre la solucin ptima. En la actualidad, el abuso y la pobre interpretacin de los resultados de BLAST ha llevado a mltiples errores de anotacin. Una cosa a tener en cuenta al usar BLAST es que, cuanta ms evidencia externa se pueda obtener para corroborar un alineamiento (fisiolgica, filogentica, gentica, etc.) es mejor. El programa de BLAST NO garantiza que las secuencias que alinea son homlogas y mucho menos que tengan la misma funcin (en el caso que sean protenas), simplemente provee posibles candidatos. Se necesitan ms anlisis para anotar correctamente una secuencia. La puntuacin BLAST depende del largo de la secuencia, una secuencia muy corta tendr una puntuacin menor que una grande, simplemente por la cantidad de bases que tiene. As que siempre se debe interpretar la puntuacin con respecto al largo de la secuencia. El e-value depende del tamao de la base de datos. Para bases de datos muy pequeas, e-values altos son menos significativos que para bases de datos muy grandes. Para la base de datos NCBI por lo general e-values de 0.01 o menos son considerados como significativos, pero esto puede depender de la secuencia que se est analizando. Se debe tener cuidado con los errores de anotacin, es comn que alguna secuencia que se anot mal (ya sea porque se hizo automtica o por error humano) sea utilizada como referencia para anotar otras secuencias similares, por lo que los errores de anotacin se pueden propagar rpidamente. Siempre debemos especificar que la

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funcin de nuestra secuencia es posible o probable si fue asignada usando identidad con otras secuencias. Asimismo debemos tener en cuenta que la gran mayora de las funciones asignadas en la actualidad son putativas y que pueden no ser una buena referencia para una asignacin funcional. A pesar de lo que comnmente se piensa, las secuencias con la mejor puntuacin o el mejor e-value NO necesariamente es la mejor opcin para la anotacin funcional de un gen. Es importante analizar todos los alineamientos que encuentra el programa y sacar conclusiones en base al resultado global. BLAST tiene varios parmetros por defecto que en general funcionan bien para la mayora de los casos, pero habr situaciones en las que es necesario cambiarlos para obtener mejores resultados. No hay forma de saber exactamente qu parmetro es el ptimo, se tienen que realizar mltiples pruebas hasta encontrar las mejores condiciones.

Tarea 7-17-1 Haga una bsqueda en la base de datos del NCBI y averige mediante la herramienta BLAST, a que protena corresponde la siguiente secuencia: GRDKVPSSGSKMPRTVIALDGGLYEHYKKFSSCVEATLT Obtenga la secuencia completa de esa protena. Tradzcala a su secuencia nucleotdica. Respuesta: Para responder primero debes saber a que base de datos se refiere. La podrs encontrar en la pgina: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez.Una vez ah busca en la barra de la izquierda la herramienta BLAST y brela. Como la secuencia que tienes es de aminocidos usa la herramienta protein blast. Cuando la abras te pedir que introduzcas la secuencia que quieres buscar y te la pide en formato FASTA. Este formato es un formato de fichero informtico basado en texto, utilizado para representar secuencias bien de cidos nucleicos, bien de pptido, y en el que los pares de base o los aminocidos se representan usando cdigos de una nica letra. El formato tambin permite incluir nombres de secuencias y comentarios que preceden a las secuencias en si. Esto significa que metas la secuencia de aminocidos sin espacios y sin puntos y comas, solo letras. Una manera es copiar del problema la secuencia y pegarla en la ventana. Una vez que hayas hecho esto oprime la instruccin BLAST, casi al final de esta ventana. Los resultados aparecern en unos segundos, dependiendo de la red. Obtendrs una tabla con las secuencias que tienen un alineamiento significativo, es decir secuencias que se parecen a la que acabas de meter, y estn ordenadas de las ms parecidas a las que menos se parecen. El primer resultado es la hexocinasa de maz Hexocinasa de maz (zea mays) Secuencia completa: 1 mvkavvvgaa vvacaavgva avlvhrrrrr daallgsaea errrraaavi eeverslatp 61 tallrgiada mvaemerglr gdihaqlkml isyvdnlptg dehglfyald lggtnfrvlr 121 vqlggrekrv vkqqyeevsi pphlmvgtsm elfdfiaaal akfvgteged fqlpegrqre 181 lgftfsfpvn qtsissgtli kwtkgfsing tvgedvvsel sramerqgld mkatalvndt 241 vgtlaggrym dtdvvaavil gtgtnaayve hanaipkwtg llpksgkmvi ntewgsfksn 301 klplseydka mdfeslnpge qiyekmisgm ylgeivrril lklahdaslf gdvvptkleq 361 pfilrtpdms amhhdsshdl ktlgsklkdi vgvadtslev ryitrhicdl vaergarlaa 421 agiysilkki grdkvpssgs kmprtviald gglyehykkf sscveatltd llgeeasssv 481 vaklandgsg igaallaash sqygasd

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7.3. Bases de datos

7.3.1. Genbank y el NCBI
El National Center for Biotechnology Information (NCBI) es parte de la National Library of Medicine (NLM), una rama de los National Institutes of Health (NIH). Est localizado en Bethesda, Maryland, en Estados Unidos. Fue fundado el 4 de noviembre de 1988 con la misin de ser una importante fuente de informacin en biologa molecular. Almacena y constantemente actualiza la informacin referente a secuencias genmicas en GenBank. En PubMed se maneja un ndice de artculos cientficos referentes a biomedicina, biotecnologa, bioqumica, gentica y genmica, una recopilacin de enfermedades genticas humanas, adems de otros datos biotecnolgicos de relevancia. Todas las bases de datos del NCBI estn disponibles en lnea de manera gratuita.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov

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Figura 7-1. Pgina principal del NCBI El NCBI ofrece adems, algunas herramientas bioinformticas para el anlisis de secuencias de ADN, ARN y protenas, siendo BLAST una de las ms usadas. GenBank se coordina con otras bases de datos como la del instituto europeo de bioinformtica (http://www.ebi.ac.uk) y la base de datos de DNA de Japn (http://www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome.html.en). Otra instituto importante que alberga varias bases de datos nucleotdicas es el instituto de investigacin genmica (The Institute for Genomic Research o TIGR) que ahora ha sido absorbido por un consorcio liderado por Craig Venter.

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http://www.tigr.org

Figura 7-2. Pgina principal de TIGR

7.3.2.

Maize GDB

La pgina de Maize GDB es la base de datos ms completa y ms til para los investigadores con un inters en fitomejoramiento. En MaizeGDB se pueden encontrar los resultados de proyectos de mapeo, QTLs e informacin genotpica y fenotpica sobre diversas poblaciones de maz. Actualmente existen varios mapas genticos disponibles para maz, entre ellos La lnea B73 es una lnea progenitora de varios hbridos que tuvieron bastante distribucin agrcola y comercial en Estados Unidos. El hibrido B73xMo17 dio a lugar un set de lneas recombinantes (Recombinant Inbred Lines o RILs) que se conocen en el medio cientfico como poblacin IBM (intermated B73xMo RIL population) y se usa mucho para proyectos de mapeo gentico. Con referencia a las bases de datos de maz, se puede recomendar el siguiente link:

http://www.maizegdb.org

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Figura 7-3. Pgina inicial de MaizeGDB

7.3.3.

Maize Gene Index

Actualmente se han secuenciado de manera masiva dos genotipos de maz. En las bases de datos pblicas de USA y Europa se usa el genotipo B73, que es una lnea homocigtica para climas templados. Por otro lado, en CINVESTAV Irapuato se secuenciaron las islas de genes (regiones hipometiladas) de una mezcla de DNA de varios individuos de una poblacin criolla de maz mexicano (el maz palomero cnico toluqueo, un genotipo del CIMMYT llamado Mexi-5). Sin embargo, el genoma de maz palomero todava no se ha ensamblado ni anotado totalmente, por lo que por el momento existe mucho ms informacin pblica para el maz B73. Por ejemplo, ya se conocen casi la totalidad de los genes de B73, que son como 56 mil secuencias consenso tentativas.

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Con referencia al genotipo maz B73, las bases de datos con ms informacin nucleotdica, incluyendo una lista casi completa de los genes de maz (Maize Gene Index) se pueden consultar en los siguientes links: http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/cgi-bin/tgi/gimain.pl?gudb=maize

http://www.maizegenome.org http://maize.tigr.org

Figura 7-4. Pgina inicial de TIGR maz.

7.3.4.

CIMMYT

Una de las instituciones lderes de mejoramiento de maz es el CIMMYT. A diferencia de las compaas comerciales, el CIMMYT trabaja para el mbito pblico y se enfoca ms bien a los

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agricultores de los lugares ms marginados. Su pgina web contiene informacin sobre los diversos proyectos que se desarrollan tanto en Mxico como en frica y otras partes del mundo. En los vnculos tambin se puede encontrar un formulario para pedir semilla del banco de germoplasma del CIMMYT.

http://www.cimmyt.org

7.3.5.

IRRI
http://www.irri.org

La institucin lder para el mejoramiento de arroz es el IRRI, que esta en las Filipinas.

Un sitio con informacin interesante sobre mejoramiento gentico es el Cereal Knowledgebank, que es una base de datos conjunta entre el CIMMYT y el IRRI. Incluye informacin sobre los 3 cereales ms importantes del mundo: maz, trigo y arroz.

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Tarea 7-2 Visite la siguiente pgina y averige ms sobre las metodologas de mejoramiento que se usan en diferentes cereales. http://www.knowledgebank.irri.org/

7.4. Paquetes de Software

7.4.1. Fieldbook para maz
Fieldbook, es un programa que desarrollaron los investigadores del CIMMYT para el manejo de inventarios, ensayos y viveros de maz. En esencia, es una serie de archivos y documentos maestros de Excel que se manipulan con algunos macros escritos en visual basic. Se definen archivos maestros de Excel (templates) que se usan; para la preparacin de la semilla (SeedPrep), la impresin de los sobres, y para la preparacin de los libros de campo (trials or nurseries). Tambin se pueden hacer resmenes de ciclos (SeasonSummary), as como envos de semillas (SeedShipment). En los archivos Excel se introducen los datos fenotpicos, tanto de los ensayos como de los viveros. Con ayuda del programa se pueden hacer los clculos de rendimiento y los anlisis estadsticos para compensar la variabilidad de campo. Para ello se exportan los datos para ser analizados por un programa estadstico llamado REML que a su vez regresa los resultados en el mismo formato de Excel. En resumen, es un paquete de macros y archivos de Excel, que le ayudan a un investigador a tener un programa de fitomejoramiento organizado y coherente. El programa puede ser descargado gratuitamente en los siguientes dos sitios:

http://www.cimmyt.org/dtma/mFinder/fb8.4.7.zip

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ftp://ftp.cgiar.org/cimmyt/FIELDBOOK/FIELDBOOK

7.4.2.

Alternativas gratuitas de software

Muchos estudiantes no tienen recursos para comprar software comercial, o no quieren usarlos para ello, y es por eso que recurren al copiado ilegal de programas. Las personas honestas, respetuosas y comprometidas con la innovacin cientfica no deberan desacreditar el valor de la propiedad intelectual. Las empresas invierten mucho dinero en investigacin y desarrollo merecen una retribucin econmica por ello. Piratear programas de software con copyright restringido es como robarle patentes a otras empresas, o copiarle la tesis a un compaero. Por qu hacerlo si no hay necesidad? Hoy en da existen alternativas muy atractivas de software gratuito bajo un esquema de licenciamiento GPL.

7.4.2.1.

Sistema operativo Ubuntu

Uno de los sistemas operativos con ms crecimiento en los ltimos aos es Ubuntu. Adems de que es gratuito y de cdigo libre, corre mucho ms rpido que Windows Vista, y por si fuera poco, no tiene problemas de virus o de spyware. Instale Ubuntu en su computadora y prubelo. El sistema Ubuntu se puede descargar del siguiente sitio:

http://www.ubuntu.com/

Cuando aprenda ms de los nuevos sistemas Linux, ver que existe un sinnmero de programas disponibles y que puede hacer todo lo que haca antes en Windows, con programas gratuitos, flexibles y poderosos. Hay ms herramientas bioinformticas disponibles en Linux que en los otros sistemas operativos (Windows y Mac). Si quiere incursionar ms a fondo en la bioinformtica y el cmputo biolgico avanzado, no hay mejor forma que aprendiendo a manejar Ubuntu y usar los programas tipo Linux.

7.4.2.2.

Open Office

Cuanto cuesta la licencia para tener instalado de manera legal el paquete de Microsoft Office en su computadora? Los que no tienen dinero para pagarla, en lugar de usar una copia pirata, pueden probar una alternativa diferente. Una de las mejores es el OpenOffice. Tanto en Ubuntu como en Windows el paquete de Open Office puede ser usado para manejar archivos Word, Excel y PowerPoint. Descargue el Open Office de forma gratuita del siguiente link:

http://es.openoffice.org/

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Figura 7-5. Ventanas de programas de OpenOffice

7.4.2.3.

Emboss

EMBOSS is "The European Molecular Biology Open Software Suite". EMBOSS is a free Open Source software analysis package specially developed for the needs of the molecular biology user community. The software automatically copes with data in a variety of formats and even allows transparent retrieval of sequence data from the web. Extensive libraries are provided with the package. It is a platform that allows other scientists to develop and release software in true open source spirit. EMBOSS also integrates a range of sequence analysis tools into a seamless whole. EMBOSS breaks the historical trend towards commercial software packages.

http://emboss.sourceforge.net/
7.4.2.4. Sequence Manipulation Suite

El Sequence Manipulation Suite (SMS) es una coleccin de programas de JavaScript para generar, formatear y analizar secuencias de DNA y protenas. Es un paquete gratuito basado en una serie de pginas web que puede correr de manera local en cualquier buscador (navegador) como Explorer o Firefox. Para probar y descargar el SMS consulte la pgina oficial:

http://www.bioinformatics.org/sms2/

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El SMS tiene una serie de funciones. La siguiente lista muestra algunos ejemplos de las funciones de este paquete que es gratuito y fcil de usar.
Format Conversion: GenBank to FASTA - accepts one or more GenBank files as input and returns the entire DNA sequence from each in FASTA format. Use this program when you wish to quickly remove all of the non-DNA sequence information from a GenBank file. One to Three - converts single letter translations to three letter translations. Reverse Complement - converts a DNA sequence into its reverse, complement, or reverse-complement counterpart. The entire IUPAC DNA alphabet is supported, and the case of each input sequence character is maintained. You may want to work with the reverse-complement of a sequence if it contains an ORF on the reverse strand. Sequence Analysis: Codon Plot - accepts a DNA sequence and generates a graphical plot consisting of a horizontal bar for each codon. The length of the bar is proportional to the frequency of the codon in the codon frequency table you enter. Use Codon Plot to find portions of DNA sequence that may be poorly expressed, or to view a graphic representation of a codon usage table (by using a DNA sequence consisting of one of each codon type). DNA Molecular Weight - accepts one or more DNA sequences and calculates molecular weight. Sequences can be treated as double-stranded or single-stranded, and as linear or circular. Use DNA Molecular Weight when calculating molecule copy number. DNA Pattern Find - accepts one or more sequences along with a search pattern and returns the number and positions of sites that match the pattern. The search pattern is written as a JavaScript regular expression, which resembles the regular expressions written in other programming languages, such as Perl. DNA Stats - returns the number of occurrences of each residue in the sequence you enter. Percentage totals are also given for each residue, and for certain groups of residues, allowing you to quickly compare the results obtained for different sequences. Fuzzy Search DNA - accepts a DNA sequence along with a query sequence and returns sites that are identical or similar to the query. You can use this program, for example, to find sequences that can be easily mutated into a useful restriction site.

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Mutate for Digest - accepts a DNA sequence as input and searches for regions that can easily be mutated to create a restriction site of interest. The program also reports protein translations so that you can see which reading frames are altered by the proposed mutations. Use Mutate for Digest to find sequences that can be converted to a useful restriction site using PCR or site-directed mutagenesis. Multi Rev Trans - accepts a protein alignment and uses a codon usage table to generate a degenerate DNA coding sequence. The program also returns a graph that can be used to find regions of minimal degeneracy at the nucleotide level. Use Multi Rev Trans when designing PCR primers to anneal to an unsequenced coding sequence from a related species. ORF Finder - searches for open reading frames (ORFs) in the DNA sequence you enter. The program returns the range of each ORF, along with its protein translation. ORF Finder supports the entire IUPAC alphabet and several genetic codes. Use ORF Finder to search newly sequenced DNA for potential protein encoding segments. Pairwise Align DNA - accepts two DNA sequences and determines the optimal global alignment. Use Pairwise Align DNA to look for conserved sequence regions. PCR Primer Stats - accepts a list of PCR primer sequences and returns a report describing the properties of each primer, including melting temperature, percent GC content, and PCR suitability. Use PCR Primer Stats to evaluate potential PCR primers. PCR Products - accepts one or more DNA sequence templates and two primer sequences. The program searches for perfectly matching primer annealing sites that can generate a PCR product. Any resulting products are sorted by size, and they are given a title specifying their length, their position in the original sequence, and the primers that produced them. You can use linear or circular molecules as the template. Use PCR Products to determine the product sizes you can expect to see when you perform PCR in the lab. Protein GRAVY - Protein GRAVY returns the GRAVY (grand average of hydropathy) value for the protein sequences you enter. The GRAVY value is calculated by adding the hydropathy value for each residue and dividing by the length of the sequence (Kyte and Doolittle; 1982). Protein Isoelectric Point - calculates the theoretical pI (isoelectric point) for the protein sequence you enter. Use Protein Isoelectric Point when you want to know approximately where on a 2-D gel a particular protein will be found. Protein Molecular Weight - accepts one or more protein sequences and calculates molecular weight. You can append copies of commonly used epitopes and fusion proteins using the supplied list. Use Protein Molecular Weight when you wish to predict the location of a protein of interest on a gel in relation to a set of protein standards. Protein Stats - returns the number of occurrences of each residue in the sequence you enter. Percentage totals are also given for each residue, and for certain groups of residues, allowing you to quickly compare the results obtained for different sequences. Restriction Digest - cleaves a DNA sequence in a virtual restriction digest, with one, two, or three restriction enzymes. The resulting fragments are sorted by size, and they are given a title specifying their length, their position in the original sequence, and the enzyme sites that produced them. You can digest linear or circular molecules, and even a mixture of molecules (by entering more than one sequence in FASTA format). Use Restriction Digest to determine the fragment sizes you will see when you perform a digest in the lab. Restriction Summary - accepts a DNA sequence and returns the number and positions of commonly used restriction endonuclease cut sites. Use this program if you wish to quickly determine whether or not an enzyme cuts a particular segment of DNA. Reverse Translate - accepts a protein sequence as input and uses a codon usage table to generate a DNA sequence representing the most likely non-degenerate coding sequence. A consensus sequence derived from all the possible codons for each amino acid is also returned. Use Reverse Translate when designing PCR primers to anneal to an unsequenced coding sequence from a related species. Translate - accepts a DNA sequence and converts it into a protein in the reading frame you specify. Translate supports the entire IUPAC alphabet and several genetic codes.

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8. Herramientas Estadsticas
8.1. Conceptos bsicos de estadstica
8.1.1. Para que sirve la estadstica?
Para poder calcular algo en estadstica, lo ms importante es tener suficientes repeticiones. El mantra de los experimentos biolgicos es: siempre incluir repeticiones y controles. De preferencia, hacer las ms repeticiones posibles. El principal problema de los experimentos agronmicos para mejoramiento gentico, es que no se hacen suficientes repeticiones para tener mayor certeza de los resultados. En un mundo ideal para un fitomejorador, sera deseable tener 5 repeticiones de un mismo genotipo sembradas en 50 diferentes localidades. En el mundo real muchas veces no se pueden hacer tantas repeticiones por cuestiones de espacio, costo, esfuerzo o de tiempo. Por ejemplo, a veces solo se hacen 2 repeticiones por localidad, y muchas veces solo se siembran menos de 5 localidades diferentes. Algunas veces no se tiene suficiente semilla para evaluarla en tantos ensayos, otras veces simplemente no se tienen las facilidades o el dinero. La estadstica se puede usar para resolver este problema de limitacin de recursos. Se podra decir que es un conjunto de herramientas matemticas que permiten sacar el mayor provecho con el menor esfuerzo experimental posible. Es decir, la bioestadstica permite llegar a una conclusin lo ms robusta posible, con el nmero limitado de repeticiones que tiene uno disponibles. La ventaja de la estadstica es que calcula un resultado y al mismo tiempo da un valor sobre la confiabilidad de ese resultado en trminos probabilsticos. A esto se le llama niveles de confianza, y se les clasifica en errores del tipo alfa () y beta (). Para entender ms a fondo la estadstica, es necesario repasar algunos de sus fundamentos y conceptos bsicos.

8.1.2.

Medidas centrales

Con una serie de datos relativamente grande uno puede calcular las medidas centrales como el promedio, la mediana y la moda. En un conjunto de valores, por lo regular, el valor promedio es el ms importante. Al promedio tambin se le llama media aritmtica. Esta medida no se debe confundir con la mediana que es el valor central de un conjunto de nmeros. La mediana es el nmero que se encuentra en medio, es decir, la mitad de los nmeros es mayor que la mediana y la otra mitad es menor. La moda es el valor que se repite con mayor frecuencia. Ninguna de estas medidas de tendencia central tomada individualmente proporciona una imagen completa de los datos. Supongamos que los datos estn agrupados en tres reas, en una hay un valor bajo que se repite mucho; en la otra, hay muchos valores promedios y en el otro tercio hay valores ms extremos, pero cada vez menos frecuentes. Tanto PROMEDIO como MEDIANA devolvern un valor situado en una zona central, y MODA devolver el valor bajo dominante. (Ver Figura 8-1) Lo que hay que recordar es que cuando la distribucin de los datos es compleja, los valores de media, mediana y moda darn valores muy diferentes (ver Figura 8-1), mientras que con una distribucin normal, los valores sern muy parecidos (ver Figura 8-2).

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Histograma de Datos
Moda: 0.2 Mediana: 0.80 Promedio: 0.96

12 10

Frecuencia

8 6 4 2 0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 2.2 2.4 2.6 2.8 3 3.2

Categora

Figura 8-1. Ejemplo de histograma de datos con una distribucin compleja. Se puede ver, que los valores del promedio, la mediana y la moda son diferentes uno del otro.
Histograma de Datos
Moda: 1.51

60 50 Frecuencia 40 30 20 10 0 1.44 1.46 1.48 1.5

Mediana: 1.510 Promedio: 1.514

1.52

1.54

1.56

1.58

1.6

1.62

Categora

Figura 8-2. Ejemplo de histograma de datos con una distribucin seminormal. En este caso los valores del promedio, la mediana y la moda son muy parecidos.

8.1.3.

Desviacin estndar y distribucin normal

Cuando se tiene una serie de datos con sus respectivas repeticiones, primero se calcula el promedio. Esto se hace con la simple formula de sumar todos los valores y dividirlo entre el nmero de mediciones. Sin embargo, el promedio no dice nada sobre la repetibilidad y por eso es necesario hacer ms clculos para reducir la variabilidad de los datos. La desviacin estndar (SD) es una medida de dispersin para variables numricas (variables de intervalo). El concepto es de gran utilidad en la estadstica descriptiva. La desviacin estndar (smbolo sigma, ) informa sobre el promedio de las distancias que tienen los datos respecto de su media

208

aritmtica, expresada en las mismas unidades que la variable. El trmino desviacin estndar fue incorporado a la estadstica por Karl Pearson en 1894.

Figura 8-3. Distribucin normal mostrando el porcentaje de valores que hay dentro de cada rango. La distribucin normal es una curva estandarizada que est basada en la frmula de Gauss.

Para conocer con detalle un conjunto de datos, no basta con conocer las medidas de tendencia central, sino que necesitamos conocer tambin la desviacin que representan los datos en su distribucin respecto de la media aritmtica de dicha distribucin. El objetivo es tener una visin de los mismos ms acorde con la realidad a la hora de describirlos e interpretarlos para la toma de decisiones. A esto se le llama prueba de hiptesis. La varianza representa la media aritmtica de las desviaciones con respecto a la media, elevadas al cuadrado. Si atendemos a la coleccin completa de datos (la poblacin en su totalidad) podemos obtener la varianza poblacional; y si por el contrario prestamos atencin slo a una muestra de la poblacin, obtenemos en su lugar la varianza muestral. En la rutina de los investigadores casi siempre se usan las medias y varianzas muestrales, casi nunca las poblacionales. La varianza y la desviacin estndar estn estrechamente relacionadas. La desviacin estndar es la raz cuadrada positiva de la varianza. Expresin de la varianza muestral:

Expresin de la desviacin estndar muestral:

209

8.1.4.

Tipos de errores

En las mediciones experimentales podemos distinguir entre dos tipos de errores. El error aleatorio debido al azar, y el error sistemtico debido a algn desperfecto del instrumento, o problemas con la referencia o la curva de calibracin. Por lo regular se trata de obtener la mejor precisin posible, con el ms alto grado de repetibilidad (Figura 8-4).

Precisin buena mala

Error sistemtico

buena Repetibilidad

mala

Error aleatorio
Figura 8-4. Tipos de errores y su relacin con precisin y repetibilidad.

8.1.5.

Diseo experimental

Los pasos para la realizacin de un experimento son: 1) Estudio del arte previo. Antes de hacer un experimento se debe tener un panorama de lo que ya se sabe (dominio del conocimiento general) y las interrelaciones con otras ramas cientficas y del conocimiento. Despus de eso se debe hacer la pregunta: Qu es lo que todava no se sabe? Solamente as se pueden plantear preguntas novedosas que contribuyan al avance de nuestro conocimiento. 2) Planteamiento del problema de investigacin. Esto incluye la definicin de una pregunta concreta y relevante. En base a esa pregunta especfica se define una respuesta terica que llamamos hiptesis. Una hiptesis es la respuesta favorita a una pregunta biolgica pero que todava no tenemos datos suficientes para sustentarla de manera rigurosa. Cuando se trata de una pregunta estadstica, por ejemplo, el efecto de un factor sobre un resultado, se define una hiptesis nula (Ho) y una hiptesis alterna:
La hiptesis nula: Por lo regular predice que el azar es la causa principal del resultado que obtuvimos. Solo cuando tenemos evidencia experimental (suficiente repetibilidad) de que los resultados no se dieron por azar, es cuando rechazamos la hiptesis nula y decimos con cierto grado de certeza (nivel de significancia) que la hiptesis alterna es vlida. En estadstica, una hiptesis nula es una hiptesis construida para anular o refutar. La hiptesis nula se presume verdadera hasta que los datos (prueba de hiptesis) indiquen lo contrario.

210

Ejemplo de Hiptesis nula para Chi cuadrado: "Si este material gentico segrega en proporciones mendelianas, no habr diferencias entre las frecuencias observadas (O) y las frecuencias esperadas (E)" Ejemplo de hiptesis nula para student: "Si la humedad relativa no influye sobre el nmero de huevos por desove, no habr diferencias entre las medias de esta variable entre las regines hmedas o secas."

3) Modelo y metodologa: En base a la pregunta planteada, se busca el mejor mtodo para contestarla. Por ejemplo, si queremos saber cul de todos las variedades de maz es mejor, lo que debemos hacer es un ensayo de campo para ver cul tiene mayor rendimiento de grano. El diseo experimental incluye la eleccin de los genotipos, los controles, el procedimiento a seguir, es decir: el diseo, las repeticiones, las localidades, el o los tratamientos a aplicar, las variables consideradas: variables independientes, variables dependientes, variables codependientes, variables extraas, etc.
Tipos de variables: * Variables independientes: Son las variables que el experimentador puede controlar y define a priori en el experimento. Por ejemplo, los genotipos, la irrigacin, los tratamientos, etc. Se supone que estas variables determinan los resultados del experimento. * Variables dependientes: Son caractersticas de la realidad que se ven determinadas ya sea por el azar o por los factores que se definieron o controlaron en el experimento. La clasificacin dependiente indica conocimiento a priori de que esta variable es efecto y no causa. Es decir, depende del tratamiento y no al revs. El valor de la variable dependiente puede ser resultado del azar (hiptesis nula), o ser efecto directo o indirecto de otros fenmenos o variables desconocidas. Slo cuando existe suficiente asociacin con la variable independiente se dice que aceptamos la hiptesis alterna. *Variable continua: Se presenta cuando el fenmeno que se mide puede tomar valores cuantitativos, por ejemplo el rendimiento, ya que esta variable puede asumir valores de rango continuo: 1, 2, 3, o 15 toneladas por hectrea. * Variables discretas: Son aquellas que establecen categoras en trminos no cuantitativos. Por ejemplo cuando se clasifican las localidades o los ambientes en: normal, sequa, bajo en nitrgeno, etc., o cuando se clasifica el germoplasma por color: blanco, amarillo, azul, etc.

El nmero de variables que se incluyan en un experimento, depende del investigador y del fenmeno que estudie. Mientras ms variables independientes se agreguen, quiz obtenga una mayor explicacin de los cambios en su variable dependiente. Por ejemplo: si quiere explicar el rendimiento de grano puede controlar variables como el genotipo, los alelos, los QTLs, la localidad, los riegos, la fertilidad del suelo, etc. Tambin se pueden incluir variables independientes, pero que no son controlables a campo abierto, como intensidad de luz, temperatura, vientos, lluvias, etc. Adems de la variable dependiente principal que es el rendimiento de grano, tambin se pueden analizar variables codependientes como: el nmero de mazorcas, el tamao de grano, das de floracin, el intervalo de floracin femenina-masculina (ASI), la senescencia, la altura de planta, etc. Si slo se utiliza una variable, ser difcil creer que el rendimiento depende slo de un factor. La relacin causaefecto no siempre es tan evidente como quiere el investigador. Entre ms variables se incluyan en el anlisis mayor ser la certeza de detectar efectos significativos y confiables. 4) Resultados: los datos obtenidos se deben organizar de manera sistemtica y congruente. Usando estos datos se hace un anlisis estadstico para describir cules fueron las relaciones observadas entre las variables. Se debe contestar si la o las variables independientes realmente influyeron significativamente sobre los valores de las variables dependientes. Tambin se debe analizar si hubo tantas variables conocidas o extraas como se pensaba, o si surgieron otras. Los resultados por lo general se presentan a manera de tablas o graficas (de barras, de pastel, etc.). Todas las formas de representacin de resultados deben incluir indicadores de variabilidad experimental con grados de confiabilidad (desviacin estndar, barras de error, repetibilidad, resultados de pruebas de T, etc.)

211

5) Conclusiones: En la investigacin y la experimentacin, las conclusiones son determinaciones hechas mediante el estudio meticuloso de los resultados del trabajo precedente dentro de una cierta metodologa. Las conclusiones toman a menudo la forma de teoras (explicacin general fenomenolgica). La conclusin es tpicamente el resultado de una discusin de los datos considerando las premisas. Sin una discusin de las premisas, no hay conclusin, si son slo aseveraciones sin evidencia, es una alegacin. Naturalmente, la precisin de una conclusin dada, es dependiente de la verdad de la conclusin elegida. 6) Difusin y divulgacin. A partir de las conclusiones ya es posible pensar en la elaboracin de un informe que puede ser oral o escrito, y tiene la finalidad de comunicar los resultados a la sociedad y a la comunidad cientfica. La publicacin del experimento y sus conclusiones se puede presentar en un congreso en forma de una charla, o hacerse a travs de un artculo en una revista nacional o internacional. Como muchas cosas en la ciencia, el proceso experimental es cclico e iterativo, de forma que una pregunta o experimento genera una serie de datos cuya interpretacin da origen a muchas preguntas ms, que a su vez pueden ser contestadas al repetir los experimentos variando las condiciones, eligiendo nuevos componentes o alterando las premisas (Figura 8-5).

Publicacin Difusin Smbolos, teoras Conclusiones Anlisis

Figura 8-5. Proceso iterativo cientfico.

Estado del Arte

Creatividad Pregunta

Proceso Cientfico Iterativo

Hiptesis Metodologa Experimento

Datos

Variables

8.2. Anlisis estadsticos

8.2.1. Ejemplo de anlisis usando pruebas de T
Ahora que hemos repasado un poco las bases de la estadstica descriptiva, trataremos de profundizar ms con algunos ejemplos. Trataremos de ver como la estadstica cuantitativa permite generar conclusiones con relevancia biolgica (inferencia estadstica). Supongamos que queremos saber si dos productos (un agroqumico y un fertilizante orgnico) incrementan el rendimiento de maz. Para ello se disea un experimento en el cual se usan los productos solos o de manera combinada. Fertilizante Producto Tratamiento XA Tratamiento XB Fertilizante: 0 kg Fertilizante: 0 kg

212

Qumico

Qumico: 0 lt Tratamiento YA Fertilizante: 2 kg Qumico: 0 lt

Qumico: 1 lt Tratamiento YB Fertilizante: 2 kg Qumico: 1 lt

El tratamiento XA corresponde al control (sin qumico y sin fertilizante), mientras que el tratamiento YB incluye los dos productos de manera combinada (con qumico y con fertilizante). Para cada condicin (nivel de tratamiento) se hacen 10 repeticiones que se manejan dentro de un campo experimental. En total se siembran 40 parcelas al azar. A continuacin se muestra una tabla con los datos que se obtuvieron del experimento. Rendimiento de maz en kilos por parcela Tratamientos XA XB YA rep1 6 9 13 rep2 7 12 12 rep3 5 12 12 rep4 4 12 12 rep5 6 11 11 rep6 7 13 11 rep7 8 11 11 rep8 6 10 10 rep9 9 10 10 rep10 9 9 14

YB 8 9 8 11 12 10 12 14 12 11

La tarea ahora consiste en hacer el anlisis estadstico para saber si los diferentes tratamientos tienen un efecto significativo sobre el rendimiento de maz. Explicaremos con estos datos algunos tipos de anlisis estadsticos, por ejemplo, la prueba T y el anlisis de varianza (ANOVA). Usaremos las funciones de Excel (o Spreadsheet de OpenOffice) para hacerlo. Lo primero que se debe calcular es el nmero de observaciones, la suma, el promedio, la desviacin estndar y el error estndar para cada tratamiento por separado. (Si no sabe usar Excel consulte primero la seccin 8.3.1 de este captulo) XA 10 67 6.70 1.636 0.517 XB 10 109 10.90 1.370 0.433 YA 10 116 11.60 1.265 0.400 YB 10 107 10.70 1.947 0.616

NumObs Suma Promedio SD SE

=CONTAR(B4:B15) =SUMA(B4:B15) =PROMEDIO(B4:B15) =DESVEST(B4:B15) =B19/RAIZ(B16)

Podemos ver que los promedios tienen valores diferentes para cada tratamiento. La pregunta ahora es saber si las diferencias son significativas. La hiptesis nula en este caso sera: las diferencias entre los tratamientos se deben al azar y no a los productos qumicos que se aplicaron. Para visualizar mejor los resultados hacemos una grafica en Excel usando los valores promedio incluyendo barras de error.

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14 12 10

Rendimiento por plot

14 12 10

Rendimiento por plot

kg/plot

kg/plot

8 6 4 2 0

8 6 4 2 0

XA

XB

YA

YB

XA

XB

YA

YB

Figura 8-6. Resultados del experimento de rendimiento. En la grfica de la izquierda se uso el valor SD para las barras de error y en la derecha el valor SE. Las barras de error son mas pequeas si se usa el valor SE (standard error, error estndar) que el valor SD (standard deviation, desviacin estndar). La grfica de la derecha se ve ms bonita por tener errores ms pequeos. Eso podra ser razn suficiente para poner siempre el valor SE en cualquiera de las graficas que hagamos. Afortunadamente, no solo hay argumentos estticos sino tambin tcnicos para usar los valores SE en nuestras graficas. Las barras de error son ms informativas si se usa el error estndar (SE) que si se usa la desviacin estndar (SD), debido a que el valor SE incluye una informacin importante, como es el nmero de repeticiones hechas (valor n) que no esta reflejada en el valor SD pero si en el valor SE.

SE =

SD n

Con el valor SE uno puede ver intuitivamente que tratamientos fueron diferentes de otros. Una regla emprica dice que si las barras de error (SE) se tocan, entonces las diferencias no son significativas ya que el valor P ser mayor a 5% (P>0.05). Slo cuando las barras de error no se tocan es cuando las diferencias podran ser significativas (P<0.05). En realidad siempre es necesario hacer pruebas para obtener un valor de P exacto. Solo con un anlisis de varianza se puede tener certeza estadstica.

Una de las pruebas ms usadas es la prueba T. En este caso, usamos la funcin de Excel PRUEBA.T con la siguiente sintaxis (matriz, matriz, 1, 3) que significa una comparacin entre dos matrices de datos, con la opcin de anlisis de una cola con muestras de varianza distinta. La prueba T permite comparar slo dos grupos entre si, por lo que tenemos que hacer varias de ellas. Para ello hacemos una matriz de valores P en donde comparamos todos los tratamientos contra todos. Valor de P de significancia estadstica XB 4.11E-06 YA 4.53E-07 0.125 YB 5.34E-05 0.397 0.119

=PRUEBA.T(C4:C13,D4:D13,1,3) =PRUEBA.T(C4:C13,E4:E13,1,3) =PRUEBA.T(C4:C13,F4:F13,1,3)

214

Prueba.T

XA

XB

YA

Como podemos ver, s hay algunas diferencias significativas entre los tratamientos, tanto de los valores promedio como los valores P. El par significativamente ms diferente, es la comparacin entre el tratamiento XA con el YA. Por otro lado, el tratamiento XB no es significativamente diferente del tratamiento YA, ni del YB tampoco (P>0.05). Tomando esto en cuenta, podemos poner estrellitas en nuestra grafica para indicar los valores que son significativamente diferentes del control XA.

14 12 10

Rendimiento por plot

*** *** ***

kg/plot

8 6 4 2 0

XA

XB

YA

YB

Figura 8-7. Grfica con significancia estadstica. Las estrellitas indican los valores P en la comparacin con el tratamiento control XA. Una estrellita significa P<0.05, Dos estrellitas indican P<0.01, mientras que tres estrellitas indican P<0.001. La interpretacin del anterior resultado es que ambos productos si incrementan significativamente el rendimiento. Tanto el fertilizante como el qumico tienen un efecto positivo. Sin embargo, el efecto de los productos no es aditivo, ya que cuando se usan de manera combinada, el rendimiento no incrementa ms. Si el efecto fuera aditivo, lo que se esperara, es que el tratamiento YB tuviera un rendimiento ms alto que XB o YA. La razn T.
Antes, cuando no haba los programas como Excel, los estadistas calculaban todo a mano y con lpiz. De hecho, al principio ni siquiera se tenan calculadoras de bolsillo. Para obtener sus resultados, se usaban formulas matemticas y se consultaban tablas de estadstica en donde se indicaban los valores de las proporciones T y F para un determinado valor P y grados de libertad (df).

Si bien hoy en da tenemos disponibles las computadoras con programas como Excel y R, no esta de ms repasar la manera en que se obtienen algunos valores estadsticos. X1 18 17 16 16 16 15 15 xi-X 3.53 2.53 1.53 1.53 1.53 0.53 0.53 (xi-X)2 12.48 6.42 2.35 2.35 2.35 0.28 0.28 X2 13 12 12 12 11 11 11 xi-X 2.67 1.67 1.67 1.67 0.67 0.67 0.67 (xi-X)2 7.11 2.78 2.78 2.78 0.44 0.44 0.44

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15 15 14 14 13 12 11 10 NumObser (n) Suma Promedio (X) 15 217 14.47

0.53 0.53 -0.47 -0.47 -1.47 -2.47 -3.47 -4.47

0.28 0.28 0.22 0.22 2.15 6.08 12.02 19.95

10 10 10 10 9 9 8 7 15 155 10.33

-0.33 -0.33 -0.33 -0.33 -1.33 -1.33 -2.33 -3.33

0.11 0.11 0.11 0.11 1.78 1.78 5.44 11.11

67.73

0.00

37.33

df=n-1

Varianza =

(x

X )2

(n 1)

SD=

Varianza

SE=

SD n

Teniendo la suma de las diferencias cuadradas y los grados de libertad (df = 14) Entonces podemos calcular la varianza, la desviacin estndar y el error como se muestra a continuacin: X1 X2 Varianza 4.838 =67.73/14 2.667 =37.33/14 SD 2.200 =4.838 1.633 =2.667 SE 0.568 =2.2 / 15 0.422 =1.63 / 15 Ahora, si comparamos los valores de 14.47 y 10.33 vemos que hay una diferencia de 4.13 entre los promedios de los dos grupos de variables X1 y X2. Es significativa esta diferencia? Para responder esta pregunta, hay que calcular la razn T. Primero hay que calcular el error estndar de la diferencia entre dos medias usando la siguiente formula:

Sx1-x2=
67.73 + 37.33 2 * = 15 + 15 2 15

x +x
2 1

2 * n1 + n2 2 n

2 2

Se procede a sustituir las variables de la frmula con los valores:

Sx1-x2 =

105.06 2 * = 28 15

0.50286 = 0.7091

A continuacin de calcula la razn T =

X1 X 2 4.13 = = 5.82 0.7091 0.7091

El valor 0.7091 es la diferencia esperada entre dos grupos si se extraen aleatoriamente de una poblacin comn con la varianza calculada para X1 y X2. El valor de la razn T indica cuantas veces mayor es la diferencia de lo que se esperara si la hiptesis cero fuera cierta. La diferencia observada es 5.82 veces mayor que la esperada segn la hiptesis de nulidad. Es lo suficientemente grande para rechazar la hiptesis cero con un nivel de confianza de 0.05? Para contestar necesitamos consultar una tabla t con los grados de libertad indicados (df=N-2=28). En este caso, el valor de 5.82 s es mayor al valor crtico, y por consiguiente, rechazamos la

216

hiptesis cero. Concluimos que las diferencias de los promedios s son significativas. Es decir, la diferencia de los dos grupos no se debe al azar, sino a algn factor externo que hace que sus distribuciones no sean de una misma poblacin.
Sera un desperdicio de tiempo hacer que los estudiantes de postgrado calculen siempre sus estadsticas a mano como en el ejemplo anterior. Si las computadoras pueden hacer el trabajo, para que desperdiciar el potencial intelectual de los jvenes con una tarea tan de rutina? Lo que se requiere de los estudiantes es que piensen. Esto implica que diseen experimentos, hagan las pruebas, y que interpreten los resultados y presenten sus conclusiones a una audiencia cientfica. Los clculos aburridos los puede hacer la computadora. Sin embargo, es necesario saber como funcionan las frmulas. El presente libro tiene el titulo de Fundamentos, y es por ello que incluimos muchas de estas nociones bsicas para el mejoramiento gentico. Ahora que hemos aprendido como lo hacan los estadistas de antao, y cuando ya entendamos como lo hacen las computadoras modernas, los estudiantes de ahora que sern cientficos del futuro nos podemos enfocar a la interpretacin de los resultados.

8.2.2.

Ejemplo de anlisis usando ANOVA

Ahora haremos un anlisis de varianza (analysis of variance, ANOVA) con los mismos datos de la seccin anterior. Al igual que la prueba T, la ANOVA se utiliza para determinar una razn de las diferencias observadas nivel/margen de error para comprobar hiptesis. Esta razn denominada como razn F, determina la varianza de las medias de los grupos como una medida de las diferencias observadas entre ellos. La razn T slo se utiliza para comprobar la diferencia entre dos medias. Es por ello que tuvimos que hacer varias pruebas T dentro de una matriz para comparar todos los tratamientos. La ANOVA nos permite verificar la diferencia entre dos o ms medias. Lo particular de ANOVA es que la misma considera la varianza total de todos los sujetos en una muestra incluyendo la varianza entre los grupos y la varianza dentro de los grupos. Se puede usar para analizar experimentos ms complejos que incluyen combinaciones de tratamientos. Por lo tanto, es una tcnica ms amplia y de mayor uso que la razn T. Una prueba T es equivalente a una ANOVA de un solo factor, mientras que para comparaciones entre dos o ms factores ya no se debe usar la prueba T, sino que es mejor usar una ANOVA.
Grados de libertad: Con la expresin de grados de libertad se designa un nmero de observaciones que pueden variar alrededor de un parmetro constante. Por ejemplo: si se le pide que escoja cinco nmeros y usted elige los que quiera, entonces tiene cinco grados de libertad. Sin embargo, si se le pide que escoja cinco nmeros cuya media de 20 (la suma de 100), entonces puede escoger cuatro nmeros libremente, pero para el quinto tendr que restringirse a un nmero especifico para poder llegar a 100. Solo as obtendr un promedio de 20. Si suma 20 + 30 + 29 + 11... el quinto nmero tiene que ser 10. Por lo tanto tiene slo cuatro grados de libertad. Usualmente, para determinar los grados de libertad (df), se resta uno del total de la muestra (df=N 1). Cuando se hace un anlisis de correlacin entre dos variables (regresin lineal) entonces se le restan dos al numero total de observaciones (df=N2). Suma de los cuadrados: En ANOVA se calcula la suma de las diferencias cuadradas. Porque es tan importante esta suma de cuadrados? La suma de los cuadrados dividido entre los grados de libertad (df) equivale a la varianza (var). Por su parte, la raz cuadrada de la varianza equivale a la desviacin estndar (SD). El error estndar (SE), se calcula a partir del SD dividido entre la raz cuadrada del numero de observaciones (n). Como se puede ver, la suma de los cuadrados esta directamente relacionado con un gran nmero de parmetros relevantes para la estadstica. Cuando se habla de la suma de los cuadrados, la diferencia se refiere a la diferencia entre el valor x y el valor promedio de todo el ensayo. Es decir, no se refiere a los valores promedio dentro de los grupos. En el ejemplo de los datos que hemos usado, el promedio global es 9.975, mientras que el promedio de los grupos individuales es: 6.7, 10.9, 11.6, 10.7 para los tratamientos XA, XB, YA, YB respectivamente.

217

Para hacer una ANOVA, es necesario organizar los datos de acuerdo al programa que se va a usar para el anlisis. La diferencia entre el formato requerido para Excel y el formato para el programa R radica en la forma en que se acomodan los grupos y los tratamientos. en Excel se especifican dos columnas de resultados segn la primer variable (Grupo de fertilizante X o Y), mientras que la segunda variable de tratamiento se especifica hacia abajo (grupo de qumico A o B). Formato de datos para Excel Grupo X Grupo Y A 75 58 68 56 71 61 B 75 60 66 62 70 60 Formato de datos para R Variable1 Variable2 Resultado X A 75 X A 68 X A 71 X B 75 X B 66 X B 70 Y A 58 Y A 56 Y A 61 Y B 60 Y B 62 Y B 60

En cambio, en R, los tratamientos se especifican con columnas extras que indican los factores (variables dependientes por tipo de qumico o fertilizante) y los niveles de tratamiento por cada factor. El resultado de rendimiento se pone en una sola columna (Resultado). La ventaja del formato de R es que permite agregar ms columnas de resultados hacia la derecha, mientras que en Excel se tiene que hacer una tabla aparte para cada resultado (parmetro) que se quiera analizar. Tomando todo esto en cuenta, usaremos nuestros datos como ejemplo. En Excel debemos acomodar los tratamientos y los datos as: Quim RendX RendY A 6 13 A 7 12 A 5 12 A 4 12 A 6 11 A 7 11 A 8 11 A 6 10 A 9 10 A 9 14 B 9 8 B 12 9 B 12 8 B 12 11 B 11 12 B 13 10 B 11 12 B 10 14 B 10 12

218

11

Para el anlisis ANOVA en Excel, debemos seleccionar todo el rango de celdas -que se muestran arriba- como rango de entrada. En el men herramientas de Excel seleccionar anlisis de datos y despus escoger: anlisis de varianza de dos factores con varias muestras por grupo. En la ventana de dialogo de especificar el valor de filas por muestra (el nmero de repeticiones, en nuestro caso son 10 por tratamiento). Para hacer el anlisis ANOVA con el programa R, es mejor acomodar los datos de esta forma: Fert Quim Rend X A 6 X A 7 X A 5 X A 4 X A 6 X A 7 X A 8 X A 6 X A 9 X A 9 X B 9 X B 12 X B 12 X B 12 X B 11 X B 13 X B 11 X B 10 X B 10 X B 9 Y A 13 Y A 12 Y A 12 Y A 12 Y A 11 Y A 11 Y A 11 Y A 10 Y A 10 Y A 14 Y B 8 Y B 9 Y B 8 Y B 11 Y B 12 Y B 10 Y B 12 Y B 14 Y B 12 Y B 11

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Para hacer el anlisis ANOVA en R, copiar las celdas arriba en el clipboard (portapapeles) y escribir en la consola de R los siguientes 3 comandos en azul: data1=read.table(file="clipboard", header=T, sep="\t") attach(data1) summary(aov(Rend~Quim*Fert)) El resultado que obtendremos ser el siguiente: Df Quim 1 Fert 1 Quim:Fert 1 Residuals 36 --Signif. codes: Sum Sq Mean Sq F value Pr(>F) 27.225 27.225 10.951 0.002132 ** 55.225 55.225 22.213 3.598e-05 *** 65.025 65.025 26.155 1.059e-05 *** 89.500 2.486 0 *** 0.001 ** 0.01 * 0.05 . 0.1 1

Ahora trataremos de interpretar el resultado. Primero comparemos las tablas ANOVA que nos dio Excel o R. El resultado ANOVA que obtendremos en Excel se vera as:
Anlisis de varianza de dos factores con varias muestras por grupo RESUMEN
A

RendX 10 67 6.7 2.68

RendY 10 116 11.6 1.60

Total 20 183 9.15 8.34

Cuenta Suma Promedio Varianza

B

Cuenta Suma Promedio Varianza

Total

10 109 10.9 1.88

10 107 10.7 3.79

20 216 10.8 2.69

Cuenta Suma Promedio Varianza

20 176 8.8 6.8

20 223 11.15 2.77

ANLISIS DE VARIANZA Origen de Promedio de las Suma de Grados de los variaciones cuadrados libertad cuadrados Quimico 27.23 1 27.23 Fertilizante 55.23 1 55.23 Interaccin 65.02 1 65.02 89.50 36 2.49 Dentro del gru Total 236.98 39

Probabilidad 10.95 0.002132 22.21 0.000036 26.16 0.000011

Valor crtico para F 4.11 4.11 4.11

Vallamos paso por paso. Las primeras dos tablas se refieren a los datos de los tratamientos A o B por separado. En las columnas se muestran los tratamientos X o Y. En esas tablas se muestran algunos valores que ya habamos calculado antes, como el nmero de observaciones por tratamiento, la suma, el promedio y la varianza, que corresponde al cuadrado de la desviacin estndar. El verdadero resultado ANOVA se muestra en la ltima tabla. Es casi el mismo resultado que nos arrojo R. En la primera columna se muestran los nombres de los tratamientos como origen de la varianza. La segunda columna muestra la suma de los cuadrados, separada por tratamiento, as como la suma total de las diferencias cuadradas del experimento. En la segunda columna se puede ver que el tratamiento con fertilizante genera ms suma de cuadrados que el tratamiento

220

con el qumico. La tercera columna muestra los grados de libertad para cada tratamiento. Ms adelante explicaremos con ms detalle la suma de los cuadrados y los grados de libertad. La cuarta columna muestra los promedios de las sumas de los cuadrados. Equivale a la suma de los cuadrados dividido entre los grados de libertad (df). La quinta columna muestra la razn F para cada variable del tratamiento (Qumico, Fertilizante e interaccin entre los dos). La razn F se calcula al dividir el valor de los tratamientos (promedio de la suma de los cuadrados) entre el valor del residual (varianza dentro de los grupos=2.49) 27.23/2.49 = 10.95 55.23/2.49 = 22.21 65.02/2.49 = 26.16 En otras palabras, la razn F se refiere a la variacin de los datos por efecto de los tratamientos que tantas veces ms grande es en comparacin con la varianza dentro de los grupos. La varianza entre los grupos es la varianza residual no explicada por los tratamientos. Entre mayor sea el valor F, menor ser la probabilidad de que esos efectos se deban solo al azar (error tipo I). La sexta columna muestra precisamente ese valor P (probabilidad de un error tipo alfa). Si no tenemos Excel, en las tablas de estadstica podemos consultar la probabilidad P, para determinado valor F, tomando en cuenta los grados de libertad (df). En nuestro caso, todos los tratamientos, as como la interaccin entre ellos fue significativa a un nivel P<0.001. Cuando la hiptesis de nulidad se rechaza una vez llevado a cabo el anlisis de varianza, lo nico que puede afirmarse es que los resultados obtenidos de los grupos difieren y que las diferencias son mayores de lo que cabra suponer en funcin de la mera casualidad. Nos dice que el efecto del fertilizante o del qumico fue significativo. El tercer rengln se refiere a la interaccin entre los dos tratamientos. El resultado nos dice que la interaccin fertilizante: qumico es significativamente diferente de lo que se podra esperar de un efecto aditivo simple (suma de los efectos de cada tratamiento). Una razn F alta no quiere decir que todos los grupos dentro de los tratamientos difieran significativamente de los dems. En nuestro caso solo tenemos dos niveles por tipo de tratamiento (fertilizante 0kg y fertilizante 2kg). En nuestro caso el resultado ANOVA nos dice que esos dos tratamientos s difieren entre si. Sin embargo, podramos hacer un experimento con varios niveles de tratamiento, por ejemplo, cinco niveles de fertilizante: 0kg, 1kg, 2kg, 3kg. En ese caso, el resultado de ANOVA, aunque sea significativo, no nos va a decir cual nivel difiere de otro. Una razn F significativa puede ser el resultado que solo un subgrupo difiera de los otros subgrupos. Por ejemplo, que el tratamiento 0kg fuera significativamente distinto de los tratamientos con 1kg y 2kg. Pero un valor P significativo de ANOVA no dice si el tratamiento 2kg y el de 3kg son significativamente diferentes. Para contestar esto, se deben hacer pruebas de comparacin mltiple adicionales. Una de ellas es la prueba de Tukey. En la seccin X se explica como hacer esas pruebas adicionales usando el programa R. Si no sabe usar el programa R, consulte la seccin X de este libro. En resumen se puede decir que primero se debe crear un objeto aov( ) en R, para despus hacer las pruebas de comparacin con TukeyHSD. Tarea 8-1. De la siguiente lista de datos calcule todos los parmetros estadsticos: n, suma, promedio, suma de los cuadrados, varianza, SD, SE y df. Hgalo con MS Excel, o con el programa spreadsheet de OpenOffice. X1 18 17 16 16 X2 13 12 12 12

221

16 15 15 15 15 14 14 13 12 11 10

11 11 11 10 10 10 10 9 9 8 7

8.2.3.

Ejemplo: varianza, heredabilidad y repetibilidad

Una de las tareas ms importantes de los mejoradores es distinguir entre los efectos debidos al genotipo y los debidos al ambiente y el azar. Esto es importante en todos los ensayos agronmicos, sobre todo los de mejoramiento, tanto los viveros de lneas como los ensayos de variedades. Las diferencias genotpicas entre lneas en un vivero o ensayo, son la seal que el mejorador est intentando detectar. Sin embargo, la seal no es pura. Hay gradientes de campo que pueden causar grandes variaciones. Los efectos de las unidades experimentales (parcelas, plots) estn llenas de ruido. La heredabilidad (repetibilidad) es la proporcin de seal:ruido (signal to noise ratio). A continuacin vamos a repasar algunas formulas estadsticas para discriminar la seal del ruido. Tambin haremos un ejercicio sobre el clculo de los componentes de varianza y repetibilidad.
Medicin Fenotpica
7 6 5 4 3 2 1 0 0 3 4

Gradiente de Campo

Seal Genotpica
4 4

Ruido

Figura 8-8. Ejemplo de mediciones fenotpicas y su descomposicin en sus componentes de seal, gradiente de campo y ruido residual. Esta figura nos ayuda a imaginarnos mejor la

222

magnitud del ruido en comparacin con la seal. La descomposicin en sus diversos componentes se hace por medio de un anlisis de varianza.
Medicin Fenotpica Rep1
4 4

Medicin Fenotpica Rep2

Medicin Fenotpica Rep3

4 3 2 1 0 4 3 2 1 0

Medicin Fenotpica Rep4

Medicin Fenotpica Rep5

4 3 2 1 0 4

Promedio de las 5 repeticiones

Figura 8-9. Mediciones fenotpicas con varias repeticiones. Entre ms repeticiones se hacen, el ruido por azar cada mes tiene un menor efecto. El promedio de las 5 repeticiones tiene menos ruido que las repeticiones individuales, y por consiguiente, la seal genotpica es ms clara y confiable. Los objetivos de esta seccin son: Repasar los modelos lineales para mediciones en las parcelas en ensayos de variedad y viveros, as como los anlisis estadsticos derivados de estas. Entender el propsito de la replicacin en programas de mejoramiento. Repasar el concepto de repetibilidad experimental (Heredabilidad H).

223

Modelar la relacin entre replicas, error estndar del promedio de un cultivar (SEM), la diferencia mnima significativa (LSD) entre los promedios de dos cultivares y la repetibilidad.

El modelo lineal para mediciones en parcelas Los efectos genotpicos, ambientales y el ruido son parte del valor fenotpico. Estos valores se obtienen de las mediciones en las parcelas. Pueden ser valores como altura de planta, nmero de mazorcas o rendimiento de grano. Los efectos del genotipo y del ambiente se incorporan en los modelos lineales. Estos modelos son los mas utilizados para analizar resultados de ensayos agronmicos. Primero se requiere estar familiarizado con estos modelos, para despus discutir mas a fondo sobre como incrementar la precisin de los ensayos, maximizar la respuesta de seleccin y utilizar eficientemente los recursos limitados de los mejoradores. As que ahora, vamos a examinar el efecto de la variabilidad del campo, as como la repetibilidad en la precisin con la que los efectos de los genotipos son estimados. Las mediciones de la parcela son analizadas utilizando un modelo lineal que permite la separacin de los efectos genotpicos, del efecto ambiental y el error debido al azar. Una parte del ruido se debe a las diferencias en la calidad el suelo, disponibilidad de agua y nutrientes en las parcelas, y tambin a la variabilidad inherente de los organismos vivos. En un diseo completamente al azar (completely randomized desing, CRD) o en un diseo sin bloques, la medicin de una parcela (P) en un vivero o ensayo de variedad, puede ser descompuesta en los siguientes componentes:

Pij = + Gi + ej

Ecuacin 8-1

Donde: Pii = valor fenotpico de una parcela que se obtuvo por una medicin cuantitativa = promedio de todas las parcelas Gi = efecto en el ensimo genotipo, expresado como una desviacin del promedio de todas las parcelas ej = el efecto residual de la ensima parcela, expresado como la desviacin del promedio de todas las parcelas En un vivero sin rplicas, las mediciones de parcelas sencillas se mezclan completamente, los efectos genotpicos y los de la parcela. En este caso, no se puede separar entre los diferentes efectos. En ensayos con rplicas, el promedio de la variedad j sobre la parcela (Yi./r), tiene el valor esperado + Gi. En la prctica el promedio de una variedad estimada de un ensayo es:

Yi. = + Gi + ej/r

Ecuacin 8-2

Dnde: ej = es la suma de los errores de ese genotipo en las diferentes repeticiones. r = es el nmero de rplicas. Como todos los agrnomos saben, algunas reas en el campo son ms productivas que otras. Si asignamos un genotipo al azar, en varias parcelas diferentes (Por ejemplo, si tenemos varias rplicas), los efectos positivos y negativos de la parcela tienden a cancelarse entre ellos y ej tiende a cero. Sin embargo, cuando tenemos pocas rplicas (r<3), los residuos (ej/r) pueden hacer que el promedio que estimamos de las parcelas, difiera de manera importante del verdadero promedio del genotipo, + Gi..

224

La razn por la que hacemos rplicas de los ensayos de mejoramiento, es para minimizar el efecto de los errores residuales de la parcela en el estimado del promedio del genotipo. Las rplicas no se hacen principalmente para generar un trmino de error para probar si las diferencias entre genotipos son significativas (y tampoco es para compensar por parcelas prdidas). La varianza del promedio de un genotipo es:

2 Y

= 2e /r

Ecuacin 8-3

El error estndar de un promedio (standard error of mean, SEM) es la raz cuadrada de 2Y. Los mejoradotes seguido estn interesados en la varianza de la diferencia entre dos variedades. La diferencia (D) debe ser expresada como sigue:

D = Y1 Y2
Ecuacin 8-4 Para dos variables independientes y no correlacionadas, la varianza de la suma es igual al a suma de las dos varianzas. Nota que si Y = c X, donde c es una constante, entonces 2Y = c22X, por lo tanto,

2D = 2Y1 + (-1)22Y2 = 2e /r + 2e /r =2 2e /r

Ecuacin 8-5

El error estndar de la diferencia entre dos promedios (Standard error of a difference between 2 means, SED) es la raz cuadrada de 2D. La mnima diferencia significativa (least significant difference, LSD) es el valor crtico de la prueba de t (t-test) de la diferencia entre dos promedios. Esta se calcula como sigue:

LSD = t/2,edf x SED = t/2,edf x (2 2e /r)

Ecuacin 8-6

Donde t./2,edf es el valor t para un nivel de significancia de /2, y el nmero de grados libertad en el trmino de error (edf) del anlisis de varianza del ensayo para /2, t./2,edf es siempre aproximadamente 2. Como una aproximacin,

LSD.05 3 SEM

Ecuacin 8-7

Es importante que el concepto de LSD quede claro: El valor LSD0.05 es la diferencia entre estimados de los promedios de dos lneas con el mismo valor genotpico, que se espera que sea excedido por mero azar con un 5% de las repeticiones de un ensayo de variedad.

225

Visto de otra manera, suponga que toma dos muestras de semilla de una variedad cultivada en la misma parcela. Cada submuestra las pone en diferente sobre, dndole diferente nombre. Despus, toma estas dos muestras y las compara en un ensayo con rplicas en diferentes sectores de la parcela. Por puro azar, la diferencia en el promedio del rendimiento entre las muestras de material idntico podra exceder el valor LSD0.05 solo el 5% de las ocasiones. Los valores de SEM, SED y LSD son mediciones importantes de la precisin de un ensayo de variedad, o de la habilidad de este para detectar diferencias. Varianza genotpica y fenotpica La varianza gentica en un ensayo, es la varianza de los efectos del cultivar, el valor Gis en la ecuacin 5.1, y se denota como 2G. La varianza fenotpica en un ensayo de cultivar, es la varianza de los promedios del cultivar a travs de las rplicas del ensayo. Se denota como 2P. Ya que los promedios estn basados en las mediciones de la parcela, las cuales contienen tanto a Gis como a ejs, 2P contiene la varianza gentica y una porcin de la varianza residual.

2P = 2G + 2e/r

Ecuacin 8-8

Donde 2e es la varianza de parcela residual o de error del ANOVA, y r es el nmero de rplicas. 2G y 2e son estimadas del ANOVA como sigue: Fuente de variacin Grados Promedio de la suma Valor correspondiente a libertad de cuadrados (Df) (Mean square) Rplicas Genotipos Residual Entonces para estimar 2G: r-1 g-1 (r-1)(g-1) MSG MSE r2G + 2e 2e

2G = (MSG MSE)/r

Ecuacin 8-9

2e se estima directamente como la varianza del error residual del experimento. La repetibilidad en los ensayos La repetibilidad en un ensayo de variedades es la proporcin de la variacin dentro de los promedios de una lnea, que es debida a la variacin en los efectos genotpicos. Tambin se le llama heredabilidad en sentido amplio (broad-sence heritability, H) y es calculada de la siguiente forma:

H = 2G/ 2p

2G /[2G + 2e/r]

Ecuacin 8-10

H es una medida importante de la precisin (fiabilidad) de un experimento. Es un estimado de la correlacin esperada entre diferentes repeticiones o corridas del mismo experimento. Es decir, es la correlacin que esperaramos entre promedios estimados de la misma serie de cultivares, estimado dos veces en diferentes parcelas del mismo campo de cultivo. Los valores que toma H se encuentran entre 0 y 1. Si observamos la ecuacin 5.10, nos daremos cuenta de que H no es

226

una constante. Mientras mayor sea el nmero de rplicas (r), o menor sea el error residual (2e=0), H se aproxima ms a 1. Entonces puede comprar Hs mayores para un experimento, invirtiendo en ms rplicas. Note que el valor de H pertenece slo al ensayo donde fue estimado. Los valores de H estimados para ensayos con menos de 30 variedades son menos confiables que los ensayos de 100 variedades. Tambin tenga en cuenta que H no nos dice nada acerca de la transmisin mendeliana de una caracterstica de padres a hijos. H es solamente una medida estadstica de la repetibilidad de una caracterstica en un experimento en particular. Esto a menudo causa confusin, debido a que en biologa molecular, la heredabilidad tiene una connotacin de herencia y de transmisin de cidos nucleicos (genes). El termino heredabilidad se acuo cuando todava no se sabia nada del DNA, de la poca clsica de Hallauer en los aos 30 cuando se fundaron los principios de la gentica cuantitativa. La mayora de los trminos que se usan en el mejoramiento estn basados en estadstica y no tanto en el DNA. Hoy en da convendra cambiar el trmino de heredabilidad por el de repetibilidad para no crear confusin entre los bilogos moleculares y los mejoradores. Sin embargo, ahora que sabemos los alcances de esos trminos, eso nos ayudara a ampliar los canales de comunicacin entre cientficos de diferentes disciplinas. Modelar el efecto de la replicacin en la precisin y repetibilidad de los ensayos de variedades Todos sabemos que hacer muchas rplicas es caro y laborioso. Podemos usar la Ecuacin 8-6 y Ecuacin 8-10 para modelar el efecto al cambiar el nmero de rplicas en un ensayo. Por lo tanto, estas ecuaciones son tiles para aquellos mejoradores que estn planeando o estructurando sus ensayos. Es importante saber si los ensayos estn sub o sobre-replicados, para saber si los recursos econmicos estn siendo bien invertidos para lograr una avance gentico deseado. Ejercicio de modelacin: En la siguiente tabla se presenta el anlisis de varianza para el rendimiento de grano de un ensayo de variedad con arroz de temporal de tierras bajas, llevado a cabo en Champassak Laos, durante la temporada de lluvias del 2004. Fuente de variacin Grados libertad (Df) 3 21 66 Promedio de la suma de cuadrados (Mean square) 688426 759729 159692 Valor correspondiente a

Rplicas Genotipos Residual

r2G + 2e 2e

Ahora, con esos datos: a) Estime 2G y 2e b) Calcule el valor predicho de SEM, SED, LSD0.05 y H para ensayos con 1-8 rplicas. El valor apropiado de t es 1.997

Nmero de rplicas
1 2 3

2G

2e

SEM

SED

LSD0.05

Reduccin en LSD debido ala adicin de rplicas

227

4 5 6 c) Si dos ensayos de variedad con 3 rplicas como el descrito anteriormente fueran llevados a cabo uno a lado del otro en el mismo campo y en la misma temporada, cul sera la correlacin esperada en los promedios de las variedades entre los dos ensayos? d) Cules son las dos maneras posibles de incrementar la precisin y repetibilidad de un ensayo de variedad? Resumen En ensayos de campo y viveros, los efectos del genotipo y de la parcela siempre se confunden. Los efectos de la parcela son ruido que enturbian el estimado del valor genotpico en los experimentos de mejoramiento. En los programas de mejoramiento, el propsito de la replicacin, es separar los efectos genotpicos de los debidos a la parcela, reduciendo la confusin, mejorando la precisin de los ensayos e incrementando nuestra habilidad de identificar genotipos superiores. La varianzas genotpicas o de error estimadas de los anlisis de varianza pueden ser usadas para estimar el LSD y la repetibilidad o heredabilidad en sentido amplio, H Incrementar el nmero de replicas reducir el LSD e incrementar H as como la precisin y repetibilidad del ensayo. Los beneficios obtenidos en la precisin disminuyen rpidamente con cada rplica adicional. Raramente es econmicamente efectivo utilizar ms de 4 rplicas. Las ecuaciones de LSD y H pueden ser utilizadas para modelar el efecto de incrementar o disminuir el nmero de rplicas en la precisin y repetibilidad del ensayo.

228

8.2.4.

Ejemplo de grfica

Figura 8-10. Scatterplot xy con histogramas y boxplots marginales.

8.2.5. 8.2.6. 8.2.7.

Ejemplo de anlisis de bloques incompletos Ejemplo de anlisis espacial Ejemplo de anlisis con modelos lineales

Input estadista CIMMYT?

Input estadista CIMMYT?

Usar el programa R. Aprender a usar la funcin lm

229

8.2.8.

Otros ejemplos

Input estadista CIMMYT?

8.3. Software para estadstica

8.3.1. Uso de Excel

Excel es uno de los programas que ms usan los fitomejoradores y los bioqumicos analticos. Las hojas de Excel se pueden usar tanto para almacenar y organizar datos, como para hacer clculos, grficas y anlisis estadsticos. En el captulo 7.4.1 (ver pgina 201) se menciona el paquete de Fieldbook basado en macros de Excel que los mejoradores de maz usan para manejar sus ensayos de rendimiento. Excel tiene una amplia gama de funciones integradas para estadstica. Entre las ms simples se pueden mencionar el promedio, la media, moda, mxima, mnima, desviacin estndar y nmero de valores de un determinado rango. Tambin hay funciones para calcular la pendiente (slope), la interseccin (intercept) con el eje-y y el coeficiente de correlacin a partir de una serie de datos xy. Algo muy conveniente del programa Excel son las funciones de bsqueda vertical, horizontal y las tablas dinmicas (pivot tables). Entre las funciones de anlisis se pueden mencionar los histogramas, las tablas de correlacin y el anlisis de varianza. Una de las funciones ms avanzadas de Excel es el solver. Se puede usar para resolver problemas lineales y no lineales. Tambin cuenta con algunas funciones para hacer anlisis estadsticos con modelos lineales simples. Segn la versin de Excel que se tenga instalada, las funciones pueden estar en ingles o en espaol. A continuacin se muestran algunos ejemplos de funciones sencillas. Tabla 8-1. Formulas y funciones de Excel Funcin Versin Versin espaola inglesa
Promedio =AVERAGE(x) =PROMEDIO(x)

Formula

x
n

Mediana Moda Mnima Mxima Numero mediciones (n) Grados libertad (DF) Desviacin estndar (SD)

de de

=MEDIAN(x) =MODE(x) =MIN(x) =MAX(x) =COUNT(x) =COUNT(x)-1 =STD(x)

=MEDIANA(x) =MODA(x) =MIN(x) =MAX(x) =CONTAR(x) =CONTAR(x)-1 =DESVEST(x)

n 1

Error Estndar (SE) Pendiente (valor m)

=STD(x)/SQR(n ) =SLOPE(y, x)

=DESVEST(x)/RAIZ(n)

SE =

SD n

=PENDIENTE(y, x)

Interseccin (valor t)

=INTERCEPT(y, x)

=INTERSECCION.EJE( y, x)

230

Coeficiente de correlacin R

=CORREL(y, x)

=PEARSON(y, x)

Coeficiente de 2 correlacin R

=RSQ(y, x)

=COEFICIENTE.R2(y, x)

Las frmulas de la tabla anterior parecen un poco complicadas. Sin embargo, al inspeccionarlas con calma, nos podemos dar cuenta que sus componentes se basan en simples manipulaciones algebraicas de los datos primarios. Se basan en algunas sumas simples y cuadradas. La Figura 8-11 muestra un ejemplo de los clculos que se hacen para una regresin lineal.

Figura 8-11. Ejemplo de clculos de regresin lineal en Excel. A partir de los datos x,y se calculan las sumas de las multiplicaciones y de los cuadrados, para despues calcular los valores m, b y R. El valor R2 por si solo no es suficiente para decir si una correlacin es significativa o no. Por ejemplo, un valor de R2=0.9 no es significativo si solo se tienen 3 puntos. Mientras que un valor de R2=0.5 es altamente significativo si se tienen cientos de datos. Es necesario tomar en cuenta los grados de libertad para una determinada comparacin. En el caso de las correlaciones entre dos variables, los grados de libertad son (n-2). La Figura 8-12 muestra la forma de calcular el valor P para un grupo de datos xy.

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Figura 8-12. Ejemplo de funciones en Excel. Para calcular el valor P se usa el valor R2 corregido con los grados de libertad usando la funcin de distribucin F. Un valor de R2=0.38 con una lista de 19 observaciones si es significativo ya que el valor P=0.0049.

8.3.2.

R para estadstica

El R es un programa para analizar datos. El programa puede hacer diversos tipos de anlisis estadsticos, as como producir muchos tipos de grficas. La ventaja de R, en comparacin de otros como SAS y SPSS, es que R es un programa gratuito y de cdigo abierto.
R is a software package especially suitable for matrix data analysis and graphical representation. R can be used as a statistical tool but also as a programming language itself, making it very flexible and highly customizable. Excellent graphical tools make R an ideal environment for exploratory data analysis and for preparing publication ready graphs (exportable as .ps or .jpg files). All work is done in command style text functions and therefore it is different from other windows style programs (like SPSS) that use menus with select and click options for predefined statistical procedures. It takes considerable time to learn to use R, but once you have passed the first burden, it is quite convenient to handle. As a programming language it is not for beginners, but rather for advanced users for whom the statistical functions of Microsoft Excel are no longer enough (for example if you want to do Principal Component Analysis). In comparison to SAS and SPSS which are very expensive commercial programs for doing statistics, R is free software distributed under the GNU and GPL license terms.

Descargue R de la pgina oficial:

http://cran.r-project.org/
Revise y descargue estos otros programas complementarios: Editor de texto para editar scripts de R: http://www.sciviews.org/Tinn-R/ Anlisis de datos de microarreglos: http://bioconductor.org/ Despus de instalar R en su computadora de manera local, el programa inicia con la ventana de la consola:

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Figura 8-13. Ventana inicial de la consola de R Tabla 8-2: Consola de R

Introduccin a R (Uso bsico)

El programa R utiliza objetos y funciones. Los objetos contienen datos, mientras las funciones utilizan los datos dentro de los objetos, para llevar a cabo clculos y obtener soluciones. Si quieres ver todas las funciones de R, escribe: help() # Abrir una ventana con informacin general (enlista todas las funciones)

Para obtener ayuda especfica sobre una funcin dada, escribe su nombre dentro del parntesis:

help(var) # Ayuda especifica sobre la funcin varianza (variance)

help(sd) ?sd # Ayuda especifica sobre la funcin desviacin estndar (standard deviation) #Alternativa para abrir ayuda sobre la funcin desviacin estndar

En muchas de las funciones de R se necesita abrir y cerrar parntesis para introducir variables o atributos de la funcin respectiva. Aunque tambin en algunas ocasiones, los parntesis se dejan vacos. R distingue maysculas de minsculas en todo lo que se escribe. Como en los comandos unix, en R puedes volver a llamar los comandos previamente escritos, utilizando las teclas de las flechas hacia arriba o hacia abajo.

Definiendo y editando objetos

Para trabajar en R, nenecitas definir objetos. Un objeto puede ser una variable, un vector o una matriz, dependiendo de la cantidad de datos y su estructura. Escoge un nombre para el objeto, que no sea el nombre de una funcin. Algunos nombres posibles son a, b, c, x, y, z, data1, data2, matrix1, model1, etc.

233

La siguiente seccin sern en ingls para practicar un poco ms est idioma. Para hacer un posgrado en biotecnologa vegetal, es muy importante poder entender instrucciones tcnicas en ingls. Las palabras en azul se refieren a los comandos que se usan en la consola de R. Haga copy de esos comandos y pguelos en la consola para que vea el resultado en R, y de esta forma aprenda a usar este programa para hacer anlisis estadsticos (Tabla 8-2). #The # sign denotes comments that are not interpreted by the console. I use them here to explain some features of the functions or commands. #To work with R you need first to define variables, vectors or matrix objects. This is done either manually or by importing data from external files. First I will explain the manual entry of data directly from the console. This can be done with the combine function: x = c(1,3,2,7,9) #create a vector x with 5 components y = c(a=1,a=3,b=2,c=7,c=9,d=2,d=3) #define y with variable names and values z=matrix(c(10,20,30,40,50,60),ncol=2) #define matrix with 2 columns. Values are equally distributed into the two columns. The first column is filled first and downwards. x; y; z #show the contents of objects x, y and z #The definition of the variables can be done with =, but also with the simbols of <depending on the side in which you put the variable. x = c(1,3,2,7,9) #my preferred option to create a vector x with 5 components x <- c(1,3,2,7,9) #alternative option to create a vector x with 5 components c(1,3,2,7,9) -> x #alternative option to create a vector x with 5 components #To show the contents of any object simply type its name x # list contents of object x x=edit(x) # edit contents of object x in a data.frame window #Now that you have defined an object x, you can do things like: summary(x) sd(x) sd(x)/sqrt(length(x)) # shows a summary of x (min, max, mean, median, quartiles) # gives the standard deviation of data in x #gives the standard error of data in x or also ->

#The object x and the results of those functions are stored in the RAM memory of R. When using R no file is writen to the harddisk unless you save it specifically. When you quit R program you can save the workspace so that all objects created during the current session are available next time you work with R. #If you need to do further calculations with the results of a given function, you need to define a new object to store the output. For example: a=length(x) ls() # stores the results of length(x) in new object a #to list all objects stored in the current workspace

#Remember that everything you type in R is case sensitive. As in unix command line, in R you can recall previously typed commands using the up and down arrow keys. #A convenient way to enter matrix data manually into R is by using the command edit(data.frame()) data1 = edit(data.frame()) # opens a window to define data1 manually

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# Tabla 8-3. Editor de datos de R. Despus de que hayas introducido los datos y cerrado la ventana del editor, tus datos se guardaran como el objeto data1. Dando un click en las marcas de las columnas, puedes definir si los valores sern numricos o categricos. Puedes nombrar tus variables, o dejar los nombres predeterminados (var1, var2, var3, etc.). Si cambias los nombres de las variables, utiliza uno corto y fcil de recordar, de tal manera que tengas fcil acceso a l (funcin attach). No utilices espacios o caracteres extraos para el nombre de las variables. Para ver que esta guardado en una matriz determinada, simplemente escribe el nombre del objeto. Aqu yo utilice data1, pero t puedes definirlo con otro nombre similar (Tabla 8-3). data1 # to list the content of the data1 object in the console window data1=edit(data1) # to re-edit the contents of object data1 and saving it edit(data1) # It prints editions on screen but it does not save changes in memory attach(data1) #to make the variables defined in data1 accesible to the console var1 # to show the contents of var1 (defined inside attached data1) detach(data1) #to detach the variables defined in data1 data1$var1 # to show the contents of var1 from data1 without the attach function La primera barrera para usar R es introducir una gran cantidad de datos en un objeto. La entrada manual de datos descrita anteriormente, no es prctica ni conveniente en determinadas ocaciones. Hay mejores opciones para introducir datos a R, desde otros archivos. Se pueden importar datos desde el portapapeles de Windows. Esto es apropiado para conjuntos de datos pequeos y medianos. Para conjuntos de datos muy grandes, puedes importar los datos desde archivos de texto externos.

Subiendo datos desde el portapapeles

Mas que escribir manualmente los datos con la funcin edit data frame, es preferible importar los datos desde Excel o Word, va el portapapeles de Windows. Para hacer esto, slo abre tul archivo de Excel o Word, y copia la tabla de datos, incluyendo o no, los nombres de las filas y los ttulos de las columnas. Despus ve al programa R y escribe el comando:

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data1=read.table(file="clipboard", sep="\t") columnas.

#Para importar sin nombres de filas y ttulos de

Las variables de las columnas sern nombradas como V1, V2, V3, consecutivamente. Si la primera celda esta vaca, se podr reconocer de manera automtica los nombres y ttulos de las filas. Este comando crea el objeto data1con el contenido del portapapeles de Windows. Transfiere los datos desde la memoria del portapapeles hacia la memoria de R. Lo anterior funciona bien para Excel, Word, Power Point y otros programas de Windows. Para mi, esta es la forma ms conveniente de importar datos a R, pues no necesito crear archivos de texto, carpetas o definir directorios de trabajo. data1=read.table(file="clipboard") #for importing without row names and column headings. Column variables will be named V1, V2, V3, consecutively. If the first cell is empty then this allows automatic recognition of row names and headings. data1=read.table(file="clipboard", header=T) #for forcing import with row names and column headings. This option works even if the first cell is not empty. data1=read.table(file="clipboard", header=T, sep="\t") data1=read.table(file="clipboard", header=T, sep="\t", na.strings="") Breve nota sobre importar datos Algunos tutoriales te recomiendan exportar los datos de hojas de Excel a archivos de texto, y desde estos archivos importarlas a R. Esto es totalmente innecesario, puesto que se puede utilizar directamente el portapapeles para importar los datos. Sin embargo, algunas veces se tiene una gran cantidad de datos que no cabe en el portapapeles. Por ejemplo, cuando se hacen microarreglos de diez mil genes. En estos casos, debes de usar la funcin read table, para importar tus archivos de texto como se describe a continuacin.

Subiendo datos desde archivos de texto

El programa R necesita definir una carpeta para subir y guardar archivos. Para cambiar el directorio en el cual quieres trabajar, ve al men ->file->. Cambia el directorio y selecciona una carpeta del directorio que elegiste. Tambin lo puedes hacer manualmente en la consola: setwd("C:/Axel StatisticsR") # sets the working manually getwd() #displays the path for the working directory dir() # lists the files in the current work directory directory

Para importar datos desde un archivo de texto (tab delimited), tienes varias opciones: data1=read.table("file.txt", header=T) data1=read.table("file.txt", header=T, sep="\t") data1=read.table("file.txt", header=T, sep="\t", row.names = 1) La opcin sep=\t te permite definir el smbolo de separacin entre valores, en la mayora de los casos, estos estn separados por un tabulador. La opcin sep=/t no funciona para formatos csy (valores separados por comas). En este caso es preciso usar la opcin sep=,. La opcin row names, te permite especificar el nombre de las filas.

236

El archivo de texto debe estar en el directorio predeterminado de R. Utiliza setwd para definir el directorio correcto. Una manera ms conveniente de subir archivos, es usando el comando file.choose().Con esta funcin no es necesario recordar o escribir el nombre del archivo manualmente. Tambin puedes navegar la carpeta con ventanas (browse the folder with windows). Para importar datos desde un archivo de texto delimitado por tabulaciones estndar, utiliza el comando: data1=read.table(file.choose(),header=T) # selecciona el archivo con una ventana emergente Si tu archivo de datos no tiene el nombre de las variables en la primera columna, entonces utiliza la opcin header=F. Recuerda que en todo lo que escribes, R reconoce maysculas de minsculas y que puedes llamar los comandos previos para corregir cualquier error, utilizando las teclas de flechas hacia arriba o hacia abajo.

Anlisis de objetos
Si tienes definido un objeto x, puedes hacer cosas simples como: x sort(x) length(x) # shows data stored in the object x on screen # list data increasing order # number of items in x

Con objetos de datos guardados en el espacio de trabajo, se pueden realizar muchas funciones individuales como: sum(x), max(x), min(x), median(x), mean(x), pero es mejor utilizar la funcin summary, que integra las funciones anteriores: summary(data1) # shows a summary of x (min, max, mean, median, quartiles) sd(data1) #standard deviation of elements in data1 sd(data1)/sqrt(length(data1)) #gives the standard error of data in data1 var(data1) #variance value, or covariance matrix of elements in data1.

Breve nota de la funcin var(). Si se da un objeto vectorial de una dimensin, el resultado es la varianza total del conjunto de datos de dicho objeto. Si el objeto es una matriz con ms de una dimensin, entonces la funcin var() calcula una matriz de covarianza, equivalente a la funcin cov(). En una matriz de covarianza, los elementos en diagonal, son varianzas dentro de la variable dada, y los otros elementos son covarianzas entre diferentes variables. La covarianza es una medida de la manera en que las variables se relacionan, es decir que tan independientes o que tan correlacionadas estn. Una matriz de covarianza, se puede escalar a una matriz de correlacin con la funcin cov2cor(). plot(data1) #matrix correlation plots with all elements in data1. cor(data1, use = "pairwise.complete.obs") #correlation coefficient matrix of all elements in data1 round(cor(data1, use = "pairwise.complete.obs"),2) #correlation matrix rounded to 2 decimals round(cor(data.frame(data1$var1, data1$var2, data1$var3)),2) #correlation matrix rounded to 2 decimals with some selected variables only

237

Definiendo nuevos objetos

Las funciones escritas como tal, solo mostrarn los resultados en la pantalla. Si necesitas hacer clculos con los resultados de una funcin dada, necesitas usar el comando object= para definir un nuevo objeto que guardar los resultados de dicha funcin en la memoria de trabajo. Por ejemplo: Matrix1=var(data1) # stores the covariance matrix in new object called Matrix1 Matrix2=cor(data1) # store the correlation coefficient matrix of elements in data1 Matrix1; Matrix2 #shows the contents of the two newly created objects. The semicolon allows separating two functions given in the same line Todos los objetos se guardan en la memoria RAM de R. Cuando se utiliza R ningn archivo se escribe en el disco duro, a menos que se guarde especficamente. Cuando cierras el programa R, puedes guardar el espacio de trabajo, de tal manera, que todos los objetos que se crearon en la sesin, estn disponibles la siguiente vez que se trabaje con R. ls() Matrix1 edit(data1) memory. #to list all objects stored in the current workspace # to list the content of the Matrix1 object in the console window # It lets you print editions on screen but it does not save changes in the object

Para editar y guardar los cambios, utiliza el siguiente comando: data1=edit(data1) rm(x) # to re-edit the contents of object data1 and saving it #to remove object x from workspace

Trabajando con matrices

Realiza algunas manipulaciones con matrices como: data3=2*data1 # define a new matrix with scalar matrix multiplication by factor 2 data4=data1+data3 # matrix addition data5=solve(data1) # define a new matrix using the inverse matrix of data1 data2=t(data1) # define a new matrix using the transposed matrix from data1 data6=data.frame(data1,data3) objects # use data.frame for adding elements to

Extraer un componente de una matriz involucra uno o dos indices [Fila,columna] data1[2,3] #element of data1 at the second row, third column z=data1[2,3] #define new object with a selected data entry of data1 #conditional recoding of values within an object

238

data1= x = rnorm(1000) #create a set of 1000 random values x[x > 1.2] = NA # to recode all values of x > 1.2 to NA data1= data.frame(a = rnorm(1000), b= rnorm(1000) , d=rnorm(1000), entry=c(1:10)) data1$a[data1$b > 1] = 5 # to recode all values of b > 1 to 5
La funcin attach se utiliza para tener acceso a varias variables dentro del objeto. Utiliza detach para eliminar el acceso a esas variables. attach(data1) # allows direct access to the variables defined inside an object hist(var1) # plots an histogram of variable var1 inside attached object data1 detach(data1) # detaches variables hist(data1$var1) # plots an histogram of var1 from data1 without attaching Valores propios y vectores propios (eigenvalues, eigenvectors, respectivamente) de una matriz se manejan con la funcin eigen(): m2=matrix(c(10,20,30,40),ncol=2) eigen(m2)

239

Creando grficos
Hay muchas maneras sencillas para graficar utilizando los datos en los objetos. plot(data1) #Salida grfica de los arreglos de grficas con los elementos en data1. Esta caracterstica de grficos es particularmente notable, pues grafica todas las variables en la matriz, contra todas las variables. Con ella, puedes hacer anlisis exploratorios y descubrir algunas correlaciones escondidas. Si deseas hacer esto en Excel, te tomar mucho ms tiempo.

58

62

66

180

220

0.40

0.50 12

62

66

AD
3

58

220

180

PH
120

0.50

EPO
1.4

0.40

EPP
6 8 12 -3 -1 1 3 70 90 120 0.8 1.1 1.4

boxplot(data1) #graphical output with boxplots of all elements in data1 attach(data1) #to make the variables defined in data1 accesible to the console var1 # to show the contents of var1 (defined inside attached data1) boxplot(var1, var2) #produces a boxplot of only the variables 1, 2 plot(data.frame(var1, var2, var3)) #plot arrays of some selected elements only. detach(data1) #to detach the variables defined in data1 data1$var1 # to show the contents of var1 from data1 without the attach function

0.8

1.1

70 90

EH

-3 -1 1

ASI

6 8

GYF

240

Si quieres obtener algunas estadsticas involucradas en los diagramas de caja, utiliza los siguientes comandos: b=boxplot(data1); b$stats # gives the value of the lower end of the whisker, the first quartile (25th percentile), second quartile (median=50th percentile), third quartile (75th percentile), and the upper end of the whisker. # plot() is a general graphic command with numerous options. plot(x) # plots the data x plot(var1, var2) # plots var1 in dependence of var2 abline(line(var1,var2)) # add a regression line

plot(y,z, main="Enter Title Here") # scatterplot with variables y and z fit=lm(y~z) #A fitted straight line is shown in the plot by executing two more commands
abline(fit)

Exportando grficas
Hacer click derecho en cualquier lugar de la ventana activa de la grfica, mostrar un men sensible al contexto, que te permite guardar la grfica como metafile(EMF) o con formato postscript (PS).Las opciones Copy as metafile o Copy as bitmap (BMP) coloca la grfica en el portapapeles. Inmediatamente necesitas pegarla en alguna aplicacin como MS Word. Hay mas formatos de grficos disponibles en el men principal. Mientras que la ventana de la grfica este activa, selecciona el men File y luego en Save As. Esto enlistar seis formatos de archivo (metafile, postscript, PDF, PNG, BMP y JPG en tres niveles de calidad), as que tienes muchas opciones. Cul es la mejor opcin de formato de grficas? En general el formato metafile, conserva la calidad de la grfica, an cuando se redimensiona en la aplicacin que se utilice despus. Por

241

otro lado, JPG es la eleccin popular el tamao del archive es mucho menor y compatible con internet. Excepto por muy raras circunstancias, yo no recomendara el mapa de bits (bitmap), puesto que es muy grande y tiene muy poca calidad de imagen cuando se redimensiona. El formato de archivos postscript es til cuando se incluye el archivo del grfico en otro archivo del mismo formato, o cuando la impresora es compatible. La calidad de la imagen no se deteriora cuando se redimensiona. Utiliza el formato metafile para aplicaciones de MS office (por ejemplo Word, Powerpoint). Dentro de la ventana del grfico haz click derecho y selecciona copy as metafile. Esto transferir la figura al portapapeles de windows. Ve a Powerpoint y pgalo como metafile. Para publicaciones, guarda los grficos con formato jpg.

Exportando datos
write.table(x, file = "dataOut.txt", append = FALSE, col.names = NA, sep = " ") # with the above commands a textfile will be created in in the working directory. To change the working directory use the following getwd() #displays the path for the working directory dir() # lists the files in the current work directory setwd("C:/Axel StatisticsR") # sets the working directory manually # open the text files in excel using the text import wizard.

Manejo de los paquetes de R

Hay varias pginas en internet dedicadas a temas estadsticos especficos Por ejemplo, para el anlisis de los datos de un microarreglo utilizando R, puedes consultar: http://bioconductor.org/ Descarga los paquetes de R desde diversos sitios de Internet y gurdalos en carpetas como archivos zip. Dentro del programa R, usa la opcin install from local zip files. Instala los paquetes directamente desde R, utilizando los siguientes comandos: install.packages("corrgram") install.packages("agricolae") install.packages("gplots") install.packages("UsingR") install.packages("lattice") install.packages(maanova") # Once you have downloaded the packages, activate them with the library function. Then you can use the extended functions in those packages.

# Example (agricolae)
data1=read.table(file="clipboard", header=T, sep="\t") # import data attach(data1) #to make the variables defined in data1 accessible to the console library(agricolae) #load and activate library model1=aov(Yield~Gen) #define a model and change variables df=df.residual(model1) MSerror=deviance(model1)/df comparison = HSD.test(Yield,Gen,df,MSerror, group=TRUE) bar.err(comparison,std=TRUE) #for plotting a graph #Make an additional LSD test with:

242

comparison = LSD.test(Yield,Gen,df,MSerror, p.adj="bonferroni", group=FALSE) bar.err(comparison,std=TRUE) #for plotting a graph #For adjusting the graph you can modify some options like: bar.err(comparison,std=TRUE,ylim=c(0,45),density=4,border="blue") #AMMIS biplots: model= AMMI(Env, Entry, Rep, Yield, graph="biplot",number=FALSE) #For adjusting the graph you can modify some options like: model= AMMI(Env, Entry, Rep, Yield, xlim=c(-4,4),ylim=c(-4,4), graph="biplot",number=FALSE)

# Example (Pairwise.T.test)
data1=read.table(file="clipboard", header=T, sep="\t") # import data attach(data1) #to make the variables defined in data1 accessible to the console pairwise.t.test(Var1, Var2) # make t.tests of Var1 grouped by category Var2 # if you want to export the data you need to use following commands: x=pairwise.t.test(Var1, Var2) # create an object x for exporting write.table(x$p.value, file = "dataOutPairwise.txt", append = FALSE, col.names = NA, sep = " ") # a textfile will be created in in the working directory. getwd() #displays the path for the working directory dir() # lists the files in the current work directory # open the text file in excel using the text import wizard. # Another option to make multiple comparisons. model1=aov(var1~var2) TukeyHSD(model1, "var1")

#Example PCA analysis (bioconductor)

#first you need to define the source to download the package source("http://bioconductor.org/biocLite.R") biocLite("pcaMethods") #downloading needs only to be done the first time library(pcaMethods) #load the library. Necessary to do it every time you run R # For importing data you have 3 options ## 1) load the matrix with data. Considering that row names are present data=read.table(file.choose(), header=T, sep="\t", row.names=1) ## or 2) not considereing the ID of metabolites or genes data=read.table(file.choose(), header=T, sep="\t") ## or 3) importing data from clipboard data=read.table("clipboard", header=T, sep="\t") # depends on the type of data, you can use: ## 1) variables in the rows and samples in the columns md = prep(t(data), scale = "none", center = TRUE) ## or 2) variables in the columns and samples in the rows md = prep((data), scale = "none", center = TRUE) ## then do the analysis. In this case for the first 5 principal components. resPPCA = pca(md, method = "ppca", center = FALSE, nPcs = 5)

243

slplot(resPPCA) # to plot the results resPPCA@scores # to see all the principal components (treatment) resPPCA@loadings # to see all the loadings

#Example PCA analysis (native R)

data=read.table("clipboard", header=T, sep="\t") #importing data from clipboard # depends on the dataframe you have: ## 1) variables in the rows and samples in the columns md = prep(t(data), scale = "none", center = TRUE) ## or 2) variables in the columns and samples in the rows md = prep((data), scale = "none", center = TRUE) md=data.frame(md[,2],md[,3],md[,4],md[,5],md[,6],md[,7]) ## Analysis for 2 principal components. pc=princomp(md, scale=TRUE) loadings(pc) biplot(pc) pc summary(pc)

#Example PCA analysis (agricolaeAMMIS)

Rep 1 Plot 1 Entry A Env Yield

E1 36.3 E1 2 4 A 37.9 E1 1 2 B 49.9 E1 2 5 B 50.3 E1 1 3 C 80.1 E1 2 6 C 82.3 E2 1 1 A 44.4 E2 2 4 A 46.3 E2 1 2 B 22.3 E2 2 5 B 20.8 E2 1 3 C 85.4 E2 2 6 C 86.7 E3 1 1 A 82.4 E3 2 4 A 86.3 E3 1 2 B 92.3 E3 2 5 B 92.8 E3 1 3 C 90.3 E3 2 6 C 94.6 data5=read.table(file="clipboard", header=T, sep="\t") # import data attach(data5) #to make the variables defined in data1 accessible to the console library(agricolae) #load and activate library model= AMMI(Env, Entry, Rep, Yield, graph="biplot",number=FALSE)

244

PC 1 2

% 85.1 14.9

2 E3 PC 2 1

E2

-1 B -4 -2 0 PC 1 2

C 4

#For changing the range of the axes use xlim and ylim: model= AMMI(Env, Entry, Rep, Yield, xlim=c(-3,3),ylim=c(-4,4), graph="biplot",number=FALSE)

#Example: Conditional Averaging

# use the same datatable as above (data5) data5=read.table(file="clipboard", header=T, sep="\t") # import data data5$avRep=ave(data5$Yield,data5$Rep) # create new column with averages among Reps data5$avEntry=ave(data5$Yield,data5$Entry) # create new column with average among Entries

#Making special graphics

# Example (gplots) data1=read.table(file="clipboard", header=T, sep="\t") # import data attach(data1) #to make the variables defined in data1 accessible to the console library(gplots) #load extended plot library plotmeans(var1~var2) #plot means with error bars

245

CONOC

40

50

60

n=19 BIOL

n=21 IBQ

n=7 ING

n=12

n=12

n=8 QFB

INGAGR OTRO

CARRERA2

# Example (lattice) x=read.table(file="clipboard", header=T, sep="\t") # import data attach(x) #make variables accessible library(lattice) #load library xyplot(var1~ var2)

80 70

CONOC

60 50 40 30 20 BIOL IBQ ING INGAGR OTRO QFB

CARRERA2

dotplot(var1~ var2) barchart(var1~ var2) stripplot(var1~ var2) bwplot(var1~ var2)

80 70

CONOC

60 50 40 30 20 BIOL IBQ ING INGAGR OTRO QFB

# Example (Simple) install.packages("UsingR") require(UsingR) data1=read.table("clipboard", header=T, sep="\t")

246

attach(data1) simple.violinplot(var1 ~ var2, col=8)

20 40 60 80

BIOL

IBQ

ING

INGAGR OTRO

QFB

par(new=TRUE) #for adding to an existing graph. Next function will add. plot(var1 ~ var2, add = TRUE) # so that a new plot is not started # Example (ellipse) data1=read.table("clipboard", header=T, sep="\t") library(ellipse) plotcorr(cor(data1, use = "pairwise.complete.obs"))

INGLES

PROBA

BIOQ BIOL INGLES PROBAB QUIM

library(corrgram) corrgram(data1)

#Trellis graphs
#In order to produce Trellis plots you must load the Lattice" library and start a trellis aware" device. library(lattice) trellis.device() #Make conditional plots with the coplot function coplot(var1 ~ var2 | var3) # plot var1 against var2, subdivided in categories var3

QUIM

BIOQ

BIOL

247

Given : SEXO

NO 80

SI

CONOC

30

40

50

60

70

NO

SI

PROPED

# It is possible to use two conditional variables in the form of var3*var4 coplot(var1 ~ var2 | var3*var4) # plot var1 against var2, subdivided in categories var3 and var4

248

Given : SEXO
M F NO SI 30 50 70

30 50 70

OTRO

QFB

30 50 70

30 50 70

NO

SI

PROPED

#Options for the coplot function: coplot(formula, data, given.values, panel = points, rows, columns, show.given = TRUE, col = par("fg"), pch = par("pch"), xlab = paste("Given :", a.name), ylab = paste("Given :", b.name), number = 6, overlap = 0.5, ...) co.intervals(x, number = 6, overlap = 0.5) # formula # Add a trendline #Use the functions lm() and abline() to add a trendline to an existing plot. data1=read.table("clipboard", header=T, sep="\t") attach(data1) plot(var1, var2) model1=lm(var1~var2) abline(model1,lwd=2) #The lwd specifies the line width model1 #To show the slope and intercept of the trendline # To add text to a graphic text (x, ...) text.default (x, y = NULL, labels = seq(along = x), adj = NULL, pos = NULL, offset = 0.5, vfont = NULL, cex = 1, col = NULL, font = NULL, xpd = NULL) mtext(text, side = 3, line = 0, outer = FALSE, at = NULL, adj = NA, cex = NA, col = NA, font = NA, vfont = NULL) title(main="Name") # Multiple plots per page #You can combine multiple plots into one overall graph, using either the

BIOL

IBQ

Given : CARRERA2

30 50 70

CONOC

30 50 70

ING

INGAGR

249

par( ) or layout( ) function. With the par( ) function, the option mfrow=c(nrows, ncols) creates a matrix of nrows x ncols plots that are filled in by row. mfcol=c(nrows, ncols) fills in the matrix by columns. par(mfrow=c(2,2)) plot(var1,var2, main="Title plot1") plot(var1,var3, main="Title plot2") hist(var1, main="Title Histogram") boxplot(var1, main="Title Boxplot", xlab="label1", ylab="label2") # The layout( ) function has the form layout(mat) where mat is a matrix object specifying the location of the N figures to plot. # Example of one figure in row 1 and two figures in row 2 layout(matrix(c(1,1,2,3), 2, 2, byrow = TRUE)) hist(wt) hist(mpg) hist(disp)

# 3D Perspective Plot
0.841 0.909 0.141 -0.757 -0.959 -0.279 0.657 0.989 0.412 -0.544 0.746 0.789 0.141 -0.687 -0.819 -0.276 0.611 0.836 0.401 -0.518 0.678 0.710 0.140 -0.634 -0.730 -0.272 0.573 0.742 0.390 -0.495 0.628 0.652 0.140 -0.592 -0.667 -0.269 0.543 0.676 0.380 -0.475 0.587 0.606 0.139 -0.558 -0.619 -0.266 0.516 0.625 0.371 -0.457 0.554 0.570 0.139 -0.530 -0.580 -0.263 0.494 0.585 0.363 -0.441 0.526 0.540 0.138 -0.505 -0.548 -0.260 0.474 0.553 0.355 -0.427 0.502 0.514 0.138 -0.484 -0.521 -0.257 0.456 0.525 0.347 -0.414

data3=read.table(file="clipboard", header=F, sep="\t") # import data without header data3=data.matrix(data3) # convert table to a data matrix x=c(1:10) # define x variable. In this case 10 values y=c(1:8) # define y variable. In this case 8 values par(mfrow=c(2,2)) # for plotting 4 graphs in one page contour(x, y, data3, col="blue") # plot contour image(x, y, data3) # plot image persp(x, y, data3, col="blue", theta = -20, phi = 15, scale = FALSE, axes = TRUE)

250

# # Example of Graph: p <- c(0:1000)/1000 x <- 6*(p^2)*((1-p)^2) plot(p,x,col="red",type="l") title(main="Likelyhood function", ylab="Likelyhood: L(p)") grid()
Likelyhood function

Firsts Exercises

data3

Likelyhood: L(p)

0.0 0.0

0.1

0.2

0.3

0.2

0.4 p

0.6

0.8

1.0

# Example of data import and analysis: To perform statistical tests, first copy the data into the clipboard and then use the following commands in R: data1=read.table(file="clipboard", header=T, sep="\t") summary(data1) #lists a summary of the data attach(data1) #to make the variables defined in data1 accessible to the console t.test(var1,var2) #T.test between data contained in two variables. Use the names of the variables inside the object. In my case they were named as var1, and var2. t.test(var1~var2) #T.test within data of variable1 grouped by categories specified in variable 2. Grouping factor of var2 must have exactly 2 levels. # Note the important difference between the t.test(var1,var2) and t.test(var1~var2) since in the first case you are comparing all values of var1 against all values of var2. In the second case, you make subgroups of the values contained in var1 depending in the grouping

251

levels defined in var2. If you have more than 2 grouping levels in var2, then it is better to use the pairwise.t.test function. pairwise.t.test(var1, var2) # make t.tests of var1 grouped by categories var2. The result is a pairwise comparison matrix. Note the comma in (var1, var2) ave(var1, var2) # make averages of var1 grouped by factor categories var2. The result is a vector of the same length as var1. #To make an analysis of variance: a=aov(var1~var2) #defines a new object a with the results of the analysis of variance a #lists the content of the previously created object a summary(a) #lists the summary of the statistical results of object a attributes(a) #lists all attributes of new object #To make a linear model: model1=lm(var1 ~var2+var3+var4) summary(model1) # show summary of the linear model attributes(model1) # shows all attributes of the new object

#Examples & Exercises

Make Volkswagen Ford Eagle Acura Buick Chrysler Cylinder V4 V4 V4 V6 V6 V6 Weight 2330 2345 2560 3265 3325 3450 Mileage 26 33 33 20 23 22 Type Small Small Small Medium Large Medium using the command

#Copy the above table from word and then import data read.table(file="clipboard" header=T) in the R console as following: CarData=read.table(file="clipboard", header=T)

# Boxplots are very useful when comparing grouped data. For example, side-by-side boxplots of weights grouped by vehicle types are shown below: attach(CarData) boxplot(Weight ~Type) # create boxplot of Weight grouped by Type title("Weight by Vehicle Types") # put title to the graph boxplot(Mileage title("Mileage by Cylinder") plot(Mileage, Weight) # title("Mileage by weight") create a # put title to the graph x,y ~Cylinder) scatterplot

252

#Example of grain yield trial data

REP 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 BLK 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 6 6 6 6 6 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 3 3 3 3 PLOT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 ENTRY 6 5 2 28 11 12 1 19 27 26 25 9 4 18 13 3 14 30 20 7 23 10 17 8 24 29 21 16 15 22 28 25 15 14 1 6 27 13 10 21 18 22 11 3 RANGE 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 LONGROW 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 20 19 18 17 16 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 1 2 3 4
GYF 11.00 8.60 7.46 10.99 11.23 11.32 8.20 10.01 12.46 13.19 10.23 11.64 7.08 5.32 8.96 9.61 11.20 11.98 5.98 6.53 7.55 11.30 9.00 8.41 10.06 11.52 6.82 12.93 7.36 9.66 12.25 9.88 7.91 10.53 6.80 10.36 10.96 13.86 12.55 9.82 12.29 9.26 13.22 6.90 AD 60.0 58.0 60.0 63.0 63.0 64.0 60.0 61.0 63.0 64.0 64.0 63.0 60.0 66.0 65.0 60.0 60.0 65.0 64.0 64.0 64.0 64.0 63.0 66.0 66.0 65.0 61.0 60.0 61.0 60.0 60.0 61.0 62.0 57.0 57.0 58.0 60.0 61.0 60.0 61.0 61.0 62.0 60.0 60.0 ASI -2.0 1.0 0.0 1.0 -2.0 1.0 0.0 3.0 1.0 0.0 -2.0 -3.0 1.0 0.0 0.0 1.0 1.0 0.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 0.0 0.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 4.0 0.0 -1.0 0.0 1.0 1.0 1.0 -2.0 1.0 0.0 -2.0 -1.0 PH 185.0 194.0 165.0 192.0 224.0 205.0 210.0 215.0 217.0 215.0 233.0 180.0 205.0 208.0 213.0 215.0 203.0 209.0 203.0 174.0 195.0 213.0 218.0 204.0 230.0 210.0 208.0 203.0 212.0 208.0 239.0 220.0 230.0 211.0 210.0 220.0 223.0 209.0 217.0 207.0 217.0 218.0 219.0 219.0 EH 96.0 99.0 70.0 109.0 120.0 109.0 109.0 113.0 109.0 113.0 108.0 85.0 82.0 92.0 103.0 113.0 92.0 102.0 109.0 90.0 88.0 106.0 106.0 93.0 115.0 118.0 104.0 105.0 113.0 107.0 130.0 121.0 123.0 108.0 95.0 117.0 121.0 113.0 102.0 92.0 102.0 124.0 104.0 108.0 EPO 0.52 0.51 0.42 0.57 0.54 0.53 0.52 0.53 0.50 0.53 0.46 0.47 0.40 0.44 0.48 0.53 0.45 0.49 0.54 0.52 0.45 0.50 0.49 0.46 0.50 0.56 0.50 0.52 0.53 0.51 0.54 0.55 0.53 0.51 0.45 0.53 0.54 0.54 0.47 0.44 0.47 0.57 0.47 0.49 EPP 1.35 0.96 1.00 1.08 1.04 1.00 0.91 0.96 1.00 1.24 1.00 1.13 1.40 1.07 1.00 1.04 1.00 0.91 0.85 0.94 1.12 0.96 1.00 0.96 1.00 1.09 0.76 0.96 0.87 0.92 1.16 0.96 0.92 1.05 0.95 1.04 1.00 0.96 0.92 1.05 1.17 1.06 1.19 0.83

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2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2

3 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 6 6 6 6 6

45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60

8 12 20 2 17 29 9 19 7 5 23 30 4 24 26 16

3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3

5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

9.48 12.37 8.72 7.30 7.64 11.82 10.23 8.46 8.10 6.43 7.53 10.49 7.32 5.60 10.92 10.96

60.0 60.0 59.0 60.0 60.0 65.0 61.0 61.0 60.0 58.0 60.0 66.0 60.0 63.0 60.0 60.0

1.0 0.0 -1.0 1.0 1.0 0.0 0.0 1.0 1.0 0.0 1.0 0.0 1.0 2.0 1.0 1.0

225.0 200.0 224.0 190.0 217.0 205.0 204.0 209.0 171.0 183.0 195.0 189.0 194.0 191.0 227.0 197.0

123.0 103.0 103.0 97.0 83.0 97.0 115.0 101.0 74.0 76.0 90.0 86.0 96.0 88.0 107.0 96.0

0.55 0.52 0.46 0.51 0.38 0.47 0.56 0.48 0.43 0.42 0.46 0.46 0.49 0.46 0.47 0.49

1.00 1.04 1.00 0.81 1.00 1.05 1.14 1.05 1.05 1.00 1.43 1.20 1.10 0.93 1.30 1.05

#Copy the above table and then type the command in the R Console: TrialData=read.table(file="clipboard", header=T) attach(TrialData) #make variables accessible boxplot(GYF ~ENTRY) # create boxplot of GYF grouped by category ENTRY boxplot(GYF ~ENTRY, notch=T) # Same as above but with notch option set to TRUE. If the notches of two plots do not overlap this is strong evidence that the two medians differ boxplot(GYF ~REP) # create boxplot of GYF grouped by category REP a=aov(GYF ~ENTRY) # make anova of GYF grouped by category ENTRY summary(a) # show summary of anova pairwise.t.test(GYF, BLK) # make t.tests of GYF grouped by category BLK #The pairwise.t.test function is quite useful since it makes T-tests with all possible two groups and provides a matrix of P values. This allows identifying groups that are significantly different from each other. Unfortunately, it seems that R can only handle about less than 20 groups. #Linear models let you find causal relationships of the dependent variables. A breeder, for example, would be interested in modeling grain yield in dependence of other trial parameters and secondary traits. Copy the table with grain yield data and then enter following command in R for modeling. TrialData=read.table(file="clipboard", header=T, sep="\t") attach(TrialData) #make variables accesible model1=lm(GYF ~REP+BLK+PLOT+ENTRY+AD+ASI+PH+EH+EPO+EPP) summary(model1) # show summary of the linear model # the lm coefficients let you know how much is the dependence from the other variable, whereas the p values indicate if the relationships are significant or not. #Construct a new variable called SELINDEX taking into account the coefficient of those variables which were significant in the linear model. In this case use GYF, EPP and ASI TrialData$SELINDEX=GYF+EPP*3.5-ASI*0.4 #Define a new variable called SELINDEX based on a linear combination of other variables GYF, EPP and ASI. The coefficients given by the linear model were used as weighting factors for this selection index. boxplot(GYF ~ENTRY)

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1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 # GYF #From the above boxplot, decide which is the highest yielding entry? Is it entry 10,11,12, 13 or 26? Are the differences significant? We can plot the selection index to find an answer. boxplot(SELINDEX ~ENTRY)

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 SELINDEX # title(main="Selection Index") # to put a title to the graph #From the above boxplot it can be seen that entry 11 is significantly better than entry 10, 12, 13 and 26. This was not significant if only looking at GYF parameter (previous boxplot). This highlights the usefulness of including secondary traits into the analysis.

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# Some interesting codes

#To add an extra column containing the rank to a ragged array indexed by more than one grouping factors: rank.lists <-with( data1, tapply( yield, list( site=site, year=year ), rank ) ) #To add an additional column ``rank'' containing the rank of the ``yield'' of the different varieties in relation to the indices ``year'' and ``site'' to the data1 object. I achieved to calculate the ranks but I do not manage to merge this result to the original dataframe. model1 <- lme(math ~ grade, mathdata, random=~grade|studentid)

#Ejemplo en espaol
data1 = read.table(file="data1.txt", header=T) #El objeto "data1" contiene ahora los datos del archivo data1.txt. Utilice help() para aprender mas de las funciones que va a utilizar para analizar sus datos. Mas que poner el nombre del archivo, es mejor usar la funcin file.choose() para escoger cualquier archivo de texto en cualquier directorio. data1 = read.table(file.choose(), header=T) summary(data1) # Le da un resumen de las estadsticas bsicas attributes(data1) # Le da los "atributos" attributes(data1)$names # Le da los nombres de las variables attach(data1) # Anexa los datos de manera que R sepa de la existencia de esas variables sin necesidad de referirnos al objeto. summary(long) # Nos da el resumen de la variable "long" summary(data1$long) # tambien da el resumen de la variable "long" # para acceder una variable sin el commando attach ponga el nombre del objeto seguid del simbolo de pesos $ plot(longitud,c) # Obteniendo una grfica (scatter plot o diagrama de dispercin) de longitud x c

#Glosary of frequent R functions

? name #does the same as help(name) a=aov(var1~var2) #defines a new object a with the results of the analysis of variance attach(data1) #to make the variables defined in data1 accessible to the console attach(object) #makes the elements of object available to be called directly attributes(data1) #lists the atributes of data1: variable and row names boxplot(data1) #boxplot data1=edit(data.frame()) # opens a window to define data1 manually data1=read.table(file.choose(),header=T) # select file with a popup window data1=read.table(file="clipboard") #import data from clipboard. Works only if there are no empty cells data1=read.table(file="clipboard", header=T, sep="\t") #import data from clipboard. Works even if empty cells are present

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data1=read.table(file="clipboard", header=T, sep="\t", na.strings="") #import data from clipboard. Works even if empty cells are present. Fills empty cells with NA. detach(data1) #to detach the variables defined in data1 help (name) #provides help about "name" hist(data1) #simple histogram ls() #shows the variables in the workspace names(table) #what are the variables inside the table pairs(data1) #splom plot pairwise.t.test(var1, var2) # make t.tests of var1 grouped by categories var2. The result is a pairwise comparison matrix. plot(data1) #simple scatter plots rm(list = ls()) #removes all variables from the work space rm(variable) #removes that variable or object round(cor(data1),2) #correlation matrix rounded to 2 decimals summary (lm(var1~0+var2*var3)) #summary of the results of a linear model with interactions summary (lm(var1~var2)) #summary of the results of a linear model summary(a) #summary of the contents of object a summary(aov(var1~var2)) #summary of the analysis of variance summary(data1) #lists a summary of the data t.test(var1,var2) #T.test between two variables. Use the names of the variables inside the object. In my case they were named as var1, and var2. t.test(var1~var2) #T.test within data of variable1 grouped by categories specified in variable 2. Grouping factor of var2 must have exactly 2 levels.

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9. Biologa de sistemas
9.1. Introduccin
La biologa de sistemas, tambin llamada biologa integral, incluye la genmica, transcriptmica, protemica y metabolmica, todas ellas unidas por las herramientas bioinformticas. Se trata de entender las funciones moleculares de un organismo en trminos globales. Para lograrlo, primero hay que aprender el idioma del DNA y entender el lenguaje de las protenas. La expresin de un gen, o la aparicin de un fenotipo se pueden entender como una cadena de informacin. El flujo de informacin en algunos casos es monodireccional, mientras que en otros es bidireccional. Al principio de la cadena est el DNA y los genes, que representan el potencial de lo que una planta puede hacer; despus estn el ARN y los transcritos que es lo que la planta planea hacer para adaptarse al ambiente durante su desarrollo; posteriormente llegan las protenas que definen lo que la clula esta realizando en determinado momento; al final estn los metabolitos, que es lo que la planta produce y nos interesa cosechar. Por ejemplo; en el caso del maz, nos interesa el almidn, las protenas y los lpidos que obtenemos de los granos.

Genoma: Totalidad de genes que tiene un organismo. Se puede definir como el DNA que esta dentro del ncleo y organelos de las clulas. Hay que recordar que algunos organelos tienen su propio genoma (cloroplastos y mitocondrias). Epigenoma: Conjunto de modificaciones que no alteran la secuencia de nucletidos, pero que s afectan la expresin de los genes, y adems son heredables (metilaciones, etc.). Transcriptoma: Conjunto de RNAs que estn presentes en un determinado momento en un tejido especfico. Por lo regular se refiere a los mRNAs que codifican para protenas. Proteoma: Conjunto de protenas que estn presentes en un tejido. Se refiere tanto a la acumulacin de protenas estructurales, as como enzimas funcionales y factores regulatorios. Metaboloma: Conjunto de metabolitos de un tejido (molculas que participan en el metabolismo). Muchas veces, los metabolitos es lo que finalmente nos importa, porque es lo que cosechamos y tiene importancia econmica.

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9.2. Genmica
Se denomina genmica al conjunto de ciencias y tcnicas dedicadas al estudio integral del funcionamiento, la evolucin y el origen de los genomas. El genoma es la suma de todos los genes de un determinado organismo, es decir es toda la informacin que est codificada en el DNA de una clula. La genmica usa conocimientos derivados de distintas ciencias como son: biologa molecular, bioqumica, informtica, estadstica, matemticas, fsica, etc. Muchas veces, la genmica es usada como sinnimo de otras reas de estudio relacionadas, por ejemplo, la protemica o la transcriptmica. Las ciencias genmicas han tenido un importante auge en los ltimos aos, sobre todo gracias a las nuevas tcnicas de secuenciacin de DNA, a los avances en bioinformtica, y a las tcnicas cada vez ms sofisticadas. La gentica clsica parte de un fenotipo, generalmente mutante, y busca el o los genes responsables de dicho fenotipo. A diferencia, la genmica su estrategia es en la direccin opuesta. Tiene como objetivo predecir la funcin de los genes a partir de la determinacin previa de todas las secuencias. La genmica (principalmente potenciada con la conclusin del proyecto del genoma humano) es un campo nuevo de investigacin con un potencial de gran impacto. La aplicacin de tecnologas a la medicina genmica, as como la secuenciacin del DNA, la bioinformtica, la protemica, y otras, consideradas en la actualidad como tecnologas exticas han tenido aplicacin reciente en las naciones desarrolladas. Roderick en 1986 introdujo el trmino genmica para discernir la secuencia de bases o molculas que constituyen el genoma de los organismos, en lo particular los objetivos principales de la genmica son:conocer la totalidad de los genes de un ser vivo y la expresin de sus transcritos, en relacin con sus procesos metablicos, sus caractersticas estructurales y sus caractersticas funcionales; as como relacionar y aplicar dicha informacin con losprocesos de enfermedad del organismo en estudio. En este sentido, se calcula que la diferencia gentica entre dos individuos es del 0.1% del genoma con aproximadamente tres millones de pares de bases. Dentro de estas variaciones se encuentran el polimorfismo del nucletido simple (SNPs), la forma ms comn de variacin del DNA en muchas especies. El estudio de los SNPs es de gran utilidad para entender la susceptibilidad o resistencia gentica a una enfermedad en particular, y conocer la predisposicin a determinadas patologas y variaciones genticas del metabolismo. En humanos, la investigacin genmica acorta el camino en la investigacin mdica hacia sus aplicaciones en la prevencin, diagnstico y tratamiento de enfermedades transmisibles, genticas, cardiovasculares, cncer, diabetes, psicosis mental grave entre otras. La medicina genmica est en sus inicios en los pases desarrollados y en corto plazo servir de base para el diseo de nuevos mecanismos de atencin a la salud. La pregunta a plantear es cmo las naciones en vas de desarrollo pueden tener acceso a los beneficios de la genmica? Muchos de los conocimientos actuales de la genmica ya han sido publicados, pueden considerarse como conocimientos del pblico en general, aunque existen compaas que hacen uso de esta informacin para desarrollar productos y servicios de carcter privado. Tarea 9-1: Con sus palabras describa las diferencias entre: genoma, epigenoma, transcriptoma, proteoma y metaboloma. De tambin un ejemplo de que tipos de equipos de laboratorio se usan para cada una.

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9.3. Transcriptmica
Con el aumento de secuencias de genes en las bases de datos, se ha producido una explosin en la aplicacin de herramientas a gran escala para analizar perfiles de expresin en los sistemas biolgicos. La capacidad de analizar cualitativa y cuantitativamente poblaciones de mRNA (transcriptmica) y protenas (protemica) suscitan la tentadora posibilidad de descifrar las rutas reguladoras y funcionales que representan el puente entre el genotipo y el fenotipo. En trminos prcticos, el perfil transcripcional de un organismo se puede determinar usando microarreglos de cDNA u oligonucletidos. Las tecnologas de miniaturizacin y automatizacin han permitido masificar el estudio de todo el transcriptoma y no slo de unos pocos genes. Los macroarreglos y microareglos ha avanzado tanto en los ltimos aos que es una realidad rutinaria en muchos laboratorios de biologa vegetal, como lo prueba el que aparezcan cada vez ms artculos cientficos que recogen este tipo de enfoque experimental. La perspectiva transcriptmica es particularmente atractiva ya que el RNA es qumicamente ms homogneo que las protenas. El mRNA se puede extraer, manipular in vitro, amplificar y secuenciar. Esto permite analizar cuantitativamente distintas situaciones fisiolgicas, de desarrollo o en distinta localizacin tisular de muchos miles de productos gnicos distintos de forma simultnea, lo que representa un estudio amplio del transcriptoma. Tarea 9-2 Averige por internet cuales son las metodologas que actualmente ms se usan para detectar cidos nucleicos (DNA o RNA), protenas y metabolitos.

9.4. Protemica
Un eslabn en la cadena de informacin entre el genotipo y el fenotipo es el proteoma. El trmino protemica se est convirtiendo en algo ambiguo que engloba casi cualquier aspecto de la expresin de protenas, el estudio de su estructura o su funcin. Sin embargo, en trminos generales, debera definirse como el estudio del perfil del conjunto de protenas de una clula o un tejido en un determinado momento. Sera anlogo al perfil de transcritos en una situacin dada. A diferencia de los estudios de transcriptmica en los que el RNA se extrae y manipula con facilidad, los estudios con protenas presentan mltiples desafos. Primero esta la heterogeneidad fisicoqumica y complejidad estructural de las protenas, lo que complica su extraccin, solubilizacin, manejo, separacin e identificacin. Adems, no existe ningn tipo de tecnologa similar a la PCR que permita amplificar aquellas protenas que son poco abundantes. Algunos de estos problemas son particularmente crticos cuando se trabaja con tejidos vegetales. Hay ya algunas bases de datos disponibles que contienen datos sobre perfiles de protenas. La segunda categora en el anlisis de protemica es la llamada protemica comparativa, donde el objetivo no es identificar todas las protenas presentes en una situacin concreta, sino caracterizar las diferencias entre distintas poblaciones de protenas en dos situaciones biolgicas diferentes. Este tipo de enfoque es en cierta medida anlogo a los perfiles comparativos de genes con libreras de cDNA substractivas. Gran parte del esfuerzo en protemica se ha realizado para desarrollar mtodos de alta resolucin para separar e identificar protenas. Uno de los pasos crticos es la extraccin y preparacin de muestras. Los tejidos vegetales son usualmente ms complicados a la hora de preparar extractos de protenas que otras fuentes biolgicas. Tienen menor contenido de protenas, usualmente contienen ms proteasas y otros compuestos que interfieren en la estabilidad de las protenas (polisacridos, lpidos y compuestos fenlicos), adems de toda una coleccin de metabolitos secundarios que pueden interferir no slo en el proceso de extraccin, sino tambin en el fraccionamiento y posterior anlisis.

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A pesar de los grandes progresos que se han realizado en protemica de plantas, hay que tener en cuenta una serie de limitaciones tericas y prcticas. Los costos y los materiales necesarios para llevar a cabo este tipo de estudio son muy altos. Hay mucha esperanza de que en un futuro prximo ser posible obtener datos de protenas a gran escala. Sin embargo, comparativamente, la cantidad y calidad de datos que se puede esperar de la protemica es mucho menor que la de otras tecnologas, como la transcriptmica o la genmica.

9.5. Metabolmica
La metabolmica aparece como una nueva herramienta funcional de la genmica que contribuye a nuestra comprensin de las complejas interacciones moleculares en los sistemas vivos. Al ser una de las ltimas micas aparecida, presenta todava muchos campos metodolgicos que se pueden y se deben mejorar antes de que aparezcan bases de datos que nos permitan integrar las concentraciones de metabolitos con el resto de recursos de la genmica. La metabolmica representa la progresin lgica desde los estudios a gran escala de micromatrices de cDNA y protemica hasta el tratamiento en conjunto de un sistema biolgico completo (biologa de sistemas). Los metabolitos de las plantas son importantes para muchas de las respuestas de resistencia al ataque de patgenos, en condiciones de estrs y contribuyen al color, sabor y olor de flores y frutos. El fenotipo bioqumico de una planta es el resultado de la interaccin entre el genotipo y el entorno. Por tanto, se necesita identificar y cuantificar los metabolitos para estudiar la dinmica del metaboloma y analizar los flujos metablicos. El reto de la metabolmica reside en encontrar cambios en las cantidades de metabolitos que se puedan correlacionar con el estado fisiolgico y de desarrollo de una clula, de un tejido o de un organismo. La enorme diversidad bioqumica que existe en las plantas hace que los metabolitos distintos que pueden encontrarse en plantas se estime que sean ms de 200,000. Esto hace que una aproximacin en gran escala al estudio de los metabolitos presentes en las plantas sea un tremendo reto. La necesidad de utilizar tecnologas diversas para caracterizar los metabolitos presentes en plantas refleja el grado de complejidad para abordar este tipo de estudio. La deduccin de cmo es el contexto biolgico de una planta dada a partir de datos obtenidos por la medida de las concentraciones de metabolitos requiere, por tanto, que la identificacin y cuantificacin de los mismos se realice con gran fiabilidad. El puente necesario que debe existir entre la metabolmica y las otras aproximaciones de la gentica funcional: transcriptmica y protemica, permitir el desarrollo de bases de datos que almacenen, integren, relacionen y permitan establecer relaciones causales entre genes, transcritos, protenas y metabolitos. Para obtener un conocimiento global de cmo funciona un sistema biolgico es esencial saber cmo responden los tres niveles de expresin. Slo as ser posible deducir asociaciones relevantes entre macromolculas, identificar correlaciones funcionales con fenotipos y construir modelos que describan de forma cuantitativa la dinmica de un sistema biolgico. Estos anlisis fenotpicos a gran escala permitirn en un futuro predecir como ser el comportamiento de una planta dada en un determinado contexto medioambiental.

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La metabolmica es el anlisis del metabolismo desde una perspectiva global. Es como ver un mapa de metro desde arriba.

Figura 9-1. Ciudad de Berln, Alemania, con sus lneas de metro

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Figura 9-2. Ejemplo de rutas metablicas en hgado. La metabolmica trata de medir todos los metabolitos que estn presentes en un tejido, y de est forma hacer inferencias simples sobre las propiedades complejas de un sistema de redes entrelazadas. Por ejemplo, de cmo estn reguladas las distintas rutas metablicas. La metabolmica estructural se concentra en elucidar todas las rutas metablicas existentes, tomando en cuenta todos los pasos qumicos, los procesos enzimticos y los genes que estn involucrados. La metabolmica funcional trata de entender como estn coordinadas las diversas rutas bioqumicas por medio de la regulacin individual de enzimas clave. Para hacer metabolmica, es muy importante entender todas las tcnicas analticas que se usan en los laboratorios para medir metabolitos cuantitativamente. En los siguientes captulos se explican algunas metodologas y principios de manera ilustrativa y breve.

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10.
10.1.
10.1.1.

Herramientas Bioqumicas
Fundamentos de enzimologa
Qu es una reaccin qumica?

Una reaccin qumica es todo proceso molecular en el que unas o ms sustancias (reactantes) sufren transformaciones para convertirse en otras molculas (productos). Las reacciones qumicas por lo regular consisten en un reacomodo de enlaces covalentes entre diferentes tomos. Es decir, se trata de un rearreglo de los orbitales electrnicos. Por ejemplo, en la reaccin 2H2 + O2 -> 2 H2O se forman dos molculas de agua a partir de dos molculas de hidrogeno y una molcula de oxgeno. En este reaccin se rompen enlaces y de distribuyen los electrones de una forma diferente. A las representaciones simblicas de las reacciones se les llama ecuaciones qumicas. Una ecuacin qumica indica la forma y los pasos en que se puede llevar a cabo una posible transformacin de las molculas. Las reacciones se dan bajo ciertas premisas y leyes que pueden ser cualitativas o cuantitativas. Tarea 10-1 Para entender las reacciones qumicas es importante definir muy bien ciertos conceptos bsicos. Investigue en un libro avanzado de qumica los siguientes conceptos y haga un breve resumen. La conservacin de las masas La conservacin de las cargas elctricas El concepto de molaridad de Avogadro El concepto de equilibrio qumico de Le Chatelier La reversibilidad de una reaccin La entropa y la entalpa de una reaccin Tarea 10-2 Cmo aplican los conceptos anteriores para la biologa vegetal? De ejemplos usando las reacciones de la fotosntesis en las hojas de las plantas. Las ecuaciones qumicas se pueden clasificar en distintas categoras: Reaccin de sntesis: Elementos o compuestos sencillos se unen para formar un compuesto ms complejo. A+B AB Reaccin de descomposicin; Un compuesto se fragmenta en elementos o compuestos ms sencillos. AB A+B Reaccin de desplazamiento simple o sustitucin simple: Un elemento reemplaza a otro en un compuesto. A + BC AC + B. En su explicacin sencilla, es cuando alguien le roba la pareja a otro. Reaccin de doble desplazamiento o doble sustitucin: Los iones en un compuesto cambian lugares con los iones de otro compuesto para formar dos sustancias diferentes. AB + CD AD + CB. Para un entendimiento prctico es el intercambio de parejas. Los dos tipos fundamentales de reacciones qumicas son: las reacciones del tipo cido-base (neutralizacin y disociacin) y las reacciones del tipo redox (oxidacin o reduccin). Reacciones cido-base Reacciones redox Se dan cuando se intercambian protones, sin Se dan cuando hay cambios en los estados de cambios en los estados de oxidacin en las oxidacin de los tomos. Por ejemplo en la reaccin molculas. Por ejemplo la reaccin H2O -> H+ + 2H2 + O2 -> 2 H2O el hidrogeno pierde un electrn OH- consiste en un reacomodo de los protones, sin (se oxida) mientras que los tomos de oxgeno

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alterar el estado de oxidacin de cada tomo. La reaccin HCl + NaOH -> NaCl +H2O es otro ejemplo, y en este caso se llama reaccin de neutralizacin. Las reacciones acido-base pueden estar acompaadas por cambios en el pH, pero no necesariamente siempre es as. Por ejemplo, la formacin de un enlace peptdico, o la hidrlisis de un enlace glicosdico son reacciones del tipo cidobase en las que no cambia el pH.

ganan dos electrones (se reducen). Otro ejemplo de una reaccin redox es la formacin de xido de hierro producida al reaccionar el oxgeno del aire con el hierro. Las reacciones ms comunes de oxidorreduccin dentro de una clula viva son las que involucran los cofactores NADH o NADPH.

Desde un punto de vista general se pueden postular solamente esos dos grandes modelos para las reacciones qumicas, que corresponden a un reacomodo ya sea de electrones o de protones. Bajo el concepto de Lewis, las reacciones de cido-base involucra el reacomodo de orbitales ocupados y libres (orbitales con y sin electrones). Mientras que la reacciones redox involucran el movimiento de uno o ms electrones entre orbitales de diferentes tomos. Las transformaciones qumicas como la combustin, deshidratacin, hidrlisis, neutralizacin, pueden ser clasificadas ya sea en reacciones acido-base, reacciones redox o una combinacin de ambas. Los procesos de solubilizacin, precipitacin, evaporacin, condensacin ms que ser reacciones qumicas son procesos fsicos. Tarea 10-3 Clasifique las siguientes reacciones qumicas: 2HCl + CaCO3 -> CaCl2 + CO2 + H2O 2Na + 2H2O -> H2 + 2NaOH Tarea 10-4 Dentro de una clula vegetal suceden algunas de las siguientes reacciones bioqumicas. Clasifquelas segn el tipo de reaccin qumica: Glucosa + ATP -> Glucosa-6-P + ADP ATP + H2O -> ADP + Pi Etanal + NADH + H+ -> Etanol + NAD+ Fructosa,1,6-bis-P -> GAP + DHAP Sacarosa + H2O -> Glucosa + Fructosa Glucosa-6-P + NADP+ -> Gluconato-6-P + NADPH + H+

10.1.2.

Qu es un catalizador?

Para que una reaccin qumica se lleve a cabo, las molculas necesitan pasar de un estado electrnico a otro. Este paso a veces requiere de un estado transitorio de ms alta energa. Los catalizadores por definicin son aquellas sustancias que de alguna manera intervienen en la formacin de este estado transitorio. Los catalizadores son aquellas sustancias que estabilizan este estado transitorio, y de esta forma aumentan la velocidad de reaccin.
La estabilizacin del estado transitorio significa que se requiere menos energa de activacin para llegar a ese estado. El modelo probabilstico de qumica (Bolzmann) dice que las molculas tienen una amplia distribucin de su energa cintica, por lo que a una determinada temperatura siempre hay un nmero de molculas que tienen mas o menos energa que el promedio. El promedio global de las molculas depende directamente de la temperatura (constante de Bolzmann multiplicada por la temperatura = kT). Con una reduccin en la energa de activacin se logra que un gran nmero de molculas tenga ms energa que ese nivel mnimo. Esta es la razn por la que las reacciones se aceleran con un catalizador, ya que hay ms molculas de la poblacin global que pueden reaccionar.

Los catalizadores se pueden clasificar en dos grandes grupos:

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Catalizadores Inorgnicos: Son metales como el Nquel, el Platino, etc. Se usan industrialmente y trabajan en condiciones como presin o temperatura extremas. Catalizadores Biolgicos: son las enzimas formadas generalmente por protenas. Son biomolculas complejas que tienen diversos grupos funcionales y que estn acomodados en una conformacin tridimensional definida.

10.1.3.

Qu es una enzima?

Los catalizadores biolgicos por excelencia son las protenas con sus grupos funcionales. Las enzimas estn hechas de 20 diferentes aminocidos, mientras que las ribozimas son catalizadores hechos de cidos ribonucleicos. Las principales caractersticas de las enzimas biolgicas son: Disminuyen la energa de activacin Se unen y modifican la estructura del sustrato Se requieren en pequeas cantidades Son altamente especficas Son regulables. Es decir, son susceptibles de ser activadas o inhibidas Intercambian diferentes formas de energa (cintica, qumica, vibracional, etc) Se desnaturalizan bajo condiciones extremas como una temperatura de 60oC o un pH de 1. Las enzimas pueden formar complejos con otras protenas o factores. A esos complejos funcionales (enzimacofactor) se les llama holoenzimas. Algunos de los principales componentes de las holoenzimas son: Coenzimas: Son molculas orgnicas tales como CoA, NAD, NADP, ATP y ADP. Grupos prostticos: son cofactores complejos que pueden unir metales como: Fe, Cu, Mg, Ca, Zn y Mo.

10.1.4.

Caractersticas generales de una reaccin enzimtica

Como todos los catalizadores, las enzimas funcionan disminuyendo la energa de activacin de una reaccin y acelera sustancialmente la velocidad de la conversin qumica. Las enzimas no alteran el balance energtico de las reacciones en que intervienen, ni modifican, por lo tanto, el equilibrio de la reaccin (G), pero consiguen acelerar el proceso incluso millones de veces. Ver Figura 10-1.

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Figura 10-1. En la imagen de la izquierda se muestra como varia la energa libre en una reaccin qumica cuando se pasa de reactantes a productos. En la imagen de la derecha se muestra la comparacin de una reaccin llevada a cabo por una enzima donde la diferencia de energa libre es menor, debido a que las enzimas disminuyen la energa de activacin. Una reaccin que se produce bajo el control de una enzima, o de un catalizador en general, alcanza el equilibrio mucho ms deprisa que la correspondiente reaccin no catalizada. Por ejemplo, la descomposicin del agua oxigenada (H2O2) para dar H2O y O2 puede ocurrir sin catalizador, con un catalizador inorgnico (platino), o con un enzima especfico (catalasa). Las respectivas energas de activacin (Ea) para cada proceso son 18, 12 y 6 Kcal/mol. As, se puede calcular que el platino acelera la reaccin 20,000 veces, mientras que la catalasa la acelera 370,000 veces. Al igual que ocurre con otros catalizadores, las enzimas no son consumidas por las reacciones que ellas catalizan, ni alteran su equilibrio qumico. Sin embargo, las enzimas difieren de otros catalizadores por ser ms especficas. Las enzimas pueden catalizar alrededor de 4,000 reacciones bioqumicas distintas. No todos los catalizadores bioqumicos son protenas, pues algunas molculas de RNA son capaces de catalizar reacciones. A estas se les llama ribozimas, como por ejemplo el fragmento 16S de los ribosomas en el que reside la actividad peptidil transferasa.

10.1.5.

Cmo funcionan las enzimas?

Prcticamente todas las reacciones qumicas que tienen lugar en los seres vivos estn catalizadas por enzimas. Llevan a cabo reacciones especficas y casi siempre actan sobre un nico sustrato o sobre un grupo muy reducido de ellos. El mecanismo cataltico de una enzima comienza cuando el sustrato se une a una regin concreta de la enzima, llamada centro activo. El centro activo comprende un sitio de unin formado por los aminocidos que estn directamente implicados en el mecanismo de la reaccin estando en contacto directo el sustrato y un sitio cataltico. Es decir, las molculas de los reactantes deben chocar con una energa y una orientacin adecuadas. La actuacin del enzima permite que los reactantes (sustratos) se unan a su centro activo con una orientacin ptima para que la reaccin se produzca. La unin al centro activo modifica las propiedades qumicas del sustrato, debilitando los enlaces existentes y facilitando la formacin de otros nuevos.

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Figura 10-2. Ejemplo de la transformacin del sustrato en el sitio activo de una enzima hacia la formacin de producto. La enzima no permanece esttica, sino que se mueve al unirse al primer sustrato. En el caso de la hexocinasa, la unin a glucosa hace que la enzima se cierre como una tijera, lo que crea un nuevo sitio para unin del ATP. Los productos obtenidos a partir de ciertos tipos de reactivos dependen de las condiciones bajo las que se da la reaccin qumica. No obstante, tras un estudio cuidadoso se comprueba que, aunque los productos pueden variar segn cambien las condiciones, determinadas cantidades permanecen constantes en cualquier reaccin qumica. Ests cantidades constantes, las magnitudes conservadas, incluyen el nmero de tomos presentes, la carga elctrica y la masa total. La cantidad de producto que se suele obtener de una reaccin qumica de forma prctica, es menor que la cantidad terica. El rendimiento de una reaccin depende de varios factores, como la pureza del reactivo, las reacciones secundarias que puedan tener lugar, etc. Cuando uno de los reactivos est en exceso, el rendimiento deber calcularse respecto al reactivo limitante. En este contexto es importante recordar el concepto de equilibrio qumico de Le Chatelier. Tarea 10-5. Considere la reaccin AB + C <-> AC + B Usando el principio de Le Chatelier, que debe agregar o quitar para desplazar la reaccin hacia la derecha? Que debe hacer para maximizar la cantidad de producto AC? Compare sus respuestas con otros compaeros y disctalo con su maestro de clases. Para que una reaccin ocurra tiene que existir un choque efectivo entre las molculas. Los choques efectivos dependern de la naturaleza de los reactivos, de su concentracin y de la orientacin de las molculas cuando ocurre el encuentro. Tarea 10-6. Entre en Internet a http://reacciones.colegiosandiego.com/ejercicios.html, y realice los ejercicios, prcticas y juegos marcados ah. Compare sus resultados con los compaeros. Corrija sus errores con la literatura especializada

10.1.6.

Nomenclatura de las enzimas

Hay varias formas de asignarle un nombre a un enzima: nombres particulares, nombre sistemtico, cdigo de la comisin enzimtica (enzyme comisin o EC). Antiguamente, los enzimas reciban nombres particulares, asignados por su descubridor. Tambin se les daba un nombre segn su origen, por ejemplo, la papaina es una enzima que se extrae de la papaya. Al ir aumentando el nmero de enzimas conocidos, se hizo necesaria una nomenclatura sistemtica que informara sobre la accin especfica de cada enzima y los sustratos sobre los que actuaba.

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El nombre sistemtico de un enzima consta actualmente de 3 partes: el sustrato preferente, el tipo de reaccin realizada terminacin "asa. La mayora de las enzimas se clasifican dependiendo la actividad que realicen sobre el sustrato. Tipo de reaccin Hidrolasa Liasa Oxido-reductasa Transferasa Isomerasa Ligasa Ejemplos Lipasa, Proteasa, Amilasa Aldolasa, Phenylamonia liasa Alcohol deshidrogenasa Hexocinasa G-6-P-isomerasa Citrato sintasa

Muchos enzimas catalizan reacciones reversibles. No hay una manera nica para fijar cual de los dos sentidos se utiliza para nombrar al enzima. La glucosa fosfato isomerasa cataliza la isomerizacin de la glucosa-6-fosfato en fructosa-6-fosfato. As, la glucosa-6-fosfato isomerasa tambin podra llamarse fructosa-6-fosfato isomerasa. Cuando la accin tpica del enzima es la hidrlisis del sustrato, el segundo componente del nombre se omite y por ejemplo, la lactosa hidrolasa se llama simplemente lactasa. Adems de los nombres sistemticos, an persisten otros consagrados por el uso. As, la glucosa-ATP fosforiltransferasa se llama habitualmente glucocinasa. El nombre de cada enzima puede ser identificado por un cdigo numrico, encabezado por las letras EC (enzyme commission), seguidas de cuatro nmeros separados por puntos. El primer nmero indica a cual de las seis clases pertenece el enzima, el segundo se refiere a distintas subclases dentro de cada grupo, el tercero y el cuarto se refieren a los grupos qumicos especficos que intervienen en la reaccin. As, la ATP:glucosa fosfotransferasa (glucocinasa) se define como EC 2.7.1.2. El nmero 2 indica que es una transferasa, el 7 que es una fosfotransferasa, el 1 indica que el aceptor es un grupo OH, y el ltimo 2 indica que es un OH de la D-glucosa el que acepta el grupo fosfato. En funcin de su accin cataltica especfica, las enzimas se clasifican en 6 grandes grupos o clases: Clase 1: OXIDORREDUCTASAS Clase 2: TRANSFERASAS Clase 3: HIDROLASAS Clase 4: LIASAS Clase 5: ISOMERASAS Clase 6: LIGASAS Como se menciona anteriormente, una de las caractersticas de las enzimas es la cantidad de enzima, por ello es importante cuantificarla. La cantidad de enzima necesaria para transformar un mol de sustrato en un minuto se llama Unidad de enzima. La actividad enzimtica tambin se puede medir en catales, que es la cantidad de enzima necesaria para transformar un mol de sustrato en un segundo. (Stryer, Enzymes: Basic Concepts and kinetics. Chapter 8. 2007).

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Figura 10-3. Cambio conformacional de la enzima debido a la unin de la glucosa a la hexocinasa.

10.1.7.

Regulacin de la actividad enzimtica

Una molcula de enzima no tiene por qu actuar siempre a la misma velocidad. Su actividad puede estar modulada por: cambios en el pH, cambios en la temperatura, presencia de cofactores las concentraciones del sustrato y de los productos finales, presencia de inhibidores, modulacin alostrica, modificacin covalente, activacin o inactivacin por proteolisis. A continuacin se explican algunos ejemplos de los tipos de regulacin enzimtica.

10.1.7.1.

Efecto del pH sobre la actividad enzimtica

Los enzimas poseen grupos qumicos ionizables (carboxilos -COOH; aminos -NH2; tioles -SH; imidazol, fenol, etc.). Estos representan algunos de los grupos funcionales de las cadenas laterales de sus aminocidos. Segn el pH del medio, estos grupos pueden tener carga elctrica positiva, negativa o neutra. Como la conformacin de las protenas depende, en parte, de sus cargas elctricas, habr un pH en el cual la conformacin ser la ms adecuada para la actividad cataltica. Este es el llamado pH ptimo. Es decir, la mayora de las enzimas son sensibles a la concentracin de protones en la solucin, por lo que desviaciones por encima o por debajo del pH ptimo pueden afectar su actividad. La influencia del pH se da por un lado por la estructura terciaria de la protena, y por otro lado por el mecanismo de reaccin que a veces requiere protones como catalizadores. La mayora de las enzimas celulares funcionan en un rango de pH de 6 a 8. Sin embargo, existen enzimas como la pepsina estomacal que tienen un pH ptimo de 2. Un pH extremo puede detener la actividad enzimtica al provocar la desnaturalizacin de la estructura proteica rompiendo enlaces inicos y puentes de hidrgeno.

Figura 10-4. Grfica del efecto del pH sobre la estructura de las protenas. En los tres ejemplos se observa que el mximo de actividad enzimtica (pH ptimo) se encuentra a diferentes valores de pH que representa que en el sitio activo participan diferentes aminocidos con grupos ionizables distintos.

10.1.7.2.

Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimtica

En general, los aumentos de temperatura aceleran las reacciones qumicas. La regla clsica de bioqumica dice que por cada 10C de incremento, la velocidad de reaccin se duplica. La mayora de las reacciones catalizadas por enzimas siguen esta ley general. Sin embargo, al ser protenas, a partir de cierta temperatura, se empiezan a desnaturalizar por el calor. La

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temperatura a la cual la actividad cataltica es mxima se llama temperatura ptima. Por ejemplo, las enzimas humanas se encuentran generalmente entre los 35 y los 40C, siendo 37C la temperatura media de las clulas humanas. La mayora de las enzimas comienzan a desnaturalizarse rpidamente a partir de los 40C. Esto se debe a alteraciones de la estructura de la protena debidas a la interrupcin de uniones inicas que resultan en la estabilizacin de la estructura tridimensional de la enzima. En cambio, las enzimas de las arqueas termfilas, que se encuentran en manantiales calientes, son estables hasta a 100C. Sin embargo, la idea de una temperatura "ptima" para una reaccin enzimtica puede ser engaosa, ya que la velocidad observada es el producto de la velocidad de la reaccin qumica y la concentracin de la enzima activa sin desnaturalizarse. La Figura 10-5 muestra que por encima de esta temperatura, el aumento de velocidad de la reaccin debido a la temperatura es contrarrestado por la prdida de actividad cataltica debida a la desnaturalizacin trmica, y la actividad enzimtica decrece rpidamente hasta anularse.

Figura 10-5. Grfica que explica del efecto de la temperatura sobre la actividad enzimtica. La velocidad aumenta a medida de que se incrementa la temperatura hasta alcanzar la temperatura ptima. Si la temperatura aumenta por encima de este punto, la enzima pierde su actividad debido al dao en la estructura tridimensional. Tarea 10-7 Los cultivos vegetales no se dan igual de bien en todos los climas. Hay unos que crecen bien a ciertas temperaturas pero no a otras. El maz no se crece ptimamente a las mismas temperaturas a las que se cultiva generalmente la papa. Haga una lista con ms ejemplos. Postule algunas hiptesis de por que esto es as. Relacione los efectos fisiolgicos conocidos a nivel de la productividad de las plantas, con los efectos que ha aprendido a nivel molecular de las clulas vegetales.

10.1.7.3.

Efecto de los cofactores en la actividad enzimtica

A veces, una enzima requiere para su funcin la presencia de sustancias no proteicas que colaboran en la catlisis: los cofactores. Los cofactores pueden ser iones inorgnicos como el Fe2+, Mg2+, Mn2+, Zn2+, etc. Casi un tercio de las enzimas conocidas requieren cofactores. Cuando el cofactor es una molcula orgnica se llama coenzima. Muchos de estos apoenzimas se sintetizan a partir de vitaminas. En la Figura 10-6 podemos observar una molcula de mioglobina (protena que transporta oxgeno al tejido muscular) y su coenzima (el grupo hemo, representado en color verde). Cuando los cofactores y las coenzimas se encuentran unidos covalentemente a la enzima se llaman grupos prostticos. La forma catalticamente activa, es decir, la enzima unida a su grupo prosttico, se llama holoenzima. La parte proteica de una holoenzima (inactiva) se llama apoenzima, de forma que: apoenzima + grupo prosttico= holoenzima. Ver Figura 10-6 Figura 10-6. Imagen de la estructura cuaternaria de una enzima mostrando los cambios estructurales al unirse un cofactor y el sustrato en el sitio activo de pasar de holoenzima a apoenzima.

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10.1.7.4.

Efecto de la concentracin de sustrato sobre la actividad enzimtica

La velocidad de una reaccin enzimtica depende de la concentracin de sustrato. Si aumenta la concentracin de sustrato aumenta la velocidad de la reaccin o actividad enzimtica. Sin embargo, un grado extremo de saturacin tambin puede limitar la velocidad mxima y hasta inhibirla. Una enzima est saturada cuando los sitios activos de todas las molculas estn ocupados la mayora del tiempo. A partir del punto de saturacin la reaccin no puede acelerarse mediante adicin de sustrato, sea cual sea la cantidad aadida. En un grfico la velocidad de reaccin habra alcanzado una meseta.

[S4] [S3] [S2]

Producto

[S1]

Tiempo
Figura 10-7. Grfica de curso de reaccin de una enzima a cuatro diferentes concentraciones de sustrato. Tanto la velocidad inicial, como el valor absoluto del producto final son distintos.

10.1.7.5.

Efecto de la fuerza osmtica sobre la actividad enzimtica

La mayora de las enzimas no pueden tolerar concentraciones de sal extremadamente altas. Los iones de sodio interfieren con los enlaces dbiles inicos de las protenas. Las enzimas tpicas son activas en concentraciones salinas de 1 a 500 mM. Existen excepciones como las enzimas de organismos halfilos. Sin embargo, en la mayora de las enzimas al encontrarse a una concentracin alta de sal se debilitan las fuerzas bsicas que estabilizan a la estructura y por lo tanto su funcin se pierde. Por lo regular los iones de sodio (Na+) son ms dainos para las enzimas citoslicas que los iones de potasio (K+). Tarea 10-8 Investigue porque los cultivos como el maz no pueden ser regados con agua salina de mar, mientras que las palmeras de coco aguantan muy bien ese tratamiento. Haga un comparativo entre los efectos de los iones de cloruro, sodio, potasio, magnesio, fsforo y sulfato. Relacione los efectos fisiolgicos a nivel de la planta, con algunos efectos a nivel molecular de las clulas vegetales.

10.1.8.

Modelo cintico de Michaelis-Menten

Los estudios sistemticos del efecto de la concentracin inicial del sustrato sobre la actividad enzimtica comenzaron a realizarse a finales del siglo XIX. Ya en 1882 se introdujo el concepto del complejo enzima-sustrato como intermediario del proceso de catlisis enzimtica. En 1913, Leonor Michaelis y Maud Menten (ver Figura 10-8) desarrollaron esta teora y propusieron una ecuacin de velocidad, que explica el comportamiento cintico de las enzimas.

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Figura 10-8. Imgenes de de Leonor Michaelis (Izquierda) y Maud Menten (derecha). Para explicar la relacin observada entre la velocidad inicial (Vo) y la concentracin inicial de sustrato ([S]o) Michaelis y Menten propusieron que las reacciones catalizadas enzimticamente ocurren en dos etapas: En la primera etapa se forma el complejo enzima-sustrato y en la segunda, el complejo enzima-sustrato da lugar a la formacin del producto, liberando el enzima libre.

Sustrato Enzima

Complejo Enzima Sustrato

Productos

E+S

ES

E+P

Figura 10-9. Representacin de la unin del sustrato con la enzima y la formacin de producto. E + S <-> ES <-> EP <-> E + P En las reacciones bioqumicas hay pasos intermedios que se llaman ES y EP que se refieren al complejo de enzima unido al substrato o al producto. Las flechas en las dos direcciones indican que la reaccin es reversible en todos sus pasos. Es importante tener en cuenta que la enzima no se degrada, sino que se recicla durante la catlisis. Es decir, la suma de E + ES + EP se mantiene siempre constante. Lo que s cambia despus del tiempo, es la cantidad de E y de P, como en cualquier reaccin en la que un substrato se transforma en un producto. Sin embargo, la proporcin de E y de P que finalmente se obtendr depende el equilibrio qumico y de las constantes de energa y no de la enzima. La enzima slo determina la velocidad de la reaccin y acelera el establecimiento del equilibrio qumico. La afinidad que existe entre la enzima y el sustrato, se caracteriza por su constante de Michaelis, Km. El valor de Km se refiere al valor de la concentracin de S cuando la cantidad de enzima unida al substrato (ES) o producto (EP) es igual a la cantidad de enzima libre (E). Es decir cuando E=ES+EP. La Km es la concentracin de sustrato con la que la enzima alcanza la mitad de su Vmax, sus unidades se expresan en moles por litro. Por su parte, la Vmax es la velocidad mxima que puede alcanzar una enzima en su punto de saturacin. Es decir cuando todas las enzimas estn unidas a un substrato (ES>>E) y casi no hay enzima libre (E=0). Las unidades de Vmax se miden en moles/min. Es importante saberse de memoria la ecuacin de Michelis y Menten, ya que esta explica la grafica de saturacin mostrada en la Figura 10-7. .

v=

[ S ] * V max Km + [ S ]

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La ecuacin de Michelis-Menten explica la aparicin de productos, el recambio del complejo enzima sustrato, la velocidad (v) y la afinidad de una enzima (Km). La siguiente figura muestra la forma en que se deriva esta ecuacin (ver Figura 10-10).

Figura 10-10. Forma de derivar la ecuacin de Michelis y Menten. Se puede distinguir entre enzima libre [E] y enzima unido al sustrato [ES], de forma que la concentracin total de enzima, [ET], (que es constante a lo largo de la reaccin) es: [ET] = [E] + [ES]. Como [E] = [ET] [ES], resulta que: v1= k1 [S] [ET] k1 [S] [ES] Este modelo cintico La representacin grfica de la ecuacin de Michaelis-Menten que se comporta como una hiprbola. La Vmax corresponde al valor mximo al que tiende la curva experimental, y la Km corresponde a la concentracin de sustrato a la cual la velocidad de la reaccin es la mitad de la Vmax. La derivacin de Michaelis-Menten est descrita por Briggs y Haldane. Se obtiene de la siguiente manera: Se supone que la reaccin enzimtica es irreversible, y que el producto no se liga con la enzima despus de la reaccin.

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Siguiendo la aproximacin del estado estacionario, que seala que la concentracin del complejo enzima-sustrato (ES) es pequea y se mantiene casi constante a lo largo de la reaccin enzimtica:

Se define: Entonces: (1) La velocidad de reaccin es: (2) La concentracin total de la enzima:

[E0] = [E] + [ES]

Por lo tanto:

[E] = [E0] [ES] (3)

Sustituyendo (3) en(1) da: Reordenando:

Km [ES] + [S][ES] = [E0][S]

(4) Sustituyendo (4) en (2): Representado grficamente se obtiene una hiprbola que representa el cambio en la velocidad a medida que aumenta la concentracin de sustrato como se ve en la siguiente Figura. Figura 10-11. Representacin grfica de la curva de saturacin de una enzima donde se puede observar como evoluciona la relacin entre la concentracin de sustrato y la velocidad de la reaccin. Esta ecuacin puede ser analizada experimentalmente con un diagrama de Lineweaver-Burke o un diagrama de Eadie-Hofstee. Para determinar grficamente por medio Lineweaver-Burke de los valores de Km y Vmax es ms sencillo utilizar la representacin doble recproca (1/v0 frente a 1/ [S]0), ya que es una lnea recta. Esta representacin doble recproca recibe el nombre de representacin de Lineweaver-Burk. Es una recta en la cul: La pendiente es KM/Vmax .

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La abscisa en el origen (1/v0 = 0) es -1/Km. La ordenada en el origen (1/ [S]0 = 0) es 1/Vmax. De esta forma, a partir de los datos experimentales se puede calcular grficamente, los valores de Km y Vmax de un enzima para diversos sustratos.

Figura 10-12. Grfica de Lineweaver-Burke o de doble recproco muestra el significado de los puntos de corte entre la recta y los ejes de coordenadas, as como el gradiente de velocidad.

10.1.8.1.

Actividad enzimtica

Se define la unidad de actividad enzimtica (U), como la cantidad de enzima que cataliza la conversin de 1 mol de sustrato en un minuto. La actividad especfica es el nmero de unidades de enzima por miligramo de protena (U/mg prot), o por mililitro de disolucin (U/ml), o por gramo de peso freso (U/gFW).

10.1.8.2.

Efectos alostricos

Hay enzimas que no obedecen la ecuacin de Michaelis-Menten. Se dice que su cintica no es Michaeliana. Esto ocurre con las enzimas alostricas, cuya grfica de la velocidad frente a la concentracin de sustrato [S] no es una hiprbola, sino una sigmoidea. En la cintica sigmoidea, pequeas variaciones en la [S] en una zona crtica (cercana a la Km) se traduce en grandes variaciones en la velocidad de reaccin.

Figura 10-13. Ejemplificacin de cmo se realiza la inhibicin alostrica. A la izquierda. Curva de saturacin de una enzima alostrica, donde se puede apreciar una cintica sigmoidea.

10.1.8.3.

Tipos de inhibicin de la actividad enzimtica

Las enzimas catalizan, virtualmente, todos los procesos celulares, por lo que no es sorprendente que los inhibidores enzimticos se encuentren entre los agentes farmacuticos y agroqumicos ms importantes. Los herbicidas mas potentes como los gliofosatos, triazinas o fosfonotricinas, son agentes qumicos que inhiben la actividad enzimtica de ciertas protenas clave para la sobrevivencia de la clula vegetal. Tarea 10-9 Investigue cuales son los agentes activos de algunos de los herbicidas comerciales como Basta, Roundup, Sanson, etc. Averige cuales son las rutas metablicas que inhiben estos compuestos. Dibuje las formulas qumicas de estos herbicidas, y cmo estas molculas se pueden unir al sitio

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activo de una enzima para inhibirla. Postule una hiptesis de porque algunos herbicidas son selectivos para hierbas de hoja ancha (plantas dicotiledneas) y otros son mas efectivos para pastos (plantas monocotiledneas). Use los conocimientos que aprendi sobre inhibicin enzimtica para explicarlo. Un aspecto muy importante sobre la actividad de las enzimas, es su capacidad de activacin o inhibicin selectiva por otras molculas o protenas. Esta se de da por la formacin de metabolitos que inhiben la actividad enzimtica, ya sea contaminantes inespecficos o inhibidores especficos. Tambin se lleva a cabo por medio de protenas que modifican las enzimas, por ejemplo por fosforilacin de grupos hidroxilo o por modificaciones en los enlaces disulfuro entre diferentes residuos de cistena (regulacin redox). Est regulacin permite a las enzimas regular el flujo metablico en una determinada va. Los inhibidores se pueden clasificar en varios grupos, entre ellos los del tipo reversible y los que causan una inhibicin irreversible. Un tipo de inhibicin reversible es la denominada competitiva. Un inhibidor competitivo compite con el sustrato por el sitio activo del enzima, pero la reaccin normalmente no tiene lugar cuando se ha fijado el inhibidor. Los inhibidores competitivos son, frecuentemente, compuestos que se parecen al sustrato. Debido a que el inhibidor se une de manera reversible, se puede cambiar el sentido de la competicin en favor del sustrato simplemente aadiendo ms sustrato. Se distinguen 3 tipos de inhibiciones: Competitiva: El inhibidor compite por el sitio activo de la enzima. No competitivo: El inhibidor se une con la enzima libre en otro sitio diferente al cataltico, afectando su velocidad de reaccin. Acompetitivo: El inhibidor se une al complejo enzima-sustrato, ms no a la enzima libre. A continuacin se muestran los diferentes tipos de inhibicin y como se pueden diferenciar de manera grfica.

277

a) Sin Inhibicin

b) Inhibicin Competitiva

Inhibida

1 V

1 V

[I] km m = 1+ kI Vmax
[I]

1 km

1 Vmax

m=

km Vmax

1 Vmax

No inhibida Interseccin

1 [S]

1 1 + [I] km k I

[S]

c) Inhibicin No Competitiva

d) Inhibicin Acompetitiva

Inhibida

Inhibida

1 V

[I] km m = 1+ kI Vmax

[I]

1 V
Intersecciones

m=

km Vmax

[I]

No inhibida

1 km

1 [I] 1 + Intersecciones Vmax k I

kI km

1+ 1+

[I]

No inhibida Intersecciones Vmax

1 [I] 1 + kI

[S]

[S]

Figura 10-14. Grfica comparativas de los inversos del sustrato y la velocidad para los 3 tipos de inhibicin; a). Enzima no inhibida; b) inhibicin competitiva; c) inhibicin no competitiva y d) inhibicin acompetitiva. En la imagen de abajo se muestra en forma tridimensional una cinasa que es inhibida por ATP. Figura 10-15

Figura 10-15. Ejemplificacin de un complejo cataltico en tres dimensiones de la protena kinasa con un inhibidor, el ATP est adyacente al sitio activo.( Stryer) Tarea 10-10 Observa las grficas, e indica cules son las diferencias significativas

278

a) En cada grfica que indica cada una de las rectas. Qu ocurre con la Vmax y con la Km? b) compara cada tipo de inhibicin, qu ocurre con la Vmax y con la Km, En cules se modifica y en cules no? Tarea 10-11 Investigue, qu es la inhibicin alostrica? Observe y explique la figura de arriba.

10.2.
10.2.1.

Fundamentos de Espectrofotometra
La radiacin electromagntica

La espectrofotometra se refiere a la medicin de la cantidad de luz absorbida por una muestra en funcin de la longitud de onda. El sufijo de metra indica que es una metodologa cuantitativa y no slo cualitativa. Es una metodologa rpida, precisa, verstil, fcil de usar y eficiente en costo. Es uno de los mtodos ms usados en la bioqumica analtica. Para explicar los usos prcticos de la espectrofotometra, primero debemos repasar algunos fundamentos tericos sobre la luz y los cromforos. La luz tiene una naturaleza corpuscular y ondulatoria. La cantidad mnima de luz (paquete cuntico) se llama fotn. Los fotones son partculas, y ondas a la vez, segn dice el principio de incertidumbre de Heisenberg. No tienen masa, pero si energa, la cual esta definida, no por su velocidad que es constante en un determinado medio, sino por su frecuencia v (seg-1) o longitud de onda ().

E = hv
Ecuacin 11

c = v
Ecuacin 12

En donde: E = energa de la molcula h = constante de Planck v = frecuencia de la onda = longitud de onda c= constante de la velocidad de la luz en medio 8 vaco (~3 *10 m/s) I = intensidad de la luz. Se refiere al nmero de fotones, o al equivalente de watts de potencia

l
Figura 10-16. Representacin de una onda senoidal con su amplitud o intensidad I y su longitud lambda. Se denomina espectro electromagntico a la distribucin energtica del conjunto de las ondas electromagnticas. Referido a un objeto se denomina espectro electromagntico o simplemente espectro a la radiacin electromagntica que emite (espectro de emisin) o absorbe (espectro de absorcin) una sustancia. Dicha radiacin sirve para identificar la sustancia de manera anloga a una huella dactilar. Los espectros se pueden observar mediante espectroscopios que, adems

279

de permitir observar el espectro, permiten realizar medidas sobre este, como la longitud de onda, la frecuencia y la intensidad de la radiacin.

Figura 10-17. Espectro de absorcin visible. Tarea 10-12. Para evaluar el contenido de nitrgeno de las plantas, a veces se usa un dispositivo que mide el contenido de clorofila de las hojas. Esto se hace con un espectrofotmetro porttil que se usa mucho en las evaluaciones de campo, por ejemplo, para el mejoramiento de maz. Averige a que longitudes de onda trabajan estos equipos y haga una relacin de los fundamentos de espectrofotometra que necesita saber para entender el funcionamiento de este aparato. Investigue tambin a nivel bioqumico que tiene que ver la concentracin de clorofila con el contenido de nitrgeno y el tipo de fertilizante que se aplica en el suelo.

10.2.2.

Cromforos

Las molculas que pueden absorber fotones se llaman cromforos. Originalmente solo se refera a la captura de fotones del rango visible, pero ahora tambin se incluyen los rangos mas amplios desde el ultravioleta (UV), hasta el rojo lejano (FR). La absorcin de energa en el rango UV-VIS se debe a que estas molculas tienen electrones que pueden ser excitados de un nivel basal a un nivel energtico ms alto. Debido a que estos niveles energticos tienen valores discretos, nicamente los fotones de una determinada longitud de onda pueden excitar esos electrones. La energa de la luz incidente (hv) tiene que ser igual a la variacin de energa entre dos estados electrnicos (fundamental Eo y excitado E*) de los orbitales moleculares del cromforo. Los cromforos tpicos encontrados en protenas y cidos nucleicos absorben luz nicamente por debajo de 300 nm, aunque las protenas pueden contener otros grupos asociados que absorban a longitudes de onda mayores. Est absorcin espectroscpica en la regin del ultravioleta de las protenas y cidos nuclecos contiene informacin importante de la composicin de estas molculas complejas y de su conformacin o estructura tridimensional en solucin. Figura 10-18. La Intensidad y posicin de las bandas del espectro de absorcin

10.2.3.

Los auxocromos

Los auxocromos son grupos funcionales unidos a un cromforo que modifican su absorbancia en dependencia del estado de ionizacin del auxocromo. Estos grupos inonizables son por ejemplo grupos carboxilo, hidroxilo o amino: -COOH, -OH, - NH2. Si estos grupos estn en conjugacin directa con el sistema pi () del cromforo, estos modifican la longitud de onda a la que la luz es absorbida, y como resultado, cambian el espectro de absorcin del cromforo. Una caracterstica de los auxocromos es la presencia de al menos un par libre de electrones que extienden el sistema conjugado por resonancia (Figura 10-19). Los ejemplos ms comunes de molculas con propiedades auxocromicas son los indicadores de pH, como la fenoftalena, que cambian su color dependiendo de la concentracin de protones en el medio. El cambio de color de los indicadores de pH se debe a un cambio en los niveles energticos de los orbitales, y esto se ve reflejado en el espectro de absorcin en el rango de la luz visible.

280

Figura 10-19. Ejemplos de Cromforos y auxocromos. Modificado de Hesse et al, 1997

10.2.4.

Espectro de compuestos biolgicos

Muchos de los compuestos biolgicos de inters, como los cidos nucleicos y las protenas, son cadenas de monmeros. Para comprender sus espectros de UV-VIS debemos examinar varias contribuciones al espectro: absorcin espectral de los monmeros individuales contribucin de la cadena de polmero estructuras secundarias y terciarias, incluyendo la formacin de hlices Efectos de la cuveta y del solvente.
Una de las limitaciones de la espectrometra es que es necesario trabajar en contenedores de vidrio o de plstico. Esto restringe la espectrometra en el rango UV porque muchos de los plasticos usados para las microplacas y las microcuvetas bloquean la luz UV de 170-310 nm.

10.2.4.1. 10.2.4.2.

Espectro de los cidos nucleicos Espectro de las protenas

Poner ejemplo de espectro de adenina y de ADN y ARN.

Los cromforos presentes en una protena pueden dividirse en tres clases: el enlace peptdico, la cadena lateral de los aminocidos y el grupo prosttico. . Figura 10-20. Espectro de una protena En cuanto a las cadenas laterales de las protenas, las bandas de absorcin ms significativas se encuentra en el ultravioleta cercano, en el intervalo de longitud de onda entre 230 y 300 nm. Concretamente, los aminocidos aromticos absorben en el rango de 260-280nm.

281

La fenilalanina es la que menos absorbe, aunque muestra un espectro complejo con mltiples bandas diferenciadas en torno a 250-260 nm. Presenta tambin bandas de mayor energa que solapan con el espectro del enlace peptdico en 215 y 180 nm. Sin embargo como no absorbe por encima de 280 nm su contribucin al espectro en la zona del ultravioleta cercano de protenas suele ser pequea. La tirosina presenta un mximo a 275 nm con un hombro a 285 nm. La banda se desplaza a mayores longitudes de onda cuando se produce la desprotonacin del OH del anillo aromtico. Un cambio de pH produce grandes efectos en los espectros de tirosina ya que el lugar de protonacin afecta directamente a la conjugacin electrnica de la cadena lateral. El mayor cambio en el espectro de la tirosina por diferentes pHs se da a 240nm, pero tambin a 280nm. La triptfano tambin presenta un mximo a 280 nm. A diferencia de la tirosina, el especto del triptfano se mantiene casi inalterado a diferentes pHs. La cistena presenta una banda centrada a 250 nm, n-->* (max ~ 300 M-1.cm-1), pero apenas se puede considerar, ya que es muy dbil.

10.2.4.3.

Grupos prostticos

Muchas protenas contienen adems de los aminocidos otros grupos que pueden encontrarse unidos a la protena tanto de forma covalente como no covalente. En muchos casos puede que estos grupos sean cromforos y contribuyan al espectro de absorcin de la protena en el UVcercano o en el visible. Por ejemplo, flavinas, fosfato de piridoxal, metales presentan bandas de absorcin intensas en estas regiones espectrales, que pueden resultar casi imprescindibles para muchos estudios fsico-qumicos de la accin de estas protenas. Cambios espectrales en los distintos estados redox o segn el entorno en que se encuentran. Figura 10-21. Estructuras y espectros de algunos grupos prostticos

10.2.5.

La ley de Beer-Lambert

Cuando la luz atraviesa un medio acuoso su intensidad decae. Es decir, no todos los fotones que entran a un medio salen, ya que algunos son absorbidos (Figura 10-22). La ley de Beer-Lambert dice que la cada de intensidad es exponencial y depende de slo tres parmetros:

282

1) el factor molar de extincin del cromforo () 2) la concentracin del cromforo en la solucin (c) 3) la longitud de la cubeta que la luz atraviesa (d) Esto se puede representar de la siguiente forma:
Microcubeta

c=
concentracin de cromforo

Io
Intensidad inicial

=
coeficiente de absorcin molar

I1
Intensidad final

Fuente de luz

Fotocelda detectora

d
Figura 10-22. Ley de Beer- Lambert. Usando una microcubeta, se mide la intensidad que entra y que sale.

log

I0 = A = *c*d I1

En donde: log = logaritmo decimal I0 = intensidad de la luz incidente I1 = intensidad de la luz una vez que ha atravesado el medio A = valor decimal de absorbancia = coeficiente de absorcin molar de la sustancia c = concentracin de sustancia absorbente en el medio d = distancia que la luz atraviesa por el medio

Ecuacin 13

Las unidades de dependen del modo en que se exprese la distancia y la concentracin de la sustancia absorbente. Por lo regular, la distancia se especifica en centmetros (cm), la concentracin en micro moles por litro (mol/l) mientras que el coeficiente molar se expresa en las unidades reciprocas (l/mol*cm). De esta forma, el valor de absorbancia (A) no tiene unidad.
Monocromador

I0

Fotocelda

0%T

100%T

Microcubeta

Fuente luminosa

Figura 10-23. Medicin de la luz que atraviesa un medio acuoso. Ley de Beer-Lambert

283

La relacin entre la concentracin y la absorcin de luz a una determinada longitud de onda es la base de la espectrofotometra para identificar y cuantificar diversas sustancias. Si conocemos de y , la concentracin de la sustancia puede ser deducida a partir de la cantidad de luz absorbida, y esto se logra con un espectrofotmetro. El parmetro de lectura que arroja un espectrofotmetro es el valor de transmitancia (%T) o el valor de absorbancia (A) a una determinada longitud de onda usando una cubeta de definido grosor (d) (Figura 10-23). El por ciento de transmitancia (%T) se refiere a la cantidad de radiacin que pasa a travs de la muestra y alcanza el detector. Una solucin lmpida, no absorbente, mostrar una lectura de 100% de transmitancia, mientras que un cuerpo opaco absorber toda la radiacin que le llega resultando en una transmitancia de 0%. Las unidades de absorbancia son al revs. Una solucin translucida da una absorbancia de cero, mientras que entre ms opaco sea, mayor ser el valor de A. Las unidades de absorbancia van de 0 al infinito, pero los aparatos por lo regular solamente dan una respuesta lineal en el intervalo de 0 a 2 (Skoog et al., 1998) .La transmitancia (T), intensidad (I) y absorbancia (A) se relacionan de esta forma:

T=

I1 = 10 A I0

Ecuacin 14

10.2.6.
10.2.6.1.

Mtodos enzimticos.
Qu es un ensayo enzimtico?

Un ensayo enzimtico es un procedimiento experimental, mediante el cual se puede medir la velocidad de una reaccin enzimtica, o bien, medir la concentracin de un sustrato. Como las enzimas no se consumen en la reaccin que catalizan, los ensayos enzimticos suelen medir los cambios, bien en la concentracin de sustrato (que va decreciendo), bien en la concentracin de producto (que va aumentando). Existen diversos mtodos para realizar estas medidas. La espectrofotometra permite detectar cambios en la absorbancia de luz por parte del sustrato o del producto (segn la concentracin de estos) y la radiometra implica incorporacin o liberacin de radiactividad para medir la cantidad de producto obtenido por tiempo. Los ensayos espectrofotomtricos son los ms utilizados, ya que permiten medir la velocidad de la reaccin de forma continua. Por el contrario, los ensayos radiomtricos requieren retirar las muestras para medirlas, por lo que son ensayos discontinuos. Sin embargo, estos ensayos son extremadamente sensibles y permiten detectar niveles muy bajos de actividad enzimtica. Tambin se puede utilizar la espectrometra de masas para detectar la incorporacin o liberacin de istopos estables cuando el sustrato es convertido en producto.
Los ensayos enzimticos ms sensibles utilizan lser dirigidos a travs de un microscopio para observar los cambios producidos en enzimas individuales cuando catalizan una reaccin. Estas medidas pueden utilizar cambios producidos en la fluorescencia de cofactores que intervienen en el mecanismo de catlisis o bien unir molculas fluorescentes en lugares especficos de la enzima, que permitan detectar movimientos ocurridos durante la catlisis. Estos estudios estn dando una nueva visin de la cintica y la dinmica de las molculas individuales, en oposicin a los estudios de cintica enzimtica tradicionales, en los que se observa y se mide el comportamiento de una poblacin de millones de molculas de enzima.

En la Figura 10-24 se puede observar la tpica evolucin de una curva obtenida en un ensayo enzimtico. Inicialmente, la enzima transforma el sustrato en producto siguiendo un comportamiento lineal. A medida que avanza la reaccin, se va agotando la cantidad de sustrato y va disminuyendo la cantidad de producto que se genera por unidad de tiempo (disminuye la velocidad de la reaccin), lo que se manifiesta en forma de curva asinttica en la grfica.

284

Dependiendo de las condiciones del ensayo y del tipo de enzima, el perodo inicial puede durar desde milisegundos hasta horas. Los ensayos enzimticos suelen estar estandarizados para que el perodo inicial dure en torno a un minuto, para llevar a cabo las medidas ms fcilmente. Sin embargo, los modernos equipos de mezcla rpida de lquidos permiten llevar a cabo medidas cinticas de perodos iniciales cuya duracin puede llegar a ser inferior a un segundo. Est tipo de ensayos rpidos son esenciales para medidas de la cintica del estado estacionario, discutida ms abajo. Figura 10-24. Curva de saturacin de una reaccin enzimtica. En la figura anterior la pendiente representa, en el periodo inicial, la velocidad de la reaccin. La ecuacin de Michaelis-Menten describe como va variando la pendiente con la concentracin de sustrato o de enzima. En estos experimentos los parmetros cinticos se determinan a partir de expresiones de las concentraciones de las diferentes especies como funciones del tiempo. La concentracin del sustrato o del producto se mide en momentos posteriores a la rpida fase inicial y durante un tiempo lo suficientemente largo que permita a la reaccin acercarse al equilibrio. Este tipo de ensayos se intenta evitar por el error matemtico que se puede introducir y es cada vez menos practicado, pero fue muy ampliamente utilizado en los primeros periodos del estudio de la cintica enzimtica. La mayora de los estudios de cintica enzimtica se centran en el perodo inicial, es decir, en la zona lineal de la reaccin enzimtica (Figura 10-24). Sin embargo, tambin es posible medir toda la curva de la reaccin y ajustar estos datos a una ecuacin no lineal. La forma de medir las reacciones enzimticas es denominada anlisis de la curva de progreso. Est aproximacin es muy til como alternativa a las cinticas rpidas, cuando el perodo inicial es demasiado rpido para ser medido con precisin. Segn la fase de la reaccin estudiada, todos los ensayos enzimticos miden el sustrato consumido o el producto generado en la reaccin durante un tiempo. Por ejemplo, se miden los micromoles (mol) de producto generados por minuto. A la velocidad reaccin tambin se le llama actividad enzimtica. Existe un nmero grande de diferentes mtodos para medir la concentracin de sustratos y productos, y muchas enzimas pueden ser ensayadas de diferentes maneras. Segn el seguimiento de la reaccin, los ensayos enzimticos pueden dividirse en dos grupos segn la manera en que se sigue la medicin. Por una parte estn los ensayos continuos, en los que el mtodo ofrece una lectura continua de la actividad monitorizando a tiempo real el sustrato consumido o el producto generado. Por otra parte existen ensayos discontinuos, en los que la reaccin se detiene en un punto y se mide la concentracin de los sustratos o los productos.

10.2.6.2.

Ensayos continuos.

Los ensayos del tipo continuo son los ms convenientes, al obtener la velocidad de la reaccin directamente en tiempo real (online). Para que se puedan realizar, la deteccin tiene que hacerse de manera no intrusiva.

10.2.6.3.

Ensayos discontinuos.

En un ensayo discontinuo se toman muestras de una reaccin enzimtica en intervalos y se mide en ellas la cantidad de producto formado o sustrato consumido.

285

10.2.6.4.

Mtodos de deteccin.

Tanto para los ensayos continuos como discontinuos hay muchos mtodos diferentes de deteccin. Espectrofotomtricos: En los ensayos espectrofotomtricos puede seguirse el curso de una reaccin observando como cambia la luz absorbida por la solucin en la que se est dando la reaccin. Para poder utilizar un ensayo de este tipo debe haber entre los sustratos o los productos alguno que absorba luz a una longitud de onda determinada, y que sea la nica molcula de la mezcla de reaccin que lo hace a la misma; de esta forma, se puede observar el aumento o la disminucin de la absorbancia a dicha longitud de onda. Cuando la luz absorbida se encuentra en el espectro visible es posible observar un cambio en el color de la muestra, y entonces hablamos de mtodo colorimtrico. Tambin es usual el uso de la luz ultravioleta (luz UV), especialmente porque sirve para monitorizar reacciones en las que participan NADH y NADPH, coenzimas que participan en infinidad de reacciones bioqumicas y que absorben luz UV en forma reducida (NADH y NADPH), pero no en forma oxidada (NAD+ y NADP+). As, la actividad de una oxidorreductasa que use NADH como coenzima puede ser monitorizada siguiendo el descenso de la absorbancia a 340 nm a medida que se consume el NADH Calorimtricos: La calorimetra es la medida del calor liberado o absorbido por una reaccin qumica. Estos ensayos son muy generales, ya que muchsimas reacciones llevan asociado algn cambio de calor y utilizando un microcalormetro no es necesario utilizar grandes cantidades de enzima o sustrato. Estos ensayos pueden ser usados para medir reacciones imposibles de medir con otros mtodos. Quimioluminiscencia: La quimioluminiscencia es la emisin de luz por una reaccin qumica. Algunas reacciones enzimticas producen luz y esta puede ser medida para detectar la formacin de producto. Estos tipos de ensayo pueden ser extremadamente sensibles, ya que la luz producida puede ser registrada en una pelcula fotogrfica por das e incluso semanas, pero al mismo tiempo son de difcil cuantificacin, porque no toda la luz emitida por la reaccin ser detectada. La deteccin de la peroxidasa de rbano por quimioluminiscencia enzimtica (ECL, enzymatic chemiluminiscence) es un mtodo comn para detectar anticuerpos en el western blot. Otro ejemplo de quimioluminiscencia es la luciferasa, enzima presente en las lucirnagas que produce luz de forma natural a partir de su sustrato, luciferina. Radiomtricos: En los ensayos radiomtricos se mide la incorporacin de radiactividad en los productos o su liberacin desde sustratos. Los radioistopos ms usados en estos ensayos son 14C, 32P, 33P, 35S y 125I. Como los istopos radiactivos permiten el marcaje de un slo tomo de un sustrato, estos ensayos son extremadamente sensibles y especficos. Son frecuentemente utilizados en bioqumica y son a menudo la nica manera de medir una reaccin especfica en extractos crudos (mezclas complejas de las enzimas liberadas al lisar clulas). En estos procedimientos la radiactividad es normalmente medida en contadores de centelleo. Cromatogrficos: En los ensayos cromatogrficos se mide la formacin de producto separando los componentes de la mezcla de reaccin por cromatografa. Normalmente se lleva a cabo mediante HPLC. Aunque esta aproximacin puede requerir grandes cantidades de material de partida, su sensibilidad puede incrementarse mediante marcaje radiactivo de los sustratos o los productos. Fluorimtricos: En el fenmeno de la fluorescencia una molcula emite luz de una longitud de onda determinada tras absorber luz a otra longitud de onda. Los ensayos fluorimtricos usan la diferencia en la fluorescencia entre producto y sustrato para medir la reaccin enzimtica. Estos

286

ensayos son generalmente mucho ms sensibles que los espectromtricos, ya que son ms especficos al tener que utilizar dos longitudes de onda en lugar de una, pero pueden sufrir ms interferencias por impurezas presentes en el medio o por la inestabilidad que muchos compuestos fluorescente presentan al ser expuestos a la luz. Un ejemplo de estos ensayos es, una vez ms, el uso de las coenzimas NADH y NADPH. En este caso, las formas reducidas son fluorescentes y las oxidadas no. Las reacciones de oxidacin pueden, por tanto, ser seguidas por el descenso de la intensidad de fluorescencia, y las de reduccin por el aumento. Tambin existen sustratos sintticos que liberan un fluorforo en reacciones catalizadas por enzima, como por ejemplo el 4-metilumbeliferil--D-glucurnido para ensayar la -galactosidasa.

10.2.6.5.

Mtodos enzimticos acoplados a NADPH

En los ensayos espectrofotomtricos puede monitorearse una reaccin bioqumica observando cmo cambia la densidad ptica de la solucin en la que se est dando. Para utilizar un ensayo de este tipo debe haber un substrato que absorba la luz de manera diferente al producto que genera. Por medio de espectrofotmetro se puede observar la disminucin de la concentracin del substrato (o el aumento del producto) en tiempo real. Cuando la luz absorbida se encuentra dentro del rango del espectro visible se observa un cambio en el color de la muestra, y entonces hablamos de un mtodo colorimtrico. En muchos casos se usa luz ultravioleta (luz UV). Para esos casos se necesitan cubetas especiales, que s sean transparentes a una longitud de onda menor de 400nm. La luz UV sirve para monitorizar reacciones en las que participan NADH y NADPH. Ests coenzimas participan en infinidad de reacciones bioqumicas, principalmente de oxidorreduccin. NADH y NADPH en su forma reducida absorben luz UV a 340nm, mientras que en su forma oxidada (NAD+ y NADP+) son casi transparentes a esta longitud de onda (Figura 10-25). As, la actividad de una oxidorreductasa que use NADP como coenzima puede ser monitoreada, siguiendo el incremento de la absorbancia a 340 nm a medida que se produce el NADPH.
+ Figura 10-25. Especto del Absorcin del NAD y del NADH

Incluso cuando la reaccin enzimtica estudiada no provoca ningn cambio de absorbancia o esta no es especfica, pueden usarse ensayos espectrofotomtricos para la enzima realizando un ensayo acoplado. En este, el producto de la reaccin a estudiar se usa como sustrato de una segunda reaccin, que ha de ser de fcil seguimiento y cuyos otros sustratos, coenzimas y enzimas deben encontrarse a concentraciones saturantes para que la velocidad de la segunda reaccin no sea limitante. Por ejemplo, en la Figura 10-26 puede verse el esquema de un ensayo acoplado para la hexocinasa, que puede medirse acoplando la produccin de glucosa-6-fosfato a la produccin de NADPH usando la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa Figura 10-26. Esquema del ensayo acoplado para la hexocinasa

10.2.6.6.

Ejemplo: Anlisis de Azcares

En la siguiente figura se puede observar el esquema de un ensayo acoplado para la medicin de tres azucares de forma secuencial: glucosa, fructosa y sacarosa. Por cada molcula de hexosas se produce un mol de NADPH, mientras que por cada mol de sacarosa se produce 2 moles de NADPH.

287

Figura 10-27. Ejemplificacin de la produccin de NADPH a partir de glucosa, fructosa y sacarosa. Tarea 10-13 El maz produce sacarosa a travs de la fotosntesis en las hojas. Bajo condiciones limitantes de agua (sequa), las estomas de las hojas se cierran, evitando as el escape de vapor de agua. Esto tambin limita la entrada de dixido de carbono, y por consiguiente, inhibe la fotosntesis. Un fisilogo de maz ha propuesto un proyecto en donde se medirn los niveles de glucosa y sacarosa en las hojas y tallos de diferentes genotipos de maz contrastantes, ya sea ms, o menos tolerantes a la sequa. Cree usted que la medicin de azucares es pertinente? Se justifica el uso de esta herramienta bioqumica para un proyecto de mejoramiento gentico de maz? Asuma una postura como evaluador de este proyecto y defindala con argumentos.

10.2.6.7.

Mtodos cinticos

Uno de los mtodos recientes para cuantificar metabolitos en un tejido es conocido como cycling assay. Esta tcnica consiste en la medicin o cuantificacin de metabolitos a muy bajas concentraciones basado en la actividad de dos enzimas que en su conjunto catalizan una reaccin cclica. Una enzima convierte el metabolito A en el metabolito B y una segunda enzima convierte el metabolito B otra vez en el A. Es decir, la reaccin global consiste en un reciclaje de una misma molcula. El truco de los cycling assays es acoplarlos a la generacin de una molcula reportera, es decir, cogenerar algn metabolito que pueda ser fcilmente cuantificado, como por ejemplo, NADH o MTT. Como las enzimas y cofactores estn en exceso, la velocidad del ciclo depende de la suma de concentracin A y B. Las concentraciones pueden ser determinadas especficamente ya que la velocidad de la reaccin ser linealmente dependiente de la concentracin de estos sustratos. Segn la ecuacin de Michaelis-Menten la relacin entre la concentracin de los sustratos ciclicos y la velocidad de reaccin es lineal en el rango de S<Km. Podemos decir que los cycling assay permiten detecciones a muy bajas concentraciones por la alta afinidad de las enzimas por sus sustratos. La Figura 10-28 ejemplifica un ensayo de cycling basados en la determinacin de metabolitos producidos por glicerol-3-P oxidasa/glicerol3-P deshidrogenasa, Gly3POX y Gly3PDH, respectivamente.
Gly 3PDH

O2

H2O2 DAP NADH+H+

Gly 3POX

Gly3P NAD+

288

Figura 10-28. Reaccin de cycling assay basada en el ciclo de glicerol-3-P Gly3POX cataliza la conversin de 02 del Gly3P en dihidroacetona-P (DAP) y Gly3P convierte el cul es detectado DAP a Gly3P y simultneamente oxida el NADH a NAD+ espectrofotomtricamente a 340 nm. Est tipo de reacciones acopladas que no dependen directamente del sustrato utilizado para monitorear la reaccin se llaman pseudo orden cero. En el caso de la Figura 10-28 la velocidad de la reaccin cclica no depende ni de la concertacin de O2 ni de NADH. La velocidad solo depender de la suma de DAP y Gly3P. La velocidad de disminucin de NADH determinar la concentracin de este metabolito (Gibon et al., 2002). Idealmente, los cycling assay se llevan a cabo a concentraciones de sustrato que son menores que el Km de las dos enzimas participantes (Gly3PDH y Gly3POx), que por lo regular son del orden de micromoles por litro, por lo que con este tipo de ensayos son muy sensibles, ya que se pueden detectar cantidades del rango de 10 picomoles de Gly3P.

10.3.

Anlisis de macromolculas

La electroforesis y la cromatografa comprenden un conjunto diverso de mtodos que permite a los cientficos separar componentes en mezclas complejas, lo que en muchas ocasiones resulta imposible por otros medios. Se pueden separar macromolculas en funcin de sus cargas, tamaos y masas moleculares. Tambin a travs de la polaridad de sus enlaces, sus potenciales redox, entre otros.

10.3.1.

Electroforesis

La electroforesis es una tcnica analtica de separacin de fundamento cintico, basada en el movimiento o migracin de las macromolculas como resultado de la accin de un campo elctrico. Por lo regular la migracin se hace con macromolculas disueltas en un determinado medio (solucin tampn de electroforesis), a travs de una matriz o soporte reticulado. El comportamiento de la molcula viene dado por su movilidad electrofortica, y esta por la carga, tamao y forma de la misma. Cuanto mayor es la relacin carga/tamao ms rpido migra un in en el seno del campo elctrico. Esta tcnica tiene como ventaja su capacidad de separar macromolculas de inters en la industria biotecnolgica y qumica. Ha sido un mtodo muy til para la separacin de protenas (enzimas, hormonas) y cidos nucleicos (DNA y RNA) con gran resolucin. La electroforesis fue desarrollada por primera vez por el qumico sueco Arne Tiselius, merecedor del Premio Nobel en 1948 por sus trabajos realizados en esta rea. La electroforesis en gel es un grupo de tcnicas empleadas por los cientficos para separar molculas basndose en propiedades como el tamao, la forma o el punto isoelctrico. La electroforesis en gel, ya sea en base a agarosa o acrilamida, se utiliza generalmente con propsitos cualitativos, pero tambin analticos. Puede ser una tcnica preparativa para purificar molculas parcialmente antes de aplicar espectrometra de masas, PCR, clonacin o secuenciacin de ADN.

10.3.1.1.

cidos nucleicos

En los cidos nucleicos la direccin de migracin es del electrodo negativo al positivo, y esto es debido a la carga negativa presente en el esqueleto azcar-fosfato. En los fragmentos de ADN dobles (con estructura de doble hlice) la velocidad de migracin es inversamente proporcional a su tamao. En fragmentos simples de ADN (una sola cadena) y ARN, dichas molculas tienden a plegarse de forma compleja y a migrar de forma ms complicada, segn la estructura terciaria formada tras el plegamiento. Sin embargo, compuestos que puedan romper los enlaces de puente de hidrgeno, como el hidrxido de sodio o la formamida, son empleados

289

para 'desplegar' las molculas lineales y permitir que la velocidad de migracin dependa nicamente del tamao y no de la estructura formada tras el plegamiento.

10.3.1.2.

Protenas

Por otra parte, las protenas no tienen una estructura predecible como los cidos nucleicos, y por tanto sus velocidades de migracin no son similares entre ellas. Incluso puede que no migren ni al aplicar una fuerza electromotriz (al encontrarse en su punto isoelctrico). Laemnli, 1970, modific la electroforesis para protenas mediante la adicin de un detergente como el dodecilsulfato sdico/dodecilfosfato sdico (SDS/SDP) y un agente reductor como el 2mercaptoetanol. Los detergentes otorgan una carga neta negativa a la protena que les permite migrar a travs del gel de poliacrilamida en relacin directa a su masa, ya que la cantidad de cargas negativas que se unen a la protena depende del tamao de sta, existiendo una relacin carga/masa similar. Por otro lado, el agente reductor rompe los enlaces disulfuros, separando a la protena en sus sub-unidades. Adems, la desnaturalizacin hace que pierdan su estructura terciaria y cuaternaria por tanto su velocidad de migracin es proporcional al tamao y no a su estructura terciaria ni a su interaccin con otras macromolculas. As, los ms grandes se desplazan ms lentamente. Cuando se ha completado la electroforesis, las molculas ms pequeas han llegado al nodo. Entonces se pueden 'revelar' mediante la adicin de un colorante especfico para hacerlas visibles. Se emplean compuestos como el bromuro de etidio, para los cidos nucleicos, o tincin de plata, azul de coomassie o tincin fluorescente, para las protenas. Asimismo se emplean otros mtodos para visualizar la separacin de la mezcla en el gel. Si el reactivo es fluorescente bajo la luz UV, se puede simplemente hacer una fotografa de la placa bajo dicha luz. Tambin, si las molculas contienen tomos radiactivos se puede efectuar una autorradiografa. Las bandas en diferentes separaciones paralelas, que estn a la misma distancia del principio, significan que contienen molculas que han atravesado el gel a la misma velocidad. Existen marcadores especiales que contienen una mezcla de molculas de tamao conocido. Si se hace una electroforesis de un marcador con una mezcla desconocida, las bandas observadas en el marcador pueden ser comparadas con las obtenidas en la mezcla desconocida para determinar su tamao o punto isoelctrico. La distancia a la que se encuentra la banda del principio es (aproximadamente) inversamente proporcional al logaritmo del tamao de la molcula.

Figura 10-29. Ejemplos de separacin de protenas (SDS-PAGE) izquierda y de cidos nucleicos derecha.

10.3.2.

Cromatografa

La cromatografa se distingue de la electroforesis por la forma en que migran las partculas. En las tcnicas cromatogrficas, la migracin de las molculas esta dado por un flujo de masas, y no por una fuerza elctrica, como en la electroforesis. La cromatografa no slo permite la separacin de los componentes de una mezcla, sino tambin su identificacin y cuantificacin. Se pueden distinguir compuestos que estn muy estrechamente relacionados. El anlisis cualitativo est basado en la medida de parmetros cromatogrficos (tiempos y volmenes de retencin) mientras que el anlisis cuantitativo est basado en la medida de alturas o reas de picos cromatogrficos que se relacionan con la concentracin. La columna cromatogrfica y la forma con la que se disea, constituye el corazn de la separacin. El detector, situado al final de la columna es el que garantiza la respuesta de los componentes que se separan.

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En todas las separaciones cromatogrficas la muestra se desplaza con una fase mvil, que puede ser un gas o un lquido. La fase mvil puede pasarse a travs de una fase estacionaria, con la que es inmiscible y que se fija a una columna o a una superficie slida. Las dos fases se eligen de forma, que los componentes de la muestra se distribuyen de modo distinto entre la fase mvil y la fase estacionaria. Aquellos componentes que son fuertemente retenidos, por la fase estacionaria se mueven lentamente con el flujo de la fase mvil; por el contrario los componentes que se unen dbilmente a la fase estacionaria, se mueven con rapidez. Como consecuencia de la distinta movilidad, los componentes de la muestra se separan en bandas o zonas discretas que pueden analizarse cualitativa y/o cuantitativamente. Estos resultados se recogen en forma de grficos llamados cromatogramas. Los mtodos cromatogrficos se pueden clasificar segn la forma en que la fase mvil y la fase estacionaria se pongan en contacto. As, en la cromatografa de columna, un tubo estrecho contiene la fase estacionaria a travs de la cual se hace pasar la fase mvil por presin. En la cromatografa en plano, la fase estacionaria se fija sobre una placa plana o a los intersticios de un papel; en este caso la fase mvil se desplaza a travs de la fase estacionaria por capilaridad o por gravedad. Las tres clases de cromatografa desde un ngulo ms general son cromatografa de lquidos, cromatografa de gases y cromatografa de fluidos supercrticos. Como su nombre lo indica, la fase mvil en las tres tcnicas son lquido, gas y fluido supercrtico respectivamente. Slo la cromatografa de lquidos es la que puede llevarse acabo en columna o sobre superficies planas, por otra parte tanto la de gas como la de fluidos supercrticos estn restringidas a los procedimientos en columna de tal manera que las paredes de la columna contienen la fase mvil. La tcnica ms usada es la cromatografa lquida de alta resolucin, HPLC, por su sensibilidad, fcil adaptacin a las determinaciones cuantitativas exactas, su idoneidad para la separacin de especies no voltiles o termolbiles y su aplicacin a sustancias de primordial inters en la industria, como son los aminocidos, protenas, cidos nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos, entre otros. A continuacin se describe este mtodo de separacin. La cromatografa lquida de protenas la podemos diferenciar en cuatro grupos: de reparto: separa los solutos basndose en la solubilidad de adsorcin: se basa en la afinidad de adsorcin de exclusin: separa solutos segn el peso molecular de intercambio inico: separa solutos segn la carga inica

Los mtodos de la cromatografa de adsorcin y reparto tienden a ser complementarios, aunque en algunos casos se superponen. La cromatografa de reparto est formada por la cromatografa Lquido-Lquido y la cromatografa unida qumicamente. Estas tcnicas se diferencian en la forma en que se retiene la fase estacionaria sobre las partculas del soporte relleno. En el segundo caso, como su nombre lo indica, la fase estacionaria se une qumicamente a la superficie del soporte. Esta tcnica actualmente es ms usada debido a que la cromatografa lquido-lquido necesita de un recubrimiento peridico de las partculas del soporte debido a la prdida de la fase estacionaria por disolucin en la fase mvil. En general los soportes para casi todos los rellenos de fases unidas qumicamente se preparan con slice rgida o composiciones donde la slice es el elemento bsico. Estos slidos estn formados por partculas mecnicamente resistentes, porosas y uniformes. Los rellenos de columna en la cromatografa de fase unida qumicamente se clasifican como de fase inversa cuando el recubrimiento enlazado tiene carcter no polar, y de fase normal cuando el recubrimiento contiene grupos funcionales polares. Esta tcnica puede utilizarse en la separacin de mezclas edulcorantes artificiales, antioxidantes, aflatoxinas, bebidas refrescantes entre otras.

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En la siguiente seccin se explican algunos ejemplos de los mtodos cromatogrficos ms usados hoy en da para el mejoramiento gentico, por ejemplo, la determinacin de la calidad nutricional del maz.

10.4.
10.4.1.

Metodologas y Equipos
Cromatografa de lquidos (HPLC)

La clave para conseguir la precisin deseada en la bioqumica analtica es el mtodo de extraccin y el mtodo de cuantificacin. El protocolo y la apropiada configuracin de los instrumentos son muy importantes, as como el entrenamiento del personal que los utilizar. El instrumento mejor diseado, el ms resistente en el mundo, no va a dar resultados adecuados a largo plazo si los usuarios finales no entienden cmo usarlo ni mantenerlo. El soporte tcnico y el personal calificado son factores crticos. El protocolo mejor escrito no funcionar si la persona que realiza la extraccin no tiene experiencia en el laboratorio y al menos un mnimo de conocimientos qumicos. Es muy importante que los estudiantes entiendan todos los fundamentos de la bioqumica y de la cromatografa para sacarle mayor provecho a estas herramientas analticas dentro de sus proyectos experimentales.

Introduccin a Cromatografa
La Cromatografa lquida de altaresolucin o High Performance Liquid Chromatography (HPLC) es el tipo de cromatografa utilizada con ms frecuencia en la bioqumica analtica. Las columnas de HPLC separan los componentes de una mezcla basndose en diferentes tipos de interacciones qumicas entre las substancias analizadas y la fase de la columna cromatogrfica. La separacin fsica est basada en la distribucin de los componentes qumicos de una mezcla entre dos fases, una fase fija o estacionaria y otra mvil. La cromatografa lquida clsica se lleva a cabo en columnas generalmente de vidrio o plstico, las cuales se rellenan de manera manual con una resina tipo gel. Luego de sembrar la muestra en la parte superior, se hace fluir la fase mvil a travs de la columna por efecto de la gravedad. Esto todava se hace mucho para separar y purificar protenas Con el objeto de aumentar la eficiencia en las separaciones, se fue disminuyendo el tamao de las partculas de fase fija hasta el tamao de los micrones, lo cual gener la necesidad de utilizar altas presiones para lograr que fluya la fase mvil. As naci la tcnica de cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC), que requiere de instrumental especial para trabajar con las altas presiones requeridas. En HPLC la fase mvil es un lquido que fluye a altas presiones a travs de una columna de metal que contiene una resina empacada desde la fbrica. Dependiendo del tipo de fase mvil o fija, y del tipo de fenmeno fsico que provoca la separacin, existen diversas variantes de cromatografa lquida:

Cromatografa De Exclusin
La cromatografa de exclusin, tambin llamada de filtracin en gel o cromatografa de permeacin en gel, se basa en la diferencia de penetracin de las molculas en los poros de la fase estacionaria debido a que la separacin obtenida depende del tamao de la molcula. El tiempo de elucin es proporcional al peso molecular de los mismos, por lo que no es muy usada con los compuestos de alto peso molecular. Est tipo de separacin por tamao difiere de las

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dems tcnicas de cromatografa en que no existen interacciones fsicas o qumicas entre el analito y la fase estacionaria. Es una tcnica reproducible, escalable y rpida. La fase fija est formada por partculas polimricas o de slice que contienen una red uniforme de poros por los que pueden penetrar las molculas de pequeo tamao. Las molculas de tamao grande se excluyen totalmente y son eluidas en primer lugar, mientras que las de pequeo tamao tienen acceso a todo el volumen poroso y son las ltimas que se eluyen; de esto se deduce que el volumen disponible para las molculas pequeas es mayor que para las grandes. Por lo tanto las molculas se eluyen por su tamao decreciente. En resumen los factores que determinan la separacin de las molculas son el tamao del poro, el tamao de la partcula y el flujo de elucin. Los diferentes tipos de partculas usadas deben ser estables, mecnica y qumicamente, tener bajo contenido en grupos inicos, uniformidad de poro y tamao. Los compuestos pueden ser derivados de dextranos (Sephadex), derivados de agarosa (Sepharosa), derivados de acrilamidas (Biogel P) y esferas de vidrio. Hay diferentes tamaos de partcula para un gel: a menor tamao mayor resolucin y menor gasto en la columna. Est tcnica se emplea en la separacin de protenas de alimentos, determinacin de glucosa y fructosa en zumos de fruta, etc. La cromatografa de exclusin molecular, tambin conocida como cromatografa por filtracin en gel, separa las partculas de la muestra en funcin de su tamao. Generalmente se trata de una cromatografa de baja resolucin de forma que se suele utilizar en los pasos finales del proceso de purificacin. Tambin es muy til para la determinacin de las estructuras terciaria y cuaternaria de las protenas purificadas. La cromatografa de filtracin molecular es un mtodo de cromatografa en columna por el cual las molculas se separan en solucin segn su peso molecular, o ms precisamente, segn su radio de Stokes. La ley de Stokes se refiere a la fuerza de friccin experimentada por objetos esfricos movindose en el seno de un fluido viscoso en un rgimen laminar de bajos nmeros de Reynolds. En general la ley de Stokes es vlida en el movimiento de partculas esfricas pequeas movindose a velocidades bajas. La ley de Stokes puede escribirse como: Fr = 6R, Donde R es el radio de la esfera, su velocidad y la viscosidad del fluido. En est cromatografa, la fase estacionaria consiste en largos polmeros entrecruzados que forman una red tridimensional porosa. Para los fines prcticos, las columnas se empaquetan con pequeas partculas esferoidales formadas por esos polmeros entrecruzados. Los poros quedan conectados formando una malla o red, lo cual determina una serie de caminos a ser recorridos por las molculas que acceden al interior de est. En consecuencia, estas partculas son porosas, y el tamao de los poros es tal que algunas molculas (las demasiado grandes) no podrn ingresar a esos poros, en tanto que otras (las suficientemente pequeas) podrn pasar libremente. Figura 10-30 Cromatografa de exclusin molecular.

Cromatografa de Adsorcin
La cromatografa de adsorcin o Lquido-Slido es la forma clsica de la cromatografa de lquidos. Ha sufrido algunas transformaciones que la han convertido en un mtodo importante de la HPLC. Las nicas fases que se utilizan en este tipo de cromatografa son la slice y la almina, siendo la primera la preferida. Es adecuada para compuestos no polares probablemente con masas moleculares inferiores a 5000.

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En general la cromatografa Lquido-Slido es ms adecuada para muestras que son solubles en disolventes no polares y por ello tienen solubilidad limitada en disoluciones acuosas que son las que se utilizan en cromatografa de reparto en fase inversa. En est tipo de cromatografa tambin se pueden separar compuestos con diferentes grupos funcionales. Una caracterstica particular de este mtodo es su capacidad para diferenciar compuestos ismeros en mezclas.

Cromatografa De Intercambio Inico

La cromatografa de intercambio inico est basada en la atraccin entre iones del soluto y puntos cargados que existen en la fase estacionaria. En el caso de intercambiadores aninicos, grupos cargados positivamente en la fase estacionaria atraen aniones del soluto. Los intercambiadores catinicos contienen puntos cargados negativamente que atraen cationes del soluto. Los intercambiadores inicos se clasifican en cidos o bsicos, fuertes o dbiles. Las resinas cidas fuertes siguen ionizadas incluso en disoluciones muy cidas, en cambio las resinas cidas dbiles se protonan a un pH prximo a 4 y pierden su capacidad de intercambio catinico. Los grupos muy bsicos de amonio cuaternario siguen siendo catinicos a cualquier valor de pH. Los bsicos dbiles de amonio terciario se desprotonan en disoluciones moderadamente bsicas y pierden entonces su capacidad. Las resinas de intercambio inico tienen aplicacin en estudios donde intervienen molculas pequeas (PM=500) que pueden penetrar en los poros pequeos de la resina. Los intercambiadores inicos de poliestireno son tan grandes que las macromolculas muy cargadas, como las protenas, se pueden enlazar irreversiblemente a ellos. Los de celulosa y dextranos sirven para intercambio inico de macromolculas. Los geles de intercambio inico se usan en el caso de molculas grandes (protenas y cidos nucleicos). Cuando las separaciones exigen condiciones qumicas fuertes se emplean intercambiadores inicos inorgnicos. En la cromatografa de intercambio inico, la retencin se basa en la atraccin electrosttica entre los iones en solucin y las cargas inmovilizadas a la fase estacionaria. Los iones de la misma carga son excluidos mientras que los de carga opuesta son retenidos por la columna. Un incremento en la concentracin del contrain (respeto a los grupos funcionales de la resina) reduce el tiempo de retencin. Un incremento en el pH reduce el tiempo de retencin en las cromatografas de intercambio catinico mientras que una disminucin del pH reduce el tiempo de retencin en las cromatografas de intercambio aninico. Algunos tipos de intercambiadores inicos son: i) Resinas de poliestireno, ii) intercambiadores inicos de celulosa y dextranos (geles) y iii) Slice porosa o vidrio de tamao de poro controlado. En general los intercambiadores inicos favorecen la unin de iones de elevada carga y radio pequeo. Este tipo de cromatografa es ampliamente utilizado en las siguientes aplicaciones: purificacin de agua, concentracin de componentes traza, Ligand-exchange chromatography, Ion-exchange chromatography of proteins, High-pH anion-exchange chromatography of carbohydrates and oligosaccharides, etc. Figura 10-31. Cromatografa de intercambio inico

Cromatografa basada en bioafinidad

Este tipo de cromatografa se basa en la capacidad de las sustancias biolgicamente activas de formar complejos estables, especficos y reversibles. La formacin de estos complejos implica la participacin de fuerzas moleculares como las interacciones de Van der Waals, interacciones

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electrostticas, interacciones dipolo-dipolo, interacciones hidrofbicas y puentes de hidrgeno entre las partculas de la muestra y la fase estacionaria. Figura 10-32. Cromatografa de biofinidad, tomado de
www.unizar.es/departamentos/bioquimica_biologia/docencia/FMBvirtual/PurProt/Croma.htm

Tarea 10-14: Realice diagramas explicando cada una de las cromatografas, con un ejemplo ya sea que tomes de la literatura o que inventes, explica, cul de las cromatografas escogera y por qu? En resumen la gran variabilidad de los mtodos cromatogrficos se debe a las diferentes condiciones que pueden utilizarse para separar los componentes de una sustancia. Todas estas tcnicas tienen en comn la existencia de una fase estacionaria a travs de la cul fluye una fase mvil, as como la presencia de un mecanismo de inyeccin de la muestra y un mecanismo de deteccin de los diferentes componentes separados.

Comentario [EVO9]: Para qu?

Cromatografa de fase normal

La cromatografa de fase normal (NP-HPLC) fue el primer tipo de sistema HPLC utilizado en el campo de la qumica, y se caracteriza por separar los compuestos en base a su polaridad. Est tcnica utiliza una fase estacionaria polar y una fase mvil apolar, y se usa cuando el compuesto de inters es bastante polar. El compuesto polar se asocia y es retenido por la fase estacionaria. La fuerza de adsorcin aumenta a medida que aumenta la polaridad del compuesto y la interaccin entre el compuesto polar y la fase estacionaria polar (en comparacin a la fase mvil) aumenta el tiempo de retencin. La fuerza de interaccin no slo depende de los grupos funcionales del compuesto de inters, sino tambin de los factores estricos, de forma que los ismeros estructurales a menudo se pueden diferenciar el uno del otro. El uso de disolventes ms polares en la fase mvil disminuye el tiempo de retencin de los compuestos mientras que los disolventes ms hidrofbicos tienden a aumentar el tiempo de retencin. La NP-HPLC cay en desuso a los aos setenta con el desarrollo del HPLC de fase reversa debido a la falta de reproducibilidad de los tiempos de retencin puesto que los disolventes prticos cambiaban el estado de hidratacin de la slice o almina de la cromatografa.

Cromatografa de fase reversa

La cromatografa en fase reversa (RPC) permite separar molculas en base a su polaridad. El principio de la cromatografa en fase reversa es semejante al de la cromatografa en capa fina. Sin embargo, aqu la fase estacionaria es de partculas de slica qumicamente modificadas con hidrocarburos saturados, insaturados o aromticos de diferentes tipos. Esto convierte a la fase estacionaria en una matrz apolar. Por lo tanto, para este tipo de cromatografas se emplean mezclas de solventes polares, tales como agua, acetonitrilo, acetato de etilo, acetona y alcoholes alifticos. Por tal razn, est tipo de cromatografa ha sido tambin llamada como cromatografa de interaccin hidrofbica (HIC). En general, est ltimo trmino se ha empleado para referirse a las aplicaciones en las que se emplean substituyentes y matrices compatibles con fluidos biolgicos. Por tanto, el termino HIC es comn cuando se habla de purificacin de protenas y carbohidratos, en tanto que RPC es ms empleado para referirse a la separacin de molculas en sistemas que son inadecuados para la separacin de macromolculas biolgicas. La HPLC de fase reversa (RP-HPLC) consiste en una fase inmvil apolar y una fase mvil de polaridad moderada. Una de las fases estacionarias ms comunes de este tipo de cromatografa

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es la de slice tratada con RMe2SiCl, dnde la R es una cadena alquil tal como C18H37 C8H17. El tiempo de retencin es mayor para las molculas de naturaleza apolar, mientras que las molculas de carcter polar eluyen ms rpidamente.
2: Glucosa 1,000 columna Bomba Solventes 500 1: Inositol Detector 250 colector -20 0.0 750 3: Fructosa Az Fructanos LDP130808 #42 1,200 nC E M32 ED_1

4: Sacarosa

6: Rafinosa

2.0

4.0

6.0

8.0

10.0

12.0

14.0

16.0

18.0

min 20.0

Figura 10-33. Diagrama cromatograma tpico.

del funcionamiento de la cromatografa de fase reversa. Y un

http://depa.pquim.unam.mx/proteinas/

El tiempo de retencin aumenta con la adicin de disolvente polar a la fase mvil y disminuye con la introduccin de disolventes ms hidrofbicos. La cromatografa de fase reversa es tan utilizada que a menudo se lo denomina HPLC sin ninguna especificacin adicional. La cromatografa de fase reversa se basa en el principio de las interacciones hidrofbicas que resultan de las fuerzas de repulsin entre un disolvente relativamente polar, un compuesto relativamente apolar, y una fase estacionaria apolar. La fuerza conductora en la unin del compuesto a la fase estacionaria es la disminucin del rea del segmento apolar del analito expuesto al disolvente. Este efecto hidrofbico est dominado por la disminucin de la energa libre de la entropa asociada con la minimizacin de la interfase compuesto-disolvente polar. El efecto hidrofbico disminuye con la adicin de disolvente apolar a la fase mvil. Esto modifica el coeficiente de particin de forma que el compuesto se mueve por la columna y eluye. Las caractersticas del compuesto de inters juegan un papel muy importante en la retencin. En general, un compuesto con una cadena alquil larga se asocia con un tiempo de retencin mayor porque aumenta la hidrofobicidad de la molcula. Aun as, las molculas muy grandes pueden ver reducida la interaccin entre la superficie del compuesto y la fase estacionaria. El tiempo de retencin aumenta con el rea de superficie hidrofbica que suele ser inversamente proporcional al tamao del compuesto. Los compuestos ramificados suelen eluir ms rpidamente que sus ismeros lineales puesto que la superficie total se ve reducida. Aparte de la hidrofobicidad de la fase mvil, otras modificaciones de la fase mvil pueden afectar la retencin del compuesto; por ejemplo, la adicin de sales inorgnicas provoca un aumento lineal en la tensin superficial, y como que la entropa de la interfase compuesto-disolvente est controlada precisamente por la tensin superficial, la adicin de sales tiende a aumentar el tiempo de retencin. Otra variable importante es el pH, puesto que puede cambiar la hidrofobicidad del compuesto. Por este motivo, la mayora de mtodos utilizan un tampn como el fosfato de sodio por controlar el valor del pH. Estos tampones controlan el pH, pero tambin neutralizan la carga o cualquiera resto de slice de la fase estacionaria que haya quedado expuesta y actan como contraiones que neutralizan la carga del compuesto. El efecto de los tampones sobre la cromatografa puede variar, pero en general mejoran la separacin cromatogrfica. Las columnas de fase reversa se echan a perder con menor facilidad que las columnas de slice normales. Aun as, muchas columnas de fase reversa estn formadas por slice modificada con cadenas alquil y no se deben utilizar nunca con bases en medio acuoso puesto que stas podran daar el esqueleto de slice subyacente. Las columnas se pueden utilizar en medio

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acuoso cidos, pero no deberan estar expuestas demasiado tiempo al cido porque puede corroer las partes metlicas del aparato de HPLC.

10.4.2.

Cromatografa de gases (GC)

La cromatografa de gases (GC por sus siglas en ingls) es una tcnica cromatogrfica en la que la muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza de una columna capilar. La elucin se produce por el flujo de una fase mvil de gas inerte. A diferencia de los otros tipos de cromatografa, la fase mvil no interacciona con las molculas del analito; su nica funcin es la de transportar el analito a travs de la columna. Existen dos tipos de cromatografa de gases (GC): la cromatografa gas-slido (GSC) y la cromatografa gas-lquido (GLC), siendo esta ltima la que se utiliza ms ampliamente, y que se puede llamar simplemente cromatografa de gases (GC). En la GSC la fase estacionaria es slida y la retencin de los analitos en ella se produce mediante el proceso de adsorcin. Precisamente este proceso de adsorcin, que no es lineal, es el que ha provocado que este tipo de cromatografa tenga aplicacin limitada, ya que la retencin del analito sobre la superficie es semipermanente y se obtienen picos de elucin con colas. Su nica aplicacin es la separacin de especies gaseosas de bajo peso molecular. La GLC utiliza como fase estacionaria molculas de lquido inmovilizadas sobre la superficie de un slido inerte. La GC se lleva a cabo en un cromatgrafo de gases. Este consta de diversos componentes como el gas portador, el sistema de inyeccin de muestra, la columna (generalmente dentro de un horno), y el detector.
Microjeringa

Detector

Rotmetro

Gas acarreador

Columna

Figura 10-34. Diagrama de un cromatgrafo de gases.

Rampas de temperatura
La temperatura es una variable importante, ya que de ella va a depender el grado de separacin de los diferentes analitos. Para ello, debe ajustarse con una precisin de dcimas de grado. Dicha temperatura depende del punto de ebullicin del analito o analitos, y por lo general se ajusta a un valor igual o ligeramente superior a l. Para estos valores, el tiempo de elucin va a oscilar entre 2 y 30-40 minutos. Si tenemos varios componentes con diferentes puntos de ebullicin, se ajusta la llamada rampa de temperatura, con lo cual esta va aumentando ya sea de forma continua o por etapas. En muchas ocasiones, el ajustar correctamente la rampa puede significar separar bien o no los diferentes analitos. Es recomendable utilizar temperaturas bajas para la elucin ya que aunque a mayor temperatura la elucin es ms rpida, se corre el riesgo de descomponer el analito.

Columnas capilares
En el GC se emplean dos tipos de columnas: las empaquetadas o de relleno, y las tubulares abiertas o capilares. Estas ltimas son ms comunes en la actualidad (2005) debido a su mayor rapidez y eficiencia. La longitud de estas columnas es variable, de 2 a 50 metros, y estn construidas en acero inoxidable, vidrio, slice fundida o tefln. Debido a su longitud y a la

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necesidad de ser introducidas en un horno, las columnas suelen enrollarse en una forma helicoidal con dimetros de 10 a 30 cm, dependiendo del tamao del horno. Las columnas capilares son de dos tipos bsicos: las de pared recubierta (WCOT) y las de soporte recubierto (SCOT). Las WCOT son simplemente tubos capilares donde la pared interna se ha recubierto con una finsima capa de fase estacionaria. Las columnas SCOT tienen en su parte interna una fina capa de material adsorbente como el empleado en las columnas de relleno (tierra de diatomeas) donde se ha adherido la fase estacionaria. Las ventajas de las SCOT frente a las WCOT es la mayor capacidad de carga de esta ltima, ya que en su fabricacin se emplean mayores cantidades de fase estacionaria, al ser la superficie mayor de intercambio. Las columnas WCOT se fabrican a partir de slice fundida, conocidas como columnas tubulares abiertas de slice fundida o FSOT. Ests columnas se fabrican a partir de slice especialmente pura, sin apenas contenido de xidos metlicos. Debido a la fragilidad inherente a est material, en el mismo proceso de obtencin del tubo se recubre con una capa de poliimida, de esta forma la columna puede enrollarse con un dimetro de unos pocos centmetros. Estas columnas, con propiedades como baja reactividad, resistencia fsica y flexibilidad, han sustituido a las WCOT clsicas.

Jeringa de Inyeccin

Septum Entrada de gas

Muestra vaporizada

Columna

Horno Cromatogrfico

Figura 10-35. Columna capilar. Las columnas FSOT tienen dimetros internos variables, entre 250 y 320 m (para columnas normales) y 150-200 m para columnas de alta resolucin. Estas ltimas requieren menor cantidad de analito y un detector ms sensible, al eluir menor cantidad de gas. Existen asimismo columnas macrocapilares con dimetros de hasta 530 m, que admiten cantidades de analito comparables a las de relleno pero con mejores cnones. En estas columnas existe un problema debido a la adsorcin del analito sobre la superficie de la slice fundida, adsorcin debida a la presencia de grupos silanol (Si-OH), los cuales interaccionan fuertemente con molculas polares orgnicas. Este inconveniente se suele solventar inactivando la superficie por sililacin con dimetilclorosilano (DMCS). La adsorcin debida a los xidos metlicos se ve paliada en gran parte por la elevada pureza de la slice empleada. Por orden de eficacia, en primer lugar estn las WCOT, luego las SCOT y por ltimo las columnas de relleno.

Detector de ionizacin de llama, FID

El detector de ionizacin de llama, es un detector utilizado en cromatografa de gases. Es uno de los detectores ms usados y verstiles. Bsicamente, es un quemador de hidrgeno/oxgeno, donde se mezcla el efluente de la columna (gas portador y analito) con hidrgeno. Inmediatamente, est gas mezclado se enciende mediante una chispa elctrica, producindose una llama de alta temperatura. La mayora de compuestos orgnicos al someterse a altas temperaturas, pirolizan y se producen iones y electrones, que son conductores elctricos. Est hecho se aprovecha estableciendo una diferencia de potencial de unos centenares de voltios

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entre la parte inferior del quemador y un electrodo colector situado por encima de la llama. La corriente generada es baja (del orden de los 10-12 ), por lo tanto debe ser amplificada mediante un amplificador de alta impedancia. Detector por ionizacin de flama

Los compuestos orgnicos se pirolizan, produciendo iones , que son direccionados a un colector en donde generan corriente elctrica

H2+O2

Flujo de la columna con CnHn

El detector es insensible a gases no combustibles, como H2O, CO2, CO y SO2

H2+O2

Flujo de la columna con SO2

Figura 10-36. Detector por ionizacin de flama y formacin de iones cuando un compuesto orgnico es quemado en una flama de H2 y O2 El proceso de ionizacin que se da en la llama es complejo, pero se puede aproximar el nmero de iones producidos al nmero de tomos de carbono transformados en la llama. Esto produce que sea un detector sensible a la masa (al nmero de tomos de carbono que salen de la columna) ms que a la concentracin, por lo tanto no le afectan demasiado los cambios en el flujo de salida. Existen algunos grupos funcionales que no dan respuesta en este detector, como el carbonilo, alcohol, halgeno o amina, y tampoco responden gases no inflamables como el CO2, SO2, agua y xidos de nitrgeno. Este hecho, ms que limitar el mbito de aplicacin de este detector, permite el anlisis de muestras contaminadas con alguno de los compuestos mencionados. Ventajas: Alta sensibilidad, del orden de 10-13 g/s. Amplio intervalo lineal de respuesta, 107 unidades. Bajo ruido de fondo (elevada relacin seal/ruido). Bajo mantenimiento, fcil de fabricar. Destruye la muestra (la piroliza).

Desventajas:

10.4.2.1.

Ejemplo: Anlisis de alcoholes y cidos por GC-FID

El control de calidad por anlisis de laboratorio usualmente se efecta en las reservas alimenticias, en materiales procesados y en los productos terminados. La cromatografa lquida HPLC se usa comnmente para analizar materiales durante el proceso de fermentacin, para

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monitorear la ruptura de las molculas de fcula en glucosa, luego la conversin a etanol. El etanol en presencia de oxgeno puede ser convertido en cido actico. Esto es la forma en que se produce el vinagre a partir de jugo de caa de azcar. El anlisis de alcohol por GC-FID no es el mismo que se hace con el alcoholmetro. EL GC-FID permite distinguir diferentes alcoholes y el acido actico por sus tiempos de retencin. PONER aqu solo un ejemplo de un cromatograma de claudia con todos los estndares de MeOH, EtOH, acetico, propanol, butanol, etc,

10.4.3.
10.4.3.1.

Ejemplos de metodologas usadas para el mejoramiento de maz

Anlisis de Triptfano

El maz es uno de los cultivos ms importantes de Amrica, por el rea cultivada, el valor de la cosecha y su amplia utilizacin en la alimentacin. Se ha establecido que alrededor del 70% del suministro mundial de protenas es de origen vegetal y aproximadamente el 30% es de origen animal. Los cereales, son los alimentos de principal consumo en la gran mayora de los pases en desarrollo y aportan a la dieta promedio el 80% de las caloras totales y el 70% de las protenas requeridas. El desarrollo de los hbridos QPM, con un alto contenido de aminocidos esenciales (lisina y triptfano), presenta nuevas posibilidades y esperanzas para reducir las deficiencias nutricionales de las familias de bajos ingresos en los pases subdesarrollados, en los cuales el maz representa una parte muy importante en la alimentacin. En la actualidad se conocen genes recesivos, por ejemplo, el gen opaque2, cuya incorporacin a variedades corrientes permiten mejorar sustancialmente la calidad de las protenas en dichas variedades.

Figura 10-37. Molcula de triptfano. La cuantificacin de triptfano es difcil debido a la inestabilidad del triptfano en condiciones cidas. Los mtodos convencionales de deteccin de los dems aminocidos principalmente se basan en la hidrlisis cida de las protenas. Esto se hace a 110C -125C por 6 - 24 horas con cido clorhdrico 6-7N. Hay evidencia de que la destruccin de triptfano durante la hidrlisis cida con cido clorhdrico, se debe a que este es oxidado por el enlace disulfuro de la cistena, ya que se ha observado que hay un incremento de esta en hidrolizados de protenas que contienen cistina y triptfano (Olocott y Fraenkel-Conrat, 1947). En ausencia de oxgeno, el triptfano es relativamente estable en cidos calientes ya sea solo o en presencia de otros aminocidos (Lugo, 1933). Sin embargo, cuando estn presentes cistina u otros bisulfatos, el triptfano es destruido. La destruccin de triptfano tambin se ha observado cuando es calentado en solucin cida con cido pirvico. La reaccin de triptfano con cido pirvico, as como la reaccin con carbohidratos, resulta en soluciones negras o cafs, y precipitados (huminas) dependiendo de la cantidad de triptfano destruido. En cambio la reaccin con cistina promueve la destruccin de triptfano sin la formacin de huminas y las soluciones permanecen claras (Olocott y Fraenkel-Conrat, 1947).

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Los mtodos desarrollados hasta ahora no estn bien adaptados para una determinacin rutinaria en muestras de alimentos vegetales. Para detectar y cuantificar triptfano en mezclas complejas en general, es necesario seguir algunos pasos, dependiendo del mtodo a emplear. La mayora de las tcnicas requieren de una previa extraccin pues el triptfano debe de estar en forma libre (no formando parte de una cadena polipeptdica) para poder ser detectado, (algunos casos de mtodos colorimtricos). Despus de la extraccin puede seguir un proceso de separacin (principalmente cromatogrfica), y por ltimo un proceso de deteccin y cuantificacin. Tarea 10-15 Haga una bsqueda bibliogrfica sobre las publicaciones sobre el gen opaco 2 y los maces QPM que han sido liberados por el CIMMYT. Tarea 10-16 Para un fitomejorador que quiere generar variedades de maz con mayor calidad de protenas, qu tan importante es el mtodo analtico que va a utilizar para medir esas caractersticas nutricionales? Haga un listado de lo que esperara de un servicio analtico en trminos de: rapidez, cercana, confiabilidad, nmero de muestras que pueden procesar, precio, garanta, etc. Cules seran sus prioridades como fitomejorador? Qu porcentaje de su presupuesto utilizara para trabajo de campo, que tanto para marcadores moleculares, y que tanto para anlisis bioqumicos?

Mtodos de Extraccin
a) Hidrlisis cida Para extraer triptfano por hidrlisis cida existen varias tcnicas, algunas recurren a la proteccin del anillo indlico contra la oxidacin que sufre por la hidrlisis cida. Algunos de estos compuestos protectores son - tolueno, cido sulfnico (Liu & Chang, 1971), cido tiogliclico (Gruen & Nicholls, 1972; Matsubara & Sasaki, 1969), -Mercaptoetanol (Pascaud et al., 1987), cido 3,3 indoilpropinico y otros reactivos (Penke et al., 1974). Sin embargo, la utilizacin de estos compuestos no da buenos porcentajes de recuperacin de triptfano, aunado a que ests tcnicas slo han sido utilizadas para determinar triptfano en protenas puras, ya que algunos compuestos del grano suelen disminuir su poder protector como son los carbohidratos resultantes de la hidrlisis del almidn (Piombo y Lozano, 1980). Alternativamente se han usado otros compuestos para hidrolizar en vez del HCl, que mejoran la recuperacin, como el cido metanosulfnico conteniendo 3-(2- aminoetil) indol, y el cido mecaptometanosulfnico (Creamer & Matheson, 1976). b) Hidrlisis Bsica Se ha optado tambin por la hidrlisis bsica utilizando NaOH en concentraciones de 4 a 6 M y protegiendo con algunos compuestos para su degradacin como Stanita (Lugg, 1938) con Acetato e Histidina (Spies, 1967) o con almidn (Dreze, 1960). Con la extraccin bsica se llegan a obtener mejores porcentajes de recuperacin aunque involucran procedimientos ms elaborados: Si se va a utilizar NaOH es necesaria una predigestin de almidn pues este suele gelificar en soluciones bsicas. Tambin son necesarias condiciones de vaco durante la hidrlisis en tubos de polipropileno (Oelshlegel, 1970) para evitar la oxidacin del triptfano (Spies, 1967; Oelshlegel, 1970) y calentando a temperaturas de aproximadamente 135C (Hugli & Moore, 1972). El uso de de Ba (OH)2 puede ayudar a evitar la formacin de gel por el almidn del grano, pero tambin puede formar compuestos que co-precipitan al triptfano como BaSO4 o BaCO3 (Robel, 1967). c) Buffers de protenas totales

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La extraccin de protenas tambin puede ser llevada a cabo con los llamados buffers de protenas totales, que pueden contener principalmente agentes caotrpicos como la urea adems de detergentes y agentes reductores como dithiothreitol (DTT) o -Mercaptoetanol entre otros compuestos. Sin embargo, algunos mtodos de cuantificacin no pueden trabajar adecuadamente si el triptfano todava esta unido a una cadena polipetdica. d) Hidrlisis enzimtica Y por ltimo estn los mtodos de extraccin con enzimas como la pronasa (Spies, 1967), pepsina, tripsina (Opienska-Blauth et al., 1963) y papana (Hernndez & Bates, 1969; Oste et al., 1976). Las enzimas se encargan de romper los enlaces peptdicos que hay entre aminocidos siendo algunas de ellas muy especficas. Ests enzimas requieren de una molcula de agua para realizar su funcin por eso a las proteasas tambin se les puede catalogar como hidrolasas. Los tiempos de hidrlisis son muy similares a los usados con la digestin bsica. Una desventaja de estos mtodos es que la hidrlisis puede no ser completa. La hidrlisis de todos los enlaces peptdicos es importante por ejemplo, para la cuantificacin por HPLC, ya que la presencia de oligopptidos causa grandes cambios en los tiempos de retencin pero no se requiere una digestin completa para mtodos espectrofotomtricos. Si se usa hidrlisis enzimtica y HPLC en combinacin, existe el riesgo de no cuantificar todo el triptfano que en realidad hay en la muestra. Mtodos Hidrlisis cida Hidrlisis bsica Caractersticas El trp debe ser protegido de su degradacin por HCl. NaOH y BaOH2 a concentraciones 4 a 6N Ventajas Se puede analizar trp junto con los dems aminocidos Buenas recuperaciones. Menor degradacin de trp. Eficiencia extraccin protenas. en la de Desventajas Bajas recuperaciones. Usados solo para protenas puras Gelificacin del almidn si se usa NaOH. Digestin al vaco y a altas temperaturas. El Ba (OH)2 puede formar BaSO4 o BaCO3 que coprecipita con trp. Algunos compuestos interfieren con algunos mtodos de deteccin.

Buffers de protenas totales Hidrlisis enzimtica

Digestin a veces incompleta y por lo tanto no compatible con algunos mtodos que requieren que el trp se encuentre en forma libre. Tabla 10-1.Caractersticas de mtodos de extraccin/digestin

Contienen principalmente: Agentes caotrpicos Detergentes Agentes reductores Proteasas: Pronasa, pepsina, tripsina y papana

La papana es barata e inespecfica

10.4.3.2.

Anlisis de Carotenos

Las frutas y vegetales de la dieta humana contienen entre 20 y 30 carotenoides que se absorben en el plasma. Los carotenoides y los tocoferoles presentan especial inters para los investigadores mdicos debido a sus caractersticas antimutagnicas y anticarcinognicas,como tambin a su asociacin con mayor longevidad y disminucin del riesgo de cncer y enfermedades cardiovasculares observadas en estudios epidemiolgicos. Aunque el suplemento con -carotenos no ha sido asociado con efectos beneficiosos sobre la reduccin del riesgo de cncer o enfermedades cardiovasculares, en estudios recientes se ha sealado que tanto la lutena como la zeaxantina dietarias o plasmticas elevadas se asociaron con reduccin de la progresin de lesiones aterosclerticas y con menor riesgo de cataratas.

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La deficiencia en vitamina A (VAD) causa sntomas que van desde ceguera, xeroftalmia, insuficiencias en el sistema inmune, hasta mortalidad materna e infantil. Este problema es frecuente en zonas como el Sudeste de Asia y pases de frica, donde el arroz sin cscara, que carece de vitamina A, es la fuente principal de la alimentacin. La administracin oral de la vitamina A en estos pases es problemtica debido a la falta de infraestructura y capital, por lo que son requeridas soluciones alternativas (Ye, 2000). La vitamina A es producida naturalmente por carotenos con actividad provitamina A y el caroteno es la ms importante provitamina A para los mamferos. Se ha reportado una lnea genticamente modificada de arroz, llamada Arroz Dorado, diseada para sintetizar y acumular provitamina A (-caroteno) en el endospermo. A partir de esto que se desarrolla el concepto de ingeniera gentica basada en el aumento nutricional del arroz para lograr una reduccin en la deficiencia de vitamina A (Hoa, 2003). El desarrollo se bas en la presencia del precursor geranil-geranildifosfato, el cual es capaz de ser sintetizado en el endospermo del arroz salvaje. Proveyendo mediante ingeniera gentica todos los genes necesarios para completar la ruta biosinttica de la provitamina A, se obtienen granos de arroz amarillos que contienen altas cantidades de -caroteno (mas de 1.6 g/g) (Ye, 2000). Se ha mostrado que el uso de una desaturasa de bacteria (crtI) disminuye el esfuerzo de transformacin ya que est es capaz de producir ambas desaturaciones (Kaspar, M. 2005). Adems no es necesaria la transformacin con el gen Licopeno-ciclasa para la obtencin de caroteno, esto puede deberse a una expresin constitutiva en el endospermo o una induccin por licopeno de esta enzima (Ye, 2000). Sin embargo, la lnea mas coloreada producida tena problemas tales como muchos eventos de integracin de los genes forneos, el marcador de seleccin era un gen antibitico y la lnea transformada era poco consumida en los pases con VAD, todos estos problemas hacan que el producto obtenido fuera indeseable para la desregulacin como cultivo transgnico (Hao, 2003). A partir de esos antecedentes, se desarroll un proyecto para obtener una nueva lnea de Arroz Dorado que satisficiera todos los requerimientos regulatorios para su liberacin como producto (Hoa, 2003). La siguiente hiptesis fue; La transformacin de lneas de arroz, mediante tcnicas moleculares que cumplan con los requerimientos regulatorios, con los genes psy y crtI, es suficiente para generar lneas que acumulen provitamina A en el endospermo. Se transformaron mediante el sistema mediado por Agrobacterium tumefaciens, por el patrn de integracin simple que produce, dos cultivares de arroz, Indica y Japonica. La construccin combina el gen fitoeno-desaturasa (crtI), fusionado con un pptido seal de transporte a plstidos bajo el promotor constitutivo 35S del virus del mosaico de la coliflor y el gen psy, bajo el promotor especfico de endospermo Gt-1. El gen pmi (Foso-Man-Isomerasa) fue usado como gen selector, el cual permite la seleccin de las lneas transformadas pero no tiene actividad antibitica. Las semillas obtenidas en la T1 fueron seleccionadas fenotipicamente por el color visible antes de someterlas a otro tipo de anlisis. Las mejores lneas desde el punto de vista fenotpico fueron chequeadas para confirmar la ausencia de integracin ms all de los bordes derecho e izquierdo del vector. Este ensayo se llev a cabo utilizando distintas combinaciones de primers y el posterior anlisis de amplificacin en distintas reacciones de PCR (Reaccin en Cadena de la Polimerasa). La tcnica HPLC permite la cuantificacin de muchos carotenos simultneamente. La cantidad de carotenos fue variable entre las distintas lneas. Se obtuvieron valores mas altos con la lnea

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Japnica que con los cultivares Indica y la cantidad parece ser independiente del nmero de integraciones.

10.4.3.3.

Anlisis de flavonoides.

La ingeniera gentica de flavonoides se ha utilizado para aumentar o suprimir la concentracin de flavonoides en las plantas, o bien para sintetizarlos a travs de cultivos de bacterias. La ingeniera metablica de los flavonoides empez en 1987(Meyer P, Heidmann I, Forkmann G, Saedler H. 1987.) y ha sido un rea de investigacin muy fructfera en la dcada del '90 (Dixon R, Steele C. 1999.) La ingeniera metablica consiste en la introduccin o supresin de genes especficos en una planta objetivo. Su realizacin es cara y trabajosa. Por eso se realiza previamente una caracterizacin minuciosa de los genes, la ruta biosinttica, la especificidad de sustrato de las enzimas concernientes y la disponibilidad de sustratos definidos de la planta objetivo.
El conocimiento profundo de la planta objeto de estudio mejora mucho la probabilidad de xito para el mejoramiento y la ingeniera gentica. Por eso se realizan experimentos previos como la aplicacin de inhibidores especficos de las enzimas, que puede proveer informacin adicional. Existen inhibidores especficos para enzimas dioxigenasas dependientes de 2oxoglutarato, como son: flavanona 3-hidroxilasa (F3H), flavonol sintasa (FLS), antocianidina sintasa (ANS) y flavona sintasa I (FS I); y para enzimas monooxigenasas dependientes de citocromo P450: flavonoide 3 hidroxilasa (F3H), flavonoide 35 hidroxilasa (F35H), flavona sintasa II (FSII) e isoflavona sintasa (IFS). Suplementar a las plantas con intermediarios de flavonoides que no se encuentran naturalmente en dichas plantas es una manera de probar si la planta tiene un sistema interno de enzimas necesario para convertir dichos intermediarios en los flavonoides deseados. La aplicacin in vivo de inhibidores puede reflejar los resultados de estrategias de antisentido o de supresin.

El desarrollo de estos experimentos previos permite hacer una prediccin del resultado final de un experimento de ingeniera metablica, ahorrando tiempo y dinero. Gracias a estos experimentos previos o aproximaciones podemos hacer tambin anlisis qumicos de alteraciones en el patrn de metabolitos, incluyendo la sntesis de nuevos compuestos o, en el caso de cambios de color, incluso inspeccin ocular. La innovacin en el color de las flores, en particular la generacin de variedades azules y amarillas desconocidas, es una de las mayores fuerzas conductoras en el desarrollo del cultivo de plantas ornamentales. En una combinacin de mtodos clsicos y moleculares. La ingeniera metablica es una herramienta muy poderosa para generar nuevos colores de flores sin cambiar otras caractersticas preexistentes en una determinada variedad o cultivar.
El xito conseguido en la sntesis de pelargonidina expresando unos genes adecuados de la enzima dihidroflavonol 4-reductasa (DFR) procedentes de otras plantas, que permite conseguir flores naranjas de Petunia, ha conllevado mucho trabajo, incluyendo la introduccin de nuevos genes en determinadas especies de plantas, la complementacin de mutantes definidos, y la supresin de la sntesis de flavonoides por antisentido o supresin de sentido (Forkmann, G., S. Martens. 2001). La formacin de delfinidina por la introduccin del gen F35H tambin ha sido alcanzada en cultivos cinicos de Dendranthema, Dianthus y Rosa, pero las antocianinas basadas en cianidina y/o pelargonidina an permanecen en estas variedades. Un nuevo avance concerniente a la manipulacin de la sntesis de chalcona ha llevado a la formacin de flores amarillo plido de Petunia. Expresando el gen chalcona quetido-reductasa (CHKR) de alfalfa en una lnea acinica de Petunia se permite la sntesis de 6-deoxichalcona isoliquiritigenina, a travs de la accin conjunta de la enzima introducida con la chalcona sintasa (CHS). Como la isoliquiritigenina no es un sustrato de la chalcona isomerasa (CHI) de Petunia, cierta cantidad de chalcona se acumula en las flores, provocando una coloracin

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amarilla plida. Una concentracin mayor de chalcona puede llevar a flores verdaderamente amarillas, lo cual podra ser alcanzado por la glicosilacin e hidroxilacin de la isoliquiritigenina. La introduccin de CHKR podra ser exitosa en todas las especies de plantas con alta actividad CHS. La coloracin invariable amarilla de los ptalos de Forsythia es causada por la acumulacin de carotenoides, sin embargo, algunas antocianinas se forman en los spalos. Se ha estudiado la ruta de estos flavonoides de los spalos, revelando que la formacin de antocianinas en los ptalos es deteriorada en los pasos controlados por las enzimas DFR y ANS, sobre todo en este ltimo paso. Introduciendo el gen DFR de Antirrhinum y el ANS de Matthiola se consigue una variedad transgnica de Forsythia con flores ligeramente marrones, debido a la sntesis de algunas antocianinas en un fondo amarillo producido por los carotenoides. Introduciendo y expresando el gen difF en las flores de Dianthus que sern tambin transformadas por el gen F3 5 H de Petunia conseguimos unas flores casi negras, debido a la gran acumulacin de derivados de delfinidina. Transformado la variedad de Dianthus Eliat con el antisentido del gen F3H que codifica para la enzima flavanona 3-hidroxilasa, conseguimos flores amarillo crema, debido a la acumulacin de naringenina-chalcona 2-glucsido.

Adems de la supresin de la formacin de antocianina, la fragancia media de las plantas transgnicas era significativamente mayor que en las flores control debido a los muy elevados niveles de metilbezoato. As, suprimiendo la biosntesis de flavonoides con el F3H antisentido se desva el flujo metablico a la biosntesis de derivados del cido benzoico. Qu conclusiones se pueden sacar sobre los trabajos previos de ingeniera gentica en los flavonoides? A pesar del xito de los trabajos recientes, es muy difcil generar o suprimir compuestos flavonoides especficos de forma altamente controlada por ingeniera metablica de la ruta de los flavonoides. El aislamiento y clonacin de ms genes implicados en la ruta biosinttica de los flavonoides y de secuencias promotoras, permitir conseguir grandes avances. No slo ser posible promover una determinada ingeniera metablica o flavonoides con funciones teraputicas en plantas de cultivo, si no que tambin ser concebible desarrollar mejoras en las plantas, tales como un aumento de la resistencia generando o manipulando fitoalexinas, o mejorando la proteccin a los rayos UV y mejorar la eficiencia de nodulacin. Adems, un mejor conocimiento de los mecanismos implicados en la co-pigmentacin y el pH vacuolar, as como la disponibilidad de respectivos genes y la mejora de sistemas de transformacin para plantas ornamentales, har que la modificacin del color de las flores sea ms factible.

10.4.3.4.

Anlisis de lpidos

Figura 10-38. Extraccin por solventes y saponificacin de lpidos.

10.4.3.5.

Anlisis de protenas totales

Los granos de maz comn son fuente alimenticia para humanos y animales domsticos, y contienen en su mayor parte hidratos de carbono (74%), y en menor proporcin, protenas (9%), aceite comestible (3.4%) y fibra (1%) (Paliwal et al., 2001). Anlisis bromatolgicos de los maces comunes que llenan actualmente el mercado mundial de granos indican que los niveles de protena cruda estn en la banda de 7.5 a 8.4 por ciento, con bajo contenido de aminocidos esenciales, especialmente de lisina y triptfano; el porcentaje de grasa est en el intervalo de 3.0 a 3.5; excepcin hecha en los maces altamente especializados, sea para calidad proteica o para alto contenido de aceite, cuyos valores son significativamente ms altos que los anteriores (Dale,1997).

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Comparado con otros cereales, el grano de maz es una fuente importante de energa, pero menor como fuente de protena, tanto en proporcin como en calidad, dada las carencias en aminocidos esenciales; el porcentaje de lisina en grano es menor a 0.29, y el triptfano no rebasa el 0.07 (Dale, 1997; Araba, 1998, citado en Feed and Grain, 1998). Desde la mejora gentica del maz, se han desarrollado variedades especializadas tanto para calidad proteica (ricos en lisina y triptfano) como para alto contenido de aceite (de 6 a 9% de grasa cruda), las cuales estn en proceso de adopcin por los agricultores y usuarios; en Mxico, los maces de alta calidad proteica (conocidos como QPM, por su denominacin en lengua inglesa: quality protein maize) se han venido promoviendo durante los ltimos seis aos con xito limitado todava; los maces de alto contenido en aceite (conocidos como HOC: high oil corn) no ingresan al mercado nacional de semillas por su origen transgnico, as como las variantes en el manejo especializado para su produccin. La condicin gemelar o poliembriona en semillas de maz es una caracterstica natural que puede ser aprovechable como una va alterna en el diseo de variedades de aplicacin especial, buscando adems de potencial de rendimiento, el valor nutritivo del grano, incrementando cantidad y calidad de aceites y protena; esto, bajo la hiptesis de que dos o ms embriones por semilla, permitirn incrementar la capacidad de almacenamiento de nutrientes de calidad.

10.4.3.6.

Espectroscopa en el infrarrojo cercano (NIR)

La espectroscopa en el infrarrojo cercano (Near Infrared Spectroscopy NIRS) es un complemento de las tcnicas analticas tradicionales. El NIRS se fundamenta en un principio segn el cul, al irradiar con un haz de luz monocromtica los materiales orgnicos, estos (en funcin de la naturaleza de los enlaces y cargas electrostticas existentes entre sus tomos y molculas), absorben una determinada cantidad de energa. La absorcin de energa en el rango NIR se debe a las vibraciones de los diferentes tipos de enlances C-O, C-H y C-N. El espectro NIR es un poco ms complejo, ya que contiene bandas de absorpcin sobrelapadas que corresponden a vibraciones simples y multiples de los diferentes enlaces. La absorpcin puede expresarse en trminos de la reflectancia (log reflectancia estndar/ reflectancia de la muestra) a partir de lo cual se logra un espectro caracterstico de cada material que refleja su composicin qumica. La cuantificacin por medio de NIRS se fundamenta en la quimiomtrica, es decir, la aplicacin de las matemticas a la qumica analtica. Esta tcnica combina la espectroscopa, la estadstica, y la computacin, generando modelos matemticos que relacionan la composicin qumica (presencia de grupos qumicos activos) con cambios de energa en la regin correspondiente al rango infrarrojo cercano (longitudes de onda entre 800 y 2500nm). Las ventajas de est tcnica es: proveer informacin acerca de un metabolito en segundos, ser un mtodo no destructivo, que requiere un mnimo o ningn tratamiento de la muestra, minimiza el dao ambiental y es una tcnica multianaltica de alta precisin que permite predecir varios factores simultneamente. Una vez calibrado el espectrofotmetro, el uso del NIRS redunda en bajos costos de anlisis para los usuarios que los requieran, por lo que, a nivel internacional, es una metodologa que tiene amplia acogida. La aplicacin de las ecuaciones de calibracin para el NIRS es un procedimiento sencillo, pudindose combinar estas calibraciones dentro de un mismo programa, de manera que con un nico barrido de cada muestra, se pueden realizar simultneamente todos los anlisis citados. Facilitndose el anlisis de materia seca, ceniza, lpidos, protena, fibra, humedad, etc. El mtodo de seleccin de ecuaciones de calibracin desarrollado en el Handbook of agriculture No. 643 (ARS, agricultural research service, USDA, Washington, DC) para el anlisis de forrajes por NIR establece que para cada componente, el error estndar de calibracin (SEC) y el

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coeficiente de determinacin (RSQ) de cada ecuacin de calibracin, representan criterios importantes para tomar una decisin respecto de la seleccin de la ecuacin. En la calibracin, un grupo de espectros y un grupo de datos qumicos se usan para derivar el coeficiente de correlacin, mientras que en la validacin y la subsecuente prediccin, un grupo de espectros y la derivada del coeficiente de correlacin se utilizan para predecir un dato qumico desconocido. En la siguiente seccin se describe en ingls el principio de espectroscopia de infrarrojo cercano:
Near infrared spectroscopy (NIRS) is based on molecular overtone and combination vibrations. Such transitions are forbidden by the selection rules of quantum mechanics. As a result, the molar absorptivity in the near IR region is typically quite small. One advantage is that NIR can typically penetrate much farther into a sample than mid infrared radiation. Near infrared spectroscopy is therefore not a particularly sensitive technique, but it can be very useful in probing bulk material with little or no sample preparation. The molecular overtone and combination bands seen in the near IR are typically very broad, leading to complex spectra; it can be difficult to assign specific features to specific chemical components. Multivariate (multiple wavelength) calibration techniques (e.g., principal components analysis or partial least squares) are often employed to extract the desired chemical information. Careful development of a set of calibration samples and application of multivariate calibration techniques is essential for near infrared analytical methods.

Figura 10-39. Ejemplo de un espectro en el rango NIR Tarea 10-17 En qu principios est basada la metodologa NIR? Haga una bsqueda en la biblioteca y averige los detalles.

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11.
11.1.

Fisiologa vegetal
Introduccin

La fisiologa vegetal es fundamental para el mejoramiento de un cultivo como el maz. Se requieren conocimientos profundos sobre los distintos procesos que ocurren dentro de las clulas vegetales para poder plantear estrategias adecuadas de seleccin fenotpica y gentica. Por ejemplo, para incrementar la tolerancia a sequa de un cultivo, primero hay que entender cuales son las partes de la planta que estn involucradas. Qu procesos metablicos estn afectados? Slo as se pueden identificar las limitantes y seleccionar de manera apropiada los genotipos que se comportan mejor bajo ese tipo de estrs. A qu rgano hay que darle ms atencin: a la raz, a las hojas o al tallo? Qu es ms importante bajo sequa? El metabolismo en los rganos fotosintticos, o los procesos de biosintticos en los rganos reproductores? Qu hormonas podran estar involucradas? Qu genes se pueden mejorar? Cules son los alelos superiores? Antes de convertirse en un fitomejorador, primero hay que dominar todos los temas de la fisiologa vegetal. Estos incluyen tpicos tan amplios como: fotosntesis, transporte vascular, xilema, floema, hormonas, etc. Sin estas bases mnimas, no se puede llegar muy lejos. Es decir, sin ciertos fundamentos slidos no se puede construir algo perdurable. Es como si una persona tratara de disear un coche de carreras sin antes conocer los principios bsicos de la mecnica. Si no sabe nada del fenmeno de combustin, cmo sabr si es mejor inyectarle ms o menos oxigeno a los cilindros? Si no sabe de aerodinmica, cmo podra disear el prototipo ms veloz? Los estudiantes que quieran convertirse en buenos fitomejoradores tienen que aprender ciertos principios cientficos, para as evitar trabajar slo a base de prueba y error. Como un chimpanc con una maquina de escribir tratando de componer un poema de Shakespeare. Si lo intenta suficientes veces durante millones de aos, tarde o temprano lograr escribir algn soneto. Lo escribir pero no sabr como lo logr, ni lo podr repetir la prxima vez. El que quiera ser ms creativo y eficiente que un mono, le conviene primero aprender el vocabulario y dominar algo de gramtica. En este captulo se dar una recapitulacin de los fundamentos y los principales temas de la fisiologa vegetal, con un enfoque tanto de ciencia bsica, como de tecnologa aplicada.

11.2.
11.2.1.
11.2.1.1.

Asimilacin de carbono
La fotosntesis
La evolucin de la foto-autotrofa

En el comienzo de la vida, la tierra estuvo dominada por diferentes tipos de bacterias. Algunas eran heterotrficas mientras que otras tenan un metabolismo autotrfico. Las bacterias fotoautotrficas podan utilizar la energa de la luz para producir su propio alimento. Las cianobacterias aparecieron hace 2.7 millones de aos, como una combinacin genmica de dos grupos de bacterias: las que tenan un fotosistema del tipo uno (bacterias verdes), con las que tenan un fotosistema tipo dos (bacterias prpuras). Las bacterias que solo tenan un tipo de fotosistema slo podan usar H2S como donador de electrones para la fijacin y reduccin de dixido de carbono. Las cianobacterias fueron las primeras que lograron acoplar los dos tipos de

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fotosistemas de manera seriada para un mismo proceso de fotofosforilacin. Esta innovacin biolgica permiti por primera vez usar agua (H2O) como donador de electrones para la fotosntesis. Esto tuvo como consecuencia que en lugar de liberarse S2 a la atmsfera como antes suceda, las cianobacterias empezaron a liberar otro gas, el O2. En un milln de aos aproximadamente, las cianobacterias incrementaron el nivel de oxgeno de la atmsfera hasta un 5%, casi la cuarta parte del nivel actual (21% O2).
La razn por la que el incremento de oxgeno tardo tantos aos es que en la tierra primitiva haba mucho hierro en su forma reducida Fe2+ que reaccionaba con el oxgeno, oxidndose as a Fe3+. Slo hasta que se terminaron de oxidar miles de millones de toneladas de hierro fue cuando el oxigeno atmosfrico incremento ms. Hoy en da, todava podemos admirar el legado de las primeras cianobacterias fotosintticas en forma de diversos colores. El pigmento que utilizan las cianobacterias, la clorofila, refleja la parte media del espectro, por lo que es de color verde. El oxgeno que se libera de la fotosntesis a partir de agua, causa una difraccin especial de la luz solar en la atmsfera. Es la razn por la que nuestro cielo es de color azul. Por si fuera poco, el color rojizo de algunas suelos se debe al xido ferroso que se produjo por el oxgeno, tambin por culpa de las cianobacterias. Podemos decir entonces que algunos de los colores ms caractersticos de nuestro planeta se deben precisamente a la fotosntesis, que inventaron por primera vez las cianobacterias hace millones de aos. Podemos decir tambin que uno de los inventos biolgicos con ms repercusin evolutiva, el acoplamiento de los fotosistemas I y II, se logr a travs de la combinacin de cientos genes de organismos diferentes, lo que hoy en da se llama ingeniera gentica. La diferencia es que en ese entonces la transferencia gentica horizontal de dio por el azar (la mano de Dios), mientras que hoy en da la transferencia de genes en los laboratorios esta supervisada por cientficos mas o menos creativos, que por lo regular prefieren tardarse menos de cien aos, no millones como la evolucin natural.

El xito de las cianobacterias pudo deberse no slo a la ventaja que supuso el aprovechamiento de la energa solar (la fotosntesis), sino tambin a la abundancia del substrato H2O en comparacin de H2S (que solo se presenta en zonas volcnicas o dentro de fumarolas marinas con emisin de azufre). Otra ventaja competitiva pudo ser la inhibicin de otros organismos competidores por el oxgeno liberado (como agente txico generador de radicales oxidantes). La emergencia de los primeros eucariontes data de 1.8 millones de aos, y se debi a la incorporacin de otra bacteria heterotrfica a una clula eucaritica con un sistema de membranas internas (ncleo y retculo endoplasmtico). As fue como las clulas eucariticas adquirieron sus primeros organelos por endosimbiosis. Las clulas eucariticas con mitocondrias pudieron multiplicarse mucho mas rpido, ya que podan aprovechar el oxigeno para oxidar alimentos (Ciclo de Krebs y fosforilacin oxidativa), y de esta forma obtenan mucho ms ATP que las otras clulas fermentadoras. Muchos millones de aos despus, algunas de estas clulas eucariticas heterotrficas, incorporaron por endosimbiosis a las cianobacterias fotosintticas formndose as clulas eucariticas con cloroplastos, dando lugar a las algas verdes. A partir de entonces, la fotosntesis de las algas verdes disminuy los niveles de dixido de carbono e increment el nivel de oxgeno hasta llegar al actual. Por ltimo, los descendientes de las algas verdes, las plantas terrestres, aparecieron hace 500 millones de aos creando as la tierra que hoy habitamos, con sus diversos paisajes y ecosistemas. Si antes la vida dependa ms de la fotosntesis marina, hoy en da la mayor parte de la biomasa y de nuestros alimentos la obtenemos de la fotosntesis de plantas terrestres.

11.2.1.2.

El esquema global

La vida sobre la Tierra depende de la luz solar. La energa lumnica es capturada por los organismos fotosintticos quienes la usan para formar ATP, NADPH, carbohidratos y oxgeno libre a partir del dixido de carbono y del agua, en una serie compleja de reacciones. En la fotosntesis, la energa lumnica se convierte en energa qumica y el carbono se fija en compuestos orgnicos. La ecuacin generalizada para este proceso es: CO2 + 2H2A + energa lumnica ----> (CH2O) + H2O + A2

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en la cual H2A significa agua o alguna otra sustancia como H2S cuyos electrones puedan ser desprendidos fcilmente. Esta frmula deja claro que el oxgeno (A2) que se libera a partir de la fotosntesis viene de las dos molculas de agua (H2A) y no del dixido de carbono. El oxgeno de la molcula de dixido de carbono (CO2) se queda una parte en los carbohidratos (CH2O) y otra parte se libera en forma de agua (H2O). La energa lumnica es capturada por el mundo vivo por medio de pigmentos especiales unidos a complejos de protenas llamados fotosistemas. La fotosntesis en las plantas ocurre dentro de organelos celulares, cloroplastos, que estn rodeados por dos membranas. Dentro de las membranas del cloroplasto est contenida una solucin de compuestos orgnicos e iones, conocida como estroma, y un sistema complejo de membranas internas fusionadas que forman sacos llamados tilacoides. Los tilacoides se apilan formando la grana. Se llaman as porque se ven como pequeos manchones verdes (grnulos) cuando uno mira los cloroplastos con un microscopio. Los pigmentos y los complejos fotosintticos responsables de la captura de la luz estn situados en las membranas tilacoides. Hace unos 200 aos se demostr que se requiere luz para la fotosntesis de las plantas con generacin de oxgeno. La evidencia de que este proceso puede ser influenciado por distintos factores llev a distinguir una etapa 100% dependiente de la luz -las reacciones lumnicas- y una etapa ms bien dependiente de la temperatura. Es decir, se llego a reconocer que exista una etapa fotoqumica dependiente de luz y una etapa enzimtica no dependiente de la luz. A esta segunda etapa se le llama reacciones "oscuras". Ahora se sabe que la etapa que requiere luz es la que se lleva a cabo en los tilacoides (liberacin de oxigeno), mientras que la fase oscura se lleva a cabo en el estroma (fijacin de dixido de carbono).

Figura 11-1. Esquema global de la fotosntesis

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11.2.1.3.

La clorofila y otros pigmentos

Para que la energa lumnica pueda ser usada por los sistemas vivos, primero debe ser absorbida. Aqu entran en juego los pigmentos. Un pigmento es cualquier sustancia que absorbe luz en el rango visible. Algunos pigmentos absorben luz de todas las longitudes de onda y, por lo tanto, parecen negros. Otros solamente absorben ciertas longitudes de onda, transmitiendo o reflejando las longitudes de onda que no absorben.
La naturaleza de la luz La luz blanca se separa en sus colores componentes cuando pasa a travs de un prisma. A este fenmeno lo llamo Newton, el "clebre fenmeno de los colores". La luz visible es slo una pequea porcin del vasto espectro electromagntico. De acuerdo con el llamado modelo corpuscular de la luz, un haz de luz est compuesto por pequeos paquetes de energa, denominados actualmente cuantos de luz o fotones. La energa de un fotn no es la misma para todos los tipos de luz, sino que, en realidad, es inversamente proporcional a la longitud de onda: cuanto mayor sea la longitud de onda, menor ser la energa. Los fotones de luz violeta (420nm), por ejemplo, tienen casi el doble de energa que los fotones de luz roja (700nm). Para el ojo humano, el espectro visible va desde la luz violeta -cuyos rayos de longitudes de onda ms cortos son de 380 nanmetros- a la luz roja, cuyos rayos visibles de mayor longitud son de 730 nanmetros (nm).

Figura 11-2. La luz blanca es una mezcla de colores diferentes, que van desde el violeta, en un extremo del espectro, hasta el rojo, en el otro.

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Los pigmentos que intervienen en la fotosntesis de los eucariotes incluyen las clorofilas y los carotenoides. Diferentes grupos de plantas y algas usan distintos pigmentos en la fotosntesis. Hay varios tipos diferentes de clorofila que varan ligeramente en su estructura molecular.

Figura 11-3. Estructura de la clorofila a, b, d, c1 y c2. De wikipedia La clorofila a es el pigmento involucrado directamente en la transformacin de la energa lumnica en energa qumica. La mayora de las clulas fotosintticas tambin contienen un segundo tipo de clorofila (clorofila b y c). Con respecto a los carotenoides, uno de los que se encuentran en las hojas es el beta-caroteno y otro es la lutena. Los carotenoides son pigmentos rojos, anaranjados o amarillos. En las hojas verdes su color est enmascarado por las clorofilas, que son ms abundantes. En algunos tejidos, sin embargo, predominan los colores reflejados por los carotenoides, como el licopeno en los tomates maduros. Lo mismo ocurre en las clulas foliares cuando degradan su clorofila en el otoo. La luz absorbida por los pigmentos lanza los electrones a niveles energticos ms altos. Dada la forma en que los pigmentos estn compactados en las membranas, son capaces de transferir su energa a molculas reactivas de clorofila a, empaquetadas en una forma particular.

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Figura 11-4. La curva superior muestra el espectro de accin de la fotosntesis, y las curvas inferiores, los espectros de absorcin para distintos pigmentos: la clorofila a, la clorofila b y los carotenoides que se encuentran dentro del cloroplasto.

11.2.1.4.

Los rganos fotosintticos

Los tejidos internos de las hojas estn completamente encerrados por clulas epidrmicas transparentes, cubiertas con una capa cerosa, la cutcula. Esta capa la hace impermable a los gases y los lquidos. El oxgeno, el dixido de carbono y el vapor de agua salen o entran a la hoja principalmente a travs de aberturas especiales: los estomas. Los gases y el vapor de agua llenan los espacios existentes entre las clulas de la capa esponjosa, entrando y saliendo de las clulas por difusin. El agua, absorbida por las races, entra en la hoja por medio de los vasos del xilema del haz conductor, en tanto que los azcares, producto de la fotosntesis, dejan la hoja a travs de un tejido conductor conocido como floema, viajando a otras partes de la planta, entre ellas, los rganos no fotosintetizantes. La mayor parte de la fotosntesis se realiza en las clulas del parnquima en empalizada, clulas alargadas que se encuentran directamente por debajo de la epidermis superior y que constituyen el mesfilo. Tienen una vacuola central grande y numerosos cloroplastos que se mueven dentro de la clula, orientndose con respecto a la luz. La luz es capturada en las membranas de los tilacoides, dentro de los cloroplastos.

11.2.1.5.

Las membranas fotosintticas

La unidad estructural de la fotosntesis en las clulas vegetales es el cloroplasto. Dentro del cloroplasto se encuentran las membranas tilacoides, una serie de membranas internas que contienen los pigmentos fotosintticos. Cada tilacoide tiene habitualmente la forma de un saco aplanado o vescula.

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Figura 11-5. Ampliaciones de una hoja verde, y estructura membranal de un cloroplasto.

11.2.1.6.

Las etapas de la fotosntesis

La evidencia de que la fotosntesis puede ser influenciada por distintos factores llev a distinguir una etapa dependiente de la luz, la etapa llamada de reacciones "lumnicas", y una etapa enzimtica, independiente de la luz, las reacciones "oscuras". Los trminos reacciones "lumnicas" y "oscuras" han creado mucha confusin pues, aunque las reacciones "oscuras" no requieren de la luz como tal, sino solamente de los productos qumicos de las reacciones "lumnicas", pueden ocurrir tanto en la luz como en la oscuridad. Mas an, trabajos recientes han mostrado que varias enzimas que controlan reacciones "oscuras" claves son reguladas indirectamente por la luz. Como resultado, estos trminos han cado en desuso y estn siendo

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reemplazados por vocablos que describen ms precisamente los procesos que ocurren durante cada etapa de la fotosntesis: las reacciones que capturan energa y las reacciones de fijacin del carbono.

En la primera etapa de la fotosntesis, la luz es absorbida por las molculas de clorofila a, que estn compactadas de un modo especial en las membranas tilacoides. Los electrones de las molculas de clorofila a son lanzados a niveles energticos superiores, y, en una serie de reacciones, su energa adicional es usada para formar ATP a partir de ADP y para reducir una molcula transportadora de electrones conocida como NADP+ (Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate). .
El NADP es muy semejante al NAD y tambin se reduce por la adicin de dos electrones y + + de un protn, formando NADPH. Tanto el ADP, ATP como NAD y NADP son molculas de azcares fosforilados unidos a una base nitrogenada (nucletidos). Sin embargo, los papeles biolgicos de estas molculas son notablemente distintos. El NADH generalmente transfiere sus electrones a otros transportadores de electrones, que continan transfirindolos en pasos discretos a niveles de energa sucesivamente ms bajos. El NADPH principalmente su usa para procesos de biosntesis, mientras que el NADH se utiliza en la gliclisis y la respiracin. En el curso de esta transferencia de electrones se forman molculas de ATP. En contraste, el ATP y ADP proporcionan energa directamente a los procesos biosintticos de la clula que requieren grandes ingresos de energa.
+ +

Figura 11-6. Esquema de la molcula de NADP+. En esta primera etapa de la fotosntesis, tambin se escinden molculas de agua, suministrando electrones que reemplazan a los que han sido lanzados desde las molculas de clorofila a. La escisin de las molculas de agua es la causa de que se forme oxgeno libre, que difunde hacia el exterior. En la segunda etapa de la fotosntesis, el ATP y el NADPH formados en la primera etapa se utilizan para reducir el carbono del dixido de carbono a un azcar simple. As, la energa qumica almacenada temporalmente en las molculas de ATP y de NADPH se transfiere a molculas adecuadas para el transporte y el almacenamiento de energa en las clulas de las algas o en el cuerpo de las plantas. La resultante de este proceso es pues la formacin de un esqueleto de carbono, a partir del cual pueden construirse luego otras molculas orgnicas. La incorporacin inicial de CO2 en compuestos orgnicos se conoce como fijacin del carbono. Los pasos por los cuales se lleva a cabo, llamados las reacciones de fijacin del carbono, ocurren en el estroma del cloroplasto.

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11.2.1.7.

Reacciones que capturan energa

En el siglo pasado se postul un modelo para explicar cmo ocurren las reacciones que capturan energa. Segn este modelo, la energa lumnica incide sobre pigmentos antena del Fotosistema II; luego, los electrones pasan cuesta abajo al Fotosistema I, a lo largo de una cadena de transportadores de electrones. Este pasaje genera un gradiente de protones que impulsa la sntesis de ATP a partir de ADP, proceso llamado fotofosforilacin. Ms adelante se explican estos procesos en detalle.
Al igual que la fosforilacin oxidativa en las mitocondrias, la fotofosforilacin en los cloroplastos es un proceso quimiosmtico. En las reacciones de fijacin del carbono los productos de la primera etapa de la fotosntesis se usan en la sntesis de molculas orgnicas. Estas reacciones, que ocurren en el estroma, forman parte del ciclo reductivo de las pentosas fosfato (Ciclo de Calvin). Las molculas orgnicas obtenidas en el Ciclo de Calvin -azcares de tres, cuatro, cinco y seis carbonos- son usadas por las clulas vegetales para elaborar sacarosa, almidn, aminocidos y cidos grasos. Estas molculas son utilizadas in situ para los propios fines de la planta o para exportar a otros tejidos a travs del floema.

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Figura 11-7. Esquema resumen del acoplamiento de los dos fotosistemas para romper molcula de agua, liberar oxigeno, generar energa qumica (ATP) y poder reductor (NADPH). La energa lumnica incide sobre pigmentos antena del Fotosistema II, que contiene algunos cientos de molculas de clorofila, a y b. Los electrones son lanzados cuesta arriba desde la molcula reactiva P680 de la clorofila a un aceptor de electrones primario. Cuando se eliminan los electrones, ellos son reemplazados por electrones de las molculas de agua, con la produccin simultnea de O2 libre y protones (iones H+). Luego, los electrones pasan cuesta abajo al Fotosistema I a lo largo de una cadena de transportadores de electrones; este pasaje genera un gradiente de protones que impulsa la sntesis de ATP a partir de ADP, proceso denominado fotofosforilacin. La energa lumnica absorbida en los pigmentos antena del Fotosistema I y transferida a la clorofila P700 da como resultado que se lancen electrones hacia otro aceptor primario de electrones. Los electrones eliminados del P700 son reemplazados por electrones del Fotosistema II y son finalmente aceptados por el transportador de electrones NADP+. La energa proveniente de esta secuencia de reacciones est contenida en las molculas de NADPH y en el ATP formado por fotofosforilacin. Entre stas se distinguen los pigmentos, los transportadores de electrones, los Fotosistemas I y II y enzimas necesarias, incluyendo las ATP sintetasas. La disposicin de estas molculas en la membrana tilacoidal hace posible la sntesis quimiosmtica del ATP durante la fotofosforilacin. Los electrones pasan desde el aceptor de electrones primario, a lo largo de una cadena de transporte de electrones, a un nivel de energa inferior, el centro de reaccin del Fotosistema I. A medida que pasan a lo largo de esta cadena de transporte de electrones, parte de su energa se empaqueta en forma de ATP. La energa lumnica absorbida por el Fotosistema I lanza los electrones a otro aceptor primario de electrones. Desde este aceptor son transferidos mediante otros transportadores de electrones al NADP+ para formar NADPH. Los electrones eliminados del Fotosistema I son reemplazados por los del Fotosistema II. El ATP y el NADPH representan la ganancia neta de las reacciones que capturan energa. Para generar una molcula de NADPH, deben ser lanzados dos electrones desde el Fotosistema II y dos del Fotosistema I. Se escinden dos molculas de agua para formar protones y gas oxgeno, poniendo en disponibilidad los dos electrones de reemplazo necesarios para el Fotosistema II. Se regenera una molcula de agua en la formacin de ATP.

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Figura 11-8. Complejos proteicos presentes en la membrana tilacoidal. La fotofosforilacin tambin ocurre como resultado del flujo cclico de electrones, proceso en el que no participa el Fotosistema II. En el flujo cclico de electrones, los electrones lanzados desde el P700 en el Fotosistema I no pasan al NADP+, sino que son desviados a la cadena de transporte de electrones que une al Fotosistema II con el Fotosistema I. A medida que fluyen a lo largo de esta cadena, nuevamente al P700, se transportan cargas a travs de la membrana. Esto genera un potencial electroqumico en los tilacoides, que finalmente genera ATP. En un proceso quimiosmtico, como la fotofosforilacin que ocurre en los cloroplastos, a medida que los electrones fluyen en la cadena de transporte de electrones desde el Fotosistema II al Fotosistema I, los protones son bombeados desde el estroma al espacio tilacoide, creando un gradiente electroqumico. A medida que los protones fluyen a favor de este gradiente desde el espacio tilacoide nuevamente al estroma, pasando a travs de los complejos de ATP sintetasa, se forma ATP. Al igual que la fosforilacin oxidativa en las mitocondrias, la fotofosforilacin en los cloroplastos es un proceso de acoplamiento quimiosmtico.

Figura 11-9. Los dos fotosistemas generan un gradiente de protones para la sntesis de ATP. En el interior del tilacoide hay un pH bajo, mientras que en el exterior predomina un pH 8.

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En este proceso, los electrones de la molcula reactiva de clorofila a del Fotosistema II son impulsados a niveles energticos superiores por la luz solar. A medida que descienden por una cadena de transportadores de electrones hacia la molcula reactiva de clorofila a del Fotosistema I, la energa que liberan es empleada para bombear protones (H+). Los protones se bombean desde el estroma al espacio tilacoidal. Esto crea un gradiente electroqumico. Cuando los protones se mueven a favor del gradiente a travs del complejo de la ATP sintetasa, desde el espacio tilacoidal al estroma del cloroplasto, el ADP se fosforila a ATP.

11.2.1.8.

Reacciones de fijacin de carbono

Las reacciones que fijan carbono son tambin conocidas como reacciones "oscuras" o reacciones "independientes de la luz". En organismos auttrofos acuticos el dixido de carbono (CO2) penetra en los sin necesidad de estructuras especiales. Sin embargo, las plantas terrestres deben protegerse de la desecacin y han desarrollado aberturas especiales denominadas estomas que regulan la entrada y salida del gas por las hojas. La fase oscura de la fotosntesis tambin se denomina ruta reductiva de las pentosas fosfato (RPP) o mejor conocido como ciclo de Calvin (en honor a su descubridor Melvin Calvin). Las reacciones tienen lugar en el estroma dentro de los cloroplastos.
A fines de la segunda guerra mundial, en los laboratorios de Berkeley (California), Calvin y sus colaboradores, usando Carbono-14 y las entonces nuevas tcnicas de intercambio inico, cromatografa en papel y radiografa "mapearon" completamente el ciclo del carbono en la fotosntesis. Por estos trabajos result laureado con el premio Nobel en 1961, y el ciclo del carbono se conoce comnmente como ciclo de Calvin, o de Calvin-Benson.

En las reacciones de fijacin del carbono que ocurren en el estroma, el NADPH y el ATP, producidos en las reacciones de captura de energa, se usan para reducir un compuesto de tres carbonos, el gliceraldehdo-3-fosfato (GAP). A esta va en la que el carbono se fija para formar 3fosfoglicerato (3PGA) mediante ribulosa-1,5- bifosfato y CO2., se le denomina va de tres carbonos o C3. Esta reaccin es catalizada por medio de la enzima Ribulosa 1-5-bifosfato carboxilasa oxidasa, RUBISCO. Rubisco presenta 8 subinidades grandes y 8 subunidades pequeas ensambladas en 4 dmeros ( figura 10-8). Los genes que codifican para las unidades pequeas son nucleares, mientras que los genes de las subunidades grandes son plastdicos. La subunidad pequea se ensambla en los ribosomas del citosol y se dirige al cloroplasto por medio de un pptido seal. La enzima es ensamblada por completo en este organelo.

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Figura 11-10. Estructura secundaria y terciaria de la holoenzima Rubisco. En rojo se muestran las molculas de ribulosa-1-5-bisfosfato unidas a los sitios activos de la enzima. Adems de la reaccin de carboxilacin, rubisco tambin reacciona con O2, dando lugar al proceso de fotorrespiracin. Como el CO2 y el O2 son sustratos que compiten por la enzima, la carboxilacin de la ribulosa -1, 5- bifosfato depende de la relacin CO2/O2 del medio. Durante la carboxilacin, rubisco ingresa tres molculas de dixido de carbono por cada ciclo. (figura 10-9).
Se combinan seis molculas de ribulosa bifosfato (RuBP), un compuesto de cinco carbonos, con seis molculas de dixido de carbono, produciendo seis molculas de un intermediario inestable que pronto se escinde en doce molculas de fosfoglicerato, un compuesto de tres carbonos. Estos ltimos se reducen a doce molculas de gliceraldehdo fosfato. Diez de estas molculas de tres carbonos se combinan y se regeneran para formar seis molculas de cinco carbonos de RuBP. Las dos molculas "extra" de gliceraldehdo fosfato representan la ganancia neta del ciclo de Calvin. Estas molculas son el punto de partida de numerosas reacciones que pueden implicar, por ejemplo, la sntesis de glcidos, aminocidos y cidos grasos.

La energa que impulsa al ciclo de Calvin son el ATP y el NADPH producidos por las reacciones de captura de energa en la primera etapa de la fotosntesis.

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El gliceraldehdo-3-fosfato tambin puede ser utilizado como material de partida para otros compuestos orgnicos necesarios para la clula. Otras plantas que viven en ambientes secos y clidos tienen mecanismos que les permiten fijar inicialmente el CO2 por una de dos vas, y as logran minimizar la prdida de agua. Estas vas se conocen como la va de cuatro carbonos, o C4 y el camino de las plantas CAM, y preceden al Ciclo de Calvin.

Figura 11-11. Ciclo de Calvin. Las enzimas estn representadas por nmeros: 1 Rubisco; 2 3phosphoglycerate kinase; 3 glyceraldehyde-3-phosphate kinase;4 triose phosphate isomerase; Aldolase; 6 fructose-1,6-biphosphate phosphatase;7transketolase; 8Aldolase; 9 Sedoheptulose1,7-biphosphate phosphatase; 10 transketolase; 11Ribulose-5-phosphate epimerase;12 ribose-5phosphate isomerase;13Ribulose-5-phosphate kinase (modificada de Taz y Zeiger 1998).

11.2.1.9.

Fotorrespiracin

Como ya se mencion, la fotorrespiracin es el proceso por el cual Rubisco fija O2 en lugar de fijar CO2. Las tasas relativas de carboxilacin/oxigenacin estn determinadas por la concentracin de ambos gases y por la preferencia de Rubisco hacia cada uno de ellos (Foyer et al., 2009). Dado que la reaccin de carboxilacin de Rubisco evolucion en condiciones de alta concentracin de CO2, las consecuencias de la oxigenacin eran mnimas (Holland, 2006), pero en las condiciones atmosfricas actuales la reaccin de oxigenacin se lleva a cabo mucho ms rpido en las plantas C3, por lo que la fotorrespiracin es considerada uno de los procesos biolgicos ms ineficientes, por lo que ,desde hace dcadas se han realizado varios esfuerzos por erradicarlo (Foyer 2009). Aunque, por otro lado, se ha demostrado que este proceso es

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necesario en algunas plantas C3. Por ejemplo, se ha propuesto que procesos tan importantes como la fijacin de nitrgeno pueden depender de la fotorrespiracin (Rachmilevitch et al., 2004) El oxgeno, un inhibidor de la fotosntesis, puede estar presente en alta concentracin en las hojas de las plantas. La elevada concentracin de oxgeno en los cloroplastos puede inducir fotorrespiracin. En la fotorrespiracin, el oxgeno sustituye al CO2 como sustrato de la RUBISCO, provocando la liberacin de CO2 y la oxidacin de la RuBP como se muestra en la siguiente ecuacin:
H H-C-O-PO3H H-C-O-PO3C=O O=O Oxgeno C=O C
-O O 3-fosfoglicerato

H-C-OH H-C-OH H-C-O-PO3H

Rubisco
O C H-C-O-PO3H 2-fosfoglicolato O-

Ribulosa-1,5-bifosfato

La elevada concentracin de oxgeno en el lugar de reaccin de la RUBISCO es la causa de la fotorrespiracin. Las plantas C4 evitan la fotorrespiracin mediante una extensin del ciclo de Calvin-Benson que consigue concentrar el CO2, y no el oxgeno, en las clulas de la vaina del haz, donde tiene lugar la reaccin catalizada por la RUBISCO. Las plantas C4 pueden mantener alta la concentracin loca del CO2 para la actividad de la RUBISCO sin incremento simultneo de la concentracin de oxgeno.

Calvin Cycle
RuBP CO2 PGA O2

Chloroplast

P -Glycolate

Peroxisome Glycerate NAD NADH OH Piruvate Glycolate O2 H2O2 Glyxolate Glu 2OG Ser Glycine 2OG Glu Gln Glu H2O+O2

Ser

Gly

Gly CO2

Mitochondrion

THF

C THF

NH3

NAD H

NAD

Citoplasm

Figura 11-12. Esquema metablico de la fotorrespiracin.

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An abbreviated scheme of the photorespiratory pathway. Phosphoglycolate produced by ribulose bisphosphate (RuBP) oxygenase activity is converted to glycolate by phosphoglycolate phosphatase in the chloroplast. Glycolate enters peroxisomes and is converted to glyoxylate by glycolate oxidase. Glyoxylate is transaminated to Gly by either Ser:glyoxylate aminotransferase or Glu:glyoxylate aminotransferase. In mitochondria, Gly is converted to CO2, ammonia and the methylene group of methylene tetrahydrofolate (C1-THF). Gly and C1-THF condense to produce Ser. Peroxisomal Ser is deaminated to hydroxypyruvate, which is reduced to glycerate by hydroxypyruvate reductase. Glycerate enters the chloroplast and is phosphorylated to 3phosphoglycerate, an intermediate of the Calvin cycle. Ammonia released during Gly decarboxylation is used by Gln synthetase to produce Gln. Glu synthase condenses 2oxoglutarate (2-OG) and Gln to produce two molecules of Glu. A dicarboxylate transporter in the chloroplast envelope transfers oxoglutarate, Glu, and Gln across the chloroplast envelope. Overall, two molecules of phosphoglycolate are converted to one molecule of phosphoglycerate and one molecule of CO2 (Modificada de Somerville C R., 2001).

Tarea 11-1 Traduzca el anterior recuadro en ingls, al castellano, y dibuje su propio esquema de fotorrespiracin considerando los diferentes compartimentos subcelulares.

11.2.2.
11.2.2.1.

Plantas C3, C4 y CAM

Plantas C3

Se denominan as a las plantas en las que el primer producto de la fijacin de CO2 es una molcula de 3 carbonos, el 3 fosfoglicerato. La ruta metablica C3 se encuentra en los organismos fotosintticos como las cianobacterias, algas verdes y en la mayora de las plantas vasculares. Estas ltimas, son plantas que crecen en zonas templadas (15-25C) y se saturan de luz con 200-300 J m-2 s-1. Como la intensidad de la luz solar en el verano es de 800 a 1000 J m-2 s-1, la mayora de esa luz no la pueden aprovechar esas plantas.

11.2.2.2.

Plantas C4

Existe otro grupo denominadas plantas C4. En estas el primer producto de la fijacin de CO2 es un compuesto de 4 carbonos como el malato y el aspartato. En estas plantas la captura del dixido de carbono se da mediante la enzima fosfoenolpiruvato carboxilasa (PEPC). Este proceso ocurre en el mesfilo, mientras que la asimilacin de carbono, ya en azcares se realiza en el haz de vaina, tras la descarboxilacin de la molcula de 4 carbonos, se contina con el ciclo que presentan las plantas C3.Por lo anterior las plantas C4 presentan otro tipo de anatoma foliar, denominada anatoma tipo Kranz (figura10-11).
a) Anatoma tpica de planta C3 B) Anatoma tpica de planta C4

Figura 10-11. a) tpica anatoma de una planta C3; b) anatoma tipo Kranz, tpica de plantas C4. (http://www.etsmre.upv.es/varios/biologia/Temas/tema_11.htm)

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Una caracterstica de la anatoma Kranz es la presencia de cloroplastos de distinto tipo. Los cloroplastos del mesfilo solo tienen fotosistema I, no acumulan almidn ni tampoco tienen protena Rubisco. Mientras que los cloroplastos del haz vascular si tienen los dos fotosistemas, si tienen actividad de Rubisco y si acumulan almidn. El hecho de que la proteina Rubisco solo se concentre en ciertas clulas permite a las plantas C4 tener una mayor eficiencia de uso de agua, y tambin de nitrgeno. La protena Rubisco representa casi el 30% del nitrgeno que requiere la planta para crecer, por lo que cualquier ahorro en Rubisco, permite ahorrar nitrgeno como fertilizante.

Las especies C4, que incluyen, la caa de azcar, el sorgo, el maz y otros pastos, crecen en climas tropicales, pues presentan temperaturas ptimas de crecimiento entre 30 y 47C; no exhiben prcticamente ningn sntoma de saturacin de luz. An con intensidades de 880 J m-2 s-1 por lo cual pueden hacer mejor uso de las intensidades de luz altas y crecen bien en condiciones de escasez de agua.

11.2.2.3.

Plantas CAM

Otras especies realizan la fotosntesis denominada CAM (Crassulacean Acid Metabolism). En estas plantas los procesos C3 y C4 se llevan a cabo en la misma clula, pero estn separados temporalmente. Durante la noche se fija el CO2 atmosfrico como malato (C4) mediante la PEPC en el citosol. El malato se guarda en la vacuola. Durante el da, el malato sale de la vacuola y se descarboxila. El CO2 liberado se asimila mediante el ciclo C3 (Dodd et al., 2002). Las plantas que realizan este proceso crecen en climas clidos, pues su temperatura ptima de crecimiento es 35C o mayor. Entre estas se encuentra la pia, el agave y el nopal.

Figura 11-13. Planta CAM del gnero Opuntia

11.2.3.
11.2.3.1.

Descripcin de las distintas rutas fotosintticas

Fotosntesis C3
Comentario [EVO10]: Esta informacin ya est mencionada. La figura de abajo se podra colocar a un lado de cualquiera de los 2 esquemas del ciclo de calvin desarrollado, eliminando alguna de las figuras (hay 3 figuras de ciclo de calvin, 2 desarrollados y uno resumido)

Todas las plantas C3 fijan el carbono a travs de un ciclo fotosinttico de varios tomos de carbono que involucra sobre todo un primer intermediario con tres tomos de carbono: el fosfoglicerato. Se denominan plantas C3 las que solamente disponen de ese ciclo bsico. La enzima responsable es la Rubisco. Es la protena ms abundante de la biosfera. .

324

Figura 11-14. Ciclo de Calvin simplificado.

325

Figura 11-15. Ruta reductiva de las pentosas fosfato.

11.2.3.2.

Fotosntesis C4

La respuesta se relaciona con la presin selectiva que ejercen ciertos ambientes en cuanto a la relacin CO2 fijado vs. H2O transpirada o Eficiencia en el Uso del Agua (WUE de water use efficiency). Puede demostrarse que incluso bajo condiciones ambientales favorables, una planta C3 pierde aproximadamente 100 molculas de H2O por molcula de CO2 que entra por los estomas. En zonas con aporte constante de agua este hecho no representa un problema pero en regiones ridas y semiridas s llega a serlo.

Comentario [EVO11]: Este parrafo no esta relacionado con el ttulo

326

Figura 11-16. La escasez de agua es un problema cada vez mas serio en el mundo.

Figura 11-17. Fotosntesis tipo C4. El CO2 es fijado en dos compartimientos diferentes: en el mesfilo el CO2 es fijado como HCO3- por la anhidrasa carbnica para ser tomado a continuacin por la PEPCasa que incorpora el carbono en un cido C4. Este cido C4 es

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transportado hacia el haz de vaina por la accin de acarreadores especficos ATP dependientes, en donde es descarboxilado para liberar CO2 que es fijado por RUBISCO e incorporado en el ciclo de Calvin-Benson. Por otro lado, dado que la actividad estomtica responde finamente al balance entre CO2 ganado/H2O perdida, aquellas condiciones que lleven a un balance desfavorable como alta temperatura e irradiancia, alto dficit de presin de vapor entre mesfilo y atmsfera, aporte limitado de agua por el suelo o conductividad elctrica muy alta en la solucin de agua del suelo, tendern al incremento en la restriccin difusiva del agua con el cierre estomtico parcial o total. Dicho cierre estomtico tambin impacta negativamente en la difusin de CO2, lo cual se traduce en aumento en la actividad fotorrespiratoria de la planta, cosa que no ocurre en las plantas C4 o CAM. En aquellos ambientes con restricciones hdricas constantes, estacionales o diarias como son las zonas ridas, semiridas y ambientes epifticos las plantas C4 y CAM funcionan como especialistas de gran xito con mayor WUE en comparacin con las plantas C3. Las modificaciones bioqumicas con lo cual se consigue esto se relacionan con el aumento en la cantidad y eficiencia de accin de la anhidrasa carbnica (AC), enzima que tiene importancia marginal en las plantas C3, y con la accin de un sistema de bombeo del CO2 conseguido a travs de la accin de la fosfoenolpiruvatocarboxilasa (PEPCasa) y ATPasas de membrana. Para las plantas C4 el resultado de las modificaciones evolutivas es que el CO2 es fijado en dos compartimientos diferentes: en el mesfilo el CO2 es fijado como HCO3- por la AC para ser tomado a continuacin por la PEPCasa que incorpora el carbono en un cido C4. Este cido C4 es transportado hacia la vaina del haz vascular por la accin de acarreadores especficos ATP dependientes en donde es descarboxilado para liberar CO2 que es fijado por RUBISCO e incorporado en el ciclo de Calvin-Benson. Con la accin de este mecanismo de concentracin y bombeo de CO2 hacia los sitios de fijacin por RUBISCO la planta es capaz mantener tasas altas de asimilacin de CO2 en presencia de baja concentracin intercelular de dicho gas. A pesar de estas adaptaciones las plantas C4 no son ms tolerantes al estrs hdrico severo que las C3; esto significa que el mecanismo C4 es una adaptacin encaminada al uso eficiente del agua, no a la tolerancia al estrs hdrico.
Algunas plantas que viven en climas secos y calurosos mantienen una baja concentracin de oxgeno en sus hojas pues mantienen los estomas cerrados para evitar la prdida de agua. Para alcanzar concentraciones de CO2 adecuadas para la fotosntesis, las plantas C4 han adaptado la fotorrespiracin con una modificacin del ciclo de Calvin-Benson. Las plantas C4 tienen una anatoma especial, con prominentes clulas de vaina de haz alrededor de los vasos de las hojas. La fotorrespiracin es mnima en plantas C4 comparada con plantas C3, y el CO2 es concentrado activamente en las clulas de la vaina del haz.

11.2.3.3.

Fotosntesis CAM

En las plantas CAM, sin embargo, el resultado de las modificaciones evolutivas es que el CO2 es fijado en dos etapas separadas temporalmente, y no fsicamente como ocurre en las C4. Durante la noche la apertura de los estomas permite la difusin de CO2 que es fijado como HCO3- por la AC y es tomado por la PEPc que lo incorpora en cidos C4 que se acumulan en las vacuolas va una bomba de membrana ATP dependiente. Durante el da, los estomas cierran y los cidos C4 son llevados al citoplasma, a travs de un mecanismo aparentemente pasivo, en donde son descarboxilados. El CO2 liberado, que alcanza concentraciones internas muy altas, es fijado en los cloroplastos por RUBISCO para incorporarlo al ciclo de Calvin-Benson. La respuesta se relaciona con la presin selectiva que ejercen ciertos ambientes en cuanto a la relacin CO2 fijado vs. H2O transpirada o Eficiencia en el Uso del Agua (WUE). Puede demostrarse que incluso bajo condiciones ambientales favorables, una planta C3 pierde aproximadamente 100

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molculas de H2O por molcula de CO2 que entra por los estomas. En zonas con aporte constante de agua este hecho no representa un problema pero en regiones ridas y semiridas s llega a serlo.

Figura 11-18. Metabolismo tipo CAM. Con las flechas azules se indican las reacciones nocturnas del ciclo C4 y con rojas, las reacciones que ocurren durante el da. Algunas enzimas estn indicadas con nmeros: 1 anhidrasa carbnica; 2 Fosfoelnolpiruvato carboxilasa; 3 malato deshidrogenasa; 4 enzima mlica.

Tarea 11-2 Cul de los siguientes enunciados sobre la fotosntesis en plantas C4 NO es cierto? A. El primer producto de la fijacin del dixido de carbono es un compuesto con 4 tomos de carbono. B. La fotosntesis C4 es una adaptacin para las plantas que viven en climas clidos y ridos. C. El dixido de carbono es fijado inicialmente en clulas mesfilas, pero el ciclo de Calvin es activo en las clulas de la vaina del haz en las hojas de las plantas C4. D. El ATP total que usan las plantas C4 para la biosntesis de azcares es mayor que el usado en las plantas C3. E. La fotorrespiracin es mnima en plantas C4 comparada con plantas C3.

11.2.3.4.

Consideraciones ecofisiolgicas

Mientras que las plantas C3 transpiran 500-700 g de agua por cada gramo de materia seca, las plantas C4 pierden solamente 250-400 g de agua. Entre las plantas que alcanzan altas eficiencias fotosintticas estn el maz, sorgo y caa de azcar.

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Las diferencias metablicas y de gasto energtico entre plantas C3, C4 y CAM son debidas a una respuesta ambiental. Cada uno de estos tipos se desarrolla en climas diferentes, y cada uno representa una adaptacin a ese clima. Esto hace que el mayor gasto energtico para la fijacin de CO2 que existe en plantas CAM y c4 tenga sentido. Las plantas C3 para fijar una molcula de O2 gastan 3 molculas de ATP y dos molculas de NADPH, mientras que las plantas C4 y CAM gastan para lo mismo 5 o 6.5 molculas de ATP respectivamente, y 2 de poder reductor. La conversin diurna de mlico para formar almidn requiere ATP y justifica la diferencia en consumo energtico. CAM y C4 son tipos de plantas adaptadas a vivir en ambientes clidos y ridos las primeras y clidos pero ms hmedos las segundas. En estos ambientes la apertura de estomas para dejar circular el aire y as poder fijar el CO2 les supondra perdidas de agua, de ah que las C4 y CAM utilicen mecanismos de acumulacin de CO2 que les permitan evitar esas perdida de agua.. Pero no slo presenta esa ventaja la acumulacin de CO2 en la planta para despus ser utilizado en el ciclo de Calvin. La Rubisco a altas temperaturas (a partir de los 30 C ms o menos) pierde afinidad por el CO2 con lo que el mayor gasto energtico que se utiliza para acumularlo dentro de la planta queda compensado, ya que en el caso de una planta c3 tuviese humedad suficiente para realizar la fijacin sin desecarse pasara mucho tiempo en fase oxigenativa, lo cual representa un gasto energtico extra (gasta ATP y poder reductor) y adems no estara fijando CO2 con lo que el rendimiento sera inferior {Foyer, 1994 #530}. Por tanto el mayor gasto energtico de plantas C4 y CAM queda compensado en los ambientes en los que viven, ya que en esos ambientes un metabolismo tipo C3 sera menos rentable y en algunos casos inviable debido a la desecacin. Si por el contrario atendemos a la produccin de biomasa entre estos 3 tipos de plantas nos encontramos con una serie de diferencias. Biomasa bruta produciran menos las plantas C3, ya que estas alternan fase oxigenativa con fase carboxilativa. Por el contrario C4 y CAM prcticamente no presentan fotorespiracin debido a que acumulan CO2 con lo que estas planta producen ms biomasa ya que aprovechan todo el CO2 en formacin de fotosintatos {Pietrini, 1999 #430}. Pero si atendemos a biomasa neta en relacin con la energa que se invierte, entonces son las plantas C3 las que ms producen y esto es debido a que gastan menos energa (pese a alternar fase oxigenativa con fase carboxilativa) que las plantas CAM y C4, las cuales hacen un mayor gasto de ATP y poder reductor para acumular CO2. |

11.2.3.5.

Resumen de diferencias entre los diferentes tipos de fotosntesis

Diferencias en el gasto energtico. Las plantas C3 para fijar una molcula de O2 gastan 3 molculas de ATP y dos molculas de NADPH, mientras que las plantas C4 y CAM gastan para lo mismo 5 o 6.5 molculas de ATP respectivamente, y 2 de poder reductor. La conversin diurna de malato para formar almidn requiere ATP. Uso eficiente del agua. Mientras que las plantas C3 transpiran entre 450 y 950 g gramos de agua por cada gramo de materia ceca que producen las plantas C4 y CAM pierden entre 250 -350 y 18-125, respectivamente. (referencias)

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Uso eficiente del nitrgeno. Las plantas C4 requieren de menos Rubisco para alcanzar la misma tasa fotosinttica. Esto se traduce en un menor consumo de nitrgeno como fertilizante. (referencias) Produccin de biomasa. Tomando en cuanta la biomasa bruta, las plantas C3 producen menos que C4 y CAM, pero si de eficiencia neta se trata, la plantas C3 producen ms biomasa con menos energa, pues gastan menos ATP que las C4 y las CAM.

Para entender por qu existen otros procesos de fijacin y asimilacin de CO2 con diferencias energticas y metablicas, es importante tomar en cuenta que: El CO2 es menos soluble conforme aumenta la temperatura (Taiz y Zeiger, Plant Physiology on line, http://4e.plantphys.net), por lo que el costo de la fotorrespiaraci aumenta, al disminuir la concentracin de CO2 Tanto Plantas C4 como CAM evitan en gran medida la fotorrespiracin, por medio de mecanismos de concentracin de CO2. En las plantas C4 la fijacin y asimilacin de CO2 estn separados espacialmente, permitiendo concentrar el CO2 en el sitio de catlisis de Rubisco y evitando el ciclo de oxigenacin (Leegood 2002). En las plantas CAM los procesos se encuentran separados temporalmente; los estomas se abren generalmente por la noche cuando la temperatura ha descendido, lo que adems de hacer el CO2 mas soluble, evita la perdida de agua y la fotorrespiracin (Dodd et al., 2002), Por lo anterior, los gastos energticos y metablicos extraordinarios que parecen presentar los mecanismos C4 y CAM, se ven compensados y llegan a ser menores conforme aumenta la temperatura Tabla 11-1. Diferencias entre plantas C3, C4 y CAM Especies tpicas de C3 Trigo, cebada, C4 Importancia papa, frijol, arroz, Maz, sorgo, caa de econmica tomate azcar, mijo perla <1% % de la flora mundial 89% en numero de especies Hbitat tpico Distribucin amplia Sitios clidos y praderas Primer producto PGA Malato estable de la fijacin Aspartato de CO2 Anatoma Vaina del haz Vaina del haz vascular no presente vascular con o sin cloroplastos cloroplastos (Kranz) Fotorrespiracin Hasta 40% de la No detectable fotosntesis Punto de 40-100 l/L 0-10 l/L compensacin para la asimilacin de CO2 [CO2] intracelular en 200 100 luz de da (l/L) Frecuencia estomtica (estomas mm-2) EUA (g CO2 fijado 40 - 300 100 - 160 CAM Pia, nopal 10% Sitios xricos epifticos Malato y

Suculencia celular o de los tejidos No detectable 0-10 l/L

10000 1-8

1-3

2-5

10 - 40

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por kg H2O transpirada) 40-50 0.2 Tasa mxima de 5-20 crecimiento (g m-2 d-1) 10-30 40-80 Generalmente menor Productividad a 10* mxima. (ton ha-1 ao-1 ) * Sin embargo, bajo condiciones de riego las plantas CAM se encuentran entre las ms productivas conocidas.

11.2.3.6.

Discriminacin isotpica

Las plantas C3 y C4 se llaman as por la molcula que primero se detectaron Calvin y sus colaboradores en experimentos con radioistopos de carbono 14. Como se mencion anteriormente, en las plantas C3 el primer compuesto orgnico fabricado en la fotosntesis tiene tres tomos de carbono y en el tipo C4 tiene 4. La biomasa que se produce por medio de estos tipos de fotosntesis C3 o C4 se puede distinguir por su composicin isotpica de sus tomos de carbono.
Si midiramos el carbono atmosfrico, casi el 99 % del CO2 ser del tipo que contiene el carbono ligero 12C. Una pequea parte, el 1,1 % del CO2, es algo ms pesado, ya que contiene 13C. Y finalmente existe tambin en la atmsfera, en muy pequea proporcin, un tipo de CO2 que contiene 14C, que es radiactivo e inestable, y cuyas aplicaciones han solid ser fundamentalmente paleocronolgicas.

Las plantas C3 y C4 tienen valores 13C muy diferentes. Esto se debe a que la enzima Rubisco discrimina el dixido de carbono de una manera ms fuerte que la enzima PEPCase. El 85 % de las plantas superiores son del tipo C3 (casi todas las arbreas) y tienen unos valores de 13C muy bajos, entre 22 % y 30 %. El otro 15 % de las plantas son del tipo C4. En su mayora son hierbas tropicales y tienen unos valores de 13C ms altos, entre 10 % y 14 %. Por lo tanto, el valor d13C del carbono de los paleosuelos depende en gran parte del tipo de planta que ha crecido en ellos. Es menor cuando han dominado las plantas C3 y mayor cuando han proliferado las del tipo C4. Por eso, el estudio de las variaciones de 13C en los paleosuelos continentales nos puede dar indicaciones del tipo de plantas, C3 o C4, que han predominado en determinados perodos. Indirectamente, el valor 13C de los paleosuelos puede tambin indicarnos la evolucin de la concentracin de CO2 atmosfrico. Ocurre que con concentraciones elevadas de CO2, las plantas de tipo C3 se ven favorecidas con respecto a las plantas de tipo C4, ya que las plantas de tipo C3 requieren menos energa para realizar la fotosntesis. Por el contrario, cuando la concentracin de CO2 es baja, aumentan las del tipo C4, ya que poseen un mecanismo de concentracin de CO2 que las favorece. Por lo tanto, cuanto menor sea 13C en el paleosuelo analizado, ms probabilidad hay que la concentracin de CO2 haya sido alta. Y viceversa. La concentracin de carbono 13 de las plantas tambin puede indicarnos la existencia de los perodos de sequa. Durante las sequas algunas plantas tienden a cerrar sus estomas para perder menos agua. Entonces, al haber disponible menos CO2 entrante, las plantas discriminan menos al carbono 13 y su concentracin en los azcares aumenta. Al parecer, antes del Mioceno (hace 15 millones de aos), las plantas C4 eran casi inexistentes. De ah que se piense que la disminucin de CO2 en el Mioceno, causada quizs por una mayor meteorizacin ligada a la emersin del Tibet, pueda haber originado el desarrollo de las plantas C4, y que el avance de las

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hierbas tropicales, que suelen ser de tipo C4, favoreci la evolucin de los grandes mamferos de la sabana {Foyer, 1998 #445}.

11.3.
11.3.1.

Tejidos vegetales
Monocotiledneas y dicotiledneas

Los nombres dicotiledneas y monocotiledneas se refieren al hecho de que el embrin de una dicotilednea tiene dos cotiledones (hojas seminales) y el embrin de una monocotilednea tiene uno. Otras diferencias caractersticas se hacen visibles en el cuerpo de la planta. Los haces vasculares principales de las hojas de las dicotiledneas habitualmente se disponen en red; los haces vasculares de las hojas de las monocotiledneas habitualmente son paralelos. En los tallos de las dicotiledneas, los haces de tejido vascular se disponen alrededor de un ncleo central de tejido fundamental; en los tallos de las monocotiledneas, los haces vasculares estn dispersos en el tejido fundamental. Existen tambin diferencias caractersticas en el nmero de piezas florales y en el nmero de hendiduras de los granos de polen entre ambas clases de angiospermas. Los gases -oxgeno y dixido de carbono- entran y salen de las hojas por difusin a travs de estomas.

Figura 11-19. Las dos clases de angiospermas son las dicotiledneas y las monocotiledneas. Las clulas del embrin de una angiosperma se diferencian tempranamente en su desarrollo en tres tejidos distintos: la protodermis, el procambio y el meristema fundamental. Estos tejidos embrionarios, conocidos como meristemas primarios, producen los tres sistemas de tejidos que son continuos en todo el cuerpo de la planta. La protodermis, el primer tejido que se diferencia, es el origen del sistema de tejido drmico, que proporciona una cubierta externa protectora para todo el cuerpo de la planta. El procambio, el tejido que se diferencia luego, origina el sistema de tejido vascular, compuesto por xilema y floema. El xilema transporta agua y minerales disueltos, mientras que el floema transporta azcares disueltos y otros compuestos orgnicos desde las clulas fotosintticas (auttrofas) de las hojas y de los tallos verdes a las clulas no fotosintticas (hetertrofas) de la planta. Los tejidos vasculares estn rodeados por el sistema de tejido

333

fundamental, derivado del meristema embrionario fundamental. Las principales diferencias en la estructura de las hojas, tallos y races residen en la distribucin relativa de los sistemas de tejido vascular y fundamental. Las clulas que se encuentran ms frecuentemente en el cuerpo de la planta son del tipo conocido como parnquima. Estas clulas, que aparecen en los tres sistemas de tejidos y predominan en los tejidos fundamentales, son tpicamente polidricas y tienen paredes delgadas y flexibles. Adems de un ncleo, mitocondrias y otras organelas, las clulas parenquimticas generalmente contienen plstidos que, segn la ubicacin de la clula, pueden ser cloroplastos, leucoplastos o cromoplastos. Adems de la fotosntesis, las clulas parenquimticas desempean una variedad de funciones esenciales en la planta, que incluyen la respiracin y el almacenamiento de alimento y agua. Cada uno de los sistemas de tejidos contiene tambin tipos celulares adicionales, especializados en funciones particulares de cada rgano.

11.3.2.

Semillas

Los embriones de muchas angiospermas pasan por un perodo de latencia antes de que germine la semilla. Con la germinacin se reinicia el crecimiento, se rompe la cubierta de la semilla y surge el esporofito joven. Las primeras hojas de follaje se abren hacia el sol y comienzan a hacer fotosntesis, mientras que, internamente, contina el proceso de crecimiento que da origen al cuerpo de la planta. En los primeros estadios del desarrollo, el crecimiento del joven esporofito depende de las reservas acumuladas en la semilla.

Figura 11-20. Desarrollo de una plntula dicotilednea (frijol).

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Figura 11-21. Desarrollo de una plntula monocotilednea (maz). Antes de la germinacin, la semilla absorbe agua y se hincha, rompiendo la cubierta seminal. Primero emerge la raz joven, seguida del hipoctilo ("debajo de los cotiledones"). Los cotiledones finalmente se marchitarn y caern. Luego emerge el epictilo que se encuentra entre cotiledn y haz de hojas. La primera estructura que aparece por encima del suelo es el coleptilo, que forma una vaina cilndrica sobre el vstago en crecimiento de la planta. Tpicamente, el resto de endosperma, con el escudete (el cotiledn nico) en su interior, est presente en la joven plntula. El crecimiento primario de la planta implica la diferenciacin de los tres sistemas de tejido, el alargamiento de las races y tallos, y la formacin de las races laterales y de las ramas. Despus de completarse el desarrollo del embrin, el crecimiento primario posterior se origina en los meristemos apicales de la raz y del vstago. Las plantas, a diferencia de los animales, continan creciendo durante todo su ciclo de vida.

11.3.3.

Hojas

Las hojas son las principales reas fotosintticas de una planta. Las clulas fotosintticas de las hojas son clulas parenquimticas que forman dos tipos de tejidos: parnquima en empalizada, constituido por clulas alargadas y densamente empaquetadas ubicadas justo por debajo de la superficie superior de la hoja, y parnquima esponjoso, que consiste en clulas de contorno irregular situadas en el interior de la hoja y con grandes espacios intercelulares. Estos espacios estn llenos de gases, que incluyen vapor de agua, oxgeno y dixido de carbono. La mayor parte de la fotosntesis ocurre en las clulas en empalizada, que estn especializadas en la captacin de la luz. El parnquima en empalizada y el parnquima esponjoso constituyen el tejido fundamental de la hoja, conocido como mesfilo. El mesfilo est envuelto casi hermticamente por las clulas

335

epidrmicas, que secretan una sustancia crea llamada cutina, formando una cubierta denominada cutcula, sobre la superficie externa de la epidermis. Las clulas epidrmicas y la cutcula son transparentes, lo que permite que la luz las atraviese y penetre en las clulas fotosintticas. Las sustancias entran y salen de las hojas a travs de dos estructuras completamente diferentes: los haces vasculares y los estomas. El agua y los minerales disueltos son transportados a las hojas, y los productos de la fotosntesis son transportados fuera de ellas, por medio de los haces vasculares. Los haces vasculares atraviesan los pecolos y se continan con los tejidos vasculares del tallo y la raz.

Figura 11-22. Estructura celular de una hoja. Ejemplos de hojas: Las hojas presentan una variedad de formas y tamaos, que van desde frondes grandes a escamas diminutas. Estas diferencias en la morfologa y tamao guardan una estrecha relacin con los ambientes en los cuales vive la planta.

Figura 11-23. Hojas modificadas. a) Espinas de un nopal. b) Hojas suculentas adaptadas al almacenamiento de agua (Sedum). c) Zarcillo de una planta de guisante. En la planta de guisante, que tiene hojas compuestas, slo los fololos individuales se modifican como zarcillos; otros fololos de hojas compuestas son aplanados, lo que proporciona una superficie amplia para la fotosntesis.

336

11.3.4.

Races

Las races son estructuras especializadas que fijan la planta al suelo e incorporan agua y minerales esenciales. La raz embrionaria, o radcula, es la primera estructura que rompe la cubierta seminal y se elonga rpidamente. La estructura interna de la raz de las angiospermas es comparativamente simple. En las dicotiledneas y en la mayora de las monocotiledneas los tres sistemas de tejidos (drmico, fundamental y vascular) estn dispuestos en tres capas concntricas: la epidermis, la corteza y el cilindro central.

Figura 11-24. Raz de un rannculo, una dicotilednea, en corte transversal. Los plstidos en las clulas parenquimticas de la corteza contienen granos de almidn, teidos en prpura en esta preparacin. Las races jvenes tienen una capa externa de epidermis y, a lo sumo, una cutcula muy delgada. Prolongaciones de las clulas epidrmicas forman los pelos radicales, que incrementan en sumo grado la superficie absorbente de la raz. Debajo de la epidermis est el tejido fundamental de la raz, la corteza, compuesta principalmente por clulas parenquimticas, frecuentemente especializadas en el almacenamiento. La capa ms interna de la corteza es la

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endodermis, una sola capa de clulas especializadas cuyas paredes contiguas, en las que se ha depositado suberina, conforman la banda de Caspary.

Figura 11-25. Diagrama de un corte transversal de una raz que muestra las dos vas de absorcin de agua y sustancias disueltas. La mayor parte de los solutos y parte del agua que entra en la raz siguen la va A, que se indica en color rojo; los solutos penetran a las clulas de la epidermis de la raz por transporte activo o por difusin facilitada; en tanto que el agua se mueve por diferencia de gradiente de potencial hdrico. Luego de atravesar las membranas celulares, ya en el simplasma de la raz, el agua y los solutos se desplazan de una a otra clula a travs de los plasmodesmos. El simplasma es la continuidad del protoplasma a travs de los plasmodesmos. Otra parte del agua y algunos de los solutos que entran a la raz siguen la va B, indicada en color azul, movindose a travs de las paredes celulares y a lo largo de sus superficies (por el apoplasto). Ntese, sin embargo, la ubicacin de la banda de Caspary y de qu manera bloquea la va B en torno a todo el cilindro vascular de la raz.

338

Para atravesar la banda de Caspary, tanto el agua como los solutos tienen que ser transportados a travs de las membranas celulares de las clulas endodrmicas o de otras clulas situadas ms externamente, a travs de la va A. Despus que el agua y los solutos han cruzado la endodermis, la mayora de los solutos continan a lo largo de la va A hasta las clulas conductoras del xilema, y la mayor parte del agua retorna a la va B para cubrir la distancia que resta hasta las clulas del xilema. En las zonas ms jvenes de la raz, donde an no se ha formado la banda de Caspary, el agua y los nutrientes esenciales pueden alcanzar el xilema a travs de la va B. Inmediatamente por dentro de la endodermis hay otra capa de clulas, el periciclo, del cual surgen las ramificaciones de la raz. Por dentro del periciclo estn el xilema y el floema. Las Figuras 9.17 y 9.18 muestran las diferencias de las estructuras celulares entre una raz de una planta monocotilednea y dicotilednea.

Figura 9.17 Detalle del cilindro vascular de la raz del rannculo (una dicotilednea).

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Figura 9.18 Corte transversal de la raz de una planta de maz (una monocotilednea), que muestra el cilindro vascular que rodea la mdula. La endodermis, que est por fuera del periciclo, se considera parte de la corteza. La endodermis contiene las bandas de Caspary

11.3.5.

Tallos

Los tallos portan las hojas y flores de la planta. Son la va por la cual las sustancias se transportan desde las races hacia las hojas, y viceversa. Los tallos verdes, al igual que las hojas, tienen una capa externa de clulas epidrmicas cubiertas con una cutcula. La masa del tallo joven es tejido fundamental, que puede dividirse en un cilindro externo (la corteza) y un ncleo interno (la mdula). El tejido fundamental est compuesto principalmente por clulas parenquimticas, pero tambin puede contener clulas colenquimticas y esclerenquimticas (fibras y esclereidas). Las figuras 9.19 y 9.20 muestran algunos ejemplos de cortes tallos de diferentes especies.

Figura

11-26.

Algunos

tipos

de

clulas

del

tejido

fundamental

de

los

tallos.

a) Clulas colenquimticas vistas en corte longitudinal. b) Corte transversal y c) corte longitudinal de fibras del floema del tallo de un tilo (Tilia americana ). Slo una porcin de la longitud de las

340

fibras puede verse en c). d) Las esclereidas, otro tipo de clulas esclerenquimticas, tienen paredes lignificadas muy gruesas. Diferencias de cortes transversales de plantas dicotiledneas y monocotiledneas:

341

Figura 9.22 Cortes transversales de dos tallos de dicotilednea y de un tallo de monocotilednea. a) En la alfalfa, una dicotilednea, el cilindro vascular est formado por haces vasculares separados. b) En este tallo joven del tilo, tambin una dicotilednea, el tejido vascular forma un cilindro continuo. Este tallo contiene conductos de muclago, que se tien de rojo. c) En el maz, una monocotilednea, numerosos haces vasculares estn dispersos en el tejido fundamental.

11.3.6.
11.3.6.1.

Tejido Vascular
Floema

El floema es un tejido especializado en transportar azcares a larga distancia. Est formado por dos tipos celulares relacionados ontogenticamente: elementos cribosos (ECs) y clulas acompaantes (CAs). Los ECs son clulas altamente modificadas que durante la maduracin pierden el ncleo y las mitocondrias. Poseen abundantes perforaciones en las paredes celulares de la zona donde se unen a otros ECs para formar conductos conocidos como tubos cribosos por donde viajan los azcares. Las CAs se caracterizan por tener un protoplasma denso, ncleo y numerosas mitocondrias, se encuentran conectadas a los ECs por una red de plasmodesmos, de tal forma que la funcionalidad metablica de los ECs depende de los procesos que ocurren en las Cas. Figura 9.20 Los ECs de la mayora de las plantas contienen protenas especficas conocidas como protenasP, las cuales pueden formar filamentos, tbulos y agregados cristalinos. Las protenas-P de la familia Cucurbitaceae son las que mejor se han caracterizado, pues se les puede purificar fcilmente a partir del exudado del floema. En Cucurbita mxima se han encontrado dos polipptidos: PP1 de 96 KDa que forma filamentos y la PP2 de 48 KDa que funciona como lectina. Las proteinas PP1 y PP2 son responsables de formar un sello cuando los ECs sufren heridas.

342

Figura 9.20 En las angiospermas, las clulas de conduccin del floema son los miembros de tubo criboso, clulas vivas con paredes terminales perforadas, que forman tubos cribosos continuos. Asociada ntimamente con cada miembro de tubo criboso hay una clula acompaante.

11.3.6.2.

Simplasto y apoplasto

Un aspecto de gran importancia en la distribucin de fotosintatos, es la forma en que tanto las clulas del mesfilo de las hojas como las del tejido demanda estn comunicadas con el floema, pues ello define la ruta que seguir el movimiento de los fotosintatos. Al movimiento de los azcares por medio de plasmodesmos se denomina va simplstica y el gradiente de concentracin determina la magnitud y la direccin del flujo de fotosintatos Figura 9.22 .Existe otra va denominada apoplstica, la cual se caracteriza porque los azcares que viajan por el floema se liberan al espacio intercelular de las clulas que forman los rganos de demanda. En este caso, la cantidad de azcares que dichas clulas asimilen depender de la actividad de transportadores ubicados en la membrana plasmtica. La sacarosa que se descarga en el apoplasto puede ser incorporada por las clulas del tejido demanda mediante un transportador especfico y/o puede ser hidrolizada por la invertasa de pared celular. Las membranas plasmticas de las clulas de los rganos de demanda tambin expresan transportadores de hexosas que permiten la entrada de la glucosa y fructosa, producidas por la invertasa. Algunos de los transportadores de azcares han sido caracterizados en sistemas heterlogos. + + Se ha determinado que funcionan como simporter (H /sacarosa H /hexosas) y su actividad permite el movimiento de azcares en contra del gradiente de concentracin. Se ha sugerido que la predominancia de las rutas de descarga de fotosintatos simplastica y apoplastica est relacionada con la forma en que se usan los fotosintatos. En tejidos que acumulan almidn la descarga es por va simplastica, pues el almidn adems de ser osmticamente menos activo que la sacarosa, se compartamentaliza en los amiloplastos, lo cual ayuda a que se mantenga el gradiente de concentracin, que favorece la asimilacin de fotosintatos. Por otro lado, en tejidos con descarga apoplstica generalmente se acumulan azcares libres, algunos de los cuales se almacenan en la vacuola, si bien esto favorece la formacin de un gradiente de concentracin que facilita a la asimilacin de azcares la participacin de los transportadores ubicados en la membrana celular es fundamental. Figura 9.22

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luz

CO2 mesfilo clula acompaante

elemento criboso

H2O

a
triosa-P

cloroplasto

sacarosa H+ Sac

Sac

C
Sac H+

Sac H+ sacarosa

vacuola

tejido fuente

Sac H+

g
Glucosa + fructosa Invertasa plastidio H+ sacarosa

e
H+ H+ Sac Sac

vacuola

Sac H+

tejido demanda

Figura 9.21. Ruta de fotosintatos de tejido fuente hacia tejido demanda . a. La planta realiza fotosntesis en el cloroplasto. b. Mediante en ciclo de Calvin se forman triosas fosfato que son exportadas el citosol y se forma sacarosa, donde puede ser almacenada en la vacuola o ser exportada hacia tejidos demanda. c. Mecanismo de va simplasto, la sacarosa viaja a travs de conductos llamados plasmodemata hasta el floema. d. Mecanismo va apoplsto, la sacarosa es liberada al apoplasto y transportadores de sacarosa H+/sacarosa cargan la sacarosa hacia el floema. e y f. Descarga del floema via simplasto y apoplasto respectivamente.g. La sacarosa puede ser hidrolizada por una invertasa de pared cuyos productos; glucosa y fructosa y son incorporados por transportadores de hexosas H+/hexosa. Tomado de Lalonde et al., 1999.

11.3.6.3.

Xilema

El xilema se encarga de trasladar la savia bruta desde la raz hacia la parte proximal de la planta. La savia bruta se compone en su mayor parte de agua e iones inorgnicos, aunque algunos compuestos orgnicos pueden estar presentes. La energa para este transporte no la proporcionan los mismos elementos traquearios, que en el tejido desarrollado estn de hecho muertos, sino por dos fenmenos fsicos: La smosis, que desplaza hacia arriba el agua acumulada en la raz gracias a la diferencia en potencial soluble del tejido radical y la humedad del suelo; al absorber agua, la raz impulsa hacia arriba parte de la misma. Este fenmeno, sin embargo, no basta para llevarla hasta las hojas, y su intensidad vara enormemente entre especies; en Vitis riparia alcanza los 145 kPa, mientras que en Celastrus orbiculatus es virtualmente cero. La succin, que atrae hacia las hojas el agua contenida en el tejido vascular para compensar la prdida de la misma por la transpiracin a travs de las hojas. El tejido de conduccin del xilema est constituido por una serie de traqueidas o vasos. Se trata de un tejido leoso de los vegetales superiores que conduce agua y sales inorgnicas en forma

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ascendente por toda la planta y proporciona tambin soporte mecnico. En las hojas, las flores y los tallos jvenes, el xilema se presenta combinado con floema en forma de haces vasculares conductores. Las races tienen un cilindro central de xilema. El xilema formado a partir de los puntos de crecimiento de tallos y races se llama primario. Pero adems, la divisin de las clulas del cmbium, situado entre el xilema y el floema, puede producir nuevo xilema o xilema secundario; esta divisin da lugar a nuevas clulas de xilema hacia el interior en las races y hacia el exterior en casi todos los tallos. Algunas plantas tienen muy poco xilema secundario o ninguno, en contraste con las especies leosas; el trmino botnico xilema significa madera. Por otro lado, el xilema puede contener tres tipos de clulas alargadas: traqueidas, elementos vasculares o vasos (trqueas) y fibras. En la madurez, cuando desempean funciones de transporte, todas estas clulas estn muertas. Las traqueidas son clulas alargadas con paredes gruesas caracterizadas por la presencia de zonas delgadas muy bien definidas llamadas punteaduras. Los elementos vasculares o vasos son traqueidas especializadas cuyas paredes terminales estn atravesadas por uno o varios poros; una serie vertical de elementos vasculares que forman un tubo continuo se llama vaso. Las fibras son traqueidas especializadas de pared muy engrosada que apenas realizan funciones de transporte y que sirven para aumentar la resistencia mecnica del xilema. El xilema de las especies ms antiguas desde el punto de vista de la evolucin, como los helechos y las conferas, est formado por traqueidas. En casi todas las angiospermas (plantas con flor), el xilema contiene tambin vasos y fibras bien desarrollados. Como las secuencias de especializacin de todos estos elementos tisulares se observan con bastante claridad, el estudio del xilema aporta importantes claves para dilucidar la evolucin de las plantas superiores.

Comentario [EVO12]: Este parrafo lo copie de las siguientes paginas, es la nica informacin que no estaba repetida y parece importante

Figura 11-27. Elementos del xilema Las traqueidas y los vasos, las clulas que componen el xilema en las angiospermas.a) Las traqueidas son un tipo ms primitivo y menos eficiente de clula conductora que predominan en las gimnospermas. El agua que se mueve de una traqueida a otra pasa a travs de depresiones. Estas depresiones no son perforaciones, sino simplemente reas en las cuales no hay una pared celular secundaria. Por lo tanto, el agua que se mueve de una traqueida a otra pasa a travs de dos paredes celulares primarias y de la laminilla media. Los vasos, caractersticos de las

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angiospermas, difieren de las traqueidas en que las paredes primarias y las laminillas medias de los vasos estn perforadas en los extremos, donde se unen con otros vasos. b) Puede haber numerosas perforaciones en clulas contiguas de miembros de vaso, o c) las paredes contiguas pueden disolverse por completo cuando las clulas maduran formando una sola abertura. Los vasos se caracterizan tambin por ser ms cortos y ms anchos que las traqueidas y sus paredes contiguas son menos oblicuas. Los vasos se conectan con otros vasos y tambin con otras clulas por depresiones de las paredes laterales.

11.3.7.
11.3.7.1.

Transporte vascular
Sistema vascular

Figura 11-28. a) formas de vaso del xilema. Fig. B: miembro de vaso en el xilema del quebracho blanco, MEB 700x. Fig c: Las clulas del floema conducen alimento desde las hojas al resto de la planta. Las clulas del floema estn ubicadas por fuera del xilema. Fig. D: Esquema de clulas de colnquima en corte transversal. Fig. E: A la derecha esquema de braquisclereidas de pera (Malus sylvestris). Al centro esquema de las astroesclereidas del pecolo de Nymphaea sp. (Planta acutica) y macrosclereidas del la cubierta seminal de la arveja (Pisum sativum). A la izquierda esquema de las fibras, en vista longitudinal y en cort

346

e transversal. Fig. F: esquema de las clulas parenquimticas; Fig. G: imagen de microscopa electrnica de barrido (MEB) de las clulas del parnquima medular de un tallo de amor seco (Bidens pilosa) 430x.

11.3.7.1.1. Apoplasto y Simplasto

En el siglo 19, el fisilogo alemn E. Munch introdujo un concepto de valor en la discusin del camino del agua en la planta. El sugiri que las paredes celulares interconectadas y los elementos del xilema llenos de agua deberan considerarse como un nico sistema que denomin apoplasto. Es decir en cierto sentido, la parte no viva del vegetal. Consiste de todos las paredes celulares en la corteza de la raz y tcnicamente las paredes de la endodermis, aunque para nuestros propsitos no incluira las bandas de Caspary de las clulas endodrmicas que tienen suberina que es hidrfoba. Todas las traqueidas y vasos en el xilema seran tambin parte del apoplasto como tambin lo son todas las paredes celulares del resto de la planta, incluyendo aquellas de tejidos tales como floema, otras clulas en la corteza y en las hojas. Se entiende que el ELA no sera equivalente al apoplasto, puesto que termina en las bandas de Caspary. Excepto por el engrosamiento de la endodermis, el ascenso del agua en el

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vegetal tendra lugar por el apoplasto, particularmente la porcin de xilema, pero incluyendo las paredes celulares de la corteza y an las de las clulas vivas en las hojas. Munch tambin denomin al resto de la planta, la porcin viva, como simplasto. Est incluira el citoplasma de todas las clulas en la planta. Se ha encontrado que el citoplasma de clulas adyacentes se encuentra conectado por pequeos poros en las paredes celulares. Esas conexiones citoplasmticas reciben el nombre de plasmodesmos. La hiptesis formulada por Dixon a principios de siglo sigue teniendo el mayor atractivo en la explicacin del ascenso del agua. Uno de sus elementos es la propiedad de adhesin del agua. Hay muchos datos en la actualidad que apoyan esta teora. En ella hay tres elementos bsicos, a saber: la fuerza impulsora, la hidratacin en el camino por adhesin a las sustancias del camino y la cohesin de las molculas del agua. La fuerza impulsora es, como se vio, el gradiente decreciente en el potencial agua desde el suelo hacia la atmsfera a travs de la planta. El agua se mueve en el camino desde el suelo a travs de la epidermis, corteza y endodermis, dentro del tejido vascular de las races, hacia arriba a travs del xilema del leo, al interior de las hojas y finalmente por transpiracin a travs de los estomas hacia la atmsfera. Y es la estructura especial de este camino, es decir el relativamente pequeo dimetro y espesor de las paredes de los tubos, y la propiedad de imbibicin de las paredes celulares del parnquima foliar los que hacen que el sistema sea funcional. Las fuerzas de imbibicin o hidratacin entre las molculas de agua y las paredes celulares, se deben a uniones hidrgeno y es llamada adhesin, la cual es una fuerza atractiva entre molculas dismiles. La tercera clave es la cohesin, esto es, la fuerza de atraccin mutua entre molculas + de agua que tambin se debe a sus uniones H . En el ambiente del camino del agua, las fuerzas cohesivas son tan grandes que el agua puede ser tirada desde la punta de los rboles altos por la evaporacin en la atmsfera, y este estiramiento puede extenderse por todo el trayecto hacia abajo a travs del tronco y las races y hasta el suelo mismo.
Comentario [EVO13]: Esta figura se podra eliminar, ya hay una de simplasto y apoplasto

Figura 11-29. Absorcin por los pelos radiculares. Ruta del agua y nutrientes absorbidos hasta las races. Apoplasto y simplasto. Papel de la Endodermis. Banda de Caspary.

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Figura 11-30.Capilaridad y presin radicular. Teora de la tensin cohesin. Evidencias. Estado metaestable de la columna de agua en el xilema. Tensin o presin negativa de la columna de agua en el xilema. Cavitacin. Proteccin.

Figura 11-31. Los elementos del Xilema. http://trc.ucdavis.edu/biosci10v/bis10v/week8/xylem.gif

Comentario [EVO14]: Todo esto est repetido y es exactamente lo mismo

11.3.7.1.2. Movimientos de Agua

El agua se mueve a travs de las plantas por medio de los tejidos vasculares. La fuerza motriz para que se den movimientos de agua dentro del xilema se deriva de la transpiracin en las hojas. La fuerza motriz para que se de el movimiento dentro del floema se deriva del metabolismo de los carbohidratos en los tejidos source y tejidos sink. El agua penetra en la planta a travs del sistema radicular y pasa por un filtro selectivo en las clulas de la endodermis. El agua asciende por los tubos del xilema, desde las races al resto de la planta. El agua es un disolvente universal y por eso lleva consigo sales minerales y algunos productos de las reacciones qumicas de la planta como metabolitos y hormonas. El agua tambin circula por los tubos cribosos del floema, para transportar el azcar por las hojas durante la fotosntesis. Las races no disponen de otro medio de nutricin y moriran sin la presencia de estos azcares translocados por las hojas. Por medio de la translocacin, el agua aporta turgencia y rigidez a las clulas. Ests caractersticas favorecen el anclaje de las hojas y tejidos nuevos, tambin es el medio por el que

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se realiza la transpiracin, amortigua los cambios de temperatura, estabiliza el pH de su metabolismo. Mantiene el volumen del citoplasma que est formado mayoritariamente por agua. La transpiracin de la planta es la evaporacin del agua efectuada desde la hoja y desde el resto de las superficies de la planta. La transpiracin es el ltimo paso del recorrido del agua, habindose iniciado en el suelo y continuado por toda la planta. Tanto la respiracin como la fotosntesis aportan agua y calor. La primera enfra el tejido vegetal, haciendo que las plantas transpiren. Alrededor del 90% de toda el agua que penetra en la planta por medio de las estructuras llamadas estomas. Por la accin de las clulas guarda, los estomas se abren durante las horas diurnas para permitir el libre intercambio y la liberacin de vapor de agua.
Fuente de poder Capilar Micrmetro

Menisco Cmara de presin Tejido Motor

Figura 11-32. Prueba para determinar la presin positiva del floema El agua procedente de las precipitaciones o el riego penetra en el suelo, donde toma contacto con el sistema radicular. La evapotranspiracin es el proceso mediante el cual se expulsa agua de los suelos mediante la evaporacin y la traspiracin de las plantas. El estrs hdrico es ms significativo en una planta que en otra, dependiendo de donde se produce dicho estrs. No solamente las plantas, que dejan caer las yemas florales, las flores e incluso los frutos pequeos sin madurar, sino las semillas germinales pueden morir con gran facilidad por falta de agua. El maz, por ejemplo, puede manifestar una prdida de grano en la mazorca si no se aplica la cantidad adecuada de agua durante la polinizacin. La mayora de las plantas muestran indicios de necesidades hdricas ante la aparicin de trastornos irreparables. Las hojas se decoloran y pueden llegar a marchitarse o retorcerse, como en el caso del maz. Otras plantas como la yuca tienen la capacidad de tirar sus hojas un da (marchitarse) y recobrarse cuando vuelve a llover. El exceso de agua es tan perjudicial como la escasez. Las semillas y las plantas tambin necesitan oxgeno para germinar y crecer. Las semillas y las races de las plantas en suelos encharcados, no tienen oxigeno suficiente para el mantenimiento de sus procesos vitales. El exceso de humedad en las races produce la aparicin de enfermedades, por lo que esta parte de la planta se puede podrir y morir. Las plantas se amarillean y se deforman Entre las formas de agua no disponible en el suelo para las plantas se incluyen: El agua gravitacional que se pierde en el drenaje El agua higroscpica la que se fija a las partculas del suelo.

11.3.7.1.3. Transpiracin y estomas

La prdida de agua por parte de las plantas en forma de vapor es una consecuencia inevitable de la apertura de los estomas. La transpiracin es un proceso fundamental para que las sales minerales puedan moverse desde el suelo hasta la hoja y para controlar la temperatura del vegetal. Esta apertura es necesaria pues a travs de los estomas ingresa el dixido de carbono que se utiliza en la fotosntesis (Figura 11-33.). A medida que el dixido de carbono, esencial para la fotosntesis, penetra en las hojas por los estomas se pierde vapor de agua a travs de estos. Esta prdida de agua plantea problemas serios para las plantas. La transpiracin tambin

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suministra la fuerza motriz mediante la que se absorbe agua por las races. Adems provee un mecanismo que enfra las hojas. La temperatura de una hoja puede ser hasta 10 15 C inferior a la del aire circundante. Esto ocurre porque el agua, al evaporarse, lleva consigo calor. El proceso de transpiracin de las plantas produce la presin negativa que jala el agua hacia arriba. Este proceso contina hacia las races, donde el agua en los espacios extra celulares que rodean al xilema es jalada hacia adentro por las perforaciones de las paredes de los elementos de los vasos y las traqueidas. Est movimiento del agua hacia arriba y hacia adentro finalmente causa que el agua presente en el suelo se mueva hacia el cilindro vascular por smosis a travs de las clulas endodrmicas. La fuerza generada por la evaporacin del agua desde las hojas, transmitida hacia abajo por el xilema hacia las races, es tan fuerte que se puede absorber agua de los suelos bastantes secos. La transpiracin tiene efectos positivos y negativos. Los positivos le proporcionan la energa capaz de transportar agua, minerales y nutrientes a las hojas en la parte superior de la planta. Los negativos son la mayor fuente de prdida de agua, prdida que puede amenazar la supervivencia de la planta, especialmente en climas muy secos y calientes. Casi toda el agua se transpira por los estomas de las hojas y del tallo, por lo tanto una planta al abrir y cerrar sus estomas debe lograr un equilibrio entre la absorcin de CO2 para la fotosntesis y la prdida de agua de la transpiracin. El flujo de agua es unidireccional desde la raz hasta el brote porque slo ste puede transpirar (figura 10-X)

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Figura 10-X. La transpiracin provoca la evaporacin en las paredes celulares del mesfilo, generando tensin en el xilema, La cohesin entre las molculas de agua en el xilema transmite la tencin desde las hojas a la raz, provocando as, el movimeineto de agua desde el suelo hacia la atmsfera (tomado dehttp://www.bufordcityschools.org/bhs/teachers/melissagreen/documents/34Ch36PlantTranspor t2005a.pdf).

Figura 11-33. Mecanismo de movimiento estomtico.

11.3.7.2.

Floema

En las plantas superiores, el floema es un tejido vascular que conduce azcares y otros nutrientes sintetizados desde los rganos que los producen hacia aqullos en que se consumen y almacenan (en forma ascendente y descendente). El floema est organizado en haces vasculares, que son los filamentos longitudinales del tejido conductor, asociados con el tejido conductor de agua o xilema. Los haces vasculares constituyen importantes rganos estructurales de los tallos herbceos y los nervios de las hojas. En el cilindro vascular que atraviesa el centro de la raz del rannculo, por ejemplo, el xilema forma un ncleo central estrellado en cuyas ranuras se insertan los haces de floema. De forma tpica, el xilema ocupa el lado del haz vascular ms prximo a la mdula, aunque no son raras disposiciones distintas. En las partes ms viejas de la planta, las clulas blandas del floema son aplastadas y empujadas hacia afuera por el floema nuevo que se va formando en el proceso de crecimiento. El floema nuevo se crea

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por la accin del cmbium o zona de crecimiento, una capa celular que separa el xilema del floema y produce clulas de este segundo tipo hacia el exterior de la planta. El floema consta de dos tipos de clulas conductoras: tubos cribosos, que son los elementos ms caractersticos, y clulas anexas. Los tubos cribosos son clulas alargadas con las paredes de los extremos perforadas por numerosos poros diminutos; a travs de ellos pueden pasar las sustancias disueltas. Estos elementos estn conectados en series verticales. Las clulas estn vivas cuando llegan a la madurez, pero los ncleos se desintegran antes de iniciar la funcin conductora. Las clulas anexas, ms pequeas, conservan los ncleos durante la madurez y tambin estn vivas; se forman junto a los tubos cribosos y se cree que controlan el proceso de conduccin. Varios tipos celulares forman el floema, tejido vegetal encargado del transporte de una solucin de sacarosa y otras muchas sustancias orgnicas conocidas tradicionalmente como savia elaborada. Estos tipos celulares son: los elementos de los tubos cribosos con sus clulas anexas, las clulas cribosas, las fibras y las clulas parenquimticas (Figura 11-34).

Placa cribosa compuesta

Figura 11-34 .Corte longitudinal de tallo de chopo (Populuxs boleana) (200x) mostrando una regin del floema secundario donde pueden observarse algunas placas cribosas compuestas y algunas clulas del parnquima floemtico axial. http://www.inea.uva.es/servicios/hist El floema puede tener fibras de lber, que son muy fuertes, y en algunas especies constituyen la materia prima de la que se obtienen fibras comerciales, como lino y yute, utilizadas en la confeccin de tejidos, arpillera y sacos o costales.

11.3.7.2.1. Transporte de solutos

La actividad metablica de los diferentes rganos (o partes de rganos vegetales) requiere el aporte de fotoasimilados en cantidades diversas. En algunos casos, los procedentes de la actividad fotosinttica de ese rgano, o bien de la hidrlisis de reservas acumuladas previamente en l, pueden satisfacer y sobrepasar los niveles sealados por estas necesidades; el rgano se autoabastece y est en condiciones de exportar fotoasimilados. En otros casos, el rgano puede ser claramente deficitario y debe importar fotoasimilados. El transporte de fotoasimilados a larga distancia, de un rgano a otro, se denomina translocacin y se lleva a cabo, en general, por el floema. . As como el agua y los solutos inorgnicos ascienden a travs del xilema, o corriente de transpiracin, los azcares manufacturados durante la fotosntesis salen de la hoja a travs del floema, o corriente de asimilables (Figura 11-35) hacia lugares donde se utilizan, como el

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vstago en crecimiento y la caliptra de la raz, as como a lugares de almacenamiento como frutos, semillas y el parnquima de almacenamiento de tallos y races.

Figura 11-35. Diagrama de la hoja que muestra los caminos seguidos por las molculas de agua de la corriente de transpiracin a medida que se mueven desde el xilema de un vaso menor hacia las clulas mesofticas, se evaporan de las superficies de las paredes de las clulas mesoflicas, y se difunden despus fuera de la hoja a travs de un estoma abierto (lneas continuas). Tambin se muestran los caminos seguidos por las molculas de azcar producidas durante la fotosntesis a medida que se mueven desde las clulas mesoflicas al floema del mismo vaso y entran en la corriente de asimilacin. Se cree que las molculas de azcar producidas en el parnquima en empalizada se dirigen al parnquima esponjoso y despus lateralmente al floema a travs de las clulas esponjosas (lneas discontinuas). Las clulas conductoras del floema de las Angiospermas son los elementos cribosos que carecen de ncleo y de la mayora de los orgnulos, pero son ricos en una protena filamentosa especfica del floema, llamada protena P. Los elementos cribosos forman series longitudinales llamadas tubos cribosos. Los elementos cribosos presentan poros, que forman reas cribosas en las paredes laterales, y placas cribosas en las paredes transversales. Las placas cribosas posibilitan la comunicacin y amplia continuidad citoplasmtica entre elementos cribosos de un mismo tubo criboso (Figura 11-37).

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11.3.7.2.2. Translocacin y Plasmodesmas

Figura 11-36. Diagrama que muestra los elementos bsicos en la circulacin del agua, iones inorgnicos, y fotoasimilados en la planta. El agua y los iones inorgnicos que absorbe la raz se mueven hacia arriba por el xilema en la corriente de transpiracin. Parte se mueve lateralmente hacia los tejidos de la raz y del tallo, mientras que otra parte es transportada hacia zonas de la planta en crecimiento y hojas maduras. En las hojas, cantidades sustanciales de agua e iones inorgnicos son transferidos al floema y son exportados con sacarosa y la corriente de asimilacin. Las partes de la planta en crecimiento, que son relativamente inefectivas capturando agua a travs de la transpiracin, reciben muchos de sus nutrientes y agua va el floema. El agua y los solutos que entran en las races en el floema se pueden transferir al xilema y ser recirculados en la corriente de transpiracin. En la figura 10-35 la letra A indica sitios especializados en la absorcin y asimilacin de materias primas del entorno. C y D designan sitios de carga y descarga, respectivamente, e I, puntos principales de intercambio entre el xilema y el floema. (La figura anterior y est modificadas de Raven, P.H. & Eichhorn, S.E. (1999). Biology of Plants. 6th ed., W.H. Freeman and Company. Worth Pub en.).

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Placa cribosa

Poro Protena P citoplsmica

Plasto modificado

Vacuola

Clula acompaante Placa cribosa Ncleo Mitocondria

Figura 11-37. Estructura interna de los tubos cribosos. En la izquierda podemos observar un esquema de los elementos de los tubos cribosos. En la derecha se observa una micrografa electrnica de transmisin de una placa cribosa en seccin longitudinal. El floema es el tejido conductor especializado en la translocacin de fotoasimilados. El movimiento de este contenido puede ser tanto ascendente como descendente y sus diferentes componentes pueden moverse en sentidos contrarios, an dentro de un mismo haz conductor. Del movimiento de los fotoasimilados, se dice que sigue un modelo de tejido fuente a tejido sumidero (consumidor). Las principales fuentes de solutos asimilables son las hojas fotosintetizantes, pero los tejidos de almacenamiento pueden servir tambin como importantes fuentes. Todas las partes de las plantas incapaces de satisfacer sus propias necesidades nutricionales, pueden actuar como sumideros, esto es, pueden importar productos asimilables. As, los tejidos de almacenamiento actan como sumideros cuando estn importando productos asimilables y como fuentes cuando los exportan (Figura 11-40).

consumidor

Fotosntesis Fotosntesis

rgano productor (fuente, source)

Hojas maduras rganos de reserva maduros

consumidor

pices de races y tallos

rgano consumidor (sumidero, sink)

consumidor

Yemas axilares en crecimiento Hojas en expansin Flores frutos y semillas rganos de reserva en desarrollo

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Figura 11-38. Esquema donde se muestra la diferencia de funcin entre los rganos fuente y los sumideros. Tambin se indican los principales rganos de la planta que actan como fuente o como sumidero. Las primeras evidencias que apoyan el papel del floema en el transporte de productos asimilables llego por las observaciones de rboles a los que se les haba quitado un anillo completo de corteza. La corteza de los tallos ms viejos est compuesta principalmente de floema y no contiene xilema. Cuando a un rbol que est fotosintetizando se le quita una tira de corteza o se le hace una incisin circular alrededor de l, la corteza por encima de la manipulacin se hincha, indicando la acumulacin de productos que se mueven hacia abajo por el floema desde las hojas fotosintetizadoras (Figura 11-39).
a) b)

Corteza Hinchamiento por materiales acumulados

Madera

Figura 11-39.Cuando de un tallo se extrae un trozo de corteza en forma de anillo a), los tejidos por encima del corte se abultaban b). Est fenmeno se debe a un crecimiento nuevo de la madera y tejidos de la corteza estimulado por una acumulacin de alimento que se desplaza hacia abajo desde las hojas y que queda interceptado en al anillo. Est fenmeno no se produce durante los meses de invierno. (Figura modificada de Raven, P.H. & Eichhorn, S.E. (1999). Biology of Plants. 6th ed., W.H. Freeman and Company. Worth Pub.). La savia elaborada es una solucin muy concentrada con un contenido de materia seca de 50 a 300 g/l. El 90 por 100 de la materia seca de la savia elaborada corresponde a azcares, particularmente sacarosa. En otras plantas tambin se encuentran otros oligosacridos, por ejemplo, rafinosa y estaquiosa, as como alditoles. Los monosacridos (por ejemplo glucosa, fructosa) no se transportan. En cambio, la savia elaborada contiene tambin aminocidos, amidas, nucletidos, cidos orgnicos e iones inorgnicos (aunque no Ca2+). Estas sustancias, no obstante, aparecen en concentraciones mucho ms pequeas, comparadas con las de azcares. Los pulgones y otros parsitos requieren los azcares y otros compuestos acompaantes, como compuestos nitrogenados, en cantidades equilibradas. Es por eso cuando toman la alimentacin descrita el exceso de azcar lo exudan en forma de melaza.

357

Figura 11-40.Diferenciacin entre fuentes y sumideros en una planta. Segn su funcin o su estado de desarrollo una parte u rgano de una planta ser fuente o sumidero de fotoasimilados A lo largo de los aos se han propuesto diferentes mecanismos para explicar el transporte de productos asimilables en los tubos cribosos del floema. Probablemente el primero fue el de difusin, seguido del de corriente citoplasmtica. La difusin y la corriente citoplasmtica normales, del tipo que se encuentra en las clulas de las plantas superiores, fueron en gran parte abandonados como posibles mecanismos de translocacin cuando se supo que las velocidades del transporte de asimilables (tpicamente 50 a 100 centmetros por hora) eran demasiado altas para que cualquiera de estos fenmenos justificara el transporte a grandes distancias va los tubos cribosos. Se han propuesto hiptesis alternativas para explicar el mecanismo de transporte en el floema, pero slo una, la hiptesis de flujo de presin, justifica satisfactoria y prcticamente todos los datos obtenidos en estudios experimentales y estructurales del floema. Todas las otras hiptesis tienen serias deficiencias. En la planta, la sacarosa producida por la fotosntesis en una hoja es secretada activamente a los tubos cribosos menores. Este proceso activo, llamado carga de floema, disminuye el potencial hdrico en el tubo criboso y hace que el agua que est entrando a la hoja por la corriente de transpiracin penetre en el tubo criboso por smosis. Con el movimiento de agua al tubo criboso de esta fuente, la sacarosa es transportada pasivamente por el agua a un sumidero, como una raz de almacenamiento donde la sacarosa es extrada (descargada) del tubo criboso (descarga floemtica). La extraccin de sacarosa provoca un aumento del potencial hdrico en el tubo criboso del sumidero y el movimiento subsiguiente del agua fuera de l en ese lugar. La

Comentario [EVO15]: No es necesaria se explica arriba

358

sacarosa puede ser utilizada o almacenada en el sumidero, pero la mayor parte del agua regresa al xilema y recircula en la corriente de transpiracin Tarea 11-3. Realice un mapa conceptual sobre lo aprendido. Compare del sistema vascular de las plantas con el sistema vascular de los animales. Indique las similitudes y las diferencias.

11.3.7.3.

Interacciones source-sink
Comentario [EVO16]:

Describir aqu el uso de carbohidratos para acumular reservas.

11.3.8.

Movimientos de agua

La prdida de agua por parte de las plantas en forma de vapor se conoce como transpiracin. Es una consecuencia inevitable de la apertura de los estomas. Esta apertura es necesaria pues a travs de los estomas ingresa el dixido de carbono que se utiliza en la fotosntesis. Si se cierran los estomas entonces se puede ahorrar agua, pero por otro lado, no se puede llevar a cabo la fijacin de dixido de carbono. A medida que el dixido de carbono, esencial para la fotosntesis, penetra en las hojas por los estomas se pierde vapor de agua a travs de stos. Aunque esta prdida de agua plantea problemas serios para las plantas, suministra la fuerza motriz mediante la que se absorbe agua por las races. Adems provee un mecanismo que enfra las hojas. Esto ocurre porque el agua, al evaporarse, lleva consigo calor. La temperatura de una hoja puede ser hasta 10 15 C inferior a la del aire circundante. Esto se puede medir por medio de un termmetro de infrarojo. De hecho, algunos mejoradores usan estos aparatos de medicin de la temperatura de las hojas para detectar diferencias fisiolgicas entre diferentes variedades.

Comentario [EVO17]: Esta informacin esta repetida en la seccin 10.3.7.2.2, se puede copiar todo esto y llevarlo hacia la seccin mencionada, donde tambin esta lo de estomas con la misma figura que la de la seccin 1.3.8.1

Figura 11-41. Intercambio de gases por los estomas. El agua entra en la planta desde el suelo por las races. El movimiento del agua hacia las clulas de la raz slo es posible cuando el potencial hdrico en el suelo es mayor al potencial hdrico en las races. Los datos sugieren que la prdida de agua genera fuerzas que permiten su absorcin. Los procesos que conducen a la entrada de agua a las clulas de la raz son capaces por s

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solos -y bajo ciertas condiciones- de generar una presin positiva. Tal presin, conocida como presin de raz es, sin embargo, slo suficiente para que el agua ascienda un corto trecho en el tallo. El agua viaja a travs del cuerpo vegetal en las clulas conductoras del xilema (vasos y traqueidas).

Figura 11-42. Mediciones efectuadas en rboles de fresno muestran que un aumento en la transpiracin es seguido por un aumento en la absorcin de agua. De acuerdo con la teora de cohesin-tensin, el agua se mueve en las traqueidas y vasos bajo presin negativa (presin menor a la atmosfrica, tambin denominada tensin). Dado que las molculas de agua se mantienen juntas (cohesin), hay una columna continua de molculas de agua que es arrastrada por traccin, desde la solucin que se encuentra en el suelo al interior de la raz, molcula por molcula, debido a la evaporacin del agua en la parte superior.

11.3.8.1.

Estomas

La difusin de los gases, incluyendo al vapor de agua, hacia el interior y exterior de la hoja es regulada por los estomas. Los estomas se abren y se cierran por la accin de las clulas oclusivas, debido a cambios en la turgencia. La turgencia de estas clulas aumenta o disminuye por el movimiento del agua, que sigue al movimiento de iones potasio hacia adentro o hacia afuera de las clulas oclusivas. Diversos factores concurren a regular la apertura y cierre de estomas, los cuales incluyen el estrs hdrico, la concentracin de dixido de carbono, la temperatura y la luz.

Comentario [EVO18]: Esto se puede llevar a la seccin 10.3.7.2.2, la figura est repetida

360

Figura

9.25

Mecanismo

de

movimiento

estomtico.

Un estoma est bordeado por dos clulas oclusivas que: a. abren el estoma cuando estn turgentes b. lo cierran cuando pierden turgencia. La clave de la apertura de los estomas reside en las microfibrillas de celulosa dispuestas alrededor de las clulas oclusivas. c. Cuando el agua entra a las clulas oclusivas, las clulas slo pueden expandirse en direccin longitudinal. d. Como las dos clulas estn unidas por los extremos, esta expansin longitudinal las obliga a arquearse y al estoma a abrirse.

11.4.
11.4.1.

Asimilacin de nutrientes
Nitrgeno

De los elementos del suelo, el nitrgeno es el ms necesario para el desarrollo y sobrevivencia de las plantas. El nitrgeno en sus iones solubles, ya sea nitratos (NO3-) o amonios (NH4+) es el que presenta ms transformaciones microbiolgicas y por consiguiente el que ms comnmente se encuentra deficiente en el suelo, contribuyendo a la reduccin de los rendimientos agrcolas en todo el mundo.
El nitrgeno es un macronutrimento de alta demanda en la produccin moderna del maz, pero debido a su gran movilidad no se acumula en el suelo; adems, la materia orgnica que lo contiene tiende a descomponerse rpidamente bajo las condiciones tropicales. Por esas razones, en la explotacin comercial de maz son imprescindibles las aplicaciones de fertilizantes nitrogenados, ocasionando una fuerte dependencia por ese insumo externo de costos elevados y crecientes. Esto motiva a la seleccin de cultivares hbridos ms eficientes

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en el aprovechamiento del nitrgeno aplicado. Los fitomejoradores pueden seleccionar sus progenies en base a su rendimiento con una cantidad de nitrgeno limitada.

Los organismos emplean el nitrgeno en la sntesis de protenas, cidos nucleicos (ADN y ARN) y otras molculas fundamentales del metabolismo. Su reserva fundamental es la atmsfera, en donde se encuentra en forma de N2, pero esta molcula no puede ser utilizada directamente por la mayora de los seres vivos (exceptuando algunas bacterias). Las principales formas de mantener suficiente nitrgeno en el suelo, es mediante la aplicacin de fertilizantes nitrogenados y la fijacin biolgica. Debido al alto costo de los fertilizantes nitrogenados, la gran cantidad de energa requerida para su produccin y las capacidades subptimas para su transportacin limita su uso en pases subdesarrollados, especialmente en comunidades agrcolas pequeas. La agricultura moderna depende en gran medida del uso de fertilizantes qumicos y pesticidas para mantener sus altas producciones agrcolas. Algunas veces el uso indebido puede ocasionar daos terribles, contaminando las aguas subterrneas y superficiales e incrementando los riesgos de intoxicaciones qumicas. El nitrgeno suele ser uno de los elementos que mas escasean. Es el factor ms limitante de la productividad de muchos ecosistemas. Tradicionalmente se han abonado los suelos con nitratos para mejorar los rendimientos agrcolas. Durante muchos aos se usaron productos naturales ricos en nitrgeno como el guano o el nitrato de Chile. Desde que se consigui la sntesis artificial de amoniaco por medio del proceso Haber-Bosh fue posible fabricar abonos nitrogenados que se emplean actualmente en grandes cantidades en la agricultura.
El uso de nitrgeno sinttico en los ltimos 40 aos ha aumentado de 3.5 millones a 80 millones de toneladas, tanto en pases desarrollados como en vas de desarrollo, incrementndose sus costos de produccin a ms de $ 20 billones USD anualmente. Para el ao 2050 la poblacin mundial se espera crezca el doble de la cifra actual de habitantes, de esta proyeccin el 90% debe residir en las regiones tropicales o subtropicales de los pases en desarrollo de Asia, frica y Amrica Latina. Segn estos datos, es razonable esperar que la necesidad de fijacin de N2 para la produccin de alimentos agrcolas para esta fecha tambin duplique la cifra fijada actualmente. Si esta es suministrada por fuentes industriales, su uso se incrementar en 160 millones de toneladas de nitrgeno por ao; lo que requerir quemar ms de 270 millones de toneladas de energa para su produccin, sin tener en cuenta la duplicacin de las fatales consecuencias que pudieran ocasionar.

El ciclo del nitrgeno Los procesos naturales de fijacin biolgica del N2 juegan un importante rol en la activacin de los sistemas agrcolas sustentables por su beneficio ambiental. El incremento de su aplicacin puede mitigar la necesidad del uso de fertilizantes nitrogenados sintticos con su consiguiente efecto benfico al ciclo del nitrgeno, y el saneamiento de las aguas subterrneas y superficiales. Este proceso depende bsicamente de la accin de los microorganismos en conjunto con las plantas.

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Figura 11-43. Ciclo del nitrgeno (wikipedia). El nitrgeno se considera generalmente un factor limitante en la produccin de cultivos y es altamente susceptible a las prdidas del sistema suelo-planta. Por lo tanto, cualquier factor que afecta a procesos de transformacin en el suelo tendr una incidencia en el crecimiento de las plantas y la eficiencia en el uso de N2. Se han propuesto diferentes enfoques para mejorar la eficiencia en el uso por las plantas y controlar las prdidas en particular que se produzcan a travs de la desnitrificacin. La inhibicin de la nitrificacin se considera un enfoque beneficioso no slo los fertilizantes para reducir las prdidas de N2 a travs de la desnitrificacin y la

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lixiviacin de NO3 (Aulakh l. 1984), sino tambin a prolongar la persistencia de fertilizante N2 en forma amoniacal (Crawford y Tiza 1993). Las bacterias y algas cianofceas que pueden usar el N2 del aire tienen un papel muy importante en el ciclo de este elemento, al hacer la fijacin del nitrgeno. De esta forma convierten el N2 en otras formas qumicas (nitratos y amonio) asimilables por las plantas. El amonio (NH4+) y el nitrato (NO3-) lo toman las plantas mediante las races y los incorporan en su metabolismo para la sntesis de las protenas y cidos nucleicos, entre otras sustancias. En el metabolismo de los compuestos nitrogenados en los animales acaba formndose in amonio que es muy txico y debe ser eliminado. Esta eliminacin se hace en forma de amoniaco (algunos peces y organismos acuticos), o en forma de urea (el hombre y otros mamferos) o en forma de cido rico (aves y otros animales de zonas secas). Estos compuestos van a la tierra o al agua de donde pueden tomarlos de nuevo las plantas o ser usados por algunas bacterias. Donde existe un exceso de materia orgnica, en condiciones anaerobias, hay otras bacterias que producen desnitrificacin, convirtiendo los compuestos de N en N2, lo que hace que se pierda de nuevo nitrgeno del ecosistema a la atmsfera. La Inhibicin de la nitrificacin podra aumentar los efectos positivos en el N2 de la mezcla de nutricin por la prolongacin de la disponibilidad de NH3 y el aumento de su absorcin por las plantas. Se ha propuesto la mejora de la productividad de maz debido a una mayor oferta de nitrgeno puede atribuirse a los efectos de iones especficos sobre la fisiologa vegetal. Existen algunas especies de microorganismos que poseen la habilidad de convertir el nitrgeno atmosfrico (N2) a amonio (NH4+) mediante la accin de la enzima nitrogenasa. Dentro de las bacterias capaces de realizar este proceso se encuentran los denominados fijadores de vida libre, los cuales fijan N2 atmosfrico sin la cooperacin de otras formas vivas, siendo la familia Azotobacteriaceae la que agrupa uno de los gneros ms importantes utilizados en la biofertilizacin a diferentes cultivos. Microorganismo BACILACEAS Bacillus polimyxa Clostridium AZOTOBACTERIAS Azotobacter Azomonas insignis Beijennckia derxii Derxia gummonsa Xhantobacter flavus ENTEROBACTERIAS Klebsiella pneumoniae Enterobacter aerogenes Erwinia herbicola Citrobacter freundii Azospinllum brasilense RIZOBIACEAS Rhizobium Bradyrhysobium STREPTOMICETACEAS Tipo de metabolismo al fijar nitrgeno Aerbico heterotrfico Importancia Econmica

Beneficios agricultura

marginales

la

Aerbico heterotrfico

Beneficios a confirmados

cosechas

no

Anaerbico o microaerfilo

Importantes asociativa

en

la

fijacin

Microaerfilo, Heterotrfico

Muy importantes en el cultivo de leguminosas

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Frankia METNOMONADACEAS Methylocystis methylococcus TIOBACTERIACEAS Thiobacillus ferrooxidans CIANOFICEAS Anabaena Nostoc Gloeothece Spirulina Synechococcus CROMATIACEAS Chromatium vinosum CLOROBIACEAS Chlorobium liminicola

Microaerfilo, Heterotrfico Microaerfilo, autotrfico Microaerfilo Anaerbico o Microaerfilo fotolitotrfico

Uso potencial en bosques Obtencin de protena unicelular Minera microbiana Cultivo de arroz, Produccin de protena unicelular

Anaerbico o fotolitotrfico

Cultivo de arroz, Produccin de protena unicelular

Anaerbico o fotolitotrfico RODOSPIRILACEAS Anaerbico o fotolitotrfico Tabla 11-2. Microorganismos fijadores de nitrgeno (tomado de Castillo & Crdenas (1990) (modificado por Wilmer P. F. Universidad Nacional de San Agustn). Algunas bacterias convierten amoniaco en nitrito y otras transforman este en nitrato. Una de estas bacterias (Rhizobium) se aloja en ndulos de las races de las leguminosas (alfalfa, alubia, etc.) y por eso esta clase de plantas son tan interesantes para hacer un abonado natural de los suelos.

El nitrgeno de la bisfera est sujeto a un rpido recambio, y debido a que es perdido como N2 a la atmsfera, su mantenimiento requiere de un continuo reemplazo con nitrgeno reducido a partir del N2 atmosfrico. Las seales implicadas en la percepcin y en la ruta de transduccin de seales que conduce a la fijacin biolgica de nitrgeno son complejas. Son necesarios futuros estudios para comprender los mecanismos de regulacin de la fijacin biolgica de nitrgeno, y de esta forma poder optimizar las plantas. La fijacin biolgica de nitrgeno es una manera efectiva, menos cara y no contaminante, para mejorar la fertilidad del suelo comparada con otras vas (como la fertilizacin qumica). Tomando en consideracin la produccin obtenida, la simbiosis Rhizobium-leguminosa es superior a los otros sistemas de fijacin de nitrgeno. Sin embargo, investigacin reciente realizada con otros microorganismos alternativos podra representar la mejor fuente de fertilizantes "renovables", por lo que demandan un gran inters como rea de futura investigacin.

11.4.2.

Azufre

El azufre es un elemento abundante a lo largo de la corteza terrestre. Se encuentra disponible como sulfato soluble o en compuestos orgnicos. En la biosfera se produce la reduccin del azufre a H2S por obra de microorganismos. Salvo en la situaciones de anaerobiosis se oxida rpidamente de forma espontnea.

365

El azufre lo asimilan las plantas y microorganismos, estos los absorben del suelo y lo asimilan como ion sulfato (SO4-2) y lo reducen a HS. Los animales no pueden realizar esta operacin, y deben recibir el azufre en su forma reducida (aminocidos azufrados). El ciclo de azufre La intemperizacin extrae sulfatos de las rocas, los que recirculan en los ecosistemas. En los lodos reducidos, el azufre recircula gracias a las bacterias reductoras del azufre que reducen sulfatos y otros compuestos similares, y a las bacterias desnitrificantes, que oxidan sulfuros. El H2S que regresa a la atmsfera se oxida espontneamente y es acarreado por la lluvia. Los sulfuros presentes en combustibles fsiles y rocas sedimentarias son oxidados finalmente a ser empleados como combustible por el hombre, debido a movimientos de la corteza terrestre, y a la intemperizacin, respectivamente. La mineralizacin del azufre ocurre en las capas superiores del suelo, el sulfato liberado del humus es fijado en pequeas escala por el coloide del suelo, la fuerza de absorcin con la cual son fijadas los aniones crecen en la siguiente escala: Cl-1- -NO3-1- - SO4-2- -PO4-2- -SiO3-2-OH-1El sulfato es ligado correspondientemente mucho ms dbilmente que el fosfato del cual pequeas cantidades es suficiente para reemplazar el SO4 a travs de las races. El sulfato es la forma soluble del tratamiento del azufre en la planta donde es reducido para integrar compuestos orgnicos. La reabsorcin del SO4, depende del catin acompaante y crece en el sentido siguiente. Ca < Mg. < Na < NH < K Entre el azufre orgnico y el mineral, no existe una concreta relacin en la planta; la concentracin de azufre mineral, depende en forma predominante de la concentracin del azufre in situ, por la cual pueden darse notables variaciones. En cambio el azufre de las protenas depende del nitrgeno, su concentracin es aproximadamente 15 veces menos que el nitrgeno. El azufre es absorbido por las plantas en su forma sulfatado, es decir en forma aninica perteneciente a las distintas sales: sulfatos de calcio, sodio, potasio, etc. El azufre no solo ingresa a la planta a travs del sistema radicular sino tambin por las hojas en forma de gas de SO2, que se encuentra en la atmsfera, a donde se concentra debido a los procesos naturales de descomposicin de la materia orgnica, combustin de carburantes y fundicin de metales. El azufre en el interior de las clulas tiene caractersticas de poca movilidad. Cumple fisiolgicamente algunas funciones importantes, adems de constituir distintas sustancias vitales, estas son: Forma parte constituyente de las protenas (cistena, metionina). Forma parte de las vitaminas (biotina). Es constituyente de las distintas enzimas con el sulfidrilo (SH-) como grupo activo, que actan en el ciclo de los hidratos de carbono y en los lpidos (en la oxidacin de los cidos grasos, como la coenzima A, CoA). Interviene en los mecanismos de xido-reduccin de las clulas (con el glutatin). Interviene en la estructura terciaria de las protenas.
Algunas especies como las crucferas, y entre ellas las liliceas, absorben una gran cantidad de sulfatos, produciendo sulfuro de alilo que ocasiona el olor caracterstico de algunos vegetales como la cebolla. El contenido de azufre en las oleaginosas, y especialmente de aquellos frutos con alto contenido de aceite como la mostaza, es notablemente elevado. El azufre es un componente insustituible de algunas grasas (mostaza y ajo), y tambin forma parte de las vitaminas (tiamina y biotina). Este elemento contribuye en la formacin de la clorofila, a un desarrollo ms acelerado del sistema radicular y de las bacterias nodulares, que asimilan el nitrgeno atmosfrico, que viven en simbiosis con las leguminosas.

366

Deficiencias del Azufre en el Suelo: Parte del azufre se encuentran en las plantas en forma oxidada de compuestos inorgnicos. Las gramneas y la papa requieren entre 10-15 Kg/Ha. Las coles 40-70 Kg/Ha. La deficiencia de azufre se observa en suelos pobres en materia orgnica, suelos arenosos franco arenosos. Una deficiencia de azufre en el suelo puede traer una disminucin de la fijacin de nitrgeno atmosfrico que realizan las bacterias, trayendo consecuentemente una disminucin de los nitratos en el contenido de aqul. Por su parte, una deficiencia del azufre altera algunos procesos metablicos y la sntesis de protenas. La insuficiencia del azufre influye en el desarrollo de las plantas.

11.4.3.

Fsforo

El fsforo es uno de los tres minerales ms limitantes para los cultivos agrcolas. Es un componente de los cidos nucleicos. Muchas sustancias intermedias en la fotosntesis y en la respiracin celular estn combinadas con esteres de acido fosfrico. Los tomos de fsforo proporcionan la base para la formacin de los enlaces de alto contenido de energa del ATP El fsforo, es la fuente de energa necesaria para que se produzcan todos los procesos metablicos en la planta. Su deficiencia le imposibilita a la planta completar normalmente dichos procesos metablicos. Los dos momentos crticos en los que su presencia es fundamental son: a la germinacin, para favorecer un rpido crecimiento radicular y en pre-floracin. En la planta el fsforo es requerido en la formacin de cidos nucleicos, fosfatos de azcares, fosfolpidos para las membranas, sntesis de protenas, entre otros, por lo que es necesario un adecuado abastecimiento de este elemento en el suelo. Su reserva fundamental en la naturaleza es la corteza terrestre y en los depsitos de rocas marinas. Por meteorizacin de las rocas o sacado por las cenizas volcnicas, queda disponible para que lo puedan tomar las plantas. Con facilidad es arrastrado por las aguas y llega al mar. Parte del que es arrastrado sedimenta al fondo del mar y forma rocas que tardarn millones de aos en volver a emerger y liberar de nuevo las sales de fsforo. Otra parte es absorbida por el plancton que, a su vez, es comido por organismos filtradores de plancton, como algunas especies de peces. Cuando estos peces son comidos por aves que tienen sus nidos en tierra, devuelven parte del fsforo en las heces (guano) a tierra (Figura 11-44).

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Figura 11-44. Ciclo del fsforo.

Los lodos residuales (bioslidos) son slidos ricos en materia orgnica con contenidos suficientes de nitrgeno y fsforo que los hace potencialmente tiles como fertilizantes y como fuente de materia orgnica. Adems pueden mejorar las propiedades fsicas del suelo como la densidad aparente, la estructura, porosidad y retencin de agua; todo lo cual puede reflejarse en un incremento en el rendimiento de los cultivos.

Gran parte del fsforo soluble de los fertilizantes qumicos se convierte en insoluble a poco de su aplicacin, y su eficiencia de absorcin est entre el 10 y el 30%. Actualmente est aumentando el uso de mtodos biolgicos para nutrir las plantas, se ha buscado incrementar el aprovechamiento del fsforo utilizando microorganismos como bacterias y hongos que habitan los suelos y cuya capacidad de solubilizar sus compuestos es bien conocida. En estudios de marcaje isotpico han demostrado que las plantas micorrizadas tienen una mayor tasa de absorcin y acumulacin de fsforo. En este sentido, la micorriza arbuscular transfiere a sus hospedantes beneficios como absorcin de fsforo, nitrgeno, zinc, proteccin contra patgenos, longevidad de la planta y absorcin de agua, etc. Las micorrizas como tecnologa biolgica aplicada representan un rea de explotacin en beneficio del desarrollo de cultivos ms productivos. Para el mejoramiento gentico de maz, aun no se ha considerado las interacciones benficas entre planta y microorganismos. Existe todava un potencial muy grande para explotar en estas reas.

11.4.4.

Otros minerales

La productividad de las tierras de cultivo est muy ligada a su equilibrio en materias orgnicas e inorgnicas. Adems de mantener los suelos en condiciones fsicas adecuadas, el manejo agronmico debe mantener las reservas de nitrgeno y otros nutrientes tambin necesarios, como el fsforo, azufre, potasio y microelementos.

11.4.4.1.

Potasio

La funcin ms relevante del potasio lo cumple en todo proceso de traslado de azcares fotosintetizados. A medida que la planta fotosintetiza, va acumulando azcares en las hojas.

368

Estos azcares son los que la planta trasloca a los granos en el momento del llenado de los mismos. El potasio es el responsable principal de este traslado. El trigo es altamente exigente en est nutriente. La deficiencia de potasio aparece primeramente en las hojas perifricas y despus en las mas jvenes, el sntoma caracterstico es clorosis alrededor del limbo, posteriormente el borde de la hoja se necrosa, las hojas ms nuevas son pequeas. Afecta el rendimiento por una disminucin del crecimiento de la raz y menor cantidad de azcar.

Figura 11-45. Hoja con deficiencia de potasio.

11.4.4.2.

Hierro

El hierro est directamente ligado a la fotosntesis. Participa en la sntesis de clorofila junto con el magnesio. Es fundamental para el aprovechamiento del nitrgeno, cumpliendo una funcin, similar al azufre en este sentido, as como, para el aprovechamiento interno del fsforo por parte de la planta.

Figura 11-46. Planta con deficiencia de hierro. Se observa una clorosis de las hojas centrales, jaspeado verde plido seguido de un blanqueamiento del limbo de las hojas. Causas: pH alto. Deficiencia del suelo.

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El hierro es otro de los elementos indispensables para el desarrollo de las plantas. Es un elemento esencial para la vida, puesto que participa en muchos procesos de oxidacinreduccin. Lo podemos hallar formando parte esencial de las enzimas del ciclo de Krebs, en la respiracin celular y como transportador de electrones en los citocromos. Esta presente en numerosas enzimas involucradas en el mantenimiento de la integridad celular, tales como las catalasas, peroxidasas y oxigenasas. En la biosfera aparece como hierro orgnico, hierro inorgnico bien soluble o en sedimento. El hierro orgnico pasa a formas de mayor o menor estado de oxidacin. El ion ferroso puede transformarse en ion frrico y viceversa pasando finalmente de nuevo hierro orgnico.

11.4.4.3.

Magnesio

El magnesio en las plantas se encuentra en contenidos menores al de calcio. (0.15-0.75% de materia seca). Este nutriente forma parte de la molcula de clorofila por lo que se encuentra ntimamente involucrado en la fotosntesis. Tiene funcin en la sntesis de aceites y protenas y la actividad de enzimtica del metabolismo energtico. El principal sntoma por deficiencia es la presencia de clorosis internerval en las hojas viejas. Es un elemento mvil en la planta a diferencia del calcio. Es muy comn la deficiencia de Mg. en suelos arenosos. Formas de Magnesio en el suelo: Magnesio contenido en minerales (primarios y secundarios) Magnesio intercambiable: representa la fraccin sorbida al complejo de cambio arcillo hmico. Magnesio en solucin: se encuentra en pequeas cantidades pero hay una rpida reposicin a partir de la fase de cambio. La principal fuente disponible para las plantas se encuentra en la forma intercambiable, como el Mg intercambiable es removido por las plantas y es factible de lavarse, este pool es repuesto a partir del Magnesio mineral por la meteorizacin de los minerales (como dolomita, hornblenda y serpentina). Algunos suelos tambin proveen al contenido de Mg intercambiable a partir de Mg que se encuentra en las interlaminas de ciertas arcillas de tipo 2:1 (Mg lentamente disponible).

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Figura 11-47. En cultivos de maz se forman fajas de color amarillento o verde claro en las hoja, mientras que las venas permanecen verdes, si continua la deficiencia se desarrolla un color rojizo-prpura, pero la nervadura permanece verde. Tarea 11-4: Sobre los principales cultivos de su regin, estudie las ms importantes deficiencias de nutrientes, e indique que sntomas o enfermedades padecen las plantas.

11.4.5.

Resumen de minerales esenciales

Los elementos esenciales de origen mineral son incorporados desde el suelo al interior de las clulas de las races a travs de la actividad de transportadores especficos, y son transportados al vstago -tras ser volcados al xilema- junto con la corriente de transpiracin. Cumplen una variedad de funciones en las plantas, algunas de las cuales no son especficas, como, por ejemplo, los efectos que ejercen sobre el potencial osmtico. Otras funciones son especficas, como la presencia de magnesio en la molcula de clorofila. Algunos minerales son componentes esenciales de los sistemas enzimticos. En la siguiente tabla se resumen los principales elementos minerales (micronutrientes y macronutrientes) requeridos por todas las plantas. Tabla 11-3. Funciones de los nutrientes en las plantas y sus sntomas de deficiencia.
Comentario [atf19]: Poner esta tabla como texto, no como figura

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372

11.4.6.

El suelo y la nutricin

Las caractersticas del suelo que afectan la disponibilidad de minerales para las plantas incluyen: la roca madre, el tamao de las partculas, la cantidad de humus que contiene y el pH. El suelo, la capa ms superficial de la corteza terrestre, est compuesto por minerales derivados de las rocas que les han dado origen. El suelo agrcola tambin esta compuesto por material orgnico en diversos grados de descomposicin. Tpicamente tiene tres capas: el horizonte A, el horizonte B y el horizonte C. El horizonte A, o capa superior del suelo, es la zona de acumulacin mxima de materia orgnica (humus). El horizonte B, o subsuelo, est formado por el producto de la alteracin de la roca madre y es pobre en materia orgnica; en este horizonte, se suelen acumular los nutrientes minerales que se han lixiviado del horizonte A. El horizonte C est constituido por rocas sueltas que se extienden hasta el lecho de rocas que se encuentra por debajo de ellas y que constituye el material originario del suelo. La profundidad y la composicin de estas tres capas y en consecuencia la fertilidad del suelo varan considerablemente en ambientes diferentes.

Figura 11-48. Diagrama de las capas de suelo de tres tipos principales de suelos. a) Bosque de conferas. b) Bosques caducos fros o templados. c) Praderas de gramneas. El mantillo material en descomposicin que se encuentra sobre la superficie del suelo de los bosques australes y septentrionales de conferas es cido y se descompone lentamente; el suelo tiene poca acumulacin de humus, es muy cido y pierde elementos minerales por lixiviacin (lavado). En los bosques caducos fros o templados, la descomposicin es algo ms rpida, la prdida de minerales por lixiviacin es menos extensa y el suelo es ms frtil. Estos suelos han sido usados intensamente para la agricultura, por lo cual es necesario prepararlos aadiendo cal (para disminuir la acidez) y fertilizantes. En las praderas de gramneas, casi todo el material vegetal que se encuentra sobre la superficie del suelo muere cada ao, al igual que muchas de las races, y grandes cantidades de materia orgnica regresan, as, constantemente al suelo. Adems, las races finamente divididas penetran extensamente en el suelo. El resultado es un suelo muy frtil. La disponibilidad de nutrientes minerales esenciales depende, en gran medida, de las caractersticas de la roca madre a partir de la cual se ha formado.

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El material originario tiene una obvia influencia sobre las caractersticas de los suelos, entre ellas, la capacidad de retencin del agua y la disponibilidad de nutrientes esenciales. Tales caractersticas dependen de la incidencia de otros factores igualmente importantes: el clima (sobre todo las precipitaciones y la temperatura), el relieve, los seres vivos que lo habitan y la edad del suelo. En un ambiente no perturbado, la mayor parte de los nutrientes minerales permanecen dentro del sistema formado por el suelo mismo, las plantas, los microorganismos y la pequea fauna que el suelo contiene y mantiene. Las propiedades de los suelos resultan de la interaccin entre los factores mencionados. Esta interaccin se refleja en el tamao de los fragmentos producidos por la alteracin del material originario. Los fragmentos ms pequeos de roca se clasifican como arena, limo y arcilla. La proporcin entre estos componentes vara de un suelo a otro. El agua y los iones en solucin drenan rpidamente a travs de suelos compuestos en su mayor parte por partculas grandes (suelo arenoso). Un suelo compuesto principalmente por partculas pequeas (arcilla) retiene agua. El pH del suelo es determinado por los mltiples factores que intervienen en la gnesis del suelo. A su vez, el pH del suelo afecta de modo singular su capacidad para retener minerales. Afecta tambin, en forma marcada y diferente, la solubilidad de ciertos iones. Las plantas, en general, producen una acidificacin del medio, lo que ayuda a degradar las superficies de las rocas y a liberar iones cargados positivamente de estas superficies. Cuando las partes vegetales mueren y se descomponen, se aaden constantemente al humus, cambiando as, no slo el contenido del suelo, sino tambin su textura y su capacidad para retener minerales y agua. A su vez, las plantas dependen del contenido mineral del suelo y de su capacidad de retencin de agua y nutrientes. Cuando estos factores mejoran, se favorece el crecimiento de las plantas. A menudo cambia tambin la abundancia relativa de las especies que en l crecen; nuevas especies son capaces de colonizarlo en tanto que otras desaparecen. Esto produce, a su vez, cambios posteriores en el suelo. As, en condiciones naturales, el suelo -y la disponibilidad de nutrientes y agua para las races de las plantas- estn cambiando constantemente. En la nutricin de las plantas, hay dos tipos de relaciones simbiticas que son importantes: las micorrizas y las relaciones en que intervienen bacterias fijadoras de nitrgeno. Las asociaciones entre bacterias fijadoras de nitrgeno, tales como los rizobios, y las races de ciertas plantas, particularmente leguminosas, dan como resultado la incorporacin del nitrgeno gaseoso de la atmsfera en compuestos orgnicos nitrogenados.

Figura 9.27 a) Ndulos fijadores de nitrgeno en las races de una planta de soja, una leguminosa. b) Microfotografa de barrido de las clulas del interior del ndulo radical de la alfalfa. Los ndulos como los que se ven en la figura son el resultado de una asociacin simbitica entre una bacteria del suelo (Rhizobium) y clulas de la raz.

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El pH del suelo es grandemente regulado por la fraccin coloidal del suelo (arcilla y humus) y los cationes de intercambio asociados a ella. Los niveles satisfactorios de la fertilidad de un suelo en las regiones hmedas dependen del uso de enmiendas para balancear las prdidas de Ca y Mg. Las enmiendas no slo mantienen los niveles de Ca y Mg sino que tambin proveen de una estabilidad fsica y qumica en el suelo. Se pueden usar como enmiendas la cal y el yeso, por otra parte tambin es juicioso el uso plantas tolerantes a la acidez en lugar de intentar un cambio en la qumica del suelo. En trminos generales el Ca y Mg se encuentran disponibles como cationes de intercambio y la cantidad disponible tiene una relacin directa con la meteorizacin de los minerales y el grado de lixiviacin. Los principales caminos de prdidas y ganancias para mantener un nivel de suficiencia o disponibilidad de los mismos para las plantas. Ntese que la principal prdida en los sistemas agrcolas es el lavado y posteriormente la erosin.

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12. Crecimiento, desarrollo y reproduccin

12.1.
12.1.1.

Fundamentos del desarrollo vegetal

El ciclo celular

Figura 12-1. El ciclo celular se compone de varias fases, cada una con una serie de procesos caractersticos para esa etapa celular. El ciclo completo se puede dividir en la interfase (I) y la mitosis (M). La interfase se puede subdividir en tres etapas: la etapa sntesis (S) de DNA y dos etapas de gap (G1 y G2). Durante la fase S se lleva a cabo la replicacin del DNA. Las clulas que estn en fase G1 y G2 se distinguen entre si, en que las de G1 solo tienen una copia del DNA, mientras que las que estn en la etapa G2 ya tienen el DNA duplicado. Una clula en etapa G2 da a lugar a dos clulas hijas en etapa G1 por medio de la mitosis. La mitosis se puede subdividir en subetapas, como se explica en la siguiente seccin.

12.1.2.

La mitosis

La divisin celular consiste en que a partir de una clula se obtienen 2 clulas hijas. La divisin del citoplasma se llama citocinesis, y la divisin del ncleo, cariocinesis. A todo en su conjunto se le llama mitosis. La mitosis produce clulas genticamente idnticas a la madre, ya que mantiene

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invariable el nmero de cromosomas. Se lleva a cabo en cualquier clula eucarionte, ya sea diploide o haploide. Las clulas hijas resultarn diploides si la madre era diploide. Algunas clulas no realizan mitosis y permanecen en un estado interfsico, pero otras la realizan frecuentemente (clulas embrionarias, clulas de zonas de crecimiento, clulas de tejidos sujetos a desgaste.). La funcin de la mitosis deriva de la necesidad de crecimiento y desarrollo del organismo multicelular, y la regeneracin de tejidos expuestos a destruccin de clulas. En unicelulares, la mitosis cumple la funcin de reproduccin asexual. Cada mitosis est precedida por una interfase, donde se produce la duplicacin del material gentico. Acta como un mecanismo que asegura que cada clula hija reciba la misma informacin gentica.

Figura 12-2. Etapas de la mitosis. Inicia con una clula en etapa G2 de la interfase. Despus sigue la profase, la metafase, la anafase y la telofase para continuar con la citocinesis (divisin celular) en donde se forman dos clulas hijas en fase G1. Las etapas de la mitosis son profase, prometafase, metafase, anafase y telofase, estas se describen a continuacin: PROFASE: La cromatina se condensa para formar los cromosomas y los dos centrolos migran a polos opuestos organizando un sistema de microtbulos (aparato mittico) para permitir la migracin de los cromosomas. El aparato mittico est constituidos por: Centrolos: Estn rodeadas por el centrosoma. A medida que cada centrolo migra, tiene un hijo y cuando llega al polo se ven dos steres (conjunto de microtbulos cortos que se extienden desde cada centrolo). Huso acromtico: Tiene forma ovoide y est formado por muchos microtbulos sin ramificaciones. Cada cromosoma est constituido por dos cromtidas unidas por el centrmero. La envoltura nuclear se desorganiza y sus fragmentos no se distinguen del retculo endoplasmtico. Desaparece el nucleolo. PROMETAFASE: Los cromosomas condensados migran hacia la placa ecuatorial del huso acromtico. METAFASE: Los cromosomas se alinean en el plano ecuatorial, y cada uno est unido por su centrmero a una fibra del huso acromtico.

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ANAFASE: Las dos cromtidas de cada cromosoma se separan por fisin del centrmero y se dirigen hacia polos opuestos. El movimiento de los cromosomas hijos hacia los polos se debe a un acortamiento de las fibras cromosmicas y se alargan las fibras interzonales. TELOFASE: El huso mittico y los steres se desorganizan. Alrededor de cada grupo cromosmico se organiza una envoltura nuclear a partir del retculo endoplasmtico y de la envoltura original. Los cromosomas se dispersan y retoman el aspecto de cromatina que tenan antes de iniciarse la divisin. Los nucleolos reaparecen a partir de sus organizadores. Citocinesis: La divisin del citoplasma se produce junto con la telofase. Se produce un surco en la membrana plasmtica, producido por un anillo de microfilamentos unidos a ella. Las 2 clulas hijas se separan, distribuyndose el hialoplasma y los organelos de un modo equitativo. Cuando no ocurre citocinesis luego de la cariocinesis, los dos ncleos quedan en el mismo citoplasma y resulta una clula binucleada. Divisin en clulas vegetales: No hay centrolos ni steres, pero se organiza el huso acromtico. Citocinesis: el citoplasma se divide mediante un tabique, que se forma por la agrupacin de microtbulos y vesculas. Las vesculas crecen, se ordenan y se funden entre si originando la placa celular. Finalmente se arman las paredes celulares a partir de celulosa, hemicelulosa y pectina.

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Figura 12-3. Clula teida con fluorescencia (microtubulos verdes y DNA azul) y vista con un microscopio confocal durante las diferentes etapas de la mitosis

12.1.3.

La meiosis

La meiosis es un proceso celular en donde el nmero de cromosomas se reduce a la mitad. En la meiosis I (etapa de reduccin) una clula diploide se convierte en dos clulas haploides, pero an con cromosomas dobles (2c). En la meiosis II los cromosomas se vuelven simples (Griffiths et al., 2003).
La meiosis es diferente y a la vez similar a la mitosis en varios aspectos. Las dos inician con clulas en fase G2, es decir, con clulas diploides (2n) pero con el DNA duplicado, es decir, cada clula tiene 4 copias (4c) de todos los genes. La primera etapa de la meiosis se da un apareamiento de los cromosomas homlogos (metafase I) y una reduccin del material gentico (telofase I). En la metafase I es donde se da la recombinacin gentica de los cromosomas (crossing over). De una clula diploide se producen dos clulas haploides (2n -> 1n) en la meiosis I, y posteriormente en la meiosis II se producen 4 clulas haploides por medio de una divisin mittica (de dos clulas 2c se producen 4 clulas 1c). En la mitosis no se da esa reduccin ya que las clulas hijas siguen siendo 2n. Es decir, en la mitosis a partir de una clula 2n4c se produce dos clulas 2n2c. Una de las diferencias ms importantes entre la meiosis y la mitosis, es que en la metafase I de la meiosis, los cromosomas se aparean en pares homlogos (ver Figura 12-4). Esto no sucede en la mitosis. En la meiosis cada cromosoma homologo solo se une de un lado a los microtubulos, mientras que en la metafase de la mitosis los cromosomas todos se acomodan a lo largo de la lnea ecuatorial y estn unidos por los dos lados a microtubulos (ver Figura 12-2). En la Figura 12-7 se compara la mitosis y la meiosis.

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Figura 12-4. Etapas de la Meiosis La meiosis I est precedida por una interfase durante la cual se duplica el material gentico (Figura 12-5). PROFASE I: La envoltura nuclear y el nucleolo se desorganizan, los centrolos migran a polos opuestos, duplicndose y se ordena el huso acromtico. Se divide en 5 etapas: Leptonema, Cigonema, Paquinema, Diplonema y Diacinesis. PROMETAFASE I: Los cromosomas migran al plano ecuatorial de la clula. METAFASE I: Los cromosomas se alinean en el plano ecuatorial. Los 2 cromosomas del bivalente se unen por medio del centrmero a la misma fibra del uso acromtico. ANAFASE I: Los 2 cromosomas homlogos unidos a la misma fibra del huso se repelen y migran a polos opuestos. Cada cromosoma est formado por 2 cromatinas.

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TELOFASE I: Cuando los cromosomas llegaron a los polos, se desorganizan el huso acromtico y los steres, se reorganizan la envoltura nuclear y los nucleolos y se constituyen los ncleos hijos.

Figura 12-5. La meiosis I .En la profase I es donde se da el intercambio gentico. http://botit.botany.wisc.edu/images/130/Meiosis/ Citocinesis: Se produce simultneamente con la telofase, y da como resultado 2 clulas hijas con un nmero haploide de cromosomas. Intercinesis: Es un perodo que tiene lugar entre la meiosis I y II y no se realiza duplicacin del ADN. Meiosis II: Los procesos de esta divisin son semejantes a los de una mitosis en una clula haploide. PROFASE II: Se condensan los cromosomas, se desintegran los nucleolos, los centrolos migran a los polos y se duplican, formacin del huso acromtico y se desorganiza la envoltura nuclear. PROMETAFASE II: Los cromosomas condensados migran a la placa ecuatorial de la clula. METAFASE II: Los cromosomas se alinean en la placa ecuatorial, y cada cromosoma se une a una fibra del huso acromtico. ANAFASE II: Se fusiona el centrmero y se separan las dos cromtidas de cada cromosoma. Cada una migra a un polo diferente. TELOFASE II: Los grupos cromosmicos llegan a los polos, el huso acromtico se desorganiza, se reorganizan la envoltura nuclear y el nucleolo, se dispersan los cromosomas y se transforman en cromatina.

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Figura 12-6. La meiosis II www.iesmcervantes.es Citocinesis: Separacin de los citoplasmas de las clulas hijas. El proceso meitico parte de una clula diploide que da como resultado 2 haploides, y a partir de stas dos (meiosis II) se obtienen 4 haploides. La Meiosis, implica variabilidad gentica y evolucin {Griffiths, 2003 #35} .

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Figura 12-7. Comparacin de la kvhs.nbed.nb.ca/gallant/biology/mitosis_meiosis.jpg.

mitosis

la

meiosis.

La reproduccin sexual introduce una importante proporcin de variaciones genticas. Cuanto mayor sea la diversidad de gametos formadas en cada progenitor, mayor ser la probabilidad de originar combinaciones diferentes por fecundacin, y mayor ser la diversidad de los descendientes. Una clula diploide, con 2 pares de cromosomas homlogos, originar por meiosis 4 gametos haploides (uno de la madre y otro del padre). En la Metafase I se va a determinar en qu sentido migrarn en la Anafase I. Hay dos opciones: Puede ocurrir que los 2 cromosomas paternos migren juntos a un polo y los dos maternos al opuesto. Puede ocurrir que migren al mismo polo el cromosoma materno del par homlogo y el paterno del par homlogo. Los otros cromosomas, migran al polo opuesto{Gupta, 1997 #112; Enger, 2005 #630}. La mitosis asegura el reemplazo de las clulas desgastadas y la preservacin de la informacin gentica. La meiosis es la que forma las clulas sexuales. Ambas divisiones, entonces, son importantes para la vida celular y finalmente, para el cuerpo. (Stansfield, 2004)

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12.1.4. 12.1.5.

Ciclo de vida y reproduccin sexual Desarrollo de flores y semillas

La flor es el rgano reproductor de la planta. Puede contener estructuras masculinas y femeninas. A las flores que presentan un nico sexo se les llama flores unisexuadas, mientras que a las que contienen ambas se les denomina flores hermafroditas. Cuando las flores son unisexuales, estas se pueden presentar en un solo individuo (plantas monoicas) o en diferentes individuos (plantas dioicas). Los tipos de flores, sus verticilos (las distintas partes de la flor) o su posicin en la planta son caractersticas que se utilizan para clasificar e identificar taxonomicamente a las plantas en diferentes familias. En una flor el tallo se modifica mucho, perdiendo su caracterstico crecimiento indefinido; a su vez, las hojas florales, las cuales carecen de yemas axilares, sustituyen la funcin de fotosntesis de las hojas normales por la de proteccin, reclamo, produccin de esporangios, etc. Es en la flor donde transcurre la mayor parte del ciclo vital de los espermatofitos. Por esta razn, cualquier modificacin en la flor afecta a su biologa, creando barreras reproductoras entre los diferentes individuos y produciendo, por tanto, nuevas especies con diferentes caractersticas. Por est razn, por la constancia de los caracteres de la flor, esta tiene un gran valor para diagnosticar una especie. Son las flores, y los frutos que se derivan de ellas, los que sirven para determinar las caractersticas morfolgicas de las especies, as como su evolucin y grado de parentesco. Las partes de una flor de una planta dicotilednea son: Pednculo: el rabillo de la flor Spalos: las hojas modificadas que constituyen el cliz. Ptalos: las hojas modificadas que forman la corola. A veces tienen colores vistosos. Androceo: la estructura reproductora masculina y est formada por el conjunto de estambres. Gineceo: la composicin reproductora femenina y est formada por los carpelos (Figura 12-8). Como la flor es un brote, en ella existen elementos de tallo y elementos foliares. Los nudos y entrenudos del tallo que constituye la flor aqu se denominan pedicelo y tlamo o receptculo. En cuanto a las hojas florales que se insertan en ese tallo, que son muy variadas, podemos distinguir: Unas inferiores, que son estriles, que tienen funciones protectoras y/o de reclamo y se llaman antfilos. Constituyen el perianto, el cul suele diversificarse en unas piezas externas con carcter protector, los spalos, que constituyen el cliz, y unas internas, por lo general vistosas y a veces fragantes, denominadas ptalos, que constituyen la corola. Unas apicales, reproductoras, que se llaman esporfilos y estn diversificadas en microesporfilos o estambres, que producen los microesporangios y constituyen el llamado androceo y en macroesporfilos o carpelos, que producen los macroesporangios y constituyen el denominado gineceo o pistilo. Las especies vegetales que se reproducen mediante flores (una gran mayora), se denominan plantas "fanergamas". Para ellas no es imprescindible que haya agua para reproducirse, por lo que pueden crecer por zonas que no son hmedas.

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a)

b)

Figura 12-8. a) Algunas partes de la flor. b) Ciclo de vida y desarrollo de una planta superior. La planta tiene sus rganos reproductores en las flores. De las flores se forman los frutos y las semillas, que son necesarias para que una planta de esta clase se reproduzca. Algunos vegetales producen flores una o dos veces cada ao, como los naranjos o los jazmines; otros slo producen flores una vez en toda su vida. La pita, por ejemplo, es una planta con espinas, que crece silvestre por toda la zona cercana al Mediterrneo. Soporta la sequa almacenando agua en sus gruesas hojas. Hasta los 20 25 aos no produce flores y muere tras la floracin {Arevalo, 2009 #635; Pino, 2009 #636}. Las plantas con flores se dividen en dos grandes grupos: gimnospermas angiospermas

Las gimnospermas no tienen carpelos para proteger sus embriones. Sus flores son muy simples y suelen pasar inadvertidas a nuestra vista. Son gimnospermas, por ejemplo, los pinos, los abetos y los cipreses. Son las plantas con semillas ms antiguas. Las angiospermas son las plantas ms recientes y ms evolucionadas. Tienen flores complejas que suelen ser llamativas a nuestra vista. Las semillas estn recubiertas por un fruto que las protege. Son la fuente de alimentacin del ser humano y de muchos mamferos. De ellas tambin se obtiene gran nmero de materias primas y productos naturales. Los jazmines, los rosales, el trigo y la encina son angiospermas La semilla o pepita es cada uno de los cuerpos que forman parte del fruto que da origen a una nueva planta es la estructura mediante la que realizan la propagacin las plantas que por ello se llaman espermatfitas (plantas con semilla). La semilla se produce por la maduracin de un vulo de una gimnosperma o de una angiosperma. Una semilla contiene un embrin del que

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puede desarrollarse una nueva planta bajo condiciones apropiadas. Pero tambin contiene una fuente de alimento almacenado y est envuelto en una cubierta protectora. El alimento almacenado comienza como un tejido fino y delgado llamado endospermo que es provisto por la planta progenitora y puede ser rico en aceite o almidn y en protenas. En ciertas especies, el embrin se aloja en el endospermo, que la semilla utilizar para la germinacin. En otros, el endospermo es absorbido por el embrin mientras que la ltima crece dentro de la semilla en desarrollo, y los cotiledones del embrin se llenan del alimento almacenado. En la madurez, las semillas de estas especies carecen de endospermo. Algunas semillas de plantas comunes que carecen de endospermo son las habas, guisantes, calabazas, girasoles, y rbanos. Las semillas de plantas con endospermo incluyen todas las conferas, la mayora de los monocotiledones, las hierbas, tales como el maz y el coco. La envoltura de la semilla se desarrolla a partir de cubiertas, llamadas tegumentos, que originalmente rodean al vulo. En la semilla esta envoltura madura se puede convertir en una fina cubierta, como en el cacahuete, o en algo ms sustancial. Las semillas de las angiospermas quedan contenidas en estructuras secas o carnosas (o en capas de ambas), llamadas frutos. En espaol se llama fruta al alimento que representan los frutos carnosos y dulces. En cambio las semillas de las gimnospermas comienzan su desarrollo "desnudas" sobre las brcteas de los conos, aunque en su desarrollo son acompaadas por escamas, que ayudan a su proteccin o a su dispersin. Existe tambin un concepto legal de semillas, en el que se considera como semilla a cualquier parte de la planta cuando su fin es la multiplicacin, incluyndose entonces plantones, vitroplantas, esquejes, etc.

Figura 12-9. Partes de una semilla. A diferencia de los animales, las plantas estn limitadas en su habilidad de buscar las condiciones favorables para la vida y el crecimiento. Por consiguiente, han evolucionado de muy diversas formas para propagarse y aumentar la poblacin a travs de las semillas. Una semilla debe llegar a la localizacin adecuada en el momento ptimo de germinacin. Estas propiedades que fomentan la produccin de la siguiente generacin es posible que estn ms relacionadas con los frutos que con las mismas semillas, ya que la funcin tpica de la semilla es la de servir de mecanismo retardante, permitiendo suspender el crecimiento si las condiciones no son favorables o dar el tiempo necesario para su dispersin {Whipple, 2009 #634}. Cada especie logra su objetivo de una forma diferente: produciendo gran cantidad de semillas, envolviendo las semillas en duras capas que se van ablandando con las lluvias y el fro invernal para germinar en la primavera. Germinacin es el proceso en el cual el crecimiento emerge desde un estado de reposo. El ejemplo ms comn de la germinacin, es el brote de un semillero a partir de una semilla de una

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planta floral o angiosperma. Sin embargo, el crecimiento de una hifa a partir de una espora mictica es tambin germinacin. En un sentido ms general, la germinacin puede implicar todo lo que se expande en un ser ms grande a partir de una existencia pequea o germen. La germinacin es un mecanismo de la reproduccin sexual de las plantas. La semilla se desarrolla de un vulo situado en el interior del ovario de una flor. Est ovario puede contener uno o varios vulos. Mientras que el vulo da lugar a la semilla, el ovario da lugar al fruto que, por tanto, puede tener una o varias semillas en su interior. En el desarrollo de la semilla podemos distinguir tres estados despus que se ha efectuado la polinizacin: Se llama germinacin al proceso por el que se reanuda el crecimiento embrionario despus de la fase de descanso. Est fenmeno no se desencadena hasta que la semilla no ha sido transportada hasta un medio favorable por alguno de los agentes de dispersin. Las condiciones determinantes del medio son: aporte suficiente de agua y oxgeno y temperatura apropiada. Cada especie prefiere para germinar una temperatura determinada; en general, las condiciones extremas de fro o calor no favorecen la germinacin. Algunas semillas necesitan pasar por un perodo de dormancia y, despus de ste, tambin un tiempo determinado de exposicin a la luz para iniciar la germinacin. Durante la germinacin, el agua se difunde a travs de las envolturas de la semilla y llega hasta el embrin, que durante la fase de descanso se ha secado casi por completo. El agua hace que la semilla se hinche, a veces hasta el extremo de rasgar la envoltura externa. El oxgeno absorbido proporciona a la semilla la energa necesaria para iniciar el crecimiento.

Figura 12-10. Ejemplo de algunas semillas. www.derechoalimentacion.org/gestioncontenidosKWDERECHO/imgsvr Tarea 12-1. De las semillas de la Figura 12-10 juegue a identificarlas con sus compaeros, gana el que identifique ms. Tarea 12-2. Vaya a las pginas Web http://www.botanical-online.com/lasflores.htm http://www.juntadeandalucia.es/averroes/concurso2004/ver/09/testc1.htm y resuelva las actividades.

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12.2.
12.2.1.

Crecimiento y desarrollo vegetativo

Regulacin del crecimiento

Las plantas responden a los estmulos de sus ambientes internos y externos. Estas respuestas les permiten desarrollarse normalmente y mantenerse en contacto con las condiciones cambiantes que imperan en el medio en que viven. Las hormonas son factores importantes en las respuestas de las plantas. Una hormona es un producto qumico producido en tejidos particulares de un organismo y llevado a otros tejidos de este, donde ejerce una o ms influencias especficas. Caractersticamente, una hormona es activa en cantidades extremadamente pequeas.
El conocimiento de las hormonas vegetales y de sus efectos sobre el crecimiento comenz con algunos estudios relacionados con fototropismos. Este sigue siendo un punto de partida apropiado en la consideracin de las respuestas de las plantas. Los cinco grupos principales de hormonas que han sido aisladas de las plantas son las auxinas, citocininas, etileno, cido abscsico y giberelinas. Tambin pueden estar presentes otras sustancias reguladoras del crecimiento.

Las plantas responden a diversos estmulos ambientales. El fototropismo -la curvatura de una planta hacia la luz- y el geotropismo -la capacidad del vstago para crecer hacia arriba y de la raz para crecer hacia abajo- son dos respuestas que otorgan un alto valor de supervivencia a las plantas jvenes. En muchas regiones, los cambios ambientales ms importantes que afectan a las plantas (y, de hecho, a los organismos terrestres en general) son los que resultan del cambio de las estaciones. La respuesta de los organismos a cambios en la duracin relativa de los perodos de luz y oscuridad en un ciclo de 24 horas se denomina fotoperiodicidad. Esta respuesta controla la iniciacin de la floracin en muchas plantas. Algunas especies vegetales muestran movimientos especficos, rpidos, que se producen como respuesta al tacto. Adems, todas las plantas vasculares parecen responder a otros estmulos mecnicos con patrones de crecimiento alterados, lo que da como resultado plantas ms bajas y robustas. Muchas angiospermas tambin pueden liberar sustancias voltiles, lo que constituye una comunicacin qumica con otros individuos de la misma especie.

12.2.2.

Tropismos y su relacin con hormonas

Un tropismo es una respuesta de crecimiento que implica la curvatura de una parte de la planta en el mismo sentido -o en sentido contrario- en el que acta un estmulo. Si la parte de la planta se curva hacia el estmulo, se dice que el tropismo es positivo, si se curva en sentido contrario, el tropismo es negativo. Una de las respuestas ms evidentes y de utilidad en las plantas es su fototropismo positivo, o sea, su curvatura hacia la luz.
Charles Darwin y su hijo Francis realizaron, en 1880, algunos de los primeros experimentos sobre fototropismo. Trabajando con plntulas de gramneas, fueron capaces de determinar que ciertas zonas de las plantas son las que perciben el estmulo necesario para que ocurra la curvatura hacia la luz. En efecto, ellos observaron que la curvatura ocurre por debajo del pice, en una parte inferior del coleptilo.

La luz que incide en un coleptilo en crecimiento hace que se curve hacia ella. La colocacin de una cubierta opaca sobre el extremo de la plntula inhibe su curvatura, pero un collar opaco ubicado por debajo del pice no la inhibe. Estos experimentos indican que "algo" producido en el pice de la plntula, y transmitido hacia abajo en el tallo, provoca la curvatura. En 1926, el fisilogo botnico holands Frits W. Went logr, por medio de un experimento, separar esa "influencia" de las plantas que la producan. Went cort los pices de los coleptilos de plntulas de avena y los coloc sobre una capa de agar, con las superficies de corte en contacto con el agar, de modo que la hipottica sustancia que transmita el estmulo pudiera

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difundir hacia el agar. Despus de aproximadamente 1 hora, sac el pice del copleptilo del agar y cort el agar en pequeos bloques. Luego, coloc cada bloque sobre el borde de una plntula cortada que haba sido mantenida en la oscuridad. La plntula se curv hacia el lado contrario a aquel en el cual haba sido colocado el bloque de agar. La curvatura es el resultado de la influencia de un estmulo, la auxina, que se desplaza desde el bloque hacia la zona subapical donde promueve el alargamiento celular. Los bloques de agar que no haban estado previamente en contacto con el pice de un coleptilo iluminado no produjeron ninguna curvatura o slo lo hicieron levemente hacia el lado en el que se haba colocado el bloque. Los bloques de agar que se haban colocado sobre un corte de coleptilo realizado ms abajo no produjeron efecto fisiolgico. Went interpret los resultados de sus experimentos como la demostracin de que el pice del coleptilo ejerca sus efectos por medio de un estmulo qumico y no por un estmulo fsico como, por ejemplo, un impulso elctrico. Este estmulo qumico fue denominado auxina, vocablo acuado por Went a partir de la palabra griega auxein que significa "incrementar". La auxina fue una de las primeras hormonas vegetales descubiertas. Se sabe ahora que el fototropismo resulta del hecho de que, bajo la influencia de la luz, una hormona, la auxina migra del lado iluminado al lado oscuro del pice caulinar. Las clulas del lado oscuro, que contienen ms auxina, se alargan ms rpidamente que las del lado iluminado, haciendo que la planta se curve hacia la luz. Esta respuesta otorga, a las plantas jvenes, un alto valor de supervivencia. Slo la luz azul -o sea la luz de menos de 500 nanmetros de longitud de ondaresulta efectiva.

12.2.3.

Geotropismo

El fototropismo otorga una ventaja de supervivencia a una planta joven. Otra respuesta con un alto valor de supervivencia es la capacidad de responder a la gravedad, enderezndose, de modo que el vstago crece hacia arriba y las races hacia abajo. Esta respuesta es conocida como geotropismo; al igual que el fototropismo, el geotropismo involucra a las auxinas como hormonas regulatorias de la elongacin celular. Este proceso, el geotropismo, implica cuatro pasos secuenciales: la percepcin de la gravedad en clulas sensoras, la produccin de seales, la transduccin de seales tanto dentro de clulas sensoras como entre clulas y, finalmente, la respuesta. Una cuestin central se vincula con el modo en que se detecta la influencia de la gravedad: cmo "sabe" una plntula si est en posicin horizontal o vertical? Las hormonas y los iones son solubles por lo que la gravedad misma no debera tener efecto sobre su distribucin. De acuerdo con una hiptesis vigente, la gravedad es percibida por organelos especializadas conocidas como estatolitos, que no son otra cosa que amiloplastos especializados que contienen almidn y que responen a la gravedad. La acumulacin de grnulos almidn en tales estructuras es necesaria en este proceso. Esto se sabe de mutantes de arabidopsis como pgm o adg1 que no tienen almidn que tambin tienen defectos en la percepcin de la gravedad. Cuando una raz crece en forma vertical, los amiloplastos se renen cerca de las paredes inferiores de las clulas centrales. Sin embargo, si la raz se coloca en posicin horizontal, los amiloplastos se deslizan hacia abajo y se disponen cerca de las que previamente eran paredes orientadas en forma vertical. A los pocos minutos, la raz comienza a curvarse hacia abajo y los amiloplastos retornan gradualmente a su posicin original.

12.2.4.

Fotoperiodicidad

Las plantas son capaces de acomodarse a los cambios estacionales en virtud de su capacidad de anticipar el calendario anual de los acontecimientos: la llegada del otoo, las lluvias de primavera, los largos perodos de sequa, los largos perodos de crecimiento, y hasta la poca en que florecen las plantas vecinas de la misma especie. Para muchas plantas, todas estas determinaciones se hacen de la misma manera: "midiendo" los perodos relativos de luz y

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oscuridad. Este fenmeno se conoce como fotoperiodicidad. Otras plantas como el maz tambin usan un reloj biolgico que es dependiente de la temperatura. Es por ello que los das de germinacin a floracin dependen tanto del genotipo si es precoz o tardo, pero tambin de la temperatura durante el da y la noche. Algunas plantas, conocidas como plantas de das largos, florecern slo cuando los perodos de luz excedan una longitud crtica. Otras plantas, las de das cortos, florecern slo cuando los perodos de oscuridad sean mayores que cierto tiempo crtico. Las plantas neutras dan flores independientemente del fotoperodo. Los experimentos han mostrado que el perodo de oscuridad, y no el perodo de luz, es el factor crtico. (ver Figura 12-11)

Figura 12-11. Experimentos de fotoperiodicidad. Las dos curvas de la Figura 12-12 muestran el cambio anual de la longitud del da en dos ciudades de Amrica del Norte, ubicadas a diferentes latitudes. La lnea verde indica el fotoperodo que resulta eficaz para el abrojo, que requiere menos de 16 horas de luz para florecer.

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Figura 12-12. La longitud relativa de la noche determina cundo florecern muchas plantas. En Chicago, el abrojo puede florecer al finalizar el mes de julio, cuando las plantas ya son adultas pero, en Winnipeg, las yemas florales no aparecen hasta los primeros das de agosto de modo que, habitualmente, la helada mata a las plantas antes de que maduren las semillas. Se han realizado experimentos con fotoperiodicidad y han mostrado que las plantas miden la longitud del perodo de oscuridad y no del de luz. En la Figura 12-11 se muestra que en a) Las plantas de da corto florecen slo cuando el perodo de oscuridad excede cierto valor crtico. As, el abrojo, por ejemplo, florece con 8 horas de luz y 16 horas de oscuridad. Si el perodo de 16 horas de oscuridad es interrumpido, aunque sea brevemente, como se muestra a la derecha, la planta no florece. b) La planta de da largo, por otra parte, que no florece con 16 horas de oscuridad, lo hace si el perodo de oscuridad se interrumpe. Las plantas de da largo florecen slo cuando el perodo de oscuridad es menor que cierto valor crtico.

Figura 12-13. Una planta de abrojo (quelite). La planta de da corto que puede soportar toda clase de inclemencias ambientales, ha sido importante para estudios experimentales de fotoperiodicidad. Cada receptculo espinoso es una inflorescencia con dos flores. Para los agricultores esta planta mas bien es una molestia como maleza.

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12.2.5.

Fitocromo

El fitocromo es una protena unida a un cromforo sensor. Est presente en pequeas cantidades en los tejidos de las plantas, es uno de los sistemas receptores que detectan las transiciones entre la luz y la oscuridad. El pigmento existe en dos formas, Pr y Pfr. Pr absorbe luz roja, mientras que Pfr absorbe luz roja-lejana. Pfr es la forma biolgicamente activa del pigmento; entre sus muchos efectos conocidos, promueve la floracin en las plantas de das largos, inhibe la floracin en las plantas de das cortos, promueve la germinacin en las semillas pequeas de plantas como la lechuga, e interviene en numerosos procesos de los vegetales.

Figura 12-14. Interconversin de las dos formas del fitocromo. Los fitocromos son sintetizados en la forma Pr. Pr cambia a Pfr cuando se lo expone a luz roja. Pfr es la forma activa que induce la respuesta biolgica. Pfr revierte a Pr cuando se lo expone a la luz roja lejana (730nm). En la oscuridad, Pfr lentamente revierte a Pr o es degradado. Las similitudes entre los espectros de accin de las respuestas biolgicas y los espectros de absorcin de los pigmentos suministraron importante evidencia de que el fitocromo es el pigmento responsable de las respuestas.

Figura 12-15. Espectros de absorcin de las dos formas del fitocromo.

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12.2.6.

Ritmos circadianos y relojes biolgicos

Cmo puede una planta de espinaca distinguir un da de 14 horas de un da de 13 horas? La medicin del fotoperodo requiere, por un lado, de fotorreceptores que permitan distinguir el da de la noche y, por otro lado, de un mecanismo que mida las horas de oscuridad. En cuanto a los fotorreceptores, se sabe que tanto los fitocromos como los criptocromos estn involucrados. El tema pendiente es, cmo miden las plantas la duracin del perodo de oscuridad? Esta pregunta nos lleva a otro grupo de fenmenos fcilmente observables. Algunas especies de plantas tienen flores que se abren por la maana y se cierran al atardecer. Otras extienden sus hojas a la luz del Sol y las pliegan hacia el tallo durante la noche.

Figura 12-16. Hojas de una planta de trbol falso (oxalis), durante el da a) y la noche b). Una hiptesis reciente, pero an sin pruebas, es que los "movimientos de sueo" evitan que las hojas absorban la luz que refleja la luna en las noches muy claras, protegiendo los fenmenos fotoperidicos. Estos movimientos diurnos continan aunque las plantas se mantengan en condiciones lumnicas constantes. Actividades menos evidentes, tales como la fotosntesis, la produccin de auxinas y la tasa de inhibicin celular, tambin tienen ritmos diarios. Los ritmos que continan con un perodo cercano a 24 horas aun, cuando todas las condiciones del ambiente se mantengan constantes se llaman ritmos circadianos y se han encontrado en todos los organismos eucariticos y en algunos procariticos (Gardner et al., 2006).
Los ciclos regulares de crecimiento y actividad que ocurren aproximadamente cada 24 horas se denominan ritmos circadianos. Estos ritmos son controlados por un oscilador endgeno el reloj biolgico -. La principal funcin del reloj biolgico, aparentemente, es suministrar el mecanismo de medicin del tiempo necesario para los fenmenos de fotoperiodicidad. Por ejemplo, la orientacin de las flores de girasol durante la noche anticipando la salida del sol en la madrugada.

En general, se considera que los ritmos circadianos son endgenos, o sea, se originan dentro del propio organismo y son controlados por lo que se conoce como reloj biolgico. La evidencia que apoya la idea del reloj biolgico interno es que, en condiciones ambientales constantes, los ritmos circadianos persisten por varios das. Diferentes especies y diferentes individuos de la misma especie suelen tener ritmos ligeramente diferentes, pero constantes, a menudo de hasta una o dos horas ms largos o ms cortos que 24 horas. Dado que el perodo endgeno de los ritmos no es exactamente igual a 24 horas, en condiciones naturales los relojes deben ser diariamente ajustados o sincronizados por el ambiente. Los factores ms importantes en la sincronizacin de los relojes son las transiciones luz/oscuridad que ocurren al atardecer y al amanecer. Actualmente se sabe que tanto los fitocromos como los criptocromos son responsables de la sincronizacin por luz de los relojes de las plantas. Por ejemplo, en Arabidospsis se ha observado que en das cortos, la sntesis de almidn es mayor que en das largos y que la tasa de degradacin de este es ms lenta. As, la planta se ajusta a una noche ms larga. Si hay un cambio repentino hacia noches ms largas, se observa

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que el almidn almacenado se degrada por completo y el crecimiento de la raz de detiene (Gibon y col., 2004. En los ltimos aos se han acumulado evidencias de que el reloj est constituido por protenas que regulan negativamente la expresin de sus propios genes, constituyendo una retroalimentacin negativa de 24 horas de duracin. Los relojes biolgicos desempean un papel importante en muchos aspectos de la fisiologa vegetal y animal, sincronizando acontecimientos internos y externos (Gardner et al., 2006, Harmer et al., 2000)

12.3.

Hormonas vegetales

Por qu germinan las semillas? Por qu algunas plantas producen flores y otras no? Por qu el meristemo de un rbol crece? Si se corta una rama Por qu se forma un brote en la parte de arriba mientras que en la parte de abajo se forman otra vez races? Puede ser esto una indicacin de un transporte polar de sustancias reguladoras del desarrollo de las plantas? Los reguladores de crecimiento, son compuestos orgnicos que, aparte de los nutrientes, influyen sobre los procesos fisiolgicos de las plantas. Estos compuestos pueden ser promotores o inhibidores. Estos casi siempre actan en conjunto y casi nunca de forma aislada, ya que la mezcla y la proporcin de las diferentes hormonas determinan la respuesta final del tejido. Los reguladores se han agrupado en clases segn su naturaleza qumica: auxinas, giberelinas, citoquininas, etileno, acido absicico, acido jasmonico, brasinoesteroides, etc. (Figura 12-17).

Figura 12-17. Formulas qumicas de cinco fitohormonas Las auxinas representan un grupo de componentes caracterizados por su capacidad de inducir la elongacin de las clulas localizadas en los brotes y en el extremo apical, as como la formacin de esquejes de la planta, la abscisin de las hojas y de los frutos sin semillas y la produccin de tejido nuevo en las zonas deterioradas. Las giberalinas se emplean para la floracin o para estimular el crecimiento para que estas adquieran mayor altura y tamao, y produzcan frutas de mayor tamao. Las giberelinas favorecen la floracin de muchas especies de plantas suprimiendo la necesidad de estas plantas a la exposicin a bajas temperaturas como en la zanahoria, el crisantemo entre otras. Las citoquininas estimulan la divisin celular y el despertar de la latencia en las semillas. Los inhibidores comprenden un grupo diverso de reguladores de la planta que inhiben o retrasan los procesos fisiolgicos y bioqumicos. Uno de los primeros inhibidores del crecimiento que se aplicaron desde el punto de vista comercial fue el hidrcido malico (HM). Se emple para prevenir la formacin de brotes en los tubrculos de las papas y cebollas. Tambin para controlar

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el rebrote del tabaco y el excesivo crecimiento de malas hiervas. El Cycocel tambin se utiliza en la reduccin de la altura de la poinsetia, para que adquiera una forma ms compacta y ms corta en la poca de Navidad (Figura 12-18) (Parker

Figura 12-18. Se ejemplifica en que lugares de la planta interviene cada hormona vegetal. http://recursos.cnice.mec.es/biosfera/alumno/1bachillerato/reino_vegetal/contenidos10.htm

12.3.1.

Auxinas

El nombre auxina significa en griego 'crecer' y es dado a un grupo de compuestos que estimulan la elongacin. El cido indolactico (IAA) es la forma predominante, sin embargo, evidencia reciente sugiere que existen otras auxinas indlicas naturales en plantas {Enger, 2005 #630} . Aunque la auxina se encuentra en toda la planta, las ms altas concentraciones se localizan en las regiones meristemticas en crecimiento activo. Se le encuentra tanto como molcula libre o en formas conjugadas inactivas. Cuando se encuentran conjugadas, las auxinas se encuentran metablicamente unidas a otros compuestos de bajo peso molecular. Este proceso parece ser reversible. La concentracin de auxina libre en plantas vara de 1 a 100 mg/kg peso fresco. En contraste, la concentracin de auxina conjugada ha sido demostrada en ocasiones que es sustancialmente ms elevada. La auxina tiene una caracterstica sorprendente que es la fuerte polaridad exhibida en su transporte a travs de la planta. Es transportada por medio de un mecanismo dependiente de energa, alejndose en forma basiptala desde el punto apical de la planta hacia su base. Este flujo de auxina reprime el desarrollo de brotes axilares laterales a lo largo del tallo, manteniendo de esta forma la dominancia apical. El movimiento de la auxina fuera de la lmina foliar hacia la base del pecolo parece tambin prevenir la abscisin. La auxina ha sido implicada en la regulacin de un nmero de procesos fisiolgicos: 1.- Promueve el crecimiento y diferenciacin celular, y por lo tanto en el crecimiento en longitud de la planta, 2.- Estimulan el crecimiento y maduracin de frutas, 3.- floracin,

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4.-Senectud, 5.- Geotropismo, 6.- Retardan la cada de hojas, flores y frutos jvenes, 7.- dominancia apical La auxina se dirige a la zona oscura de la planta, produciendo que las clulas de esa zona crezcan ms que las correspondientes clulas que se encuentran en la zona clara de la planta. Esto produce una curvatura de la punta de la planta hacia la luz, movimiento que se conoce como fototropismo. El efecto inicial preciso de la hormona que subsecuentemente regula este arreglo diverso de eventos fisiolgicos no es an conocido. Durante la elongacin celular inducida por la auxina se piensa que acta por medio de un efecto rpido sobre el mecanismo de la bomba de protones ATPasa en la membrana plasmtica, y un efecto secundario mediado por la sntesis de enzimas. La principal auxina endgena es el cido indolil-3-actico (AlA). Es sintetizada en la planta a partir del L-triptofano, que puede estar libre o formando parte de protenas. Por accin de una transaminasa se transforma en cido indolpirvico el cual se descarboxila por accin de una descarboxilasa formndose indol-acetaldehdo. Luego acta una oxidasa que lo transforma en cido indol actico. Existen otras vas de sntesis que conducen al compuesto mediante la formacin intermedia de triptamina, o bien mediante un intermediario nitrlico. El AIA se puede transformar en cido indol butrico por accin de una sintasa (Figura 12-19)

Figura 12-19. Ruta metablica del cido 3-Indolbutrico Dentro de las funciones tenemos: 1.- Promueven el crecimiento en tallos y coleptilos. La elongacin se produce por aumento de: a. extensibilidad de la pared: surgi as la hiptesis del crecimiento cido: que sugiere que una de las principales acciones auxnicas es la de inducir + a las clulas a transportar protones hacia la pared celular tanto por estimulacin de H ATPasas existentes como por incremento en la sntesis de estas protenas. La capacidad de los protones para provocar la prdida de pared esta mediada por protenas llamadas Expansinas, que rompen los puentes hidrgeno entre los polisacridos de la pared. b. Captacin de solutos. c. Sntesis y depsito de polisacridos y protenas: necesarias para mantener la capacidad de desgaste de la pared inducida por cidos.

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2. Promueven la formacin de races adventicias. 3. Inhiben el crecimiento en races en concentraciones bajas. 4. Promueven la dominancia apical (fenmeno por el cual las yemas apicales de muchas plantas presentan mayor crecimiento que las yemas laterales). Los brotes apicales inhiben el crecimiento de los brotes laterales (axilares), se cree que las auxinas convierten al pice del tallo en un vertedero de citocininas provenientes de la raz, lo que explicara la dominancia apical. 5. Favorecen la floracin. 6. Inducen la diferenciacin vascular. 7. Retardan la abscisin de hojas, flores y frutos jvenes. La abscisin es la cada de hojas, flores y frutos en plantas vivas. Este efecto est regulado por un balance hormonal que implica a las auxinas y al etileno, cuando el rgano vegetal (hoja, flor o fruto) es joven el balance favorece al AIA, que disminuye la sensibilidad al etileno (lo que retarda la abscisin), pero cuando el rgano vegetal envejece, disminuyen los niveles de AIA, y se incrementan la de etileno, por ello el balance hormonal termina por favorecer al etileno (que incrementa la abscisin) 8. Estimulan la formacin de races adventicias de tallos y hojas. Por lo que comercialmente son usadas como hormonas de enraizamiento. Hay evidencias de una biosntesis de AIA independiente de L-triptofano (cuyos precursores son el indol y el indol-3-glicerol fosfato) en una planta mutante de maz. Se comprob que a pesar de que la mutante tiene 1/7 parte de triptofano que la cepa salvaje, tiene 50 veces ms AIA que el maz salvaje. Receptores hormonales Las plantas, aunque carecen de sistema nervioso, poseen, al igual que los animales, un sistema hormonal de comunicacin a larga distancia mediante el cual las clulas blanco traducen la seal hormonal en una respuesta especfica. Estos receptores son protenas que se unen de forma especfica y reversible a la seal qumica; tras realizarse la unin experimentan un cambio conformacional, pasando de una forma inactiva a una forma activa, poniendo en marcha un programa molecular que conduce a la respuesta caracterstica. La bsqueda de receptores para auxinas en plantas se ha basado en el estudio de dos respuestas caractersticas: la proliferacin de callos e induccin de races o tallos regulado por el balance auxinas / citocininas y la elongacin del coleptilo o secciones de tallo. En callos desarrollados a partir de mdula de tabaco se encontr que existan tres clases de protenas que actuaban como receptores, perfectamente distinguibles por su capacidad de ligamiento y su localizacin. Dos de ests protenas estaban ligadas a membranas y localizadas en el plasmalema, una de ellas presenta a pH 4 elevada afinidad con el cido naftilftalmico (NPA), un potente inhibidor sinttico del transporte de AIA: ligara el AIA en la zona del plasmalema que limita con el citoplasma y lo transportara a travs de la membrana al apoplasto. La otra protena tiene una afinidad mayor por el AIA 10-7 M a pH 5 y no liga NPA, se localiza en la parte exterior de la membrana plasmtica, dada la elevada concentracin de auxinas necesaria para la induccin de races en el callo de mdula de tabaco y la baja afinidad de esta protena por las auxinas naturales podra estar implicada en el proceso de regeneracin radicular. En fracciones solubilizadas de tejidos homogeneizados se localiza una tercera protena citoplsmica / nuclear a muy baja concentracin, con elevada afinidad por el AIA 2.5 nM a pH 7.5, superior a la de las protenas de membrana, la existencia de esta protena hace pensar que jugara un papel anlogo al que explica el mecanismo de accin de las hormonas esteroides en clulas animales: la auxina controlara directamente la actividad transcripcional en el ncleo al acoplarse con el receptor citoplsmico / nuclear.

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En coleptilos de maz se han buscado receptores que ayudarn a explicar la respuesta ms caracterstica de las auxinas, es decir, la elongacin celular, llegndose a la evidencia de que existen tres fracciones membranosas con capacidad de ligar auxinas. Estas fracciones son el retculo endoplsmico, el tonoplasma y la membrana plasmtica. Para el receptor del retculo endoplsmico la constante de afinidad frente a ANA es 0.5-0.7 M y la afinidad del receptor frente a varias auxinas y compuestos relacionados guarda bastante paralelismo con la actividad promotora del crecimiento de los mismos. A pesar de que en los coleptilos de maz el retculo endoplsmico es el receptor mayoritario en el control de la accin de la auxina sobre el crecimiento, en el caso de clulas de callo de mdula de tabaco ya hemos visto que no se localiza ningn receptor en RE, por tanto no puede generalizarse que este receptor localizado en el RE sea el punto central para la accin de las auxinas. Una vez que se ha producido la unin de la auxina, bien sea un nico factor de unin o bien a varios, la percepcin por la clula de esta unin debe traducirse en una respuesta. Varios laboratorios han abordado este problema mediante el estudio del efecto de las auxinas sobre la expresin gnica (Theologis, 1986). Mediante el estudio de los promotores de los genes activados por las auxinas se estn estudiando las primeras etapas de los mecanismos de accin de estas. Las auxinas inducen un grupo especfico de mRNAs. En la soja, el tratamiento con auxinas activa un grupo de genes que codifica para varios polipptidos de pequeo tamao (8-10 kDa) en 2-5 minutos. Estos pequeos mRNAs inducidos por las auxinas (small auxin upregulated mRNAs SAUR), tambin se expresan a los pocos minutos de haberse producido el estmulo geotrpico (Guilfoyle et al., 1992). Otros mRNAs tambin se activan adems por calor (heat shock) y metales pesados y pueden estar implicados en aspectos ms generales de la activacin metablica. Las auxinas participan en una gran variedad de fenmenos dentro de la planta. As en el desarrollo del fruto es consecuencia de la liberacin de auxinas por la semilla. De hecho muchos cultivadores inducen el desarrollo del fruto en flores no polinizadas (frutos partenocrpicos) mediante la aplicacin de auxinas a las flores. Otro fenmeno gobernado por las auxinas es la dominancia apical o inhibicin del desarrollo de las yemas laterales por la yema apical. Este hecho parece estar producido por el transporte descendente de auxina. La cada de las hojas y frutos, as como la iniciacin de la raz, tambin parece ser gobernada por las auxinas. En el primer caso se ha observado que demora su desprendimiento, mientras que en el segundo estimulan la aparicin de races, como es el caso de las races adventicias. As, de manera de resumen, podemos concluir que las auxinas son las fitohormonas responsables de las nastias y tropismos. Como mencionamos anteriormente, el abanico de procesos gobernados por las auxinas es muy variado. Sin embargo, todava falta estudiar los mecanismos de accin a nivel molecular, ya que no se conocen todos los componentes de sealizacin y respuesta.

12.3.2.

Citocininas

Son un grupo de hormonas que regulan la divisin celular. Derivan de la adenina o de aminopurinas. Las diferentes cadenas laterales se unen al nitrgeno del carbono 6. Pueden presentarse como: bases libres (que constituyen las formas activas de las citoquininas), o bien ribonuclesidos, ribonucletidos y glicsidos (que se activan por conversin a la forma de base libre); tambin pueden hallarse como bases modificadas formando parte de los tRNA (aunque la cantidad de citoquininas derivadas de esta fuente carece de gran relevancia) La primera citocinina natural aislada fue la zeatina [N-(4-hidroxi-3-metil-2-butenil)aminopurina] obtenida de granos de maz (Zea mays).Una buena fuente de citocininas la constituyen los frutos y semillas

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inmaduras y los hidrolizados de tRNA de plantas, animales y micoorganismos.Estructura de algunas citocininas naturales. La biosntesis tiene lugar principalmente en el citosol de las clulas de meristemas apicales de raz, y tambin en embriones jvenes de maz y hojas jvenes en desarrollo. La cadena lateral deriva de la va del acetato-mevalonato. El isopentenil pirofosfato se transfiere al AMP (derivado de la sntesis de purinas) por accin de la Citoquinina sintasa (una prenil transferasa similar a las de la sntesis de los terpenos). El isopentenil adenina ribonucletido generado se transforma en las diferentes citoquininas, sin embargo muchas de las enzimas involucradas todava no se han identificado. Las provenientes del tRNA se forman durante el procesamiento del precursor del tRNA (existe una prenil transferasa diferente a la vista en la otra va que reconoce una secuencia especfica de bases, y no emplea AMP como sustrato). El catabolismo de auxinas tiene lugar principalmente por: Conjugacin: Conversin a ribonuclesidos o ribonucletidos. Tambien pueden convertirse a glicsidos: stos constituyen la principal forma de almacenamiento de las citoquininas. Degradacin a adenina o sus derivados por accin de la citoquinina oxidasa. Ubicacin: Se las encuentra en tejido vascular, sobre todo en el xilema, en puntasde races, en frutos en desarrollo, en tejidos tumorales infectados por Agrobacterium tumefaciens, en semillas en germinacin, en ndulos de races de leguminosas, en algas, bacterias y hongos. Movilizacin: Las citocininas sintetizadas en las races son movilizadas (comoribonucletidos principalmente) por el xilema hacia la hoja, donde se acumulan (enprimavera y principios del verano) o bien se desglicosilan cobrando actividad. Cuando las hojas alcanzan el mximo desarrollo, las citocininas son glicosiladas y luego exportadasva floema a otros rganos, como los frutos. Efectos fisiolgicos: 1. Promueven la divisin celular. Asociadas a las auxinas favorecen el transcurso deG2a M.2. Promueven la formacin y crecimiento de brotes laterales (axilares). Es decir que vencen la dominancia apical.

12.3.3.

Giberelinas

Las giberelinas (GA) son esencialmente hormonas estimulantes del crecimiento al igual que las auxinas, coincidiendo con estas en algunos de sus efectos biolgicos. 1. Estimulan la elongacin de los tallos (el efecto ms notable). Debido al alargamiento de las clulas ms que a un incremento de la divisin celular, es decir que incrementan la extensibilidad de la pared, este efecto lo consiguen con un mecanismo diferente al de las auxinas, pero es aditivo con el de ests. Uno de los mecanismos ms estudiados involucra la activacin de la enzima XET (Xiloglucano endo transglicosilasa), responsable de la hidrlisis interna de los xiloglucanos, lo que permite la transferencia de un extremo cortado hacia un extremo aceptor libre de una molcula de xiloglucano aceptora. Esto tambin facilitara la penetracin de las expansinas en la pared celular. 2. Estimulan germinacin de semillas en numerosas especies, y en cereales movilizan reservas para crecimiento inicial de la plntula. Las semillas se encuentran encerradas en una pared celular (proveniente del fruto) llamada pericarpo testa. (1) Las GAs son sintetizadas por los coleptilos y el escutelo del embrin, y liberadas al endosperma amilceo. (2) Las GAs difunden hacia la capa de aleurona (3) las clulas de la aleurona son estimuladas para sintetizar y secretar -amilasa y otras hidrolasas hacia el endosperma amilceo. (4) El almidn y otras

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macromolculas se degradan hasta pequeas molculas sustrato. (5) Esos solutos son captados por el escutelo y transportados hacia el embrin en crecimiento {Emons, 1993 #546}. 3.- A nivel de las clulas de la aleurona, en semillas de cereales estimulan la sntesis y secrecin de -amilasas, y la sntesis de otras enzimas hidrolticas (por ejemplo -1,3-glucanasa y ribonucleasa). La unin de GA a su receptor membranal produce la activacin de la protena G +2 de membrana, lo que deriva en: (I.) una va de transduccin dependiente de Ca que involucra a la aalmodulina y a protenas cinasas, que favorecen la exocitosis (hacia el endosperma) de vesculas cargadas de -amilasa; (II.) una va de transduccin independiente de Ca+2, que involucra al GMP cclico como segundo mensajero, activando un intermediario de transduccin proteico, que a nivel del ncleo favorece la degradacin del represor gentico, que impide la expresin del gen GA-myb; la protena GA-myb es un factor de transcripcin que favorece la expresin de genes que codifican la biosntesis de -amilasa (y otras enzimas hidrolticas) que se almacenan en vesculas para su posterior exocitosis. 4. Inducen la partenocarpia. Proceso por el cual se forma fruto sin fertilizacin. Las auxinas tambin producen partenocarpia, pero las giberelinas son ms activas. 5. Reemplaza la necesidad de horas fro (vernalizacin) para inducir la floracin en algunas especies (hortcolas en general). 6. 7. Induccin de floracin en plantas de da largo cultivadas en poca no apropiada. Detienen el envejecimiento (senescencia) en hojas y frutos de ctricos

Se puede decir que los primeras pasos de sntesis son comunes al camino biosintetico de poliisoprenoides; a partir de la Acetil CoA y por la va del acetato mevalonato se forma isopentenil PP (IPP), que representa Ia unidad isoprnica base de estos compuestos. Luego continuar la sntesis con formacin de geranil PP (GPP), farnesil PP (FPP)y geranil geranil PP (GGPP) (compuesto de 20 carbonos, dador de todos los carbonos de las giberelinas). Este compuesto se cicla para formar el ent-Kaureno o (-) Kaureno. Por accin de monooxigenasas (del tipo citocromo P450) el C19 de este compuesto es oxidado a alcohol (ent-Kaurenol), aldehdo (ent-Kaurenal) y cido ent-Kaurenoico, a nivel de la membrana del retculo endoplsmico. En un paso posterior el anillo B se contrae por expulsin del C7 pasando de un anillo de 6 Carbonos a otro de 5, formando el gibano, luego por oxidacion en C7 se forma el GA12 aldehdo. El aldehdo GA12 se transforma en giberelinas tipo C19 mediante dos rutas, una que involucra la 13 hidroxilacin temprana y otra donde no se hidroxila esa posicin. En ambas vas hay descarboxilacin y reacciones catalizadas por oxidasas de membrana y citoslicas {Kaur, 1998 #447; Stoll, 1998 #51}.

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b)

a)

Figura 12-20. Sntesis de giberelinas. a) Posibles rutas de la sntesis de los isoprenoides en plantas. La ruta citoslica o ruta del mevalonato (MVA) y ruta plstidica o ruta del metil-eritrolfosfato (MEP) a partir de la va acetato-mevalonato. b) Sntesis de las giberelinas a partir del entkaureno. http://4e.plantphys.net/article.php?ch=20&id=366

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Figura 12-21. Mecanismo de estimulacin para la sntesis y secrecin de enzimas hidrolticas a nivel de la aleurona. Su uso est limitado por su costo. Se usa para incrementar el tamao de las uvas sin semillas haciendo que se elonguen los racimos, de modo que estn menos apretados y sean menos susceptibles a infecciones por hongos. Para aumentar la produccin de malta en cervecera, mediante efectos promotores de la digestin de almidn por las giberelinas. Para aumentar la longitud de los tallos de la caa de azcar, mejorando as el rendimiento.

12.3.4.

Etileno

Etileno es una hormona que afecta el crecimiento, desarrollo, maduracin y envejecimiento de todas las plantas. Normalmente es producido en cantidades pequeas por la mayora de las frutas y vegetales. La accin del etileno es ms lenta en temperaturas ms bajas. A su ms bajo nivel de temperatura, la fruta es bsicamente inactiva y no responde bien al etileno aplicado

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externamente. El etileno penetra en muchas sustancias. De hecho, penetra a cajas de cartn, madera (que son usadas para envo de los productos) y hasta paredes de concreto. Mientras que el etileno es invaluable debido a su habilidad para iniciar el procesamiento de maduracin en muchas frutas, este puede tambin ser muy daino para otros, vegetales, flores y plantas ya que acelera el proceso de envejecimiento, disminuyendo as la calidad del producto y su vida de anaquel. El grado de dao depende de la concentracin de etileno, tiempo que ha sido expuesto y temperatura del producto. Uno de los siguientes procesos debe ser usado para asegurar que los productos sensitivos al etileno no sean expuestos al mismo a) frutas que produzcan etileno (como manzanas, aguacates, pltanos, melones, melocotones, peras y tomates) debern ser situados separadamente de los que son sensibles al etileno (brcoli, col, coliflor, hojas verdes, lechugas, etc.). En general el etileno no es daino o toxico para los humanos en las concentraciones que se encuentran en los cuartos de maduracin.

12.3.5.

Acido Abcsico

La fitohormona Acido Abscisico (ABA) es una reguladora de procesos importantes como son el desarrollo de la semilla, dormancia y posterior germinacin. Tambin interviene en la respuesta adaptativa de tejidos vegetativos frente a estreses ambientales de sequa, salinidad y fro. Muchos de los efectos del ABA estn mediados por cambios en la expresin gnica principalmente a nivel de transcripcin. Entre estos genes se encuentran los denominados LEA (late embryogenesis abundant), como el rab28. Este gen contiene en su promotor 2 elementos ABRE (ABA responsive element) necesarios para su induccin durante la embriognesis y en respuesta al ABA. Estudios in vivo han mostrado que a estos elementos se unen factores de la familia bZIP. En este trabajo presentamos el aislamiento y la caracterizacin de dos factores de transcripcin de la familia de las bZIP, denominados EmBP-2 y ZmBZ. Se ha analizado la expresin de los factores a nivel de mRNA y de protena, su interaccin in vitro con los elementos ABRE del gen rab28, su actividad in vivo sobre la expresin del gen rab28 en tejidos embrionarios y vegetativos y los mecanismos que pueden modificar su actividad, como el estado de fosforilacin y su localizacin subcelular. Nuestros resultados apuntan a que estos factores tienen un papel regulador de la expresin del gen rab28 a travs del elemento ABRE.

12.3.6.

Resumen de hormonas como reguladoras del desarrollo vegetal

Las hormonas integran el crecimiento, desarrollo y actividades metablicas en los distintos tejidos de una planta. Son tpicamente activas en cantidades muy pequeas. Las hormonas se consideran reguladores bioqumicos endgenos. La respuesta a un "mensaje" regulador determinado depende no slo de sus caractersticas (o sea de su estructura qumica) sino tambin de la identidad del tejido especfico u rgano blanco sobre el que acta y de cundo y cmo se recibe. Adems, la respuesta a cualquier hormona dada es influida por una variedad de otros factores del ambiente interno del organismo, entre los cuales cabe destacar el efecto conjunto de otras hormonas. Se conocen cinco tipos principales de hormonas vegetales, o reguladores del crecimiento: las auxinas, las citocininas, el etileno, el cido abscsico y las giberelinas. La evidencia reciente sugiere que otros compuestos tambin funcionan como hormonas vegetales. Las auxinas -cido indolactico o AIA- son producidas principalmente en tejidos que se dividen rpidamente, como los meristemas apicales. Participan en muchas respuestas de las plantas, de las cuales la respuesta fototrpica es solo un ejemplo. Las auxinas provocan el alargamiento del vstago, promoviendo principalmente el alargamiento celular. En conjuncin con la citocinina y el

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etileno, las auxinas parecen intervenir en la dominancia apical, en la cual se inhibe el crecimiento de las yemas axilares, restringiendo as el crecimiento al pice de la planta. En concentraciones bajas, las auxinas promueven el crecimiento de las races secundarias y de las races adventicias. En concentraciones ms altas, inhiben el crecimiento del sistema principal de races. En los frutos en desarrollo, las auxinas producidas por las semillas estimulan el crecimiento de la pared del ovario. La produccin disminuida de auxinas se correlaciona con la abscisin de frutos y hojas. La capacidad de las auxinas para producir estos variados efectos parece resultar de las diferentes respuestas de los distintos tejidos "blanco" y de la presencia de otros factores, incluyendo otras hormonas. La citocininas promueven la divisin celular. Alterando las concentraciones relativas de auxinas y citocininas, es posible cambiar los patrones de crecimiento de un tejido vegetal indiferenciado.

Figura 12-22. La respuesta de las clulas de tabaco en cultivo de tejido a combinaciones de auxina (AIA) y citocinina (cinetina). Las concentraciones de AIA (en miligramos por litro) se indican en las curvas. La cinetina sola tiene poco efecto en el crecimiento del tejido indiferenciado de tabaco (un callo). El AIA slo hace que el cultivo crezca hasta un peso de aproximadamente 10 gramos, independientemente de la concentracin usada. Cuando ambas hormonas estn presentes, el crecimiento se incrementa en gran medida. Ntese, sin embargo, que cuando se exceden las concentraciones ptimas, la tasa de crecimiento declina. El etileno es un gas producido por los frutos durante el proceso de maduracin, proceso que ese mismo gas promueve. Desempea un papel central en la abscisin de las hojas y se piensa que es un efector de la dominancia apical. El cido abscsico, una hormona inhibidora del crecimiento, puede estar involucrado en la induccin de la dormancia en las yemas vegetativas y en el mantenimiento de la dormancia de las semillas. Las giberelinas estimulan el alargamiento del vstago, inducen el repentino crecimiento y floracin de muchas plantas y tambin estn implicadas en el crecimiento del embrin y de la

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plntula. En las gramneas estimulan la produccin de enzimas hidrolticas que actan sobre el almidn almacenado, los lpidos y las protenas del endosperma, convirtindolos en azcares, cidos grasos y aminocidos que nutren a la plntula. Figura 9.29

Figura 12-23. La accin de la giberelina en una semilla de cebada. En la anterior figura se puede ver que el embrin libera giberelina que difunde hacia la capa aleurnica. La giberelina hace que las clulas de aleurona sinteticen enzimas que digieren las reservas alimenticias del endosperma convirtindolas en molculas ms pequeas. Estas molculas son transportadas a las regiones del embrin en crecimiento. Tabla 12-1. Las principales hormonas y sus efectos

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12.4.

Desarrollo reproductivo de maz

Tarea 12-3. Haga una bsqueda bibliogrfica y averige las particularidades de la reproduccin y desarrollo en maz. Tarea 12-4. Haga un dibujo comparando el ciclo reproductivo de animales con el de plantas superiores. Ponga especial nfasis en la fase gametoftica, y en la doble fecundacin que solo se da en plantas. Indique en que etapas se da la meiosis, y la mitosis.

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13.
13.1.

Transferencia Gentica
Transferencia sexual

TRANSFERENCIA VERTICAL VS. TRANSFERENCIA HORIZONTAL La informacin gentica se transmite de padres a hijos verticalmente. La recombinacin es la unin de la informacin gentica de dos individuos por medio de la reproduccin sexual. Visto as, se trata de un mecanismo transmisin de informacin. La probabilidad de que dos alelos existan en estado homocigoto (digamos AA y BB) en un mismo individuo a partir de otro aabb y sin que haya recombinacin mediada por la reproduccin sexual ser la probabilidad de que "A" mute a "a" al cuadrado multiplicada por la probabilidad de que B mute a "b" al cuadrado. El efecto de la recombinaciones entonces aumentar la probabilidad de aparicin de combinaciones genticas en varios rdenes de magnitud. Este efecto se hace ms manifiesto si consideramos una mayor cantidad de genes determinando el fenotipo sujeto a estudio. Para varios genes el fenmeno se hace con una probabilidad de un milln de veces ms que si consideramos nicamente dos genes. Cada gene que agregamos, por su efecto en un fenotipo polignico, incrementa la relevancia de la recombinacin en seis rdenes de magnitud al ser comparada con la mutacin como fuente de variacin gentica. Algunos fenotipos resultan afectados por decenas de genes y esto causa que la relevancia de la recombinacin en tales casos sea muy clara. TRANSFERENCIA DE GENES VS. TRANSFERENCIA DE GENOMAS. Uno de los aspectos ms interesantes a considerar es la diferencia en cuanto a su mecanismo y las implicaciones que tiene la transferencia de un gene para aqulla de todo el genoma. Si recordamos, la especie es comnmente definida como aquel grupo de individuos que comparten la misma poza gnica. En este caso, la transferencia horizontal especfica es una va de la reproduccin sexual que junto con la recombinacin, constituyen fenmenos comunes; pero no es tan comn, si consideramos que la transferencia se lleva a cabo entre individuos de especies diferentes. Esta transferencia cuando existe, llega a desempear un impacto central sobre la manera de generar nueva variabilidad. Supongamos por un momento que los genes de la fotosntesis rebasaran los lmites especficos transfirindose a un hetertrofo multicelular: constituira entonces un organismo que en la actualidad no existe. De hecho la ingeniera gentica trata primordialmente est tipo de transferencia; por ejemplo, transferir genes de resistencia a la sequa entre plantas diferentes es la versin biotecnolgica de un fenmeno que ha prevalecido en la naturaleza por mucho tiempo. As como en cada evento de reproduccin sexual se ponen en contacto dos genomas distintos, podramos imaginar la transferencia de un genoma de una especie a otra distinta. La teora endosimbitica del origen del cloroplasto y la mitocondria es un tpico caso de esta clase de transferencia. Aqu no slo se rebasan las barreras entre especies, sino que la cantidad de material gentico que se moviliza es tal, que la variante producida crea una novedad que difcilmente se obtendra de otra manera. Existen especies de bacterias y de otros organismos que no tienen reproduccin sexual; en la mayora de ellas, la recombinacin no presenta un papel importante cuando se consideran genes localizados en el cromosoma 27. El mismo principio no parece aplicarse al estudiar los genes presentes en plsmidos (genomas circulares fsicamente independientes del cromosoma), en los cuales se han localizado, por ejemplo, los genes responsables de la resistencia a algunos antibiticos y que pueden ser transferidos en forma horizontal.

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Una pregunta que parecera central para abordar este problema, en poblaciones naturales, es cmo se puede detectar la transferencia horizontal y cmo sera posible estimar la tasa de ocurrencia en la naturaleza? DETECCIN DE TRANSFERENCIA HORIZONTAL Un experimento que se antoja til para detectar la transferencia horizontal consistira en usar a un organismo marcado con ciertos genes e introducirlo a una poblacin con otros marcadores genticos, registrando as, el paso de ellos entre las cepas. Por lo que el experimento podra hacerse con mayor factibilidad en bacterias, dado lo breve de su ciclo de vida, para una revisin asi la tasa de transferencia y la tasa de fijacin combinadas es del orden de la tasa de mutacin como se ha sugerido para genes cromosomales en bacterias, digamos10 9 ste fenmeno sera difcil de detectar sobre todo si consideramos que el marcador gentico puede aparecer en la poblacin con esa misma tasa. Si se quisiera obtener un nivel de sensibilidad mayor, entonces se pueden usar tres marcadores genticos, detectando el paso de dos de ellos que estn ligados; en cambio, si la tasa es mayor y se utiliza una fuerte presin selectiva para hacer que la tasa de fijacin sea igual a uno, entonces est enfoque puede ser usado para detectar la transferencia, pero si no se halla de esta manera, hay que argumentar las siguientes razones: a) el gene o los genes que se utilizaron probablemente estn localizados en regiones del genoma que no se transfieren o bien, b) la sensibilidad de la metodologa usada tal vez no sea eficaz para revelar valores mnimos de transferencia.

Comentario [ATF20]: A qu se refiere

13.1.1.

Cruzas entre individuos de la misma especie

El concepto de especie se presenta como un concepto absolutamente clave, pero en la prctica no resulta un asunto trivial determinar cuando debemos considerar a un grupo de individuos como pertenecientes a la misma especie y cuando no. Una extraordinaria disparidad morfolgica no asegura que dos individuos pertenezcan a especies distintas. Por ejemplo en las hormigas hay distintos tipos de individuos en una misma colonia, o individuos de ciertas especies que cambian su aspecto dependiendo del biotopo donde viven, o variedades obtenidas por seleccin artificial. El caso de los perros y sus razas es muy llamativo. De un gran dans, a un mastn, o a un caniche enano hay tanta variabilidad morfolgica, que luego, cuando nos dicen que dos peces pertenecen a especies distintas porque uno de ellos tiene un hueso interno con una forma ligeramente distinta, nos desconcierta y nos hace preguntarnos por qu son especies distintas si son tan parecidos. Tampoco el caso contrario de total coincipencia morfolgica entre dos individuos permite asegurar que pertenezcan a la misma especie. Esto desconcierta a mucha gente y ocurre porque no hemos entendido el concepto de especie que intentaremos definir a continuacin. Los individuos de una misma especie son individuos que componen una poblacin donde todos comparten un mismo legado gentico que est sometido a un libre intercambio gentico de forma preferente entre individuos de su misma especie, de forma que dicha poblacin de individuos evolucionar y se adaptar a su entorno natural de forma independiente a la de otras poblaciones. Esta no es la nica definicin posible, pero la idea subyacente en muchas definiciones ampliamente aceptadas es esta. Es importante recalcar que el concepto de especie est ligado al de poblaciones donde se intercambian genes entre ellos y no meramente al aspecto de los individuos. Esta definicin slo es aplicable a las especies de animales y plantas que se reproducen sexualmente Gracias a esta definicin, podemos ya descartar varios casos de individuos que no podrn pertenecer a una misma especie. Si los machos y las hembras no pueden procrear porque hay una incompatibilidad a nivel gentico, queda claro que no son de la misma especie. Ya es algo pero con eso no

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hemos adelantado mucho, porque eso nicamente ocurre entre especies que estn bastante alejadas entre si. Si la descendencia de dos individuos pertenecientes a poblaciones distintas da lugar a hbridos estriles que no pueden procrear como el caso de los mulos, significar que los padres tampoco son de la misma especie porque ambos grupos poblacionales presentan una barrera a nivel gentico que a la postre, igual que en el caso anterior, les impide el libre intercambio de genes a nivel poblacional. La cosa se vuelve menos evidente cuando intentamos cruzar individuos de distintas poblaciones y obtenemos una descendencia frtil. Si los padres se consideran especies distintas se tratara de hbridos frtiles y si los padres son simplemente razas distintas los consideraremos una raza mestiza, pero el criterio de fertilidad gentica en este caso no nos sirve para discernir si estamos ante un caso de especies distintas o de razas distintas de una misma especie.

13.1.1.1.

Meiosis y fecundacin

En las plantas con flor, podemos reconocer estructuras masculinas y femeninas. El grano de polen (que se encuentra en las anteras de las flores) posee los gametos masculinas. Estos gametos debern llegar hasta las estructuras femeninas de la misma u de otra flor para dar lugar al embrin. Todas las plantas con flor poseen estructuras reproductivas de ambos sexos. La parte masculina est compuesta por los granos de polen contenidos en las anteras y la femenina por el vulo que se encuentra en el interior del ovario de la flor. La fecundacin es la unin del gameto masculino, llamado anterozoide, con el gameto femenino, denominado osfera, la cul se encuentra en el ovario de la flor. Como estas dos clulas son haploides, su unin dar origen a un embrin diploide que se encuentra dentro de la semilla. En las plantas, la fecundacin es algo ms compleja, ya que este embrin -como los de todos los organismos- necesita de sustancias de reserva para desarrollarse; y a diferencia de los animales, las sustancias de reserva que lo nutren debern estar contenidas en la misma semilla.

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Figura 13-1.El grano de polen formando el tubo polnico. Para alcanzar la gameta femenina (osfera), el grano de polen primero se deposita en el estigma y luego avanza hasta la parte inferior del carpelo (a travs de un tubo que l mismo genera llamado tubo polnico) hasta llegar a la osfera (Figura 13-1). En el grano de polen existen dos tipos de clulas: la vegetativa, cuyo ncleo gobernar el crecimiento del tubo polnico, y otra muy pequea, la generativa, la cul se dividir para producir dos gametas masculinas. El tubo polnico crece atravesando el estigma y el estilo, llevando en su extremidad el ncleo de la clula vegetativa, seguido por el ncleo de la clula generativa. El crecimiento del tubo contina por el estilo, nutrindose a expensas de sus tejidos, y dirigindose al ovario. Luego prosigue por las paredes del ovario hasta llegar al vulo. En las plantas, el vulo est formado por siete clulas, de las cuales las ms importantes son el gameto femenino (osfera) y otra clula de mayor tamao que contiene dos ncleos llamados ncleos polares. (Figura 13-2) Cuando el tubo polnico llega hasta el vulo, uno de los gametos masculinos se fusiona con la osfera para dar la cigota (diploide), a partir de la cual se formar luego el embrin por sucesivas mitosis; mientras que el otro gameto se une con los ncleos polares para dar la clula madre del endospermo (triploide). A partir de esta clula, tambin por mitosis, se formar el endospermo, tejido que almacena las sustancias de reserva de la semilla.

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Figura 13-2. La fecundacin. Figura del gineceo.

13.1.2.

Cruzas entre especies diferentes

El tipo de transferencia habitual, o transferencia vertical de genes, es la que se da desde un ancestro a su descendencia, como ocurre por ejemplo en la reproduccin sexual. La transferencia horizontal de genes (HGT, por sus siglas en ingls) consiste en la transmisin del genoma, o parte de este, de un organismo a otro que no forma parte de su descendencia Desde hace tiempo se conoce la importancia del proceso de HGT en procariotas, como en el caso de la conjugacin bacteriana, descubierto a mediados del siglo pasado, en la que una clula transfiere informacin gentica a otra diferente con la mediacin de plsmidos. Estos procesos son muy importantes como fuente de variacin gentica, equivalentes en cierto modo a la recombinacin cromosmica de los organismos con reproduccin sexual. Sin embargo, la HGT en bacterias ira ms all, dado que tambin se produce transferencia gentica entre especies alejadas filogenticamente, lo cual permite la formacin de genomas extraordinariamente heterogneos y dinmicos. Sin embargo, en los ltimos aos se han acumulado evidencias de que este proceso puede ser mucho ms generalizado de lo que se pensaba en un principio, no estando reducido a ciertos tipos de bacterias. La transferencia horizontal de genes parece haber tenido una gran importancia en todos los grupos de seres vivos, incluyendo plantas superiores y animales, al menos en las primeras etapas de la evolucin. Hoy sabemos que gran parte del genoma humano est constituido por DNA vrico, incorporado al material gentico de la clula. El papel de la HGT en la evolucin es uno de los puntos ms activos de discusin en biologa evolutiva. Desde aquellos que la consideran una fuente ms de variacin gentica, hasta algunos investigadores que creen que nos hallamos ante un nuevo paradigma biolgico, que no se limitara a completar la nueva sntesis evolutiva, sino incluso a sustituirla en buena parte. La transferencia horizontal de genes en plantas y animales

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Como nos referimos ms arriba, la transferencia de genes bacterianos a genomas de eucariotas, parece estar facilitada por endosimbiontes, desde las mitocondrias y plastos (Margullis, 1967; 1970; Gupta, 2000), pasando por los bien conocidos procesos de transmisin bacteriana a algunos hongos como Saccharomyces o la bacteria Wolbachia pipientis en la lnea germinal de algunos eucariotas. Gupta (2000), tambin describe importantes parentescos entre genes implicados en la transmisin gentica en eucariotas y arqueobacterias, as como los implicados en el metabolismo celular eucarita y las eubacterias. Recientemente se ha comprobado la integracin del genoma de Wolbachia en insectos y nemtodos en porciones de tamao variable, desde 500 pares de bases hasta el genoma completo de la bacteria. Tambin recientemente, ha sido referida la transferencia horizontal de genes bacterianos en rotferos (Gladyshev, Meselson & Arkhipova, 2008). Algunos de estos genes no son operativos en el organismo receptor, pero otros s son transcritos, indicando que este fenmeno representa un mecanismo real para la adquisicin de nuevos genes. La incorporacin de genoma vrico a las clulas procariotas y eucariotas se ha revelado tambin en los ltimos aos como un fenmeno no solo habitual, sino importantsimo en la incorporacin de genes reguladores de la expresin e incluso, codificadores de protenas muy similares en distintos grupos animales, y tan variadas como las DNA polimerasas (Villareal & DeFilippis, 2000), protenas involucradas en el desarrollo de la placenta (MI et al., 2000), en los procesos autoinmunitarios o en la espermatognesis (Jamain et al., 2001). Algunos autores afirman que la explicacin a la presencia de genes reguladores similares en diferentes grupos de organismos -como los genes HOX, implicados en el control del desarrollo embrionario (Ronemus y Martienssen, 2005)- podran tener un origen vrico (Sandn, 2000, 2002). Se ha llegado a calcular que entre el 60 y el 80% de los intrones (genes no codificadores de protenas) de animales contemporneos fueron adquiridos por insercin despus de la divergencia evolutiva de animales y plantas (Fedorov et al. 2003). Trabajos recientes apuntan hacia el hecho de que virus y bacterias no se limiten a transferir sus propios genes al organismo eucariota, sino que puedan servir de vectores para el intercambio gentico entre distintos huspedes, incluso alejados filogenticamente entre si. Esto podra suponer un mecanismo de recombinacin global, infintamente ms poderoso en la generacin de variacin que la tradicional recombinacin cromosmica en la meiosis. A pesar de que la controversia sobre el origen de los virus es tan antigua como su descubrimiento, estos ltimos datos alimentan la hiptesis de que las partculas virales pudieran ser fragmentos de ADN o ARN independizados de las clulas, aunque otros autores opinan que los virus no solamente no proceden de estructuras celulares, sino que tienen una funcin vital para la evolucin (Sandn, 1998). En cualquier caso, los virus e incluso las bacterias podran representar un verdadero sistema de mensajera interespecfica, y no nicamente un sistema de transmisin unidireccional. Las consecuencias de esto, obviamente, son importantsimas para la biologa evolutiva. Es incompatible la transmisin horizontal de genes con la teora sinttica? Muchos autores asumen estos mecanismos, incluso los ms complejos, como una fuente ms de variacin (Kidwell & Lisch 1997), sobre la que la seleccin natural trabajara posteriormente del modo habitual, de igual forma que la endosimbiosis (Margullis, 1995). Otros especialistas creen que si la incorporacin de genes nuevos mediante la HGT es algo tan generalizado como algunos datos parecen indicar, cuestionara la teora sinttica en sus propios cimientos, tanto en cuanto al papel de la mutacin como fuente de variacin, como al de la seleccin natural como fuerza modeladora (Sandn, 2005). Sin embargo, muchas de estas

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crticas se basan ms en motivos que podramos llamar filosficos, presentando un rechazo visceral -y habra que decir poco cientfico- al concepto de competencia y seleccin del ms apto sin detenerse en explicar cual sera el mecanismo alternativo de seleccin de toda esta inmensa variabilidad producida por los incansables mensajeros. Particularmente, quiz se trate de un enfoque ms integrador el que la propia Margullis (1995) realiza sobre la simbiognesis -que podra considerarse como la transmisin horizontal total Eventualmente, tenemos que comprender que la seleccin natural opera, no tanto actuando sobre mutaciones al azar, que son a menudo dainas, sino sobre nuevas clases de individuos que evolucionan por simbiognesis por incorporacin de genes o incluso genomas completos. Un burro macho puede ser cruzado con una yegua y producir una mula (mulo si es macho), y un caballo macho puede ser cruzado con una burra y producir un burdgano. Los mulos son extraordinariamente dciles, fuertes y resistentes (al contrario de las mulas que generalmente son intratables), por lo que se consideran unos animales particularmente valiosos a la hora de llevar cargas pesadas durante largas distancias, sobre todo en terrenos montaosos y desrticos; antiguamente solan transportar el agua usada por el servicio de bomberos para apagar los incendios, ya que su desarrollado sentido de la obediencia prevalece incluso sobre el miedo natural al fuego. A esta caracterstica de ser ms resistentes que sus progenitores, los cuales son en este caso especies distintas, se denomina vigor hbrido.

Figura 13-3. La mula, sirve para cargar al ser ms fuerte que el burro. Los burdganos, en cambio, son bastante pequeos y dbiles. Aunque menos comunes, tambin se han conseguido hbridos de asnos domsticos y varias especies de cebras, conocidos como ceburros o cebrasnos. Todos estos hbridos son estriles, ya que las especies del gnero Equus tienen diferente nmero de cromosomas. As, los caballos, que tienen 64 cromosomas, y los burros, que tienen 62, producen cras con 63 cromosomas.

Figura 13-4. El trigo.

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Las gramneas conocidas como "parientes silvestres" del trigo estuvieron expuestas al fro, la sequa, el calor, el anegamiento y todo tipo de enfermedades y plagas. Las especies que hoy sobreviven resistieron esos flagelos y adquirieron una proteccin gentica casi invencible. Ahora una estrategia de pre-mejoramiento recupera este patrimonio gentico para los trigos harineros. Estas gramneas resistentes no son slo parientes del trigo, sino tambin sus antepasados. Los cruzamientos espontneos entre especies diferentes dieron origen a trigos primitivos que los seres humanos comenzaron a sembrar y seleccionar hace miles de aos. Cuando el trigo se domestic, adquiri la capacidad de producir granos ms grandes y numerosos, pero perdi una buena parte de la proteccin gentica duramente ganada por sus antepasados. (http://www.cimmyt.org/whatiscimmyt/AR99_2000Spa/futuro/recuperacion/) El trigo es la planta ms cultivada del mundo, y de las primeras histricamente, posiblemente porque sus granos contienen los cinco nutrientes: carbohidratos, protenas, grasas, minerales y vitaminas. Pero esto es slo un poco de lo que usted debe saber acerca de est cereal. El trigo es probablemente el primer cereal que fue cultivado por la humanidad), se encontraron granos de trigo carbonizados de hace 6,700 aos en la localidad Jarmo (Irak), poblado ms antiguo de los descubiertos hasta ahora y uno de los lugares donde naciera la agricultura. Otra investigacin indica que el lugar de origen del trigo es la actual Etiopa (en el continente africano), el cual se cultivaba en esa zona hace aproximadamente ocho mil aos. Lo cierto es que fueron los griegos los que molieron el grano hasta obtener harina y con ella fabricaron pan, tras ponerla a cocer en hornos diseados para tal fin. Posteriormente, en esta forma de alimento lleg a Egipto y se constituy en elemento esencial de la dieta de sus pobladores, quienes sofisticaron la forma de hacer harina, incorporndole mantequilla, leche, huevos y miel para hacer panes de distintas formas, tamaos y sabores. A Amrica, los trajeron los ingleses a Estados Unidos, y los espaoles a Mxico y el resto de Latinoamrica. El trigo es una planta gramnea de la familia del csped. Presenta espigas que contienen los granos;que a su vez tienen una envoltura o cscara (epispermo), llamada afrecho. El afrecho est formado por seis capas distintas, las cuales son ricas en celulosa, hierro, fsforo, calcio, magnesio, fluor y vitaminas del complejo B. En su interior se encuentra el germen o embrin que contiene protenas, fibra cruda, aceites, vitamina E y B, adems del cido graso llamado linoleico que acta en los casos de exceso de colesterol en la sangre. Un elemento ms que forma parte del trigo es el gluten, compuesto que cuenta con alto contenido de protenas a las que se divide en dos grupos: glutelinas, comunes en todo cereal, y prolaminas, de las que cada grano posee un tipo nico, gliadina. Ahora bien, del trigo se aprovecha todo como unidad o bien por separado. Por ejemplo, la cscara o salvado es excelente proveedor de fibra, protenas, vitaminas y minerales; se puede encontrar en el mercado desde casi entero hasta molido muy fino, y puede mezclarse con diversos jugos de frutas y verduras, o bien ser ingrediente de panes, pastas o galletas. Por otra parte, se llama smola a la trituracin del grano de trigo junto a pequeas cantidades de cscara; se utiliza como pasta para sopa e incluso para postres.

13.1.3.
13.1.3.1.

Poliploidia en el reino vegetal

El maz como especie autotetraploide

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13.2.
13.2.1.

Organismos Genticamente Modificados

Transferencia por Agrobacterium

Agrobacterium es una proteobacteria alpha de la familia Rhizobiaceae, la cual tambin incluye a las fijadoras de nitrgeno que viven en simbiosis con las legumbres. A diferencia de estas, Agrobacterium es un parsito y causa grave dao a la planta afectada (Figura 13-5).

Figura 13-5. Infeccin de Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium tumefaciens es una bacteria que causa en las plantas dicotiledneas unos tumores conocidos como "agallas" o "tumores del cuello", que crecen en la zona donde se unen la raz y el tallo (cuello). Es de notar que Agrobacterium no es ni el nico ni el ms comn causante de tumores en las plantas. Muchos pueden ser causados por insectos o larvas que segregan ciertas sustancias que producen el mismo efecto aparente, sin embargo la capacidad de transmisin de DNA por el Agrobacterium est siendo extensamente explotada en biotecnologa, como medio de insertar genes forneos dentro de las plantas y desarrollar organismos modificados genticamente. Se trata entonces de un vehculo ptimo para operaciones de ingeniera gentica. Entre los transgnicos creados por este mtodo estn las plantas productoras del insecticida Bt, una toxina originalmente producida por el Bacillus thuringiensis. La bacteria se gua por las sustancias que la planta excreta de heridas pequeas, por las que se introduce. Se ubica entonces en los espacios intercelulares y desde all transfiere a las clulas de la planta un fragmento de su material gentico, un plsmido (DNA circular extracromosmico bacteriano) para transferir un segmento conocido como T-DNA, que se integra en alguna zona del genoma de la planta.

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Figura 13-6. Mecanismo de infeccin de Agrobacterium tumefaciens. Este T-DNA insertado por el Agrobacterium contiene genes que provocan la produccin de reguladores del crecimiento vegetal, de lo cual resulta el desarrollo del tumor. El T-DNA tambin contiene genes codificadores de enzimas que causan que la planta produzca aminocidos especializados llamados opinas. Estos son una fuente de energa especfica para A. tumefaciens, pero no para otros organismos (Figura 13-6).

13.2.2. 13.2.3. 13.2.4.

Transferencia por Biobalstica Vectores virales para expresin transiente Legislacin sobre los OGM en Latinoamrica

Marco jurdico de bioseguridad. Situacin Legal

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Ventajas y desventajas de los OGM

Ventajas cientficas para investigacin Ventajas econmicas en su aplicacin Punto de vista del agricultor Punto de vista del consumidor

13.3.
13.3.1.

Divergnicos
Definiciones

Qu es un transgnico?
El trmino transgnico significa la inclusin de un gen extrao a un organismo. Normalmente usamos el prefijo trans cuando atravesamos distancias. Por ejemplo, un viaje trasatlntico es cuando cruzamos un ocano muy grande, mientras que una trans-fusin sangunea es cuando un enfermo recibe sangre de otra persona. Decimos que trans-portamos productos o transmitimos mensajes. En el contexto biotecnolgico, un trans-gnico es cuando se transfiere un pedazo de DNA de una clula a otra. Por ejemplo, introducir el gen de una bacteria a una planta de maz.
La definicin legal de transgnicos no solo esta basado en la tcnica para introducir los genes, sino que adems implica forzosamente que el cientfico estuvo consciente. Cuando los genes se introducen sin la intervencin activa del ser humano, por ejemplo cuando las bacterias absorben por s solas los pedazos de DNA o cuando las agrobacterias del suelo transforman en el campo a las plantas, o cuando los virus infectan a los organismos, entonces no se les llama transgnicas. Por ejemplo, muchos virus se integran en los cromosomas de animales y plantas, pero como no es un proceso que se supervisa por un cientfico en un laboratorio, entonces no se les cataloga como organismos transgnicos desde el punto de vista legal. Sera un poco complicado si considerramos a todos los organismos o clulas que tienen dentro un gen extrao como transgnicos, ya que tendramos que decir que nos hemos vuelto transgnicos cada vez que tenemos una gripa. Es decir, transgnico tiene que ver con el gen extrao y con la tcnica, pero tambin con 'laboratorio'.

Si bien muchos de nosotros hemos escuchado hablar sobre los transgnicos, a veces se trata de opiniones, ms que de noticias o informacin fidedigna. Para formarnos una idea propia sobre un tema, primero es necesario entender todos los trminos y sus definiciones. Si bien ya se dijo lo que es un transgnico, es muy importante notar que el concepto divergnico es similar pero no idntico. La palabra divergnico es ms amplia, ya que adems de los genes extraos tambin incluye las nuevas combinaciones de genes, mutaciones, hibridaciones y dems modificaciones genticas y genmicas. En la definicin del trmino transgnico, no importa si el organismo o el gen es beneficioso o no para el ser humano, siendo la metodologa que se utilizo para introducir el gen la que define a los organismos transgnicos. Por ejemplo, cuando se utiliza una pistola de presin o si se usan agrobacterias para transformar las plantas. Si consultamos la legislacin sobre bioseguridad que se ha implementado en algunos pases, veremos que el comn denominador sobre la definicin de los transgnicos es la tecnologa y procedimientos que se aplican. En otras palabras, las definiciones no dicen que es un transgnico per se, sino ms bien, como se hace un transgnico. Es decir, no importa el resultado, sino el mtodo. Esta forma de definir es fcil y sencilla, pero tambin puede ser un poco ambigua, y a veces hasta problemtica.
Por ejemplo, podramos definir a un automvil como un objeto que se produce en la fbrica de Ford usando la tecnologa de produccin en masa. Muy fcil, o no? Entonces, dnde esta el

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problema? Si somos consecuentes, entonces, si de la Fbrica de Ford sale una bicicleta, de todos modos se le tendra que considerar como automvil, aunque no tenga motor. Al mismo tiempo, lo que se produzca fuera de la fbrica de Ford no se considerara como automviles, aunque tengan cuatro ruedas y motor. Exactamente ese es el problema legal con los transgnicos. Aunque no contengan un transgen sino solo un gen propio en sentido contrario de todos modos se les considera como transgnico. En cambio, el trigo harinero es una planta que contiene cromosomas no solo de una o dos, sino de tres especies diferentes, y sin embargo, el trigo no se considera una planta transgnica, o s?

De dnde viene la palabra divergnico?

La palabra se deriva de diversidad y de gentica. Se parece a la palabra divergencia, que significa una divisin de algo en dos o ms partes. Un organismo divergnico es aquel que contiene una nueva secuencia de DNA o una nueva combinacin de genes. El trmino describe el aumento de la variabilidad biolgica, uno de los procesos bsicos de la evolucin. La diversidad gentica es la base de la riqueza de las selvas tropicales y los ambientes naturales. La diversidad biolgica, adems de ser algo esttico, es un valor prctico ya que al incrementar la flexibilidad de los ecosistemas se disminuyen los riesgos a largo plazo. Es decir, la diversidad es la esencia de la sostenibilidad. La diversidad es algo que se agota por la seleccin natural, y es por ello que tiene que ser constantemente renovada.

En qu se diferencian transgnico y divergnico?

A diferencia de la palabra transgnico, que significa la inclusin de un gen extrao a un organismo, el concepto divergnico es ms amplio, incluyendo las nuevas combinaciones de viejos genes, mutaciones, hibridaciones y dems modificaciones genticas y genmicas. En la definicin del trmino transgnico, no importa si el organismo o el gen es beneficioso o no para el ser humano, siendo la metodologa que se utilizo para introducir el gen a la clula la que define a los transgnicos. En la definicin del trmino divergnico, no importa las condiciones ni los procesos que llevaron a esa nueva diversidad gentica, siendo el resultado final el que determina si un organismo es divergnico o no. Para que se pueda llamar divergnico, se tiene que cumplir los tres requisitos esenciales: 1) nueva diversidad, 2) beneficioso para el ser humano y 3) no estar patentado. Digamos entonces que para algunas personas el hecho de generar plantas hexaploides con miles de genes de especies distintas es algo habitual, mientras que introducir un gen es algo tan extraordinario, que es necesario restringirlos. Ya que es un producto de la fabrica Ford, las autoridades exigen que se cumplan todas las normas y reglamentos de los automviles, aunque se trate solo de una bicicleta. Entre ms lo analicemos, ms nos daremos cuenta de lo absurdo que es la legislacin actual sobre los transgnicos. Aunque el producto de una cruza sexual, una mutacin o una modificacin gentica sea el mismo, el mtodo de obtenerlo es lo que determina si se considera silvestre o transgnico En la definicin de los divergnicos, no importa las condiciones ni los procesos que llevaron a esa nueva diversidad gentica, siendo el producto final el que determina si un organismo es divergnico o no. Para que se pueda llamar divergnico, se tiene que cumplir tres requisitos esenciales: 1) nueva diversidad, 2) beneficioso para el ser humano y 3) no patentado. Nota 1: la definicin legal de transgnicos no solo esta basado en la tcnica para introducir los genes, sino que adems implica forzosamente que el cientfico estuvo consciente. Cuando los genes se introducen sin la intervencin activa del ser humano, por ejemplo cuando las bacterias absorben por si solas los pedazos de DNA o cuando las agrobacterias del suelo transforman a las plantas en el campo, o cuando los virus infectan a los organismos, entonces no se les llama transgnicas. Por ejemplo, muchos virus se integran en los cromosomas de animales y plantas, pero como no es un proceso que se supervisa por un cientfico en un laboratorio, entonces no se les catalogiza como organismos transgnicos desde el punto de vista legal. Sera un poco

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complicado si insistiramos en que cada organismo o clula que tiene un gen extrao es transgnica, ya que tendramos que decir que nos hemos vuelto transgnicos cada vez que tenemos una infeccin viral. Es decir, transgnico tiene que ver con el gen extrao y con la tcnica, pero tambin con 'laboratorio'. Para los organismos divergnicos, lo que importa es el resultado final y no la tcnica. Tampoco importa el lugar en que se genere, ya sea el laboratorio o el campo, sino que sea libremente disponible para as aumentar la diversidad y evitar los monopolios. Tarea 13-1: Elabora un ensayo en dos partes representando dos opiniones opuestas. Primero discuta las razones por la que el trigo se debera considerar una especie completamente normal desde el punto de vista gentico. En la segunda parte explica las razones por las que el trigo si es especial ya que combina los genomas de especies diferentes. Tarea 13-2 Elabora otro ensayo en donde de su opinin sobre la siguiente cuestin: Es un proceso natural o un proceso artificial cuando el DNA de especies diferentes se combina en una misma clula? Haga una bsqueda bibliogrfica para recabar evidencia cientfica que sustente sus conclusiones de manera objetiva y slida. Cada estudiante puede leer su ensayo en clase y despus discutir las diferentes opiniones en grupo con su maestro. Respeten los diferentes puntos de vista, pero tambin sean objetivos y crticos con las premisas y la evidencia que sustenta cada argumento (fundamentos).

Comentario [ATF21]: Ya esta en el primer recuadro del subtema

Qu es un divergnico?
Un organismo divergnico es una especie mejorada que contiene genes diversos. Estos genes deben de ser para caractersticas beneficiosas para el ser humano y el medio ambiente. Pueden ser microorganismos, animales o plantas. Los organismos divergnicos pueden ser creados a partir de mutaciones, cruzas y mejoramiento gentico clsico, as como tambin por hibridaciones y otras tecnologas innovadoras para combinar los genes o genomas deseados en un contexto y una configuracin beneficiosa. Los organismos divergnicos estn definidos por tres caractersticas esenciales: nueva diversidad gentica beneficio para el ser humano sin restricciones de patentes

El requisito principal es que el organismo contenga una nueva diversidad gentica, ya sea una nueva secuencia de ADN, un nuevo gen, un nuevo alelo, o una innovadora combinacin de genes o genomas. Lo importante es el resultado final a nivel del organismo, independientemente de la metodologa o la tecnologa que se utiliz. Es decir, la diversidad gentica puede ser generada por cruza natural o artificial, por hibridacin sexual o somtica, por mutacin puntal o genmica, o por ingeniera gentica o cualquier otra metodologa novedosa. Igualmente, la reacomodacin de antiguos genes o una nueva combinacin de viejas secuencias de DNA tambin pueden ser consideradas como diversidad gentica. Por esa razn podemos decir que los organismos divergnicos representan una nueva diversidad biolgica en nuestro planeta. La segunda caracterstica que distingue a los divergnicos de los dems organismos, es el beneficio que generan para el ser humano. Para que se merezcan llamar divergnicos tienen que ser ms tiles y eficientes que los organismos silvestres, contribuyendo as a una mejor satisfaccin de las necesidades humanas, ya sean de alimentacin, estticas, ecolgicas, tecnolgicas o mdicas.

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La tercera caracterstica de los divergnicos es que no pueden ser monopolizados ni su uso puede ser restringido por corporaciones privadas. Por definicin, los organismos divergnicos llevan a un aumento de la diversidad y no a su disminucin como en el caso de los monocultivos agrcolas o monopolios comerciales. Ningn patente puede restringir la libre reproduccin, distribucin e inclusin de los organismos divergnicos en subsecuentes programas de mejoramiento gentico. Es decir, todos los agricultores de todos los pases del mundo pueden usar las semillas divergnicas para replantarlas o cruzarlas libremente. De esta forma, los divergnicos aumentan el nmero de variedades y de especies tiles y de libre acceso a todos los seres humanos.
A veces la ciencia nos revela realidades tan especiales, que es necesario inventar nuevos trminos y metforas para describir exactamente los fenmenos tecnolgicos. Quin hubiera entendido el significado de telfonos celulares, discos duros, cmaras digitales, rayos lser, internet, quimioterapia o viagra hace tan solo 50 aos. El trmino transgnico surgi muy temprano al inicio de los trabajos moleculares con bacterias y DNA en la dcada de los sesenta. Sin embargo, la palabra 'transgnico' es limitada, y con el tiempo la realidad ha superado a su definicin. El nuevo trmino divergnico pretende resaltar la importancia de la diversidad gentica. La diversidad no slo es sustentable, sino que tambin representa una fuente de bienestar colectivo. Es una riqueza biolgica que debe de estar al alcance de todos los seres humanos de este planeta.

13.3.2.

Ejemplos

Un ejemplo de una planta divergnica que no se considera transgnica por las leyes de Bioseguridad es el trigo moderno. El trigo que conocemos comnmente se gener a travs de la combinacin de los genomas de tres especies diferentes de cereales. Surgi por medio de cruzas sexuales, de mutaciones genmicas y un proceso extensivo de seleccin. Y aunque solo se han identificado tentativamente a las variedades parentales, el proceso de modificacin no fue consciente ni planeado, sin propsito o una metodologa definida, el producto final, el trigo hexaploide con el nuevo genoma AABBDD, es sumamente beneficioso para el ser humano. Y como no est patentado, entonces se cumplen los tres requisitos para la definicin de los divergnicos. Casi todas las plantas tiles se han generado a travs de mutaciones y recombinaciones de genes por cruzamientos. Sin embargo, tambin se pueden generar plantas divergnicas sin involucrar procesos sexuales. Por ejemplo, los injertos son una combinacin somtica y fisiolgica entre dos especies parecidas, pero con genomas diferentes. Los injertos unen las ventajas de la raz de una planta, con los beneficios del tallo de otra variedad o especie. Por ejemplo, el tallo del limn sin semilla se puede injertar en el tronco de la naranja cida. De esta forma la raz vigorosa de la naranja ayuda a producir un rbol que da ms limones. Otro ejemplo, es el injerto de la vid europea con la vid americana. La ventaja de la variedad americana es que su raz es resistente a ciertos patgenos del suelo, mientras que las variedades europeas producen excelentes uvas dndole una alta calidad al vino. De hecho, sin los injertos, la vinicultura en Europa sera imposible por culpa de las plagas del suelo. Dado a que los injertos significan un aumento de la diversidad gentica por utilizar dos genomas complementarios para hacer un solo individuo, adems de que son beneficiosas para el uso humano y no son patentables, los injertos son plantas divergnicas. Considerando la definicin que es simple pero tambin muy rigurosa, existen muchas plantas divergnicas, casi tantas como plantas que conocemos como domesticadas. Un ejemplo de una planta transgnica que si es divergnica, es el arroz supervitamnico (golden rice). El arroz dorado contiene nuevos genes que son responsables de la sntesis de betacaroteno (provitamina A). Las semillas de arroz que son normalmente blancas, adquieren un color anaranjado como la zanahoria. En el arroz dorado de la primera generacin se introdujeron

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genes bacterianos, mientras que en el arroz de segunda generacin se usaron algunos genes del maz. Los genes originales fueron introducidos al arroz a travs de la ingeniera gentica. Por haberse usado esa metodologa, el arroz dorado se considera como una planta transgnica. Esta planta novedosa ha resultado ser beneficiosa para el ser humano, sobre todo por su valor nutritivo y su aporte de vitaminas en los pases que tienen altos ndices de ceguera debido a la falta de vitamina A en su dieta. Por otro lado, los agricultores de bajos recursos pueden usar el arroz dorado sin pagar regalas. El uso y reproduccin de sus semillas no esta limitada por las empresas (Solo se aplican ciertas restricciones a los agricultores que obtengan ganancias superiores a los 10 mil dlares). En trminos prcticos podemos decir que el arroz dorado no esta patentado. Con esto se cumplen los tres requisitos, de forma que tambin podemos hablar de arroz divergnico. Tambin existen ejemplos de plantas transgnicas que no son divergnicas. No por que se produjeron con ingeniera gentica ya los convierte automticamente en divergnicos. Primero tiene que demostrarse que son tiles para el ser humano, y adems no deben estar restringidas con patentes. Aunque es difcil determinar si una planta es beneficiosa o no, porque cada quien puede tener criterios diferentes, el hecho de no ser patentado es fcil de controlar. Por ejemplo, el maz, algodn y la soja Roundup son plantas transgnicas porque se crearon usando tcnicas moleculares para hacerlas resistentes a ese herbicida. Ests variedades transgnicas no generan valor agregado para el consumidor, pero si traen ventajas para los agricultores porque les ahorra trabajo y dinero para mantener sus cultivos libres de malezas. Sin embargo, las variedades roundup estn patentadas, de forma que los agricultores no tienen permiso de conservar las semillas para los siguientes ciclos. Esto obliga a los campesinos a comprar continuamente semilla nueva y cara. Adems, como los mismos genes estn patentados, los mejoradores no pueden usar esas plantas como padres para sus cruzas, ya que cualquier variedad que contenga esos genes pasa a ser propiedad de la compaa. Ejemplos: Planta silvestre Roundup Trigo, Injertos Golden Rice Transgnica No Si No Si Divergnica No No Si Si

Por ejemplo, los microorganismos divergnicos producen medicinas para enfermedades como la diabetes, o aditivos que mejoran nuestra digestin y nutricin, o enzimas que nos ayudan eliminar la mugre de la ropa o nos permiten combatir los desastres ecolgicos como las contaminaciones de petrleo en el mar. Por otro lado, las plantas divergnicas producen frutos de mayor calidad, requieren de menos agua y fertilizantes para crecer, y contienen ms vitaminas para la alimentacin y la salud. Finalmente, los animales divergnicos producen huevos, leche y lana mejorada, as como protenas dietticas y teraputicas, u rganos como hgados o riones para trasplantacin en humanos enfermos.

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13.3.2.1.

Hbridos

Figura 13-7. Origen genmico del Trigo Un organismo diploide tiene el doble, mientras que un tetraploide tiene cuatro y un hexaploide seis veces el nmero de cromosomas de un organismo haploide. Por ejemplo, la cebada es diploide, mientras que el trigo durum es tetraploide y el trigo harinero es hexaploide. Lo interesante del trigo es que contiene el genoma de tres especies que generalmente no se cruzan en la naturaleza.

13.3.2.2.

Injertos

En unir una parte de una planta a otra. El resultado es un individuo autnomo formado por 2 plantas diferentes. Es posible hacer injertos mltiples, es decir, injertar ms de una yema o pa sobre un mismo patrn. Por ejemplo, para obtener un manzano con varias variedades de manzanas; un rosal con flores de distintos colores; Datura arbrea con flores blancas y rojas a la vez. El inconveniente es que la vida de las plantas con injertos mltiples se acorta bastante y puede llegar a durar slo 2 3 aos; depende. Por ejemplo: casi todos los rboles frutales se producen cultivando un patrn a partir de semilla y a l se le injerta una yema de la variedad deseada. Si te fijas un poco por encima del cuello podrs observar un pequeo abultamiento o curvatura; ese es el punto donde se injert la yema. (Figura 13-8).

Figura 13-8. A: Injerto - B: Patrn Por tanto, la mayora de rboles frutales que vemos son en realidad 2 plantas: las races pertenecen a una especie o variedad y el tronco y las ramas pertenecen a otra.

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Punto de injerto. Algunos frutales no hay necesidad de injertarlos, como el olivo o la higuera. Los rosales que compramos vienen casi todos injertados. El injerto es un mtodo de multiplicacin que mantiene las caractersticas de una variedad de fruta o de planta ornamental. Lo he explicado ms arriba. Es decir, que una variedad de fruta de calidad o un rbol con una floracin ornamental, si queremos que la descendencia tenga estas caractersticas con exactitud, se multiplica por esquejes, acodo o injerto; no por semilla, donde la descendencia suele ser variable. 2. Permite aprovechar las buenas caractersticas que aportan los patrones. El patrn o portainjerto pone las races y ofrece una mayor resistencia a suelos malos, calizos, encharcados, con hongos, plagas... depende del patrn que sea

Figura 13-9. Ejemplos de injertos

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13.3.2.3.

Endosimbiosis

Figura 13-10. Clula vegetal mostrando diferentes organelos y subcompartimentos

13.4.

Ejercicios de Discusin

Existe una gran polmica en torno a la biotecnologa. Algunas personas dicen que los transgnicos atentan contra la biodiversidad. Que las plantas mejoradas van a acabar con las plantas tradicionales. Dicen que la ingeniera gentica es mala y por eso quisieran prohibirla. Sin embargo, los cientficos dicen que los hechos demuestran lo contrario. La biotecnologa crea nuevas combinaciones de genes, y por eso podemos decir que se incrementa la diversidad. La biotecnologa es una forma de creatividad gentica que permite generar nuevas variedades de plantas y animales. A pesar de lo que puedan opinar los dems, lo importante es lo que opina cada uno. No dejemos que los dems decidan por nosotros. Es mejor estar bien informados para as tomar la decisin que mas nos convenga a todos. En esta seccin incluimos una serie de preguntas con un enfoque ms de discusin y desarrollo. En algunos casos incluimos algunos ejemplos de respuestas a las diferentes preguntas. La intencin es fomentar la capacidad crtica del lector en torno a los debates actuales sobre la biotecnologa. Un investigador que pretenda hacer mejoramiento gentico no podr ignorar el contexto econmico, ecolgico, social y filosfico en torno a las preguntas polmicas de la ingeniera gentica. Tarea 13-3 Cmo ser la agricultura del futuro? Podran haber una con ms biologa y menos qumica? Ejemplo:
Tal vez no lo podemos predecir a ciencia cierta. Lo que si podemos decir es que las plantas mejoradas son la base de la agricultura moderna, y seguirn siendo importantsimas en la agricultura integral, asegurando as la alimentacin mundial. Tal vez si podamos decir que las plantas divergnicas seran una parte cada vez ms importante de la agricultura moderna

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Tarea 13-4: Podramos usar las plantas divergnicas en la agricultura orgnica del futuro? Deberamos? Haga un ensayo contestando estas preguntas. Ejemplo:
Si la evidencia indicara que las mejoras genticas permiten cultivarlas con menos fertilizantes, insecticidas y qumicos, entonces, porqu no? Al ser resistentes a herbicidas de bajo impacto ecolgico tambin permiten el cultivo "cero labrado" con un mnimo requerimiento de movimientos de tierra y el correspondiente ahorro de maquinaria agrcola pesada y consumo de petrleo. Esta prctica agrcola tambin reduce la erosin del suelo y la prdida de la fertilidad de los campos. Adems, al contener mayor cantidad de vitaminas y crecer ms rpido, stas plantas no slo son ms saludables y nutritivas, sino tambin ms eficientes. Esto beneficia tanto al ser humano como al ambiente, ya que el incremento del rendimiento permite dedicar menos superficie para la agricultura, ayudando as a conservar las reas naturales.

Tarea 13-5 Prepare un ensayo sobre los organismos genticamente modificados en Mxico. Exponga los diferentes puntos de vista ya sea como: empresario, poltico, agricultor, ambientalista, consumidor y cientfico. Tarea 13-6 Los organismos Divergnicos son Enemigos o Aliados? Organice un debate entre sus compaeros de clases. Tarea 13-7: Algunas personas afirman que es una necesidad tica y moral, la de tomar las medidas tcnicas necesarias para impedir que el hambre y la pobreza se generalicen ms en nuestro planeta. Sin la diversidad y la gentica, no podremos aumentar la eficiencia ni sobrevivir a largo plazo. Podramos progresar sin innovar? Es necesaria la ingeniera gentica? Haga un ensayo contestando las preguntas anteriores. Ejemplo:
La poblacin mundial sigue creciendo y aumentando, pero los recursos naturales son limitados y estn disminuyendo rpidamente. La creatividad cientfica ha sido uno de los pilares de nuestra civilizacin, y hoy ms que nunca tenemos que aprovecharla al mximo. Los microorganismos y los animales divergnicos ya nos estn ayudando a superar algunos retos. Usamos sus productos diariamente en nuestros jabones, ropa y medicinas. Las plantas verdes siempre han sido y seguirn siendo nuestras aliadas. Aprovechar al mximo las ventajas que nos pueden ofrecer las plantas divergnicas no solo es vital para nuestro bienestar, sino que es una tarea para cual todas las personas pueden contribuir con su granito de arena.

Tarea 13-8 Cmo podramos obtener ms organismos divergnicos? Platique con sus compaeros. Ejemplo:
Los organismos divergnicos no son ciencia ficcin. Son usados a diario en todo el mundo. Aunque ya constituyen una parte integral de nuestra civilizacin, lo novedoso es que en las ltimas dcadas hemos desarrollado herramientas ms rpidas y mejores para generar organismos divergnicos. La investigacin biolgica ha generado conocimiento valiossimo contribuyendo as al avance tecnolgico. La historia de la humanidad nos demuestra que el progreso cientfico conlleva al bienestar social. Sin embargo, a veces los cambios han sido tan rpidos, que no todas las personas se logran adecuar. Especialmente la biotecnologa ha progresado de forma tan espectacular, que a veces no ha podido comunicar sus resultados de una forma fcil y sencilla. Cuando la poblacin no entiende de qu se trata, surgen los temores. Esas inseguridades se convierten en angustias y al final en oposiciones a las nuevas tecnologas. Es bueno ser cauteloso, pero no debemos dejar que el miedo nos paralice y nos

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imposibilite progresar. Por lo menos hay que ser tan inteligentes como para escuchar las nuevas ideas, para as usar la lgica y la razn para juzgar objetivamente.

Tarea 13-9 Podran llegar a ser peligrosos los organismos divergnicos? Trate de entender los puntos de vista de todos sus compaeros. Ejemplo:
Es normal que existan reservas acerca de las cosas que no nos son familiares. Tal vez pensemos que las desconozcamos, pero en realidad los divergnicos nos han acompaado durante muchos aos. De hecho, ya nos hemos acostumbrado a las ventajas de esos organismos. Por ejemplo, algunos jabones para la ropa contienen enzimas producidas por bacterias recombinantes. Son aditamentos que nos ayudan a lavar mejor al mismo tiempo que ahorra energa porque no es necesario usar temperaturas tan altas como lo hacan nuestras abuelas. Nos deberamos alarmar por algo as? Algunas personas dicen que si. Muchas pertenecen a grupos polticos que se han querido hacer famosos por los escndalos. Ha creado una angustia alrededor de la modificacin gentica. El miedo es similar al de los monstruos, fantasmas y demonios. De nios nuestros padres nos ensearon que el pnico a lo que desconocemos es ms perjudicial que benigno. Los cientficos y la sociedad deben de ver la realidad de frente y sin prejuicios. Podran ser peligrosos los jabones modernos, el trigo harinero o el limn sin semillas? Tal vez si lo puedan ser, pero tambin es probable que pueden ser mucho mas tiles de lo que son dainos. El peligro no deriva de como se genere la diversidad gentica, sino del resultado final. Por ejemplo, pensaramos que un becerro que nace por fertilizacin in vitro sera mas peligroso que el que nace por parto natural? Tal vez no dependa de como naci, sino de que si es animal bravo o manso. Es necesario que se monitore constantemente la calidad y la utilidad de esos organismos para asegurar que todos nuestros alimentos sean saludables. Sin embargo, este control no se debe restringir a los productos que se generen con una metodologa especfica, sino que se debe aplicar a todos los que contengan una nueva diversidad gentica. Por ejemplo, una nueva variedad de papa debera someterse a todos los controles de calidad aunque halla sido generada por el mtodo tradicional, y no solo si fue por ingeniera gentica. En la mayora de los casos las metodologas modernas son ms precisas y eficientes.

Tarea 13-10 La transferencia de genes es un fenmeno nuevo dentro de la evolucin normal? Discuta objetivamente con sus compaeros. Ejemplo:
La teora de la evolucin nos invita a recordar los procesos naturales que permitieron que una bacteria se convirtiera en una clula eucaritica, un organismo multicelular, un pez y despus en un mamfero. La transferencia de genes entre bacterias, plantas y animales ha sido uno de los requisitos de la evolucin. No hay duda de que los procesos naturales pueden generar alteraciones genticas sorprendentes, la diferencia con respecto a la biotecnologa no son las modificaciones per se, sino mas bien la rapidez. Algunos eco-activista tal vez no estarn de acuerdo. Ellos diran que es normal que entre especies de cereales como el trigo exista un intercambio de genes, pero es algo totalmente distinto si de una bacteria se saca un gen para metrselo a una planta o a un animal. Son especies muy diferentes que en la naturaleza nunca intercambiaran genes. Y sin embargo, se equivocan, ya que eso es exactamente lo que pasa en la naturaleza. Slo basta mencionar como las plantas se volvieron verdes al adquirir genes de las cianobacterias. Vindolo desde esta perspectiva ms amplia, diramos que los mtodos 'artificiales' que se aplican en la biotecnologa no son nada nuevos, sino son una combinacin de procesos enteramente naturales. En realidad podemos decir que las modificaciones que se hacen actualmente con la ingeniera gentica son solamente una mnima parte de lo que normalmente pasa en los ecosistemas

Tarea 13-11

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Discuta crticamente la siguiente cuestin. A quin le dara usted ms credibilidad? A una organizacin poltica como Greenpeace o los cientficos que tienen experiencia directa con la biotecnologa? Asuma una posicin y defindala ante sus compaeros de clases Ejemplo:
Pareciera que algunas personas han descartado el uso de ingeniera gentica para su aplicacin en una agricultura ms ecolgica. Pero, por qu no usar plantas mejoradas si los hechos demostraran que son seguras, eficientes, y traen ventajas para la salud, la ecologa, y la agricultura? Si usamos estircol y substancias txicas como sulfato de cobre para crecer verduras con denominacin orgnica, por qu nos deberamos negar a comer genes en nuestros tomates? La agricultura orgnica usa Bacilos como control biolgico. Si se pueden usar extractos que contienen todos los genes de esas bacterias, por qu no se puede usar una planta mejorada que slo contenga uno de esos genes insertados en su genoma? Por qu comer miles de genes no es malo, pero comer uno solo si es malo? Estamos dispuestos a considerar la posibilidad de que las nuevas plantas mejoradas sean ms saludables que las tradicionales? Deberamos cerrar nuestros ojos antes de tener todos los datos? Estaramos dispuestos a liberarnos de las ideologas para analizar la ingeniera gentica desde un punto de vista racional? Las plantas modernas pueden ser superiores y ms saludables que las plantas tradicionales. Por ejemplo: Antes de ser llevadas a Europa por los espaoles, las papas silvestres eran mucho ms venenosas. De hecho, las papas pertenecen a una de las familias de plantas ms venenosas, las solanceas. Hoy en da, las papas se han mejorado de forma que podemos comerlas cocinadas. Sin embargo, la tarea de mejoramiento no ha acabado, ya que los tubrculos todava son txicos si son consumidas crudos o verdes. Por otro lado, algunas plantas se han mejorado considerablemente por ingeniera gentica. Por ejemplo, se ha demostrado que el maz Bt contiene menos contaminaciones por insectos, hongos y micotoxinas. Estos ejemplos nos demuestran que una planta mejorada como el maz Bt puede ser mucho ms segura, mientras que al comer una planta salvaje como la papa podramos hasta morir.

Tarea 13-12 Es normal o no es normal insertar genes en otra especie? Disctalo con sus compaeros. Ejemplo:
Para algunas personas el hecho de generar plantas hexaploides con miles de genes de especies distintas es algo habitual, mientras que introducir un solo gen es algo tan extraordinario, que es necesario restringirlos. Ya que es un producto de la fabrica Ford, las autoridades exigen que se cumplan todas las normas y reglamentos de los automoviles, aunque se trate solo de una bicicleta. Si lo analizamos a fondo, nos damos cuenta de que la legislacin actual sobre los transgnicos es algo absurda en ciertos puntos. Aunque el producto de una cruza sexual, una mutacin o una modificacin gentica sea el mismo, el mtodo de obtenerlo es lo que determina si se considera silvestre o transgnico.

Tarea 13-13 Es bueno o es malo comer DNA? No es peligroso insertar genes de bacterias al maz, Qu pasa cuando nos comemos las tortillas? Asuma una posicin y defindala ante sus compaeros de clases Ejemplo:
Durante nuestra evolucin como seres vivos hemos comido plantas con todo su ADN, sin que alguna vez un gen vegetal haya tenido un efecto adverso en nuestro genoma. El ADN est presente en todas las clulas vivas. Comerlo no es algo peligroso sino es algo muy nutritivo. Es tan bueno que se ha empezado a usar en algunas novedosas cremas faciales y productos cosmticos. En realidad, la modificacin gentica no es ningn invento reciente del hombre sino es algo muy antiguo. La transformacin de bacterias con pedazos externos de ADN es un proceso comn de la evolucin. La introduccin de genes a las plantas es un proceso natural que llevan a cabo las bacterias del suelo. Aunque no nos habamos dado cuenta, las agrobacterias, virus y retrotransposones lo han estado haciendo desde hace millones de aos.

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Tarea 13-14. Busque otras analogas o discusiones sobre nuevos avances cientficos o tecnolgicos, y cmo se han visto envueltos en la polmica. Proponga una analoga en donde se vea reflejada la discusin de los transgnicos y divergnicos, con su propuesta. Finalmente defienda su postura sobre los transgnicos y divergnicos. Algunas pginas que puede consultar son: http://www.elmundo.es/elmundo/2009/02/18/ciencia/1234974212.html http://www.elmundo.es/mundodinero/2007/01/18/economia/1169118808.html http://www.ecoportal.net/content/view/full/34967 http://www.tierramerica.info, http://www.finanzas.com/noticias/empresas/2009-02-12/91032_paris-cancelo-maiz-razonesecologicas.html http://www.econsulta.com/index.php?option=com_content&task=view&id=22994&Itemid=181

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14.
14.1.

Gentica de Poblaciones
Las leyes de Mendel

Explicacin breve de las 3 leyes de Mendel. Ejemplo de los chcharos. 1) Homogeneidad de la F1 2) Segregacin en la F2. Porcentajes de segregacin 3:1 3) Independencia de los genes. Excepcin: ligamiento de genes
Blanca aristas speras Negra aristas lisas

P0

R R

B B Meiosis

b R

B r

Fecunda cin

F1
Negra spera

Meiosis en el espermatozoide B b R r

B R

BBRR

BBRr Negra spera

BbRR Negra spera

BbRr Negra spera

B R

Negra spera

Progenie F2 Segregacin

BBRr

BBrr Negra lisa

BbRr Negra spera

Bbrr Negra lisa

Meiosis en el vulo

Negra spera

BbRR

BbRr Negra spera

bbRR Blanca spera

bbRr Blanca spera

9:3:3:1

Negra spera

BbRr

Bbrr Negra lisa

bbRr Blanca spera

bbrr Blanca lisa

Negra spera

Figura 14-1. Ejemplo de segregacin mendeliana con dos genes independientes. Los alelos son completamente recesivos o dominantes. Los padres son homocigotos y la F1 es toda homognea. La segregacin de la F2 es de 9:3:3:1

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Tarea 14-1. Considere tres guisantes amarillos, redondos, etiquetados A, B y C. Cada uno fue cultivado en una planta y luego se cruz a una planta cultivada de un guisante verde, arrugado. Exactamente fueron 100 guisantes de cada cruza y fueron clasificados en clases fenotpica como sigue: A 51 amarillo, redondo 49 verde, redondo B 100 amarillo, redondo. C 24 amarillo, redondo 26 amarilla arrugado. 25 verde, redondo 25 verde, arrugado. Cules son los genotipos de A, B y C? Puede resolver ms problemas en el libro modern genetic analysis de Griffiths et al o del libro Gnetica, serie Schaum de W.D. Stansfield.

14.2.

La gentica de poblaciones clsica

Hay que tener en cuenta que gran parte del marco terico de la evolucin y la gentica surgi en una poca anterior al descubrimiento del DNA como molcula portadora de la informacin biolgica. Solo hasta despus de 1940-1953 fue cuando se supo que el DNA era tan relevante para la herencia. Antes se pensaba que las protenas eran las responsables. En ese entonces se pensaba que el DNA era un polisacrido montono y demasiado sencillo como para ser portador de una informacin tan compleja. En la dcada de los 70s surge la biologa moderna con las herramientas del DNA recombinante. En 1988 se desarrolla la metodologa de PCR, y eso le da un gran impulso a la gentica molecular (antes solamente exista la gentica clsica). La teora sobre la gentica de poblaciones es algo antigua, pero sus principios bsicos son los mismos an hoy en da.

14.3.

Ley de equilibrio Hardy-Weinberg

Una poblacin no solo se puede ver como un nmero de individuos, cada uno con un determinado genotipo (combinacin de dos alelos en organismos diploides), sino que del punto de vista global (no individual) tambin puede verse como una poblacin de alelos con determinada frecuencia. A esto se le llama pool gentico. Para los mejoradores genticos el enfoque suele ser la poblacin (queremos que todos los individuos sean buenos). Si nos quedamos con un solo individuo, despus no tendremos diversidad gentica y no podremos continuar haciendo mejoramiento. Recordemos que la diversidad se forma por medio de mutaciones y recombinacin (ver capitulo 2). La seleccin por si sola no permite avance gentico ms all de la curva de distribucin inicial (Griffiths, et al 2004). Para el mejoramiento es necesario tener el conocimiento de la gentica mendeliana en la poblacin y no solo del individuo. Cuando hablamos de frecuencias gnicas o fenotpicas nos puede interesar la disminucin de una determinada frecuencia gnica, por ejemplo, de un homocigtico recesivo que causa un defecto o una enfermedad. Ahora todo lo analizaremos en poblaciones (alelos y fenotipos) y veremos cmo se transmiten de generacin en generacin. Ejemplo de los chcharos: Tenemos dos fenotipos; (gg) = amarillo, el resto = verde. Contando individuos podemos determinar frecuencias, pero a veces no tenemos el conocimiento exacto del genotipo, slo del fenotipo (porque no podemos discriminar entre GG y Gg). Asumiendo una

430 serie de premisas como que los individuos se cruzan de forma aleatoria2 podemos usar entonces la frmula binomial (Ley de Hardy Weinberg): Formula Binomial:
1 = ( p + q) 2

1 = p2 + 2pq + q2

Si determinamos el nmero de individuos amarillos de una muestra representativa de la poblacin, podemos estimar el valor para la frecuencia genotpica de los amarillos homocigticos recesivos (gg) que es q2. Con el valor de q podemos estimar la frecuencia de p que sera p = 1 q (asumiendo que en total solo hay dos alelos y que todos los alelos que no son q tienen que ser p). Usando esos dos valores se puede calcular la frecuencia de los heterocigotos (Gg) y homocigotos (GG).
1 = ( p + q) 2

GG = p 2 Gg = 2 pq

Frmula binomial para inferir las frecuencias gnicas en una poblacin. Esto se utiliza a nivel de poblaciones, por ejemplo cuando queremos estimar el nmero de portadores potenciales (heterocigotos) de una enfermedad que solo se observa en estado recesivo.

Cuando los alelos son igual de frecuentes en una poblacin (p = q = 0.5), entonces tenemos el caso tpico de la gentica de Mendel, en donde la formula binomial nos dice que la frecuencia de los individuos se comporta como 1:2:1 a nivel de genotipo o 3:1 a nivel de fenotipo. Ejemplo carcter multiallico: El modelo se complica cuando el carcter es multiallico (ms de dos alelos). Es el caso de los grupos sanguneos donde hay tres alelos, ABO y seis posibles genotipos, pero tan slo cuatro fenotipos. Frmula binomial para 3 alelos: 1 = ( p + q + r ) 2 p2(AA) + 2pq(AB) + 2pr(A0) + q2(BB) +2qr(B0) + r2(00) = 1 En ese caso, primero nos tenemos que preguntar: Hay algn fenotipo que se le pueda asignar un genotpo especfico? S. Podemos decir que los 0 son homocigotos recesivos 00 y los AB son heterocigotos codominantes AB; Fenotipo A Fenotipo B Fenotipo AB Fenotipo O = (AA) + (A0) = (BB) + (B0) = (AB) = (00) = p2 + 2pr = q2 +2qr = 2pq = r2

Ejemplo: En una ciudad hay 64% de personas con grupo sanguneo O y 1% de personas con grupo sanguneo AB. Asumiendo que la poblacin se encuentra en equilibrio de Hardy-Weinberg calcule el porcentaje de personas con grupo sanguneo B y A. Forma de resolver: En realidad con estos datos no podremos distinguir entre el grupo A y el B, pero primero hagamos los clculos para las probabilidades r, p, q y despus asumamos que el grupo sanguneo A es mas frecuente que el grupo B. De los datos mencionados sobre los individuos 00 y AB sabemos que (r2=0.64) y (2pq=0.01). Con esto calculamos que (r=0.8) y que (q=0.005/p). Substituya la frmula (1= p + q + r) con los valores (r y q) y despus resuelva todo para p. Usando la solucin a la formula binomial obtenga que p=0.1707 (primera solucin cuadrtica) o tambin p=0.02903 (segunda solucin cuadrtica). Como dijimos que A es ms frecuente que B, entonces el valor de p=0.1707 corresponde a A y el valor de q=0.02903
Hay que asumir una serie de premisas: Apareamiento aleatorio. La probabilidad de que un vulo o esperma tenga tal o tal genotipo esta determinado por la frecuencia gentica de los alelos en la poblacin. Se asume que todos los vulos y espermas tienen la misma viabilidad y que los individuos no tienen preferencias sexuales, sino que escogen a su pareja al azar.
2

431

corresponde a B. Usando el primer valor de p confirme que el valor de q=(0.05/p)=0.02903. Ahora si, con esos valores calcule las frecuencias de todos los genotipos posibles. Respuestas: r=0.8 , p=0.1707, q=0.0293 AA= 2.91%, AB=1% , AO=27.31%, BB=0.09%, BO=4.69%, OO=64% Los genotipos AA y A0 tendrn el fenotipo A; y los BB y B0 sern B. Con ello podemos decir que los grupos sanguneos esperados en esa poblacin sern de: A= 30.23%, AB=1%, B=4.77%, O=64% Tarea 14-2: Haga una encuesta en su saln de clases: Qu grupo sanguneo tiene cada alumno? Usando esos datos calcule las frecuencias de los fenotipos AB y O. Con esos valores que corresponden a (r2) y (2pq) use las formulas binomiales para calcular el porcentaje de genotipos AA, AO, BB y BO. Compruebe si su saln de clases se encuentra en equilibro de Hardy Weinberg. Para hacer esto debe comparar el valor que estimo por medio de la frmula binomial para los genotipos AA y AO, con el valor real observado de alumnos con grupo sanguneo A (recuerde que el fenotipo A es la suma de los genotipos AA + AO). Discuta posibles razones por la que los valores calculados para los grupos sanguneos A y B puedan ser diferentes a los observados. * En realidad siempre hay factores que cambian las frecuencias gnicas en la poblacin y a la larga se traducen en cambios fenotpicos. Cules son esos factores?: Mutaciones, migraciones, seleccin natural, seleccin artificial, preferencias sexuales, viabilidad de los gametos, deriva gentica, etc. Cuando el nmero de individuos analizado es pequeo, el azar juega un papel importante y los resultados pueden no ser los esperados. Se dan cambios genticos de generacin a generacin por el nmero tan reducido de individuos (efecto de cuello de botella), lo que hace que a la larga las frecuencias genticas cambien de forma impredecible por el factor del azar.

14.3.1.

Ejemplos de aplicaciones de la Ley de HardyWeinberg

Equilibrio en cromosomas autosmicos: Asumiendo que se cumplen los anteriores requisitos de equilibrio; y que se tienen unas determinadas frecuencias genotpicas de los alelos dominantes. Para que esto sea as es necesario que en la poblacin ninguno de los anteriores factores tenga un papel importante. Si hay mutacin y migracin estos clculos se complican. Bajo esas circunstancias no se podr inferir las frecuencias genotpicas a partir de frecuencias gnicas. En esta ley las frecuencias genotpicas se mantendrn estables generacin a generacin si no hay factores que varen las frecuencias gnicas y por tanto, las genotpicas. Para el caso que analicemos podemos preguntarnos: Se cumple lo que dice Hardy-Weinberg? Est en equilibrio Hardy-Weinberg? Si la respuesta es que no, nos debemos preguntar por qu no se cumple: Por mutaciones, migracin, azar por poblacin pequea, etc Aplicaciones de la ley de Hardy-Weinberg: Inferir el nmero de individuos portadores de una enfermedad. Conociendo los individuos que la tienen (dominantes), sabremos sus frecuencias y podremos calcular los portadores recesivos si se cumple la ley de Hardy-Weinberg. Alelos ligados a cromosomas sexuales, por ejemplo el cromosoma X: En el caso de los genes ligados al cromosoma X es necesario una segunda generacin para llegar al equilibrio porque la madre contribuir con dos alelos y el padre solo con uno. El clculo de HW no ser igual; en hembras s (pq son diploides) pero no en machos (ser A- o a-). Una

432

vez conocemos (q = Frecuencias(aa)) nos dar directamente el nmero de machos afectados (Ias anomalas ligadas al sexo, habr ms machos afectados porque se esperan q machos y q2 hembras). Si los machos estn ms afectados que las hembras es una enfermedad ligada al cromosoma X. Se cumple HW si: No hay mutaciones. No hay seleccin Buscar un equilibrio donde las Poblacin de gran natural. fuerzas que afectan HW no tengan un tamao. No hay migracin. peso importante. Genotipado de individuos:

Figura 14-2. Grfico-modelo simple de 2 alelos En la Figura 14-2 se representan las frecuencias genotpicas frente a la frecuencias de uno de los alelos (aa) = rojo; (Aa) = lila. Cuando q = 1: aumenta el nmero de individuos (aa) y disminuyen (AA). Cuando p = q: (Aa) llegan al mximo, 0,5 (50%), s se cumple HW. Si el nmero (Aa) > 0,5: en una poblacin afirmaremos que no se cumple HW. Adems, cuando p = q = 0,5 tambin tendremos el mismo nmero de (AA) y (aa) (25% cada uno). Adems a partir de esta grfica tambin inferiremos cundo la frecuencia de (AA) = (aa). Ejemplo: El problema que se nos plantea para predecir la variacin del carcter con el modelo de HW. Qu pasar si en la poblacin provoc un cambio en las frecuencias gnicas?. Cmo afectar sto a las frecuencias genotpicas?. Por ejemplo, hacemos PCR y obtenemos los siguientes individuos observados: AA aa OBS ESP 25 40 24.2 39.2 60 61.6 Aa Para ver si esto se ajusta a HW habremos de ver los individuos esperados: calcular p y q para nuestra poblacin. En la poblacin tenemos 125: AA = 25 / 125 Aa = 60 / 125 aa = 40 /125

Ahora vamos a calcular la frecuencia de cada alelo:

AA = p 2 = 0,442 125 = 24,2 A = (50 + 60) / 250 = p = 0,44 Aa = 2 pq = 2(0,440,56)125 = 61,6 a = (80 + 60) / 250 = q = 0,56 aa = q 2 = 0,562 125 = 39,2
2 2 2

* Para ver s esto se ajusta a HW habremos de ver los individuos esperados: calcular p y q para nuestra poblacin. Recordemos que en la poblacin tenemos 125:
2

* X 2 = (O E ) = (25 24.2 ) + (60 61.6 ) + (40 39.2 ) Comparar Tabla X2. E 24.2 61.6 39.2 El valor que nos d lo buscaremos en las tablas de X2. Hay que buscar en la columna de 2 grados de libertad porque tenemos tres clases genotpicas (grado de libertad = n-1). Si X2 valor de la tabla, afirmaremos con una P (95%) que las diferencias son debidas al azar y que por tanto; HW se cumple.

433

14.3.1.1.

Clculo de las generaciones necesarias para eliminar un genotipo

Si queremos eliminar los individuos aa de una poblacin (por ejemplo porque es un alelo detrimental para el rendimiento), nos podemos preguntar: Cuntas generaciones tendr que esperar para que cambien las frecuencias allicas? En gentica de poblaciones se puede definir un parmetro muy importante: Coeficiente de seleccin negativa (S): Indica la frecuencia de muerte o penalizacin. Un valor de cero implica que no se penaliza y el valor de 1, que se penaliza al mximo. Un valor de 0.5 significa que eliminaremos la mitad de los individuos. Este valor de seleccin negativa S es reciproco a un valor de seleccin positiva (Fitness W) de la siguiente manera: W=1S Dependiendo de nuestro punto de vista podemos usar un coeficiente de seleccin negativa (S) o el coeficiente de Fitness (W). Un individuo con S = 0 W = 1. Estos valores se refieren a las probabilidades de que un individuo pase sus genes a la siguiente generacin. Cuando queremos seleccionar, el modelo terico nos indicar la W que debemos de aplicar a cada genotipo para lograr un cambio de las frecuencias p q en la poblacin. Cmo calcular las nuevas frecuencias gnicas en la siguiente generacin? Para ello primero calculamos las frecuencias de cada uno de los genotipos en la poblacin inicial usando la Ley de Hardy Weinberg. AA Aa aa Frecuencias p2 2pq q2 1 = p 2 + 2 pq + q 2 Despus se le asigna un valor de Fitness W a cada genotipo: Fitness W AA WAA Aa WAa aa Waa

En trminos globales, la poblacin tendr un fitness reducido que ser el resultado de las sumas del fitness de cada genotipo multiplicado por su frecuencia de aparicin en la poblacin. Wglobal = WAA * p2 + WAa * 2pq + Waa * q2 Supongamos entonces que vamos a eliminar a todos los genotipos aa y vamos a conservar a todos los AA y Aa (WAA=1, WAa=1 , Waa=0 ). Esto significa que vamos a eliminar a un nmero de individuos que equivale al porcentaje de q2 de la poblacin inicial. Con los valores de Fitness mencionados y usando un valor inicial p=q=0.5 entonces esto representa que eliminaremos a q2 =0.25 de los individuos. El fitness global de la poblacin se reducir en la siguiente proporcin: Wglobal = (1) * (0.5)2 + (1) * 2*0.5*0.5 + (1) * (0.5)2 = 0.75 Cmo podemos calcular los valores de p y q de la siguiente generacin? Para ello podemos usar las siguientes frmulas:
p' = p 2 W Aa W AA + pq W global W global

q' = q 2

W aa W Aa + pq W global W global

Modelos de seleccin Seleccin en Contra del Alelo Recesivo (SARA).

434

Asumimos el equilibrio Hardy-Weinberg para la poblacin y queremos hacer seleccin en contra del recesivo (aa). Definimos entonces un coeficiente de seleccin S. Qu pasara en la siguiente generacin si hago una seleccin diferente para cada grupo de individuos? Si eliminamos a todos los (aa), entonces esos individuos no tendrn descendencia ni transmitirn sus genes. La Fitness W promedio de la poblacin ser: AA Aa aa Frecuencias p2 2pq q2 W = p 2 (1) + 2 pq (1) + q 2 (1 S ) = 1 q 2 S Fitness W 1 1 1-S Una vez que tenemos W, debemos saber cuntos individuos con un genotipo determinado tendremos en la poblacin (frecuencias genotpicas):
AA = p 2 (1) 1 q 2 S
Aa = 2 pq (1) 1 q 2S

aa =

q 2 (1 S ) 1 q2S

A partir de esto nos preguntaremos; con qu medida he hecho disminuir la frecuencia del alelo a partir de una seleccin en contra: Q = Frecuencias (aa) H = Frecuencias (Aa)
/ 1 q 2 (1 S ) 1 2 pq H'= + / 2 1 q 2S 2 1 q2S q(1 Sq) q 2 (1 S ) pq q' = q' = + p = 1 q 2 2 1 q2S 1 q S 1 q S q ' = Q '+

Estimacin

de

las

frecuencias gnica de (a). S = 1 para eliminar todos los aa en la siguiente generacin:

q' = q(1 Sq) 1 q2S q' = q(1 q) 1 q2

Cunto ha cambiado la frecuencia de un gen (a) cuando hacemos seleccin?

q = q 'q =

Sq 2 (1 q ) 1 Sq 2

Vemos que todo depender de la frecuencia inicial y el valor de s. Imaginemos que un alelo inicialmente est presente con una frecuencia muy baja, casi nula, matemticamente q ser muy pequeo.

Figura 14-3 Diferentes curvas de coeficiente de seleccin negativa. Cuando se hace seleccin contra uno de los genes, aunque partamos de una situacin de frecuencias intermedias (50%), con pocas generaciones q ya es importante, pero la pendiente de la curva cada vez se hace mas plana. As, si el valor de q es muy bajo, no notaremos cambio

435

de una generacin a la siguiente. Si lo hacemos contra un alelo recesivo la magnitud de cambio de q entre una generacin y otra, depender mucho de la frecuencia inicial de q. Cuando q es muy baja, q tambin es muy baja. A medida que q tiene un valor mayor q tambin ser ms grande. Erradicar completamente un alelo recesivo a travs de los homocigotos recesivos tendera a infinitas generaciones ya que slo erradicamos aa pero no Aa, de forma que siempre quedarn portadores que de nuevo pueden originar aa. Un S = 0.5 quiere decir que el 50% de (aa) ya no les dejara reproducir. En este caso y a medida que cambia la frecuencias del alelo, vemos que con 0.5 tambin harn falta ms generaciones. Tasa de Mutacin / Balance de Seleccin Si la mutacin en la poblacin es prcticamente despreciable no se toma en cuenta, pero si eliminamos uno de los alelos podra aparecer de nuevo el alelo por mutacin? S, aunque no sea muy probable. Est probabilidad vendr definida por la tasa de mutacin. Si asumimos esto que la tasa de mutacin = , llegara un momento en que q sea tan pequeo que q = y los alelos que saco entre generaciones se vean compensados por los formados por mutaciones. Se llega a un equilibrio mutacin-seleccin. Cundo pasar esto?:
qe =

Haciendo seleccin contra un alelo puedo determinar cuando llegar a este qe = 0.004. equilibrio? S, aplicando la anterior frmula: S = 1 y = 1.510-5

As pues nunca llegar a erradicar del todo un alelo. No se puede erradicar (aa) porque se llega a un equilibrio en la mutacin. Si fuera eliminacin de Aa y aa en una generacin entonces s podran ser erradicados. Seleccin en contra del alelo dominante. Selection Against a Dominant Allele. (SADA) En ocasiones se quiere seleccionar a los alelos dominantes (individuos portadores). Veremos que el modelo general explicado anteriormente tambin sirve en este caso. Al hacerlo cabe decir que las frecuencias de los genotipos (aa) y (Aa) no tienen porque tener el mismo valor. AA p2 1 Aa 2pq 1-s aa q2 1-s

w = p 2 (1) + 2 pq(1 s ) + q 2 (1 s ) w = 1 sq (2 p q)
Y en la siguiente generacin ser:

p 2 (1) AA = 1 sq(2 p q)

Aa =

2 pq(1 s ) 1 sq(2 p q)

aa =

q 2 (1 s ) 1 sq(2 p q)

Se ha de combinar el nmero de reproductores que utilizamos y el factor de seleccin para que podamos obtener mejoras rpidamente pero sin disminuir mucho la poblacin. Cuando acto sobre Aa y aa, AA y Aa (contra el dominante) se puede llegar rpidamente a anular la anomala en pocas generaciones, siempre en funcin de s, de forma que si s = 1, se necesita una sola generacin pero se reduce mucho la poblacin. En herencia codominante, puede que nos interese mantener los heterocigotos. Tambin se puede hacer. Esto es ms normal en la seleccin natural cuando el heterocigoto presenta ventaja. Seleccin a favor del heterocigoto En funcin de los coeficientes de seleccin por cada heterocigoto podr predecir cuando se dar la situacin de equilibrio. AA p2 1-s Aa 2pq 1 aa q2 1-t

w = p 2 (1 s ) + 2 pq (1) + q 2 (1 t ) w = 1 p 2 s q 2 t

436

Y en la siguiente generacin ser:

AA =

p 2 (1 s ) 1 p 2 s q 2t

Aa =

2 pq(1) 1 p 2 s q 2t

aa =

q 2 (1 t ) 1 p 2 s q 2t

Cuando se hace seleccin a favor del heterocigoto, es como si se hiciera seleccin a favor de los dos alelos. Se llegar a un equilibrio porque p y q se mantendrn constantes.

Figura 14-4 Frecuencia de alelos

q =

q tq 2 q 1 sp 2 tq 2 s t q= p= s+t s+t

En el equilibrio p = 0 y q = 0

Para una determinada frecuencia allica de q, si s = t significar que q = 0,5 y p = 0,5 vemos que si el coeficiente de seleccin es igual para ambos heterocigotos, vemos que estaremos en equilibrio y que q = 0. Si q < 0,5, q ir cambiando hacia el equilibrio hasta llegar a 0,5. Si q > 0,5 la tendencia de q ser disminuir para llegar al equilibrio. En est grfica se representa s = t. Seleccin en contra del heterocigoto: Implica que el valor de fitness de los homocigotos es superior al de los heterocigotos. Los valores del equilibrio de p y de q son los mismos que en el caso anterior. Cabe decir que no hacemos A1A2, 1 X, porque entonces estaramos afirmando que los dos homocigotos tienen el mismo fitness (w). AA p2 1+s Aa 2pq 1 aa q2 1+t

w = p 2 (1 + s ) + 2 pq(1) + q 2 (1 + t ) w = 1 + p 2 s + q 2 t

Y en la siguiente generacin ser:

AA =

p 2 (1 + s ) 1 + p 2 s + q 2t

Aa =

2 pq(1) 1 + p 2 s + q 2t

aa =

q 2 (1 + t ) 1 + p 2 s + q 2t

Y en el equilibrio p = 0 y q = 0

q=

s s+t

p=

t s+t

437

Figura 14-5 Los homocigotos tienen w > heterocigotos, pero no tienen necesariamente la misma w. Como que ambos alelos A y a estn favorecidos respecto al heterocigoto se llegar a un equilibrio. Cuando s = t (favorecimiento de los homocigotos en igual medida) vemos que estamos en q = 0,5 (equilibrio). Modelos simples de seleccin: Si WAA > WAa > Waa Seleccin a favor del alelo dominante se fijar el alelo A. Seleccin a favor del heterocigoto y se llegar al equilibrio Si WAA < WAa > Waa polimorfismo estable. Si WAA > WAa < Waa Seleccin a favor del homocigoto: Si s = t polimorfismo estable. Si s t polimorfismo inestable. Si s > t o s < t se fijar un alelo u otro. Si WAA < WAa < Waa Seleccin a favor del alelo recesivo se fijar el alelo a. Tarea 14-3 The actual rate of mutations creating new c alleles is about 0.00000067. Is a balance between mutation and selection a plausible explanation the maintenance of the c allele at a frequency of 0.02? If not, develop an alternative explanation and use AlleleA1 to demonstrate that it is plausible.

14.3.1.2.

Consanguinidad

Hardy-Weinberg asuma que si se da el fenmeno de consanguinidad, es decir, si se parte de individuos emparentados no se cumplir el emparejamiento aleatorio. Esto por que habr individuos con ms probabilidad de aparearse que otros. Cmo vara la consanguinidad las frecuencias? La primera consecuencia es una disminucin de los heterocigotos a favor de homocigotos. Debido a que la mayora de enfermedades son recesivas, a ms homocigotos, mayor probabilidad de que haya anomalas genticas. La situacin ms extrema sera la autofecundacin (selfing). Si cruzamos heteros tendr 1/4, 1/4 y 1/2. Si ahora cruzo los AA con AA toda su descendencia ser AA al 100%. El 25% de A vuelve a generar Aa pero hay que sumarle 1/4 de 50 Aa que tambin generaran AA, y solo nos quedaran pocos heterocigotos. Si ahora volvemos ha hacer selfing y cruzamos de nuevo el 37.5% de AA con ellos, 25% aA entre ellos y 37.5% aa todava disminuirn ms los heterocigotos. Cmo se calcula el valor de la consanguinidad? Si la consanguinidad disminuye en heterocigotos, hay que tener en cuenta que las frecuencias gnicas (p y q) no varan como pasara con la seleccin, sino que variarn las frecuencias genotpicas, por lo que hay la misma proporcin de alelos pero distribuidos de forma diferente.

438

F es una manera de estimar en una poblacin si hay mucha consanguinidad. Segn la ley de HW podramos calcular los heterocigotos esperados y podemos va PCR genotipear la poblacin y observar los resultados. Si hay ms heterocigotos de los esperados podremos atribuirlo a consanguinidad.

F = 1

HeteroOBS H = 1 HeteroESP 2 pq

H = 2 pq (1 F )

Si los observados son iguales a los esperados, F=0, lo que nos indica que no hay consanguinidad. Si hay menos observados que los esperados la F comenzar a tener un valor positivo hasta llegar al valor mximo de 1 cuando no hay ningn hetero observado. Desde el punto de vista terico, conocidos los genotipos puedo hacer predicciones de HardyWeinberg. Si no hay HW es porque alguna de las frecuencias observadas es diferente a la esperada. Si vemos menos heteros de los esperados una de las explicaciones ms plausibles es porque no habr aparejamiento aleatorio. Hay relacin directa entre F y probabilidad de aparicin de enfermedades. Si F > 0.3-0.4 acostumbra a ir acompaados a una situacin de aparicin de enfermedades genticas. Un ejemplo importante es cuando en los partos se ve un nmero creciente de animales muertos consanguinidad.. La nica manera de normalizar F es introducir nuevos animales en la poblacin para volver as a tener los heteros esperados. Cmo concebimos estrategias para detectar animales portadores de la enfermedad gentica (portadores de alelos a) si solo puedo discriminar homocigotos recesivos (aa) de los que no lo son? Como sabemos si un macho que no presenta la anomala es aA o AA? Si no se tienen tcnicas moleculares (PCR), se harn cruzamientos y veremos los resultados, as inferiremos probabilidades. Hacemos cruzamientos parciales de este individuo A_ con un individuo afectado aa: AA x aa Aa x aa Aa todos los descendientes sern sanos 1/2 Aa + 1/2 aa el 50% estarn enfermos.

Si el macho A_ cruzado con hembras aa da lugar a una descendencia aa (slo 1) ya nos ndica que ser portador pero si nos salen Aa, cuntos descendientes habr de tener para afirmar al 95% de probabilidad que siempre ser Aa? Si ha tenido n descendientes y el animal es Aa y n todos son los descendientes Aa la probabilidad de no detectar que es portador es de (1/2) , la probabilidad de detectar que sea portador es 1 - (1/2)n. As pues los individuos que debera tener con 0,95: 0.95 = 1 - (1/2)n n = indica el nmero de descendientes necesarios para afirmar que ese individuo es portador con un 95% {Assaf, 2009 #190; Bacolod, 2009 #191} Cul es la magnitud del cambio que quiero obtener y cunto tiempo quiero esperar para conseguirlo?

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14.3.1.3.

Marcador biallico

Ejemplo marcador M1 biallico: Tendr 3 genotipos diferentes. Quiero saber potencia de diferentes de 2 individuos de este marcador. Cmo se hace? Calculamos la probabilidad de que escogiendo 2 individuos al azar, los dos sean iguales, sabemos las frecuencias allicas el panel de marcadores ha de tener probabilidad muy baja de que dos individuos sean iguales, si no es as ese marcador no nos servir. AA AA p2 x p2 = p 4 Aa Aa 2pq x 2pq = 4p2q2 p4 + 4p2q2 + q4 = PI (*) Aa aa q2 x q2 = q 4 (*) Es la P (de que este marcador no diferencie dos individuos), P (dos individuos escogidos al azar sean iguales). Sabiendo p y q de cada alelo puedo calcular P (dos individuos = para todos los SNPs)? S, haciendo producto de probabilidades. Si uno de los marcadores no es polimrfico (p = 1) en este caso la probabilidad de que dos sean iguales es 1. En una poblacin alemana, haciendo -13 esto con 37 SNPs, la probabilidad de tener 2 iguales era del orden de 10 , pero, cul es el problema? Que estos 37 SNPs no tienen por qu ser polimorficos en otras poblaciones y en ellas el valor cambia drsticamente y no nos servira.

14.4.

Heredabilidad

Usando el modelo lineal que presentamos anteriormente (captulo X), podemos decir que la varianza fenotpica total (VF) depende de la varianza ambiental (VE), las varianzas genticas (VG + VGxE + VGxG) y la varianza aleatoria (VR). VF = VE + VG + VGE + VGG + VR Para algunos caracteres, los resultados de la seleccin son muy modestos. Esto es debido a que tienen baja influencia gentica. A est grado de influencia se le llama heredabilidad (h2). La heredabilidad indica el por ciento de varianza fenotpica que corresponde a la varianza gentica (peso de los genes en un carcter). h2 = 1 Un caracter tiene alta heredabilidad cuando la Variabilidad Fenotpica (VF) se puede explicar enteramente por la Variabilidad Gentica (VG). VF VG. Esto implica que VE y VGE son cercanos a 0. h2 = 0 La baja heredabilidad se da cuando VG es muy pequea y VF muy grande. VF >> VG. Esto tambin indica que VE es muy predominante.

Heredabilidad = h2 =

VG VF

La heredabilidad indica que tanto de la varianza fenotpica VF depende de la varianza gentica y no de la ambiental. Por otro lado, la heredabilidad tambin se puede entender como la correlacin fenotpica entre el padre y el hijo. Si comparamos dos padres con una diferencia genotpica dada (valor x), y vemos que esta misma diferencia fenotpica se observa en los respectivos hijos (valor y), entonces la heredabilidad es alta. La pendiente (valor a) que obtenemos de esa lnea de regresin corresponde en cierta forma a un factor de respuesta a ese carcter. El coeficiente de regresin lineal (Coeficiente de Pearson) es un indicador directo de la heredabilidad. Estimacin del valor gentico (Mtodo de genetistas clsicos):

440

Los mejoradores clsicos no podan medir la VG directamente. Cuando conocan el grado de parentesco entre diversas poblaciones entonces podan evaluar indirectamente VG. Para conocer h2 se asume pues la idea de que cuanto ms se parezcan entre ellos, los genes tendrn ms influencia del caracter. Para calcular la VG no se usa el coeficiente de regresin sino la pendiente de la recta de regresin de los datos experimentales. R2 para saber si la extrapolacin es correcta. R2 1: Indica que la importancia de los genes en un carcter es muy alta. Podremos modificar un valor en funcin de otro. Conocido el valor fenotpico del progenitor podremos calcular el valor fenotpico del hijo. R2 0: Indica que la importancia de los genes en un carcter es baja. Datos de 1 progenitor: h2 = 2a: Slo estn el 50% de los genes. Datos de 2 progenitores: h2 = a (pendiente de regresin): 100% de los genes. Mucho ms exacto. Utilizando esta regla matemtica ser necesario tener en cuenta que si un carcter est determinado por los genes esperaramos que en todas las poblaciones R2 fuera muy alto aunque no siempre es as: h2: h2 0,40,5: Margen importante de seleccin (estudiar poblaciones con alto grado de parentesco). h2: h2 0,4: Poco margen de seleccin. El 60% del carcter vendr determinado por el ambiente.

Comentario [atf22]: Tengo que checar si esto es cierto o es al revez.

14.5. Parmetros matemticos de variabilidad gentica

Existe una gran diversidad de estadsticas para cuantificar la variabilidad gentica y resumir la informacin a trminos ms manejables. Los parmetros estadsticos ms empleados son: porcentaje de locis polimrficos, nmero medio de alelos/locus, la heterocigosidad esperada (HE) y observada (HO) y el ndice de contenido de polimrfico (PIC). ndice de heterocigosidad (H) P (Individuo heterocigoto): La H indica, en una poblacin y para cada marcador, la probabilidad de que el individuo sea heterocigoto. La H se calcula midiendo el nmero de heterocigotos totales. Para ello es necesario especificar los genotipos posibles, indicando cuntos individuos de cada genotipo integran esa poblacin.
H = 1 Pi 2
i =1 K

P( AA) = p 2 P( Aa) = 2 pq P(aa) = q 2

H = 1 ( p2 + q2 )

H = 1 hom ocigotos = Heterocigotos De 0 a 1

- Dice si un marcador es mucho o poco informativo. - hace una estimacin de las frecuencias de los alelos en la poblacin. La constitucin gentica de la poblacin quedara descrita por la proporcin, porcentaje o por las frecuencias de los tres genotipos (frecuencias genotpicas). Si la cuarta parte de los individuos son AA, la frecuencia de este genotipo sera 25% Obviamente, la suma de las frecuencias genotpicas debe ser 1-100%. H mxima: Si los alelos presentan frecuencias idnticas. H menor: Cuanto menos individuos se muestren (en poblaciones consanguneas).

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H aumenta: A medida que sube el nmero de alelos en una frecuencia elevada (en poblaciones abiertas). ndice del Contenido de informacin de un Polimorfismo (PIC): El PIC es similar al valor de heterocigosidad, y oscila entre 0 y 1. Este ndice evala la informatividad de un marcador en la poblacin de acuerdo a las frecuencias de los alelos. Para su clculo se multiplica la probabilidad de cada posible cruzamiento (estimado a partir de las frecuencias allicas) por la P (de que sean informativos) es decir, que se pueda identificar al progenitor del que procede el alelo. Es el ndice que ms se usa en estudios genticos, los individuos informativos son los heterocigotos: H = Heterocigosidad. C = Coeficiente de ambigedad y describe la P (de no poder discriminar de quin proviene el alelo del hijo si los 2 padres son heterocigotos para el mismo alelo).
n n n PIC = H C = 1 Pi 2 2 Pi 2 Pj 2 i =1 4243 i =442443 1 1 j = i +1 1 Nivel heterocigocidad Coef . de ambigedad

* Si los alelos en la poblacin poseen una frecuencia equivalente podemos realizar el clculo con otra frmula ms reducida:

PIC =

( K 1) 2 ( K + 1) 2 K3

* PIC siempre ser menos que (H) pq es una H modificada. Se desarroll para estudiar cmo los alelos se transmitan en la siguiente generacin y para los alelos codominantes.

442

15.
15.1.

Gentica cuantitativa
Carcteres de distribucin discontinua

Bsicamente se puede hablar de dos tipos de caracteres: los de distribucin discontinua y los de distribucin continua. A los primeros tambin se les llama caracteres cualitativos. Son aquellos que estn determinados por uno o muy pocos genes, por eso tambin son llamados oligognicos. Presentan una variacin cualitativa, discreta o discontinua: en una poblacin se observan clases de individuos segn el genotipo que presenten y el mecanismo de accin gnica actuante. Las observaciones que sirvieron de base a las Leyes de Mendel se realizaron en caracteres cualitativos que expresaban diferencias de clase entre dos fenotipos: chncharos de color verde o amarillo, flores blancas o rojas, etc. Sin embargo, se define como fenotipo de un individuo a toda caracterstica visible o medible de dicho individuo. Muchos caracteres de inters econmico en produccin animal, especficamente los que pueden ser medidos, varan en forma continua, lo que significa que los individuos no pueden ser clasificados en clases discretas. La gentica cuantitativa es la rama de la gentica que estudia los caracteres controlados por muchos genes, denominados polignicos, y de sus propiedades genticas en las poblaciones {Griffiths, 2003 #35}.

15.2.

Carcteres de distribucin continua

Los Cuantitativos: Otro tipo de caractersticas no pueden ser encuadradas dentro de la una variacin discreta, ya que para ellas puede existir un espectro de fenotipos que cambian imperceptiblemente de un tipo a otro. Son denominados cuantitativos, mtricos o continuos, ya que son aquellos que pueden ser medidos en los individuos: peso, altura, tamao de camada, conversin alimenticia, etc. La mayora de ellos, en una poblacin, presentan una distribucin normal. La variacin continua y normal est dada por dos causas: La segregacin simultnea de muchos pares de genes: son caracteres polignicos. Estn determinados por muchos pares gnicos, cada uno de los cuales hace un pequeo aporte a la determinacin del carcter. El genotipo de un individuo es la sumatoria de los efectos individuales (efecto aditivo) de cada uno de estos genes. La accin o efecto del ambiente, que modifica al fenotipo en cierto grado. El peso adulto de un individuo est determinado genticamente, pero puede verse modificado segn la alimentacin recibida a lo largo de su vida. Esta influencia ambiental, considerando como ambiente como todo aquello que no sea gentico, hace que la simple medicin del carcter en el individuo nada haga inferir cual es su genotipo. Un mismo fenotipo puede as, corresponder a distintos genotipos con distinta influencia ambiental. Modelo gentico para caracteres cuantitativos Un modelo es un esquema terico, generalmente en forma matemtica, de un sistema o de una realidad compleja, que se elabora para facilitar su comprensin y el estudio de su comportamiento. El valor que se observa cuando un carcter se mide sobre un individuo es el valor fenotpico de ese individuo. El modelo que se utiliza para estudiar el valor fenotpico (P) es en componentes atribuibles a la influencia del genotipo (G) y del ambiente (E) es la ecuacin:

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P=G+E En la que P es el valor fenotpico, G el valor genotpico y E el efecto ambiental. Se define como genotipo como al arreglo particular de genes que presenta el individuo, y el ambiente como todas las circunstancias bioticas y abioticas que afectan al valor fenotpico. Al englobar todas las circunstancias no genticas dentro del trmino ambiente es claro que el genotipo y el ambiente son, por definicin, los nicos dos determinantes del valor fenotpico, ya que todo lo que no es genotipo, por definicin, es ambiente. Los caracteres cualitativos tienen muy poca o nula influencia ambiental, por lo que el modelo que se aplica a ellos es: P=G Genotipo El Genotipo de un individuo o Valor Genotpico se particiona en componentes atribuibles a diferentes causas: Valor Gentico Aditivo (Ga): como ya se mencion, para los caracteres cuantitativos, cada gen hace un pequeo aporte individual al genotipo. Ese aporte se denomina valor aditivo del gen. El genotipo aditivo es la sumatoria de dichos efectos de todos los genes que determinan en genotipo de ese individuo para ese carcter. Tambin se lo denomina Valor de Cra, Reproductivo o Mejorante. El valor representa, del valor genotpico, slo la parte que puede ser transmitida de los padres a su descendencia. Valor Gentico por Dominancia (Gd): o desviacin por dominancia que surge de la interaccin entre alelos de un locus. Es la sumatoria de los efectos producidos debido a las interacciones allicas entre todos los pares de genes que determinan el carcter en un individuo. Valor Gentico por Interacciones (Gi): con ms de un locus determinando el carcter, se debe tener en cuenta tambin las interacciones entre loci (no allicas), que se denominan eptasis. Es la sumatoria de los efectos producidos debido a las interacciones no allicas entre todos los pares de genes que determinan el carcter en un individuo. G = Ga + Gd + Gi Ambiente Los efectos ambientales son independientes del genotipo del individuo y ocasionan una desviacin del valor fenotpico del mismo, con respecto al valor gentico, que en muchos casos puede ser considerable. En trminos generales, se puede hablar de dos clases de efectos ambientales: Permanentes: son todos aquellos que una vez que actan sobre el individuo lo afectan durante toda su vida. Por ejemplo, una deficiencia nutricional prolongada durante el perodo de crecimiento puede provocar un efecto, que no es gentico, que afecte el peso adulto de un animal. Temporales: son los que actan sobre el genotipo de manera transitoria: alimentacin, estado sanitario, condiciones climticas, etc. Considerando todos los elementos que componen el valor fenotpico de un individuo, slo el valor gentico aditivo es heredable. En rigor, el 50 % del mismo, ya que se hereda el 50 % de los genes y no se heredan ni las interacciones allicas, ni los efectos ambientales.

444

Parmetros poblacionales para caracteres cuantitativos El hecho de que exista gran cantidad de genes que determinan un carcter cuantitativo y la influencia del ambiente, hace que sea imposible la estimacin de las frecuencias gnicas de cada uno de ellos. Para estos caracteres la caracterizacin de la estructura poblacional se realiza en base a otros elementos que, en definitiva, dependen de las frecuencias gnicas. Media Poblacional Uno de los elementos que definen a una distribucin normal es su media. La media fenotpica para una poblacin, para un carcter cuantitativo, est dada por la suma del valor gentico promedio de todos los individuos que la componen y el promedio de las desviaciones ambientales que los afectan. Varianza Fenotpica El estudio gentico de un carcter mtrico se centra en el estudio de su variacin, cuya medida matemtica ms comnmente usada es la varianza. Para estudiar esta variacin es necesario desglosarla en componentes atribuibles a diferentes causas. La magnitud relativa de estos componentes es la que determina las propiedades genticas de una poblacin Por tanto, la varianza fenotpica se puede descomponer en varianza genotpica (VG) y varianza ambiental (VE). La varianza genotpica es la varianza de los valores genotpicos y la varianza ambiental es la varianza de las desviaciones ambientales: VP = VG + VE

Si se consideran todos los componentes del modelo gentico, puede desglosarse como: VP = VGa + VGd + VGi +VE Es decir, existe en la poblacin distintas fuentes de variacin debidas a cada uno de los componentes: varianza gentica aditiva (VGa), varianza gentica por dominancia (VGd), varianza gentica por interacciones (VGi) y varianza ambiental (VE). El grado de variabilidad genotpica de un carcter en una poblacin tiene relacin directa con las frecuencias gnicas de la misma. Con frecuencias extremas (p = 0, p= 1) la varianza gentica aditiva es cero, ya que los individuos no presentan diferencias genticas entre ellos, son todos homocigotos. Cuando toman valores intermedios (p = q = 0.5) la variabilidad aditiva es mxima. {Griffiths, 2003 #35; Aldridge, 2009 #176}

15.2.1.1.

Diseos experimentales para detectar QTLs

Algunas poblaciones se han utilizado mucho para detectar QTLs de enfermedades o productividad. En algunos casos esas poblaciones se han derivado de cruzamientos experimentales entre dos lineas homocigotas, por ejemplo, la linea Mo17 y el B73 que dieron lugar a los RILS de la poblacin IBM (intermated B73 Mo17 population). En muchos pases no existe una infraestructura pblica para evaluar diferentes genotipos de maz en mltiples ambientes. En algunos centros se evalan lneas homocigticas. Pero de que sirve eso si las lneas no son las que se liberan a campo? El rendimiento lo debemos medir en los hbridos. Si las lneas per se no dan un resultado confiable, entonces la debemos utilizar en todos los cruzamientos posibles. A esto se le llama un cruzamiento tipo dialelo.

445

Figura 15-1. Aspecto del cromosoma 4, vemos que hay varios QTLs en este cromosoma. Por ejemplo 4 es igual a la escala de probabilidad de que el QTL est en algn lugar del cromosoma 4, en el eje x est el marcador a lo largo de QTL. La regin del grueso es igual a la zona en la que trabajaremos en el laboratorio (la primera), donde vemos que se han buscado todava marcadores, es una regin de 20 cM 1 cM 1 Mb 20 Mb, puede representar muchos aos de trabajo Deteccin: Un QTL se localiza en un intervalo 10-30 cM. La probabilidad de detectarlo depender de una serie de factores que nosotros no podemos controlar: Heredabilidad del carcter Naturaleza gentica (dominante, recesivo o aditivo) Nmeros. de genes que afecten el carcter Magnitud del efecto del QTL sobre el carcter

15.2.1.2.

Clonacin por posicin

A partir del pedigr podemos detectar que el QTL est en una zona concreta. Por ejemplo, gracias a la asociacin a un microsatlite. Entonces, debemos buscar BACs que representen aquella regin del genoma y comenzar a secuenciarlos para identificar que genes hay en aquella zona. Ahora hay que ver cual de los genes es el responsable y ms concretamente la mutacin que hay en l. Teniendo las secuencias de los BACs como se predice la existencia de genes en ellos? Se puede hacer de dos maneras: In silico por medio de bases de datos Bsqueda en bancos de datos de genes y ESTs localizados en la regin, anlisis de homologa con genes y ESTs de las bancos de datos, anlisis de secuencia para detectar ORFs y exones. Una posibilidad es detectar ORFs y exones, en los eucariotas ORFs no sirve igual que en procariotas porque estn separados por exones e intrones, por eso en eucariota para identificar los exones se buscan secuencias consenso de inicio o final de los intrones y del lariat. El codn bias tambien puede ser usado para detectar regiones de genes. Una regin codificante (exn) se puede diferenciar del resto por su composicin de tripletes. Por ejemplo la prolina puede estar codificada por cuatro tripletes diferentes pero hay algunos ms frecuentes que otros. Si miramos los RNAs de transferencia que se unirn a este triplete en humanos veremos que no habr ninguno que pueda unir a CGG, de manera que CGG se unir al AGG que tambin se unirn a CCU. Esto quiere decir que para algunos codones hay ms RNAs de transferencia y esto acelerar su traduccin. Tambin podemos detectar islas de CpG. Las zonas poco metiladas estn asociadas a la presencia y expresin de un gen.

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Hibridacin de clones genmicos sobre RNA o sobre genotecas de cDNA Tenemos un BAC de 150 kb y queremos saber si contiene un gen, para lo cual cogemos fragmentos del BAC, marcamos e hibridamos sobre RNA (northern) o sobre gametotecas de DNA. Si realmente hay algn gen veremos una banda. Problema, si el exon que detecta nuestro fragmento es pequeo bajar la sensibilidad y no veremos banda. Tambin puede ser que este gen no se exprese en aquel momento o en aquel tejido, por lo que puede que no veamos que est aquel gen. Si el gen se expresa poco el northern tampoco tendr suficiente sensibilidad para detectarlos Islas CpG No de forma computacional, es decir, que tengo clones sin secuenciar, por ejemplo tengo enzimas de restriccin que cortan en zonas CG cuando no estn metiladas (hipometiladas < 20% de los Cgs metilados, hipermetiladas como mnimo hay un 30%). Si vemos que corta es que hay diana. Identificacin de genes en una regin Generamos fragmentos aleatorios del BAC usando enzimas de restriccin que reconocen diana de 4 pb ( como media tendr una diana cada 256 pb (1/4)4 = 1/256). Los fragmentos aleatorios contendrn todo el BAC y se pueden solapar entre s. Aadimos dinkers y hacemos PCR usando primers marcados con biotina. Por otro lado tenemos una genoteca de cADN del tejido donde sospecho que se expresa el gen, hago PCR y amplifico todos los insertos para obtener una coleccin de fragmentos de los genes que se expresan en ese tejido. Entonces har hibridacin: La molcula de DNA genmico se hibrida con una igual. La cadena 5-3 de cDNA se une con el complementario del clon genmico o la 3-5. La molcula del clon se hibrida con si misma. Aprovechando el marcaje con biotina se pueden retener con un imn, tan solo aquellas que tengan hibridacin BAC-genmico o BAC-BAC. Ahora hacemos PCR usando primers de la genoteca de cDNA, de forma que as conseguiremos tener grandes cantidades de BAC+cDNA y no BAC.

15.2.1.3.

Dificultad en la identificacin de genes y mutaciones que explican los QTLs:

La mayor dificultad no es detectar QTLs sino identificar el gen responsable o la mutacin causal. Los QTLs tienen efecto limitado. La mayora de las veces, un solo QTL puede explicar de 0.5% a 5 % del total de la varianza fenotpica. Otro problema es que pueden existir diferentes QTLs ligados que afectan conjuntamente un carcter. Una posible explicacin es porque hay diversas mutaciones causales: no hemos de buscar un solo gen con importancia causal, sino tres genes con efecto pequeo, que sumados tienen un efecto grande que se observa como un solo QTL. Tambin hay fenmenos de epistasia. La eptasis es cuando hay una interaccin no aditiva entre los QTLs. Es decir, cuando el efecto combinado de los QTLs no es la simple suma del efecto de los QTLs individuales. Los polimorfismos causantes de los QTLs podran ser mutaciones que afectan la regulacin gnica, por ejemplo que disminuyen en un 20% la expresin de un gen. Pero tambin pueden ser mutaciones en las regiones codificantes de las protenas que afectan la funcin de una enzima o sus propiedades catalticas o cinticas {Collard, 2005 #22}.

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16.
16.1.

Mapas genticos
Tipos de mapas

Los primeros mapas genticos datan de 1900. En esa poca solo se utilizaban marcadores fenotpicos tipo I. Ya en ese entonces se establecieron grupos de ligamentos (conjuntos de genes que se heredan juntos). En 1960 se pudo empezar a trabajar con protenas, gracias a la electroforesis y agentes inmunolgicos que podan detectar protenas con muy alta especificidad y sensibilidad. En 1980 se desarrollaron tcnicas de deteccin basadas en hibridacin obteniendo as marcadores moleculares como; RFLPs. En 1988 surgi el PCR y por tanto los microsatlites, RAPD, AFLPs, etc. Existen 2 tipos de mapas genticos: Los mapas de ligamento que utilizan como medida la distancia de las frecuencias de recombinacin (medida indirecta de la distancia). Los mapas de ligamiento dan medidas en centimorgan. Un centimorgan es cuando de un grupo de cien descendientes, en 99 de los casos los alelos de un padre se heredan en bloque, mientras que en un solo caso (1/100) se da una recombinacin entre los alelos del padre y de la madre. Los mapas fsicos Se basan en secuencias contiguas y completas de DNA (contigs) y que posicionan fsicamente sobre un cromosoma o unos marcadores en el DNA. Los mapas fsicos dan medidas en kilobases.

16.1.1.

Mapas de ligamiento

Comenzaron a inicios del siglo XX. El primero en desarrollarlos fue Thomas Hunt Morgan quien escogi Drosophila melanogaster como organismo de experimentacin gentica. Se hacan cruzas para revalidar las teoras de Mendel. El cruz en Drosophila homocigotos para alelo mutante y homocigotos para alelo normal. La descendencia (F1) se cruz con homocigoto recesivo. (Griffiths,et.al. 2004). P: F: pr pr / vg vg X pr+ pr / vg+ vg X pr+ pr+ / vg+ vg+ pr pr / vg vg = pr+ pr / vg+ vg

Qu se esperaba obtener? Las hembras T1 pueden producir cuatro gametos mientras que el macho homocigoto recesivo slo tieneuno, por lo que se obtienen cuatro genotipos diferentes y por tanto cuatro fenotipos. La 2 ley de Mendel de distribucin independiente deca que de cuatro gametos era probable que se heredaran, pero Morgan vio que no era as: habr dos fenotipos mucho ms abundantes y dos mucho menos de lo que se espera. Curiosamente los dos ms frecuentes vemos que corresponden con los gametos pr+vg+ y prvg que se conocen como los parentales, los otros dos son los recombinantes. Se les llama parentales porque son los que produjeron los progenitores originales en la FO. Si los gametos parentales son ms frecuentes es porque los dos genes estn ubicados en el mismo cromosoma. (A) Qu pasa si estn ligados? Slo se observarn gametos del tipo parental (A)

448

(B) Morgan: pero esto no fue lo que observ Morgan. Afirm que deba de existir algn mecanismo que permitiera cruzar cromosomas (quiasmo): Se obtienen pues de cada gameto como afirmaba Mendel: 2 gametos parentales 2 gametos recombinantes

Fr entrecruza miento = 2Fr recombinac in

50%

Fr recombinacin =

N Re combinante s Entre 0 y N Total

La frecuencia de entrecruzamiento es el doble de la frecuencia de recombinantes porque el entrecruzamiento slo afecta a dos de las cuatro cromtidas. Lo que se ver en la descendencia (fenotipo) no sern los gametos, pero en funcin del fenotipo podemos saber que gametos se han recibido. Mapas de dos puntos: Sturtevant: encontr una aplicacin a la ligadura: Hacer mapas usando frecuencias de recombinacin. En el caso de dos locus, cruzamos un individuo doble heterocigoto con un individuo prueba con lo que obtenemos cuatro genotipos diferentes. Vemos que las frecuencias de cada uno de los cuatro no son iguales, viendo de nuevo mucha mayor frecuencia de 1 de lo que se espera y 2 mucho menos. A partir de esto se ha deducido que quien condiciona el genotipo en la descendencia es el doble heterocigoto que puede ser dibujado AaBb: Fase acoplamiento de Fase de repulsin

Cmo averiguaremos en qu fase estn los alelos? Sabemos que siempre habr menos recombinantes que parentales, si nos fijamos en la tabla (AB) y (ab) son los gametos parentales (que siempre estn en una Frecuencias 50%, as que el individuo heterocigoto del ejemplo est en fase de acoplamiento. Una vez se sabe la fase, se conocen los gametos parentales y recombinantes y ya se puede calcular la frecuencia de recombinacin:
FR= 46 + 54 R = = 0,1 total 1000

Comentario [ATF23]: Cul tabla

Ahora podemos hacer un mapa que nos indica que locus A y B estn separados por una frecuencia de recombinacin del 10%.

Qu frecuencia de entrecruzamiento hay? FE = 2FR = 1 FE = 20%. Sturtevant dijo que la frecuencia de recombinacin era proporcional a la distancia, as se podan hacer mapas, adems tambin deca que las probabilidades de que se de entrecruzamiento es uniforme a lo largo del cromosoma, lo que implica que cuanto mayor distancia haya entre los locus, mayor frecuencia de recombinacin hay, si se asume que la recombinacin se da de forma aleatoria a lo largo del cromosoma.

449

A A

B C B C

En este caso es ms probable que se de entrecruzamiento entre A y C que entre A y B. Esto nos permite usar las frecuencias de recombinacin como una medida de la distancia.

Situaciones en las que nos podemos encontrar: Frecuencia = 50%: No nos permite saber si estn en el mismo cromosoma con FE del 100% o si estn en diferente cromosoma y si se sigue la 2 ley de Mendel no nos da ninguna informacin, porque si dos genes estn muy lejanos entre s se puede dar entrecruzamiento y parecera que estuvieran en cromosomas diferentes. Frecuencia << 50%: Podemos asegurar que estn en el mismo cromosoma y nos indica la distancia aproximada entre ellos. Es una situacin informativa. Entonces hablaremos de que estn ligados. Podramos diferenciar dos situaciones: los dos locus estn tan juntos que la Frecuencia es 0%, si estn parcialmente ligados es la situacin ms interesante para hacer mapas porque nos indica la distancia. Mapa con tres locus (puntos): Cruzamos un heterocigoto de tres genes con un homocigoto recesivo y se obtienen ocho genotipos diferentes. Para hacer el mapa comenzaremos calculando la distancia entre B y C sin tener en cuenta A, y as sucesivamente. B c En este caso es ms probable que se de entrecruzamiento entre A y C que entre A A y B. Esto nos permite usar las frecuencias de recombinacin como una medida b C de la distancia. a Primero calcularemos la fase de BbCcAa: los gametos ms abundantes son BcA y bCa (son los parentales) sin haber sufrido entrecruzamiento: P: BbCcAa x bbccaa Clculo de las distancias de 2 en 2: BC los recombinantes sern BC y bc que estn con 38, 147,135 y 44: 38 + 147 + 135 + 44 = 36.4% 1000 CA los recombinantes sern ca y CA que estn en 38, 7, 11 y 44: 38 + 7 + 11 + 44 = 10% 1000 BA los recombinantes sern Ba y bA que estn en 147, 7, 11 y 135: 147 + 7 + 11 + 135 = 30% 1000 Puede ser? 30+10 no es 36,4 si no 40. Gametos parentales: P BAc (320) baC (298) Gametos rocomb (I): RI BaC (147) bAc (135) Gametos rocomb (II): RII BAC (38) bac (44) Gametos recomb: DR Bac (7) bAC (11) doble

Clculo de las distancias: Para calcular la distancia AB hemos de tener en cuenta los gametos y como hay recombinacin entre AB:
D( AB) = RI + DR 147 + 135 + 7 + 11 = = 30% total 1000

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RII + DR 38 + 44 + 7 + 11 = = 10% total 1000 RI + RII + 2 DR 147 + 135 + 38 + 44 + 2(7 + 11) D ( BC ) = = = 40% total 1000 D( AC ) =

Antes sala 36.4 porque no tenamos en cuenta a uno de los tres marcadores y al hacer distancias de 2 en 2, no tuvimos en cuenta el DR y estbamos asignando una distancia menor de la que hay realmente.
Coincidenc ia e int erferencia = DRobservad os D Re sperados

Clculo de los esperados: Afirmamos que la probabilidad de recombinacin en I y II son independientes entonces cul es la probabilidad de tener una recombinacin doble?

P( DR esperados) = P( RI ) P( RII ) N individuos

Verdad, siempre y cuando los dos sucesos sean independientes. La P(Re I) = distancia AB en tanto por 1. DR esp. = 0,3 0,1 1000 = 30 C = 18 / 30 = 0.6. Slo se observa el 60% de los DR que se esperan, en este caso nos est indicando que la protena recombinante no es independiente a la Re II, hay una interferencia que hace que cuando hay recombinacin en I disminuye la recombinacin en II. Clculo interferencia: I = 1-C I = 0,4 Tanto I como C (0 C 1) y (0 I 1)

Si

I=0

C = 1 DR obs = 1
DR esp

Si I = 1

C = 0 DR obs = 0
DR esp

* Cuando se produce recombinacin en I nunca se da en II, ya que habra una interferencia total. Anlisis de ligamento: Pedigr: Suponiendo que el padre est sano y la madre est enferma (enfermedad autosmica dominante, donde el alelo A provoca la enfermedad). Estar en todos los hijos que han recibido A de la madre (enfermos)?. Desconocemos el gen que la provoca pero podemos determinar genotipos de marcadores si tengo un microsatlite cerca del locus que determina la enfermedad cuando se transmite el alelo A la madre tambin transmite el alelo 1 del microsatlite (slo se romper esta situacin si hay recombinacin o si estn A y 1 cerca, casi no habr recombinacin). Vemos que en la descendencia hay un recombinante porque A se hereda con 2 (FREQUENCIA = 1 / 6 = 0.18) A partir de esto podemos afirmar que el microsatlite est cerca del locus de la enfermedad (estar pues en el mismo cromosoma y cerca, porque si no estuviera cerca, tendramos la misma probabilidad de observar A-1 y A-2, y no es as) El gen est prximo al marcador de posicin conocida, por lo que sabemos en qu zona (+ o -) se sita el gen de la enfermedad porque se hereda conjuntamente con el alelo de un marcador. En un mapa de ligamento de cerdo con medidas de distancias en cM. En un color estn los marcadores y en otro los genes. Entre el marcador SO11 y SO23 qu FRecomb hay?: Aunque la distancia es 80, la frecuencia es 50% mximo no detectar si estn ligados y pensar que estn en cromosomas diferentes.

451

16.1.2.

Caractersticas de la recombinacin

Para hacer mapas de ligamento hacen falta marcadores polimrficos. Es necesario que el marcador presente diferentes variantes (alelos) para distinguir entre A y a. La frecuencia de recombinacin nunca supera el 50%. Si hay 2 marcadores que estn muy lejos en un mismo cromosoma no se puede detectar que estn ligados, ni calcular la distancia entre ellos. Dos marcadores muy separados no dan suficiente informacin. Hace falta disponer de muchos marcadores para superar este inconveniente y detectar todos los marcadores que pertenecen al mismo cromosoma. Si la distancia entre marcadores es muy pequea, por ej. 1cM entre A y B querr decir que habr que analizar 100 individuos para encontrar 1 recombinante. La cercania de los loci implica dificultad para encontrar recombinacin en la descendencia. Mltiples entrecruzamientos; implica que si se dan 2 entrecruzamientos entre A y B y no hay un marcador entre ellos vemos el resultado como gametos parentales. Bajo estas condiciones se subestima la distancia. Cmo se puede corregir sto? Si una a media se da en 0,2 entrecruzamientos la distancia ser de 10 cM, si se da un entrecruzamiento a distancia de 50 cM a nosotros nos gustara esto, que hubiese relacin lineal entre distancia y nmero de entrecruzamientos (a). En realidad tenemos (b): para frecuencias de entrecruzamiento pequeas, las distancias o frecuencias de recombinacin se comportan de forma lineal, pero si aumenta la frecuencia de entrecruzamiento, obtendremos una frecuencia de recombinacin por debajo de lo que es normal. Por ejemplo en un 0,6 deberamos observar un 30% pero vemos un 20%. Este problema se agrava a medida que aumenta la distancia porque es ms probable que se den ms recombinaciones para corregir est diferencia, se hace siguiendo la funcin del mapa. Esta es una ecuacin que relaciona la frecuencia con la distancia gentica de un mapa. Est ecuacin se aplica en valores grandes cuando se ha comenzado a desviar de la realidad, porque si la distancia es pequea se asume que no hay mltiples entrecruzamientos. FR = 10% FR = 40% D = 10 cM. D = funcin del mapa.

Existen distintas formas de calcular esta relacin: 1. Funcin del mapa de Haldane se basa en la distribucin de Poisson: D = -1/2 Ln (1-2r) Donde i es la frecuencia de recombinacin observada i = 1/2 (1-e-2d) Si en el mapa tenemos el valor de distancia, y queremos saber la frecuencia de recombinacin, se procede al revs que en el caso anterior. En esta frmula se asume que no hay interferencia, que si se da entrecruzamiento en una zona no disminuye la probabilidad de que haya entrecruzamiento en la zona adyacente. 2. Funcin del mapa de Kosambi interferencia: D = 1/4 Ln (1+2r / 1-2r) para distancias grandes donde s que asumimos hay

La frecuencia es diferente en machos y hembras: Cuando se han hecho mapas de ligamento en machos y hembras, los machos son normalmente diferentes. En el esquema vemos el cromosoma tres de un animal, en macho, hembra y la media. El mapa de ligamento en la hembra suele ser ms largo. Cabe decir que las distancias fsicas entre los marcadores son iguales, pero en las hembras se da ms recombinacin y por eso las distancias en cM son diferentes. La frecuencia no es uniforme a lo largo del cromosoma: Se encuentran zonas hot spots, llamados puntos calientes de recombinacin. Esto se da tanto a nivel cromosmico como a nivel gnico, se consideran heredables. Si yo tengo un mapa fsico (p) con marcadores distribuidos

Comentario [ATF24]: Cual esquema?

452

uniformemente a lo largo del cromosoma, realizo un mapa de ligamento (c) entre los marcadores veramos que las distancias entre ellos son variables segn la probabilidad de que haya recombinacin. En el mapa no es cierto que los extremos disminuyan, sino que aumentan porque la probabilidad de recombinacin es mayor en los telmeros. Si miramos el verde veremos que la distancia aumenta de forma exponencial a medida que nos alejamos del centrmero y nos acercamos al telmero. Hasta ahora habamos observado un pedigr con una frecuencia de 0.18 entre A y 1. Nos lo podramos creer?: No, ya que por azar nos podran haber salido aquellos datos ya que slo hemos medido en seis individuos y hace falta una medida de mayor fiabilidad. Esta medida es el Lod score, que mide la probabilidad de que exista ligadura entre dos loci. Para calcular Lod score, primero hay que calcular Odds ratio (razn de semejanza). Odds: Probabilidad de encontrar una recombinacin entre seis individuos si la frecuencia es del 10%.
Odds Ratio = P( de obtener los fenotipos observados si Fr = 0%) L( ) = = L * ( ) P (de obtener los fenotipos observados si Fr = 50%) L(0,5)

Probabilidad de obtener (1 recombinacin / 6) si la frecuencia es del 50%, lo cual implica que no estn ligados. El Lod score es el logaritmo de la anterior ecuacin:
L( ) Z ( ) = Log10 L* = Log10 L(0,5)

Ej: Imaginemos que tengo 40 individuos, 8 de ellos son recombinantes y 32 parentales. FR = 8/40 = 0.2 20% Estn ligados?

Aparentemente diramos que s porque 20 < 50, pero nos lo podemos creer? Calculemos Lod score. Para calcular las probabilidades tomemos en cuenta que estamos ante una distribucin binomial:
N P( X = K ) = p K q N K K

Si FR = 0,2 R = 20%; P = 80% 40 P( X = 8) = 0,2 8 0,8 32 8 Si FR = 0,5 R = 50%; P = 50% 40 8 P( X = 8) = 0,5 0,5 32 8 Zmx 3 Zmx < -2 se acepta la ligadura. se rechaza la ligadura.

48 8 0,2 0,8 32 L(0,2) 8 Z ( ) = log 10 = 3,35 = L(0,5) 48 8 0,5 0,5 32 8

Log de 1000 = 3 significa que la P (numerador) = 0,2 es 1000 veces ms probable que la P(denominador) = 0,5 por lo que podemos afirmar que estn ligados.

Si representamos todos los Lod score de las frecuencias veremos que para =0,2 el Lod score es mximo. Est es el obtenido al calcularlo por diferentes frecuencias de recombinacin (). Se trata por tanto de una mezcla de probabilidades de ligadura, el valor para el cual se obtiene una Zmx. Es una estimacin de la frecuencia de recombinacin: Ejemplo: Vemos 2 pedigrs, no muy significativos porque no hay mucha descendencia. Vemos que el Lod score no supera el 2, as que no podemos afirmar nada. La ventaja del Lod score es que se pueden sumar los datos de diferentes familias.

453

Zmx (a) = 0,623 Zmx (b) = 0,3

(0,623 + 0,3 = 0,9)

Log (A x B) = Log (A) + Log (B)

Si supera 3 estn ligados, por debajo de -2 no estn ligados.

16.1.3.

Mapas fsicos

Mapas de clones solapados Secuencia de DNA. Un contig map es un mapa gentico que representa el orden relativo de un vinculado (contiguos) de la pequea biblioteca con la superposicin de clones que representan un segmento cromosmico completo. Los contig maps ofrecen la posibilidad de un estudio completo y, a menudo, de gran parte del genoma mediante el examen de una serie de clones que se superponen, despus, una sucesin ininterrumpida de informacin sobre esa regin. Estos mapas se han hecho con YACs pero hoy ya no se usan porque recombinan mucho, pese a tener la ventaja de que cabe una Mb. Debido a la recombinacin de los YACs se vi que en las genotecas haba un 30% de quimerismos y por eso se usan hoy mas los BACs, en los cuales caben de 100 a 300 kb. Se aisla DNA genmico y se hace una genoteca dentro de vectores BACs. Se buscan clonas que se solapan para reconstruir cada cromosoma. Despues se secuencias los BACs de forma individual. Cmo se hace el contig? Una posibilidad es por Fish, se marca cada BAC fluorescentemente y sabremos en que zona se sita. Otra metodologa son los mapas de macrorestriccin o digestin parcial (cogemos BACs y digerimos con enzimas de baja frecuencia de corte como Not I, que corta cada ocho pares de bases, Sal I que solo corta secuencias no metiladas). Finalmente podemos usar tecnologas con marcadores comunes; por Fish sabemos que los BACs se sitan en una zona, pero no sabemos el orden, aprovechamos que conocemos microsatlites en aquella regin y hacemos PCR para ellos viendo as su orden. Estas genotecas tambin se pueden hacer de un solo cromosoma y no de todo el genoma. Cmo lo aislamos? Por electroforesis de campo pulsado (PFGE). Pero en levadura que tiene pocos cromosomas va bien, pero no con mamferos que tienen muchos. Tambin por citometra de flujo que permite separar cromosomas humanos, pero si los cromosomas (como 21 y 23) tienen un tamao similar no podremos. El cuatro s, porque es el ms pequeo. La ltima opcin es por microdiseccin de cromosomas donde pescamos 1 y lo aislamos, por lo que ya lo podemos observar al microscopio. Como tenemos mapas fsicos y de ligamiento podemos integrar los dos tipos de informacin mapas genmicos integrados. Si vemos un mapa fsico y uno de ligamiento, se ha buscado la relacin entre los cM y las Mb, y se ha visto que 1 cM (1% de frecuencia recombinante) equivale a 1 Mb, aunque esto es aproximado porque variar en funcin de la especie, del sexo, etc.

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Figuras 16-1. Contig map del cromosoma 3p21.1-9 y megaplasmido pSymB de S. meliloti Strain 1021 Composicin de mapas genticos-fsicos: La medida de los cromosomas influir, ya que se ha visto que los cromosomas pequeos presentan una mayor frecuencia de recombinacin. En el grfico se representan los brazos de los cromosomas y la relacin de cM-Mb para cada uno brazos ms grandes tienen como media 1 cM -1 Mb, mientras que los brazos menores podemos llegar a 2,4 cM por 1 Mb. As pues, dada 1Mb tendremos 1 recombinacin cada 100 gametos en cromosomas grandes y dos recombinaciones en cromosomas pequeos. Los diferentes mapas que hemos visto tienen una cierta jerarqua. Los cromosmicos y los genticos son los que tienen menor resolucin mientras que la secuencia es la que presenta mayor resolucin. A partir de los mapas gentico y cromosmico, se amplia una zona ms concreta y despus todava se amplia ms viendo as no tan solo microsatlites sino tambin ESTs podemos hacer mapas de clones solapados que nos permitirn determinar el orden de los genes y conocer la secuencia. Tarea 16-1 En relacin a los mapas explicados, realiza un cuadro sinoptico explicando las caracteristicas de cada uno. Dnde crees que tengan aplicacin cada uno?

Comentario [ATF25]: Cul grfico

16.1.4.

Mapas cromosmicos o citognicos:

Bandeo: Para los mapas cromosomicos es necesario poder identificar los cromosomas de cada especie. Al principio esto ha de ser posible gracias a tcnicas de bandeo. El patrn de bandas permitir identificar los cromosomas. Existen 4 tipos de bandeo, entre los ms usados tipos de bandeo; bandeo G y el R. Ideograma: El patrn de bandas se puede representar grficamente en lo que se conoce como un ideograma a la izquierda tenemos tincin como Giemsa y a la derecha con reverso. En el caso de los bovinos vemos que solo X e Y tienen brazo p y q. Identificacin cromosomas: No siempre es fcil identificar cromosomas. Por ejemplo en pjaros hay slo ocho parejas de macrocromosomas, mientras que puede haber hasta treinta pares de microcromosomas. Los microcromosomas son muy pequeos (como un punto) y haciendo tcnicas de bandeo no se pueden diferenciar.

455

Cmo diferenciar cromosomas? Con la tcnica del Chromosome Painting. Se desarrollan sondas especficas para cada microcromosoma y se hace hibridacin in situ. Las sondas se marcan con fluoroforos que despues pueden ser visualizados en un microscopio (Figura 16-1).

Figura 16-1. Algunos cromosomas marcados con fluoroforos. Mapas cromos Vemos algunos genes marcados con verde. En algunos casos se puede precisar su localizacin ms exacta mientras que en otros slo podemos decir que est en un cromosoma determinado. Mtodo FISH y sus variantes: Cromosomas normalmente en metafase (est condensado y lo podemos ver al microscopio ptico). Con las sondas fluorescentes se ven cuatro cromosomas. Hay dos cromosomas homlogos y cada una de las dos cromtidas hermanas unidas. Una vez identificado dnde est, teiremos para conocer en que cromosoma est. El problema es que es necesario elaborar la sonda y unicamente lo podemos hacer si previamente hemos aislado el gen. Metafase: La resolucin es bastante baja. Para incrementarla puedo estirar cromosomas y los dos puntos de hibridacin quedarn ms separados. Esto se puede hacer por estiramiento mecnico a travs de centrifugacin. Ncleo interfsico: Otra opcin es hacer Fish con cromosomas que tengan ncleo interfsico, pero ahora el DNA no est compactado, lo usaremos principalmente para ordenar genes, pero con el inconveniente de que la distancia no puede ser correcta porqu los puntos estarn curvados, es necesaria una media entre diversos ncleos. Fibras de DNA (BAC o YAC): La otra alternativa es usar fibras de DNA que son BAC o YAC, sobre los que puedo saber la posicin de genes dentro de stos. Mtodo Clulas somticas hbridas (RH): Se debe escoger la especie de inters, y por otro lado disponer de clulas tumorales de ratn o hmster. Las clulas de la especie de inters (en est caso de vaca) son irradiadas (si no hiciramos esto no se romperan los cromosomas). Seguidamente se fusionan los dos tipos de clulas (usando PEG) que favorece la fusin de citoplasma o bien usando virus como el (Sendai) que se unen a la matriz y por contacto permiten la fusin. Obtendremos una clula hbrida que tendr cromosomas de ratn enteros y cromosomas de vaca rotos. Seguidamente se hace el proceso de seleccin, donde de forma aleatoria se van perdiendo los fragmentos de la vaca, pese que a veces queda retenido de forma estable algn trocito de uno de los cromosomas de la vaca (la retencin de un fragmento u otro es aleatoria). Tendremos una coleccin de clulas, cada una de ellas, con diferentes fragmentos de cromosoma de la vaca. En est proceso nos interesa tener ms de 100 clones o clulas diferentes que entre todas contengan el genoma de la vaca.

Comentario [ATF26]: Qu significa

456

Caracterizar los clones: Seguidamente es necesario caracterizar lo que tiene cada uno de estos clones celulares. Cmo lo sabremos? Si tengo marcadores que s que estn en un cierto cromosoma, puedo hacer Fish e identificar en que clon est aquella regin del cromosoma, o PCR, bandeo Una vez que hemos caracterizado ste es muy til para localizar y posicionar nuevos genes. Determinar las clulas en un cromosoma: Imaginemos que tenemos 27 clulas de parejas para el cromosoma 4 del cerdo. La lnea vertical negra nos indica que trozo del cromosoma tiene cada clula; por ejemplo la 6, 18, 20, 25 y 27 tiene todo el cromosoma 4. Si tenemos el gen entre FABP4 puedo hacer PCR para identificar (tan slo es necesario hacer sta para amplificarlo sobre las clulas que tengo en el par, e identificar en que regin del cromosoma est). Por ejemplo si hacemos esto y solo nos saliera una banda en el gel (por lo tanto ha habido amplificacin): 1, 6, 9, 11, 12 puedo acotar que estara en el cromosoma 4 brazo p, entre las bandas 13 y 15 4p 13-15. Estos mapas conocidos como RH (Radiation Hibrids) tienen ventajas respecto a los mapas de ligamiento: Los marcadores no deben ser polimrficos. No debe haber interferencia. No hay diferencia entre sexos. La resolucin puede ser ms grande que en los mapas genticos pero depende del par, es decir de la radiacin que hayamos utilizado. A ms radiacin ms trozos pequeos. Con estos mapas no tan solo podemos identificar la localizacin, sino tambin establecer distancia con otro marcador que ya estaba localizado. La probabilidad de que A y B estn en el mismo fragmento es ms elevada que en BC. La medida de la distancia es la probabilidad de rotura cromosmica entre los dos marcadores (omega). Adems no hay interferencia porque el hecho de que haya rotura en un punto no quita que se pueda dar en otro. El valor de omega oscila entre 0 y 1, no es aditiva y es necesario aplicar funcin de mapa como en los mapas de ligamiento. La medida de la distancia es cR (unidad de distancia que indica frecuencia de rotura): Ejemplo: 1 cR 10 cR A y B estn en clulas diferentes en 1 de cada 100. B y C estn en clulas diferentes en 10 de cada 100.

Pero la distancia depender de la radiacin que se utilice para construir el panel. Ms radiacin, ms fragmentos pequeos y por tanto la probabilidad de que A y B estn separados ser mayor. Por ello se evala la relacin kb / cR ern cada panel RH. Si s que el marcador 1 y 2 estn a 20 mega bases (distancia real) y al hacer esta tcnica me salen 20 cR podr establecer que en este panel 1 cR es igual a 1 Mb.

16.2.

Aplicaciones de los mapas genticos

Los mapas genticos se puede usar para identificar las regiones que contienen genes que determinan caracteres econmicos y cuantitativos importantes (Quantitative Trait Loci o QTLs). Por ejemplo, rendimiento de grano, das de floracin femenina, altura de planta, tolerancia a la sequa, etc. Tambin nos interesan las caractersticas que determinan susceptibilidades, defectos o genes que determinan resistencia a cierta enfermedad. Adems de identificar los genes, la genmica (no tan solo los mapas) permite otras aplicaciones como genotipado de genes de inters productivo, hacer seleccin asistida por marcadores MAS (usa informacin de marcadores para introducir de un genotipo a otro un carcter de inters, haciendo cruzamiento en la zona del genoma que nos interesa), tambin introgresin asistida (pasar de una raza a otra) por marcadores MAI (Marker assisted Introgession). Otra utilidad es identificar paternidades, y finalmente tambin modificar los genes de inters.

457

El nmero de genes que provocan enfermedades hereditarias y que han sido identificados aument exponencialmente. Caracteres cualitativos: Son aquellos caracteres con variacin fenotpica en dos o pocas categoras. La variacin de est carcter es discontinua ya que da saltos de una forma a otra (verde, amarillo o blanco). Generalmente se deben a caracteres determinados por un nico gen, que ya sea que est en su versin normal o mutada (negro o albino). Caracteres cuantitativos: Son aquellos caracteres con variacin fenotpica en una escala continua medible debido a causas genticas o ambientales. La variacin de este carcter puede ser discreta o continua pero siguiendo una distribucin normal. Suelen ser multifactoriales. Se utiliza el modelo de Fisher (modelo infinitesimal) que determina los caracteres por infinitos genes (poligenes) con efecto muy pequeo y aditivo. Esto es difcil de creer porque no hay infinitos genes, adems, no siempre es aditivo porque no puede haber equidistancia y tampoco todos tienen un efecto pequeo, aunque a pesar de todo esto es un modelo muy utilizado actualmente porque funciona bastante bien. Hasta que no hemos tenido herramientas que nos permiten caracterizar los caracteres cuantitativos. Vemos que cuando tenemos dos loci no es igual a una distribucin normal, pero cuando ya tenemos mas de 3 s. QTLs: Locus que afecta a caracteres cuantitativos, es una regin de un cromosoma que tiene uno a ms genes que afectan a un carcter cuantitativo. Cabe decir que slo podemos detectar los loci que tienen un efecto importante sobre el carcter. La contribucin de cada QTL puede ser diferente aunque influyan sobre el mismo carcter, depende del fondo gentico. Un QTL puede ser muy importante en una variedad y en otra no. Se ha visto que hay enfermedades multifactoriales: cncer, asma en las que tendremos factores genticos y ambientales que determinan la enfermedad: puedo clasificar individuos en la poblacin segn su predisposicin a sufrir la enfermedad en funcin de sus genes y factores ambientales. Vemos dos poblaciones diferentes. La poblacin 1 da lugar a una media diferente a la poblacin 2. La media de 2 es mayor porqu est desplazada hacia la derecha. Slo los individuos que superen un determinado lindar sufrirn la enfermedad. Cmo se detectan los QTLs? Intentar asociar el fenotipo con un determinado locus. Para hacerlo hace falta una poblacin de estudio o bien unos cruzamientos hechos expresamente para abordar este problema. Hay un gran trabajo de genotipar marcadores y polimorfismos de genes, finalmente hay una parte estadstica para asociar fenotipo con genotipo. Todo esto se basar en el anlisis de ligamento. Partimos de un individuo heterocigoto por un QTL: los que reciban Q grande tendrn ms prolifericidad, junto QTL hay un marcador para que el individuo sea heterocigoto. Si no hay ligamento tendremos cuatro gametos con probabilidad , los que tienen Q la van com M y con m: no se encuentra ningn tipo de asociacin. Si estn ligados (estn en el mismo cromosoma y muy cerca por lo que no hay recombinacin) Q siempre ir con M, miremos si el individuo es M y entonces eso ser que ha tenido Q y que es
Comentario [ATF27]: Cmo es esto?

Comentario [ATF28]: Qu significa

458

prolfico. Esto solo ocurre si estn totalmente ligados. Habr asociacin total entre marcador y fenotipo (Q y M). Si estn parcialmente ligados s que se podr dar recombinacin, pero recordemos que los recombinantes estarn en menor proporcin. Si la FR es 20% veremos QM en un 80% y Qm en un 20% encontraremos una cierta asociacin, M est relacionado con Q. Si el locus que afecta al carcter cuantitativo est cerca del marcador podremos establecer la anterior asociacin. Veamos el toro que es Qq para el locus que determina la produccin de leche. Miramos en sus hijas: el amarillo produce menos leche y vemos que en ellos es ms frecuente el alelo m.

16.2.1.

Mapa gentico de maz

Figura 16-2. Mapa gentico de maz

459

16.2.2.
16.2.2.1.

Metodologas para identificar genes

Aproximacin de genes candidatos

Consiste en analizar genes que estn relacionados con la fisiologa del carcter de inters. Por lo regular son genes cuya funcin o fenotipo se determino en una especie modelo. Primero de hace una lista de todos los genes candidatos. Despus se pueden determinar polimorfismos en estos genes para hacer un estudio de asociacin. La Diabetes es una alteracin metablica producida por un incremento en los niveles de glucosa en sangre, la Diabetes Tipo 2 (DT2) es la que se presenta generalmente en el 95% de los casos y en Mxico y es la segunda causa de muerte a nivel nacional en los adultos. Se han descubierto ms de 40 genes candidatos ara explicar el desarrollo de este padecimiento que es multifactorial y polignico.( Garca Fajardo LV1, Garca Mena J1, Wacher Rodarte N2, de la Vega F3, Kumate J4, Cruz Lpez M2 asociacin de polimorfismos de una sola base (snps) en genes candidatos capn10, irs-1 y ppar- con diabetes tipo 2 en una muestra de poblacin mexicana www.smb.org.mx/XXVICONGRESO/text). Por ejemplo los genes candidatos podran ser en el cerdo ibrico, que tiene una prolificidad baja, pero en cambio hay una raza china que no es tan buena en la produccin de carne pero que su prolificidad es el doble y llega antes a la pubertad. Quiero saber los genes del cerdo chino que determinan la prolificidad y transferirlos al ibrico. Para ello, cruz un macho ibrico y una hembra china, la F1 se cruz entre s dando F2 1000 animales con diferencias fenotpicas. Se hace la lista de genes candidatos: receptor de prolactina, ESR, FSM, FSM y seguidamente buscar polimorfismos. Una vez que tengo la lista de candidatos escogemos unos cuantos y buscamos polimorfismos por ejemplo la FSM: sabemos que tiene 4 exones: elaboramos primers y hacemos PCR, secuenciamos el fragmento y puede ser que encontremos algn polimorfismo en aquel intrn. Entonces secuenciamos nuestros individuos FO y vemos que todos los Meishan (chino) son T en aquel polimorfismo y los ibricos son C. Seguidamente haremos un estudio de asociacin en la F2. Para hacerlo primero hay que genotiparlos porque todos los F1 son CT de forma que en F2 podemos encontrar 3 genotipos: CC, CT y TT. T (presente en meishan) ser el responsable de que haya mayor prolificidad: miramos de contrastar si los TT sern ms prolficos que los CC. Si la respuesta es afirmativa nos indicar que este gen tiene influencia sobre la prolificidad. Puedo asegurar que este cambio nucleotdico es el causante de las diferencias? Como que es un carcter cuantitativo solamente si el gen tiene un peso importante lo detectaremos (15-20%) porque tambin intervienen efectos ambientales. Imaginemos que esto explica un 20% de las diferencias de prolificidad, puedo afirmar que este SNP es responsable? En principio no, porque hemos de tener en cuenta que este SNP se situar dentro de un intrn: poco probable que tenga efecto, pero esto no nos lo podemos creer del todo. Si estuviera en un exon y diera un cambio en la protena. Lo que tendramos que hacer para saberlo es identificar la mutacin causal. Si CC o TT no explica las diferencias ha de ser alguna otra cosa que est prxima al SNP (ya que se heredan conjuntamente). Por tanto hay que secuenciar, todo y que es bastante difcil porque la mutacin puede estar en muchas kb, por ejemplo se observa que hay una deleccin o insercin en el exon 1. Hay que tener en cuenta que podra darse recombinacin de forma que T se heredase con delecin excepto si hay recombinacin que el marcador y la mutacin causal no se heredan conjuntamente).

460

Una vez se ha encontrado la mutacin causal hay que hacer validacin gentica: hay que mirar si esto se da en otra poblacin. Tambin hemos de validarla funcionalmente: vamos a otro modelo animal diferente del cerdo como el ratn e intentamos simular el cambio nucleotdico para ver si pasa esto. Tambin se podra actuar sobre el cerdo y hacer estudios de expresin para ver si se expresa ms o menos. Para verificar la asociacin habra que hacerlo en ms generaciones y en otras poblaciones. En el caso de que haya asociacin puede ser debido por desequilibrio, azar o que la mutacin no acte sola. Hay muchos otros genes que afectarn a la prolificidad, por lo que depender del fondo gentico aunque el gen tenga influencia importante siempre depender de otros genes o factores. Al hacer aproximacin por genes candidatos apostamos por un nmero limitado de genes y el genoma es muy grande, as que puede ser que los genes que miramos no sean realmente los causantes. Aun as se han obtenido muy buenos resultados. En el cerdo se han utilizado para estudiar caracteres como la prolificidad, calidad de la carne, etc. En la prolificidad se han visto muchos genes implicados. ESTs Se hacen muchos estudios de ESTs que son secuencias expresadas cortas y parciales. A partir de mRNA obtenemos cDNA que ponemos en el plsmido y tendremos as una genoteca, ahora lo secuenciaremos. Esto permite caracterizar todo aquello que se est expresando en un tejido concreto o en un momento concreto sabemos que genes estn activos, es como hacer un northern virtual ya que la abundancia de un mRNA concreto nos indicar donde expresar ms. Qu tipo de comparacin haremos? Lneas especializadas por ejemplo, una lnea A produce muchos ms vulos que una lnea B, podemos ver genes implicados comparando los dos ovarios. Diferencias en produccin lneas de buena calidad de la carne vs. Lneas de baja calidad, o bien vacas con mucha leche y vacas con poca. Buscar los genes responsables. Diferencias en tratamientos ver como influyen a uso de los medicamentos.

16.2.2.2.

Clonacin por posicin

Supongamos que no se sabe nada (o muy poco) del conjunto de genes que determinan algun carcter. Que podemos hacer? Se puede buscar marcadores a lo largo de todos los cromosomas. Por ejemplo si se quiere analizar 100 microsatlites en 300 variedades, eso supone analizar 30.000 genotipos. Si vemos el resultado que nos muestra este diagrama afirmaremos que estos microsatlites no son informativos para el gen de inters: el estudio de asociacin con est microsatlite no nos indica nada, se hereda independientemente del carcter cuantitativo porque o bien se encuentra en un cromosoma diferente, o bien est en el mismo cromosoma pero muy alejado del QTL. En este caso encontramos asociacin entre B y el QTL. Como que usamos marcadores que se donde estn en este punto del mapa cromosmico ya que Q y B se encuentran tan cerca que siempre se heredan juntos y no hay posibilidad de recombinacin. Una vez situamos ms o menos el gen habr que refinar esta posicin, por esto buscaremos todos los posibles marcadores que haya en esa regin. Tambin lo que podemos hacer es ampliar el nmero de individuos segregantes estudiados. Para hacer esto con humanos, usaremos familias en las que segrega una enfermedad (rojo). Normalmente se trabaja con parejas de individuos emparentados (hermanos) que tienen la

461

enfermedad. Se analiza si tienen los mismos alelos de microsatlites y si es as querr decir que el microsatlite est asociado al gen responsable de la enfermedad. La otra posibilidad es hacer el estudio de asociacin en una poblacin donde haya individuos enfermos y sanos, mirar si hay microsatlites asociados a las personas sanas y que no estn en las enfermas. Lo que es ideal y se utiliza con especies domsticas son los cruzamientos experimentales para generar desequilibrios de ligamento, como por ejemplo cruzar dos variedades que son muy diferentes genticamente. A veces no se puede validar el gen debido a: - el desequilibrio de ligamiento - asociacin del gen candidato al azar - interaccin del gen con el fondo gentico especfico de la poblacin estudiada.

16.2.2.3.

Genes candidatos por posicin

Es una estrategia, donde por anlisis por ligamiento localizamos en que cromosoma est el gen, entonces, miramos los genes candidatos que hayan sido descritos en aquella regin del cromosoma o en cromosomas homlogos de otras especies. Seguidamente se hace deteccin de polimorfismos y estudios de asociacin. Se hace con mapas comparativos si no se dispone del genoma secuenciado y si se tiene, se hace un anlisis de genes candidatos en la regin exacta. Despus se detectan polimorfismos y se hacen estudios de asociacin.

16.2.2.4.

Mapas comparativos

Si detectamos QTLs en el cromosoma 4 de la caa de azucar, vamos a encontrarnos con la limitante de que el genoma de esa especie no se ha secuenciado al 100%. Sin embargo, si vemos que esa zona genomica es sintenica con el cromosoma 8 del arroz, entonces podemos buscar los genes del arroz (que si se ha secuenciado en su totalidad), y depues tratar de confirmar la presencia de esos en caa de azucar. Se pueden realizar dos lneas paralelas de investigacin. Deteccin de barridos selectivos Cada vez es ms econmico secuenciar el genoma completo de una especie. No es necesario analizar todos los SNPs (son millones), si identificamos los tag SNPs, con ellos ya tendramos suficiente debido a que diversos SNPs estn ligados. A eso se le llama desequilibrio de ligamiento (linkage desequilibrium). Hablaremos entonces de hacer un genoma scan usando mapa de SNPs de alta densidad o bien resecuenciar el genoma de una poblacin, por lo que podramos detectar barridos selectivos. Las especies domsticas se han seleccionado de forma muy intensa por ciertas caractersticas fenotpicas, lo que ha producido una huella en el genoma que podramos detectar (barrido de seleccin). Cuando un locus es seleccionado se intensifica la frecuencia en detrimento del resto. Imaginemos que se produce una mutacin que es favorable para que aumente el contenido de azcar. Seleccionamos esa mutacin y aumentamos su frecuencia en la poblacin, al cabo de unas generaciones la mayora de individuos tendrn la mutacin en su genoma, pero aumentar la frecuencia de la mutacin implica aumentar la frecuencia de un trozo del genoma, lo cual arrastrar otros SNPs que estn cerca y que tambin sern seleccionados (Haplotipos). Con el paso del tiempo ir desapareciendo este desequilibrio por ligamiento y aumentar la diversidad gentica por recombinacin, aparicin de nuevas mutaciones, etc. Este proceso es ms lento.

462

Despus del proceso de seleccin en esta zona del genoma se espera una zona cromosmica con poca variabilidad, ya que los individuos sern homocigotos para esta regin del genoma. Otra manera de verlo es a travs de un grfico presentando el grado de heterocigoticidad a lo largo del cromosoma. Azul es igual en una zona del cromosoma, esperamos una bajada del heterocigotizado porque un cambio nucleotdico ha sido escogido.

463

17. Metodologas Mejoramiento

17.1.
17.1.1.

de

Metodologas clsicas
Introduccin

El mejoramiento de plantas es un trmino utilizado para describir la creacin, seleccin y establecimiento de fenotipos superiores de especies vegetales. El desarrollo de cultivos mejorados debe responder a las necesidades tanto de los productores como de los consumidores. Las principales metas del mejoramiento de plantas, incluyendo a los cultivos agrcolas y hortcolas, se han enfocado a mejorar el rendimiento, la calidad nutrimental y otras caractersticas de valor comercial. Dentro de la escala global, el paradigma del mejoramiento de plantas ha sido extraordinariamente exitoso, encontrando ejemplos importantes como la introduccin de variedades de trigo (Triticum aestivum) y arroz (Oryza sativa) que generaron la revolucin verde (Everson y Golin, 2003). Tambin estn los ejemplos sobre el desarrollo de hbridos de maz (Zea mays; Duvick, 2001) y la reciente comercializacin de cultivos transgnicos (James 2007). Estos y muchos otros productos que resultaron del mejoramiento de plantas, han generado mltiples beneficios para la sociedad en general, en trminos de un mayor y sustentable suministro de biomasa, la cual es cosechada y aprovechada en forma de alimentos, vitaminas, medicinas y diversas materias primas como fibras, madera, papel, lubricantes y combustibles. El mejoramiento de plantas tiene una larga historia integrando las ltimas innovaciones en biologa y gentica para optimizar el desarrollo de cultivos optimizados. La seleccin prehistrica de fenotipos visibles que facilitaban la cosecha e incrementaban la productividad, llevaron a la domesticacin de las primeras variedades de cultivos (Harlan, 1992). Esta domesticacin puede ser considerada como uno de los primeros ejemplos de biotecnologa, entendida en un sentido amplio, como el uso de herramientas tecnolgicas para facilitar procesos biolgicos.

17.1.2.

Importancia del ambiente

La informacin gentica determina el potencial de una especie. Pero eso no significa que el potencial que tienen los genes realmente se expresen a nivel de fenotipo. La interaccin inherente de los genes, los transcritos, las protenas y los metabolitos con el ambiente es la que finalmente determina el fenotipo observable de un individuo. La evaluacin correcta y precisa de la variacin fenotpica es el elemento crucial para una seleccin efectiva. No es suficiente con medir solo la variacin genotpica, ya que esta no incluye los otros parmetros que son muy importantes. La variacin expresada depende tanto del potencial gentico como de las condiciones del ambiente (factores biticos y abiticos), as como de las variaciones circunstanciales del azar. La magnitud del efecto de cada uno de estos componentes puede variar de caso en caso. Las metodologas clsicas de mejoramiento gentico parten precisamente de este punto. Las metodologas modernas deben tomar en cuenta esta complejidad. La conexin entre genotipo y fenotipo no es tan simple como la conexin entre una secuencia nucleotdica y su secuencia protenica.

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17.1.3.

Importancia de los modos de reproduccin

El conocimiento detallado del modo de reproduccin de una especie es esencial para su mejoramiento. La forma de reproduccin de un cultivo es un factor categrico para el desarrollo adecuado de esquemas de cruzas, incluyendo los mtodos de seleccin que se deben aplicar para el mejoramiento. Lo que se entiende es por ejemplo: la auto-fertilizacin de cultivos como en el trigo, implica formas de trabajo muy diferentes a los que se usan en una especie de polinizacin cruzada como el maz, que adems muestra un fuerte efecto de heterosis. Por lo regular se usan mtodos de seleccin para un cultivo que toman en cuenta el estado gentico en que van a ser usados en campo. Es difcil escoger lo que se quiere a nivel de hibrido, si solo de evala el fenotipo a nivel de lnea. Por ejemplo, la autopolinizacin de cultivos de polinizacin cruzada conduce a la drstica reduccin en su rendimiento. A esto se le llama depresin endogmica. Un investigador que no este acostumbrado a trabajar con hbridos tal vez pueda subestimar estos detalles al inicio. Es por ello que muchas veces los investigadores deben aprender las particularidades de una especie antes de convertirse en buenos mejoradores. Un mejorador que ha trabajado con trigo tarda de 2 a 5 aos en convertirse en un buen mejorador de maz. Por otro lado, los mejoradores de arroz y de trigo pueden transferir sus prcticas ms rpidamente debido a que estos dos cultivos son igualmente autgamos. Lo mismo sucede entre sorgo y maz, que son ambos cultivos hetergamos. Por otro lado, los mtodos de mejoramiento de cultivos sexuales son totalmente diferentes de los cultivos de reproduccin asexual (por ejemplo, cultivos clonales como el agave o el pltano). La propagacin asexual es un tipo de reproduccin en donde alguna planta o parte de ella pueden ser utilizadas para la multiplicacin, sin siquiera implicar un cambio gentico de generacin en generacin. Es por ello que deben de tomarse muy en cuenta los parmetros sexuales y las condiciones genticas en que se hacen las evaluaciones de campo y la seleccin de los genotipos. La seleccin de vegetales se puede dividir en cuatro grandes categoras: la cra de lneas de cultivos autgamos (trigo, arroz, etc) la cra de poblaciones de cultivos algamos ( la cra de hbridos en cultivos alegamos que presentan una fuerte heterosis (maz, sorgo, etc) la cra de clones de cultivos de propagacin vegetativa (por ejemplo agave, henequn, pltano, papa, fresa, aguacate, etc). Dentro de estas categoras, hay varios mtodos de cultivos posibles. Adems, existe un amplio espectro de tcnicas y tecnologas para realizar pasos ms fciles de estos mtodos, ms rpidos, ms precisos, o permitir a todos ellos, como: El cultivo de de microsporas, el rescate de embriones, mutagnesis, la transferencia de genes mediada por Agrobacterium, el anlisis de QTLs, los marcadores moleculares, etc.

17.1.4.

Autopolinizacin o polinizacin libre

Algunas de las razones por las cuales el mtodo de auto fertilizacin es tan efectiva, es por la eficacia de la reproduccin, as como la disminucin de la variacin gentica. La mayora de los loci se fija con una tasa alta. Lo que se pretende es la fijacin de alelos superiores correspondientes a genotipos altamente adaptados. Esto se debe a que con cada generacin de autopolinizacin la tasa de heterocigotos disminuye en un 50%, por lo tanto, una homocigosis de 99% se obtiene despus de 5 a 8 autofecundaciones. En las plantas de polinizacin libre, casi no se produce la endogamia. Este modo de reproduccin permite la seleccin natural en las poblaciones silvestres de esas plantas. Las plantas no-genticamente fuertes o inestables se eliminan de la poblacin en una primera fase

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evolutiva. Los pasos crticos en la mejora de la libre fertilizacin de los cultivos, son la eleccin de los padres y la identificacin de las mejores variantes, que se generan por la segregacin en cada generacin. Los mtodos de seleccin que se usan son por ejemplo: la seleccin masal, la seleccin por pedigr y la seleccin recurrente. Tambin existen formas de derivar lneas como la seleccin de descendientes de sola semilla (SSD), o la generacin de lneas por medio de de dobles haploide (DH) duplicados. En la mayora de los programas de mejoramiento gentico se aplica una combinacin de algunos de estos mtodos. En las siguientes secciones explicaremos algunos de los mtodos de seleccin de forma resumida.

17.1.5.

Seleccin Masal

Este mtodo de seleccin depende principalmente de la seleccin masiva de plantas dentro de una poblacin, de acuerdo a criterios del fenotipo de plantas individuales. Se siembra una poblacin en una parcela aislada, y se fomenta la polinizacin cruzada entre todas las plantas (recombinacin por polinizacin libre). Por lo regular se usan densidades de plantacin altas. Este tipo de seleccin se lleva a cabo sobre todo con cultivos semilla pequea como la alfalfa, que generalmente son plantadas en altsimas densidades. Tambin se hacen seleccin Masal para diversas poblaciones criollas de maz. Se seleccionan plantas en base a alguna caracterstica de inters. Por ejemplo: aspecto de planta, tamao de mazorca, forma de grano, color de semillas, etc. Las plantas, mazorcas y semillas seleccionadas se mezclan y se siembran a granel para la prxima generacin. Este mtodo se utiliza para mejorar la poblacin en general por medio de un criterio o varios criterios fenotpicos o genotpicos. La seleccin puede ser positiva o negativa. Es un mtodo sencillo y a la vez eficaz y rpido para la mejora de razas o poblaciones criollas. Un inconveniente de la seleccin masal es la gran influencia que el ambiente tiene sobre el desarrollo del fenotipo y el rendimiento de las plantas individuales. A menudo no est claro si las plantas fenotpicamente superiores son tambin genotpicamente superiores. Las diferencias de ambiente pueden conducir a que la seleccin masal tenga muy baja eficacia, y por consiguiente, el progreso gentico por unidad de tiempo sea menor al que se puede obtener con otros esquemas de mejoramiento.
En la seleccin en masa hay algunos factores que deben tenerse en cuenta al seleccionar las plantas. Es mejor seleccionar por bloques. El gradiente de campo puede ser un factor muy importante en el momento de la seleccin. La seleccin se debe hacer cuando la mayora de las caractersticas de la planta se presenten claramente. En algunas plantas es durante la floracin, mientras que en otras es durante la cosecha.

El mtodo de seleccin masal slo ser efectivo para los rasgos altamente hereditarios. Es decir, solo funcionar para los razgos fenotpicos que sean altamente visibles a nivel de planta o semilla individual. Esto solo se da para caractersticas con alta heredabilidad, por ejemplo, el color azul o amarillo de las semillas de maz. Sin embargo, este mtodo es simple y barato y supone menos trabajo que la seleccin pedigr en las generaciones primordiales. Es muy recomendable tener grandes poblaciones de plantas para garantizar que suficiente segregacin para que los mejores combinaciones de alelos se presenten en algunas plantas individuales cuando empieza la seleccin. Durante los avances generacionales, un nmero menor de registros se mantienen a comparacin que la seleccin por pedigr.
La seleccin masal es el mtodo ms simple, ms fcil y ms antiguo de seleccin de plantas. Las plantas individuales son seleccionadas en base a su desempeo fenotpico. Se utilizan semillas a granel para producir la prxima generacin. La seleccin en masa ha demostrado ser muy eficaz en el mejoramiento de maz en las etapas iniciales. Pero su eficacia para la mejora del rendimiento fue objeto de severas crticas en los aos 40 en Estados unidos. Esto finalmente culmin en el perfeccionamiento de los mtodos de seleccin para maz. Esta seleccin no prev ningn control sobre la matriz de polen durante la polinizacin. La fuente de polen no se conoce en una polinizacin cruzada. Como consecuencia, la seleccin se limita

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slo a las madres. Las estimaciones de heredabilidad se reducen a la mitad, ya que slo los padres se utilizan para la cosecha de semillas. Sin embargo, los avances generacionales son de un solo ciclo, por lo que se pueden llevar mas rondas de seleccin a comparacin con otros mtodos de seleccin que requieren de 2 a 3 aos para cada ciclo de seleccin.

Variedad A x Variedad B

F1
Polinizacin libre Lote aislado

F2
Polinizacin libre Lote aislado

Parcela masiva
Seleccin de mejores plantas

F3
Polinizacin libre Lote aislado

Parcela masiva
Seleccin de mejores plantas

F4

Parcela masiva

F5
Mazorca por surco

Siembra espaciada

F6
Cruzamiento con probador

Surcos de plantas

F7 a F10

Loc 1

Pruebas de rendimiento

Loc 1

Rep 1

Rep 2

Figura 17-1. Mtodo de seleccin de poblacin masiva (Masal). Mtodo de seleccin Masal: La progenie de la cruza se cultiva en forma masiva hasta le generacin F5. Se seleccionan plantas o cabezas de lnea y se siembran en surcos de plantas o cabezas de lnea en la F6. Se seleccionan los surcos superiores y se cultivan en un ensayo preliminar de rendimiento. Las cepas superiores se hacen crecer en pruebas de rendimiento de la F8 a la F10. Pueden hacerse varias modificaciones a este procedimiento, por ejemplo la seleccin podra comenzar en la F3 o F4, purificando las lneas que tengan un rendimiento superior en las siguientes generaciones; o bien, las parcelas masivas podran repetirse y cosecharse para determinar el rendimiento y desechar cruzas completas con base en el rendimiento de dichas parcelas.

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Seleccin peridica Este tipo de seleccin es una versin refinada de la masa y difiere de la siguiente manera: Visualmente los individuos son seleccionados de poblaciones sometidas a pruebas de progenie. Las plantas seleccionadas sobre la base a los datos de la prueba de progenie se cruzan unos con otras en todas las formas posibles para producir semillas. Esto forma la base para la nueva poblacin. Generacin de lneas por medio de semillas nicas (SSD) Este mtodo se introdujo como un medio para transformar toda la generacin F2 tan rpido como sea posible en una generacin de plantas homocigotas. Esto a pesar de que la poblacin inicialmente sea muy heterognea. Este mtodo puede utilizarse para reducir el tiempo que se requiere para eliminar los genotipos que an no son homocigotos. Debido a que con slo se desea obtener una semilla por planta (no toda una mazorca), entonces las plantas pueden ser sembradas a muy alta densidad. Tambin se puede intentar tener dos o tres, a veces incluso ms ciclos por ao. Esto puede hacer que el proceso para la liberacin de un cultivar, se disminuya de 10 a 5 aos. El mantenimiento de registros no es necesario a principios de cada generacin. La desventaja es que este mtodo no elimina las plantas ms dbiles como en otros mtodos, y no existe ninguna disposicin para la seleccin de plantas superiores en la generacin F2. Algunos investigadores han hecho modificaciones de este mtodo para remediar esos problemas. Una variedad desarrollada por este mtodo ser ms uniforme que los elaborados por la seleccin masal, porque todas las plantas de tal variedad tendrn el mismo genotipo. Las semillas de plantas seleccionadas no se agregan. Si no que estn separados y son utilizados para realizar pruebas de progenie. Esto se hace para estudiar el comportamiento reproductivo de las plantas seleccionadas. Seleccin de hermanos completos Las plantas de la poblacin original se autofecundan para producir progenies S1, que son evaluados en el prximo ciclo. Esto se puede hacer con ensayos de mltiples repeticiones y en diferentes localidades para identificar las familias S1 prometedoras. El remanente de semillas S1 de estas familias seleccionadas se recombina en la tercera temporada. Como consecuencia, un ciclo se puede completar en tres ciclos. Las unidades de seleccin y recombinacin son las progenies S1. Seleccin de medios hermanos La seleccin se hace en base a pruebas de progenie de rendimiento en lugar de la apariencia fenotpica de las plantas de sus padres. Las semillas seleccionadas de medios hermanos, que han sido polinizadas al azar por el polen de la poblacin, se cultivan en filas con el propsito de seleccin. Una parte de la semilla se siembra para determinar la capacidad de rendimiento, de cualquier carcter de cada planta. La semilla de las familias ms productivas se cosecha a granel para completar un ciclo de seleccin. Mtodo dobles haploides Se pueden producir plantas haploides por la eliminacin de cromosomas. Se pueden obtener a por medio del cultivo de microesporas. Sin embargo, las cruzas con inductores de haploida son mas utilizados hoy en da por su capacidad para producir plantas haploides con mucha mayor cantidad en comparacin con los otros mtodos. Destaca que son necesarias para alterar el desarrollo de vas de microsporas de producir polen a la formacin de plantas haploides. Actualmente, el llamado mtodo inductor es muy utilizado en el mejoramiento del maz (el maz hbrido)

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El nmero de cromosomas haploides de las plantas se duplica con el tratamiento de colchicina. Espontneamente las plantas haploides se duplica, sin embargo, tambin puede ser producido directamente a partir de los tres mtodos. Los mtodos de rescate de embriones pueden utilizarse para garantizar que las semillas de estos cruces no se aborten. Este mtodo tiene el potencial de acortar los ciclos de mejoramiento gentico en comparacin con los mtodos del pedigr o de distribucin masiva. Al igual que el nico mtodo de seleccin de semillas, a principios de generaciones no estn sujetos a la seleccin, pero la mayora de las lneas se eliminan durante la evaluacin de campo los ensayos. El objetivo es el mismo que para SSD: transformar el material gentico de la F1 tan rpido como sea posible en un homocigoto en la mayor parte de las plantas. Este mtodo en mano de obra es muy intenso y el ms caro de los procedimientos porque aumenta la cantidad de generaciones por ao. Por este mtodo para tener xito, los vegetales deben ser genticamente estables. Retrocruzas: Es un mtodo de seleccin para el mejoramiento de genotipos. Este es un tipo de cruza repetida con el mismo padre recurrente. Se puede generar as una lnea isognica. Un alelo puede ser incorporado en el fondo gentico de una lnea elite. El llamado padre recurrente (a la variedad) es altamente productiva y comercialmente de xito, pero carece de este gen especfico (por ejemplo, la resistencia a las enfermedades). Este rasgo es, por ejemplo, puede estar presente en una variedad silvestre o extica (donante). Despus de la primera cruza, se repite la cruza con el padre recurrente. Despus de cada cruza las plantas hbridas con la combinacin de genes deseados deben ser identificadas y seleccionadas. Despus se cruzan de nuevo con el padre recurrente. Esta tcnica es fcil cuando los rasgos que se aaden son fcilmente heredados. Es decir, es adecuada para introgresar alelos dominantes y fcilmente identificables en las plantas hbridas. Si hay genes no deseados que estn estrechamente emparentados con el gen deseado, los genes no deseados son transferido junto con el gen deseado y los descendientes pueden sufrir de un desperfecto. Una de las ventajas del mtodo de la parte de atrs, es que las pruebas (para que no sea el rasgo deseado) no es necesaria. Este mtodo se utiliza para, por ejemplo, transferencia de la esterilidad masculina en lneas puras, que es un requisito previo para muchos programas de mejoramiento hbrido. Mientras el Marcador de retrocruzas asistida es habitualmente aplicada en programas de mejoramiento de la introgresin de genes. Mtodos de seleccin tradicionales Se ha generado una cantidad de variedades muy diversas con los mtodos de seleccin tradicionales. Hay un cmulo de oportunidades para la recombinacin de genes, para piramizar alelos en cultivares superiores. Sin embargo, hay pocas oportunidades para la rotura de bloques de genes ligados y haplotipos. Los mejoradores estn buscando superar estas deficiencias a travs del aumento de la cantidad de cruzas y recombinaciones realizadas. Tambin se esta tratado de iniciar las pruebas de rendimiento en las generaciones anteriores e introducir sistemas modificados para la mejora de poblaciones. Por ejemplo, la seleccin recurrente de poblaciones pertenecientes a grupos heterticos recprocos (reciprocal recurrent selection RRS). Las lneas que bsicamente son genticamente idnticas, a excepcin de un nico gen, se llaman lneas isognicas. La cra hbrida es una categora muy importante para fertilizar los cultivos y tiene las siguientes ventajas en comparacin con la alternativa natural que es la poblacin de cra: Ms heterosis Mxima intensidad posible de seleccin (mejor genotipo posible de la poblacin) Ms fcil para crear variedades con mltiples genes de resistencia (cruza entre dos lneas complementarias)

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Mtodo atractivo para las empresas privadas a causa de la depresin endogmica, que constituye un mecanismo natural para la proteccin de las variedades.

El incremento de semillas hbridas ha sido uno de los principales objetivos de la horticultura y prcticas agrcolas, porque son las plantas hbridas ms productivas (debido al vigor hbrido) y ms uniformes que las plantas procedentes de la polinizacin al azar. Para aumentar semillas hbridas, de polinizacin libre y polinizacin de medios hermanos (polinizacin por una planta de la misma lnea) de las semillas madre debe ser rehuido. Un mtodo de castracin de la lnea femenina utilizada, que luego, naturalmente, es de polinizacin cruzada por el polen de la lnea que acta como padre. Esta debe plantarse en una fila adyacente. Sin embargo, este proceso es muy intensivo de mano de obra y caro. Si las plantas se pueden hacer auto-incompatibles con la introduccin de genes que controlan la auto-incompatibilidad, esto facilitara la produccin de semilla hibrida, ya que reduce los costos de mano de obra. Las semillas para los hbridos se generan por medio de la polinizacin cruzada entre dos diferentes lneas. Sin embargo, el paso necesario de los padres en la fertilizacin de formas homocigticas por cuenta propia no es fcil con el material auto-incompatible. Lo ms conveniente es utilizar un sistema de esterilidad de polen citoplsmico-gnico. Auto-esterilidad, auto-incompatibilidad, flores imperfectas, y obstrucciones mecnicas de la flor. Seleccin de polinizacin cruzada de cultivos El estado natural para los cultivos de auto-fertilizacin es el homocigotico. Especies de plantas que el modo normal, las caracterstica reproductiva y las caractersticas de la estructura de la poblacin de las semillas es a travs de establecer un alto grado de polinizacin cruzada. Cada planta recibe una mezcla de polen de un gran nmero de individuos que tienen diferentes genotipos. Estas poblaciones se caracterizan por un alto grado de heterocigosidad. Esto permite un libre flujo de genes entre los individuos dentro de las poblaciones, generando asi un enorme potencial de la variacin gentica, que se mantiene. En el desarrollo de variedades hbridas, el objetivo es identificar a los heterocigotos ms productivos de la poblacin, que entonces se producen con la exclusin de los dems miembros de la poblacin. En contraste, en el mejoramiento poblacional se prev una mejora por medio de la eliminacin gradual de los alelos nocivos y menos productivos. Esto se logra por ciclos repetidos de recombinacin y seleccin. Los programas de mejoramiento de poblaciones son lentos, pero deben de ser constantes y con un compromiso a largo plazo. Por otro lado, la produccin de hbridos tiene por objeto aprovechar al mximo los beneficios de la heterosis en mucho menos tiempo. Los dos enfoques son complementarios y no mutuamente excluyentes. Selecciones con prueba cruzada de rendimiento El propsito de este tipo de seleccin es una ligera desviacin del concepto de poblacin. La intra-mejora en el sentido de que la poblacin se mejora, no slo para el rendimiento, sino tambin con respecto a la capacidad de combinacin con una poblacin de referencia. Se trata del mejor aprovechamiento del vigor hbrido. Consiste de tres pasos: 1. Auto-polinizacin y la prueba de cruce de individuos 2. Evaluacin de los cruces en los ensayos replicados 3. Recombinacin cruzada remanente de las semillas de plantas seleccionadas Mtodos de seleccin para el desarrollo de cultivos de cra pura en la cruza entre variedades. La introduccin de germoplasma y lneas de cra se realizan para crear nuevas combinaciones de genes. En las generaciones siguientes, los genotipos ptimos (presumiblemente superior que tengan los genes y combinaciones de genes) son seleccionados y fijados en los estados

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homocigotos por medio de fertilizacin y seleccin. Son ampliamente probadas estas selecciones, con el objetivo de la liberacin de algunos predominantes para el cultivo. Cultivos de propagacin asexual (seleccin de clones) La reproduccin asexual cubre aquellos modos de multiplicacin de plantas, en los que la formacin de gametos y fertilizacin no se lleva a cabo. Es decir, no hay meiosis ni fecundacin. A falta de la recombinacin gentica que se da durante la meiosis, la composicin gentica de material vegetal que se multiplica sigue siendo esencialmente la misma. La composicin de alelos es exactamente la de la planta madre. A esto se le llama clon. Los clones superiores son seleccionados y propagados vegetativamente. La descendencia permite la liberacin de variedades estables sin ningn tipo de deterioro debido a la segregacin. Esta caracterstica singular de la reproduccin asexual ha ayudado a desarrollar una serie de cultivos de frutas y hortalizas, incluidas uvas, fresas, aguacates, platanos, mangos, manzanas, etc. La uniformidad tan alta de los clones es algo destacado. En cuanto se encuentra una planta superior, esta se puede reproducir ilimitadamente de manera vegetal. Sin embargo existe el riesgo de patgenos altamente especializados. La variabilidad gentica es necesaria para amortiguar los cultivos contra agentes patgenos, as como la estabilidad de la produccin bajo condiciones ambientales variables. Mutagnesis El mejoramiento de plantas a travs de mutaciones inducidas tiene claras ventajas y limitaciones. Cualquier clon vegetativo pueden ser tratados con mutgenos, e incluso con un nico mutante deseable o una parte de un propgulo mutado puede ser multiplicado como un tipo mejorado de la variedad original. Desarrollo de nuevos clones El desarrollo y registro de nuevos clones debe tener lugar por medio de la seleccin local del clon en plantaciones antiguas, as como la importacin de clones de alta calidad desde el extranjero, para la evaluacin local. Un clon es la descendencia vegetativa de una planta madre especficas, pero no muestran ninguna desviacin gentica, morfolgica o fisiolgicoa de la planta madre. La evaluacin se lleva a cabo con los diferentes clones seleccionados despus de la seleccin. Los diferentes clones se comparan entre s para determinar su calidad y capacidad de resistencia. La Cra no participa en la seleccin del clon, el clon no puede ser criado para la resistencia de ciertos tipos de virus, el nfasis debe ponerse en asegurarse de que el clon al salir de la guardera es libre de virus. Se han desarrollado tcnicas para poner a prueba los clones para cualquier virus nocivo. Los virus nocivos a veces no muestran en las evaluaciones del anteproyecto de.desarrollo fitosanitario (deteccin de virus y erradicacin de virus) es, pues, realizado en los laboratorios e invernaderos, en paralelo con el terreno y la evaluacin de la calidad en el campo del clon. Los desarrolladores tuvieron que incorporar tcnicas, como los cultivos de tejidos y propagacin in vitro de material limitado para desarrollar clones libres de virus de la madre. El meristemo apical est libre de cualquier virus nocivo. Al utilizar el meristemo apical para el cultivo de tejidos pueden ser desarrollados un clon libre de virus. Multiplicacin de clones Durante la primera fase de multiplicacin, cada uno de los clones candidatos se mantiene en un almacn. A partir de ese tejido ncleo se harn todas las futuras multiplicaciones y evaluaciones. Durante la segunda fase de multiplicacin, los portainjertos (el patrn) y el injerto se debern mantener en lugares libres de insectos dentro de instalaciones de campo en zonas aisladas. El vstago y material patrn de la segunda fase de la fuente son injertadas y encalladas. Las plantas injertadas se plantaron en zonas aisladas para el establecimiento de bloques de la madre. Estos bloques se utilizan para fines de multiplicacin. La tercera fase es la creacin de bloques descendiente de la madre de las explotaciones de los productores contratados de la citada fuente en el pre-seleccin, se mantienen. Unos 4 km de suelo virgen

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17.1.6.

Esquemas de seleccin
Vivero fuente Vivero Fuente: Se renen varios miles de plantas de diversas fuentes.

Lneas clonales

Lneas clonales: De 200 a 400 plantas establecidas.

Policruzamiento

Policruza: De 25 a 50 clones superiores se cultivan en un vivero aislado, permitiendo polinizacin cruzada aleatoria. La semilla se cosecha y se mezcla.

Progenie del Policruzamiento

Prueba de la progenie de la policruza: Semilla de la policruza cultivada en pruebas de rendimiento. Las clonas se evalan con base a este comportamiento.
Clones seleccionados para establecer variedad sinttica

Establecimiento del cultivar snttico: con base al comportamiento de la progenie del policruzamiento se seleccionan de 4 a 10 clones para establecer un cultivar sinttico. Los clones se aslan y se permite interpolinizacin aleaoria. La semilla cosechada es la generacin Sin 0. Multiplicacin de la semilla del nuevo sinttico: Se cosechan cantidades iguales de semilla de cada clon y se mezclan parea cultivar la generacin Sin 1. Para la generacin Sin 2 y sucesivas se cosecha semilla de polinizacin abierta.

Sin 1

Sin 2

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Poblacin Fuente: Seleccionar plantas superiores y cruzar con un progenitor probador Recombinacin libre Autofecundacin controlada

Polinizacin libre Ciclo1

Planta seleccionada

Progenitor probador

Progenitor probador

Planta seleccionada

Progenie del cruzamiento de prueba

Progenie del cruzamiento de prueba

Ciclo 2
a) Mezclar semilla de polinizacin libre procedente de plantas con progenies superiores en el cruzamiento de prueba b) Mezclar semilla autofecundada procedente de plantas con progenies superiores en el cruzamiento de prueba

Figura 17-2. Seleccin de familias de medios hermanos basada en el rendimiento de la progenie del cruzamiento de prueba

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Poblacin Fuente: Seleccionar plantas superiores y autopolinizar

Plantas autofecundadas (S0)

Prueba de Progenie S1

Mezclar la semilla autofecundada sobrante de las plantas S0 con progenie superior y sembrarla en aislamiento

Figura 17-3. Seleccin basada en el rendimiento de la progenie S1.

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Variedad A x Variedad B

F1

Parcela masiva

F2
Una semilla por Mazorca. Sembrar en bulk

Plantas individuales

F3
Seleccin de mejores plantas

Plantas individuales

F4
Seleccin de mejores plantas

Plantas individuales

F5
Mazorca por surco

Plantas individuales

Surcos de plantas

F6
Cruzamiento con probador

F7 a F10

Loc 1

Pruebas de rendimiento

Loc 1

Rep 1

Rep 2

Figura 17-4. Mtodo de seleccin de descendencia uniseminal. Las semillas cosechadas de la F1 se siembran de manera espaciada en la F2. Una sola semilla cosechada de cada planta F2 se utiliza para obtener la generacin F3. Esto se repite hasta la generacin F5. En esta generacin las plantas se cosechan y se siembra en un surco de progenie en la F6. En la generacin F7 se establece un ensayo preliminar de rendimiento. Este ensayo se repite hasta la F10. Algunos fitomejoradores combinan este mtodo, con el mtodo de seleccin por pedigree. Cultivan slo las generaciones F3 y F4 utilizando el primero de estos mtodos, acortando el tiempo que se requiere para hacer la prueba de rendimiento.

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F1

Hibrido o variedad Cruzar con inductor de haploida Seleccionar semillas de haploides

Doblar cromosomas con colchizina

Transplantar a campo

F2
Germinar semillas de Haploides en laboratorio Haploides duplicados en invernadero

H0
Parcela de plantas individuales

Autofecundar. Sembrar mazorca por surco

F3

Surcos de plantas

H1 H2

F4
Cruzamiento con probador

Surcos de plantas
Lneas homocigotas

Loc 1

F5 a F8
Loc 1

Pruebas de rendimiento

Rep 1

Rep 2

Figura 17-5. Mtodo de haploides duplicados para la generacin de lneas homocigotas. Para el mtodo de dobles haploides, se parte de una poblacin elite o de un hbrido de alto rendimiento (F1). Las plantas se cruzan con un inductor de haploida. Las mazorcas se desgranan en bulk. Se seleccionan las semillas haploides (aleurona azul con embrin blanco). Se germinan las semillas haploides y se tratan con colchizina (inhibidor de mitosis) para generar plantas con cromosomas duplicados (F2=H0). Las plantas se transfieren a invernadero o directamente a campo en una parcela de plantas individuales. Ah se autofecundan todas las plantas (H0-->H1). Se cosechan y se siembran mazorca por surco. Se avanza una generacin mas seleccionando las mejores lneas (H1-->H2). Se hace cruza con un probador y se evalan los hbridos de las lneas haploides en ensayos de rendimiento en las generaciones F5 a F8.

17.1.7.

Mejoramiento por pedigr

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Parentales

Variedad A x Variedad B

F1
Autofecundacin

Hbrido F1

F2

Parcela masiva Plantas individuales Siembra mazorca por surco

Siembra espaciada. Autofecundacin. Seleccin de mazorcas.

F3 F4 F5 F6
Mazorcas desgranadas en bulk

Surcos de plantas=familias F3
Seleccin de mazorcas Seleccin por Familias

(50-300 surcos) Familias F4. Surcos de plantas

Familias F5. Surcos de plantas

Lneas semi-avanzadas

F7 a F10

Loc 1

Pruebas de rendimiento Con repeticiones y mltiples localidades

Loc 1

Rep 1

Rep 2

Lneas avanzadas

Figura 17-6. Diagrama que muestra la metodologa de mejoramiento por pedigree. Mtodo de seleccin por pedigree: A partir de plantas F2 seleccionadas, se hacen crecer en surcos progenies de 25-30 plantas en la F3. De los mejores surcos se seleccionan las plantas superiores y las mazorcas mas bonitas se desgranan mazorca por sobre y se siembran en familias de surcos. La seleccin consiste en escoger las mejores plantas de las mejores familias. Al llegar a F6, las familias empiezan a ser relativamente mas uniformes. En la F7 se establecen pruebas preliminares de rendimiento mismas que se continan hasta la F10. El mtodo de pedigr es generalmente rpido y fcil. Sin embargo, este mtodo es muy intenso en mano de obra. Los padres se cruzan y se genera una F1, que despus se autofecunda para generar una poblacin F2, que despus deriva en familias de lneas F3, F4, etc. La seleccin de plantas con nuevas combinaciones de genes se hace en base a la genealoga. La descendencia se somete repetidamente a la seleccin y siempre las plantas individuales se toman como fuente de nuevas familias descendientes (mazorca por sobre, mazorca por surco), hasta que se alcanza la uniformidad gentica. Slo entonces, las semillas de varias mazorcas se combinan y

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mezclan para tener ms semillas para pruebas de extensas de combinaciones hbridas. Es importante llevar un registro detallado del origen de las plantas o las lneas seleccionadas. La intensidad de seleccin puede ser variada, en la prctica, de acuerdo a la disponibilidad de infraestructura (espacio de campo, almacenaje de semilla, instalaciones, personal para desgrane, seleccin y preparacin de ensayos, etc.). Con una sola planta de seleccin se debe llevar a cabo en base a rasgos de alta heredabilidad. En la primera fase se deben concentrar los alelos mayoritarios y favorables. En una fase posterior, cuando las unidades de evaluacin son parcelas y ya no plantas individuales, se puede hacer seleccin para algunos rasgos con menor heredabilidad. Una objecin en contra de este mtodo es que la variacin gentica disponible para la seleccin de los rasgos cuantitativos, se puede reducir drsticamente en las primeras generaciones. Es por ello que es importante tener una poblacin de familias lo mas grande posible desde el inicio de la generacin F3. Por lo regular se deben empezar con 100 a 300 lneas S2. La purificacin de semillas y la multiplicacin suele ser incorporado en una de las ltimas generaciones de seleccin de pedigr. La eficiencia de la cra es uno de los objetivos para la generacin de pruebas. Esto se hace por la identificacin temprana de familias superiores. La eliminacin rpida de las poblaciones inferiores y la posterior concentracin de los esfuerzos de seleccin en las poblaciones superiores se traducen en un aumento de la eficiencia. Una evaluacin precisa de genotipos es esencial para el xito de este mtodo.

17.1.8. 17.1.9.
17.1.9.1.

Seleccin recurrente Metas de mejoramiento

Rendimiento

Falta hacer una grafica de este mtodo

La agricultura se centra en el consumidor, para innovar y mejorar la calidad y cantidad de los suministros alimenticios en el mundo globalizado. Este es un punto de partida muy importante, si tenemos en cuenta que hasta ahora la biotecnologa agrcola, a travs de la gentica, se haba centrado en la lucha contra los insectos y la desratizacin Falta input

17.1.9.2.

Calidad nutricional

Entre las tendencias ms importantes de la nueva agricultura, nos encontramos con la formacin de nuevos productos y servicios, influidos por una demanda de alimentos de mejor calidad. Pero tambin, nos encontramos con una expansin biotecnolgica cada vez ms rpida, con una mayor tecnologa informtica, con nuevas empresas relacionadas con el sector y con una expansin global en potencia. Gracias a la biotecnologa, la mejora de los alimentos, a travs de la incorporacin de nuevas propiedades nutricionales potencialmente beneficiosas, reducir los riesgos vinculados con el padecimiento de algunas afecciones, como la osteoporosis o los procesos cardiacos. Desde la mejora gentica del maz, se han desarrollado variedades especializadas tanto para calidad proteica (ricos en lisina y triptfano) como para alto contenido de aceite (de 6 a 9% de grasa cruda), las cuales estn en proceso de adopcin por los agricultores y usuarios; en Mxico, los maces de alta calidad proteica (conocidos como QPM, por su denominacin en lengua inglesa: quality protein maize) se han venido promoviendo durante los ltimos seis aos con xito limitado todava; los maces de alto contenido en aceite (conocidos como HOC: high oil corn) no ingresan al mercado nacional de semillas por su origen transgnico, as como las variantes en el manejo especializado para su produccin.

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La condicin gemelar o poliembriona en semillas de maz es una caracterstica natural que puede ser aprovechable como una va alterna en el diseo de variedades de aplicacin especial, buscando adems de potencial de rendimiento, el valor nutritivo del grano, incrementando cantidad y calidad de aceites y protena; esto, bajo la hiptesis de que dos o ms embriones por semilla, permitirn incrementar la capacidad de almacenamiento de nutrientes de calidad (Castro, 1973; Rodrguez, 1981; Espinoza et al, 1998; Espinoza et al., 1999).El planteamiento de que la condicin gemelar o poliembrinica de las poblaciones PE ( frecuencias poliendromicas) del IMM (instituto Mexicanan del maz) debe estar asociado a un mayor y mejor contenido de nutrientes en la semilla, principalmente en cuanto a aceites y protena embrionaria, se ha venido documentando, inicialmente por la va de anlisis bromatolgicos de las semillas (Espinoza et al., 1999), y recientemente por la cuantificacin de ciertos nutrientes especficos, como el caso de los cidos grasos (Valds et al, 2004) y, planeado para realizarse en fechas del ao 2004, la determinacin de los aminocidos lisina y triptofano en harina de granos completos. La hiptesis en esta lnea de trabajo es que dos o ms embriones por semilla, deben conferirle a sta una mejor constitucin nutritiva y cierta ventaja selectiva. La seleccin aplicada para incrementar la poliembriona en las poblaciones de maz bajo estudio influye de manera positiva en los contenidos nutrimentales de las semillas, e.g. aumentando el nivel de grasa cruda por encima del promedio conocido en el maz comn y la proporcin de cidos grasos insaturados, mejorando la relacin oleico:linoleico. La cantidad de protena cruda en maces PE no presenta variaciones significativas a los testigos, sean maz comn o especializado del tipo QPM; sin embargo, ser importante corroborar, en estudios a realizar otros estudios, cual es el nivel de lisina y triptofano, estableciendo la hiptesis de que los maces PE han acumulado mayores contenidos en estos aminocidos esenciales por el hecho de presentar un mayor nmero de embriones por semilla. Ingeniera Metablica La ingeniera metablica ofrece un medio para mejorar la calidad y cantidad de flavonoides presentes en los alimentos que ingerimos. Siendo otro ejemplo de mejoras en el potencial nutricional de los alimentos En tomate, que produce naturalmente slo pequeas cantidades de kaempferol y quercetina en la piel del fruto, se ha conseguido introducir y sobre-expresar los genes reguladores Lc y C1 de maz, lo que lleva a un incremento de la formacin de kaempferol de ms del 60%, principalmente en la pulpa de los frutos. Adems, la introduccin del gen CHI de Petunia aumenta la biosntesis de quercetina en ms del 70% en la piel. La expresin de Lc y C1 en patata causa una marcada acumulacin de kaempferol en los tubrculos. En el futuro, la disponibilidad del gen FLS, codificante de la enzima flavonol sintasa, obtenido de varias fuentes permitir una ingeniera mucho ms directa en la sntesis de los flavonoles.

17.1.9.3.

Calidad industrial

En un fuuro no muy lejano los cientficos agrcolas podrn desarrollar polmeros industriales o productos fibrosos procedentes de fuentes renovables como el maz o la soja.(Parker) tanto dentro como fuera del sector agrcola. Desde el siglo XX, el inters se ha incrementado. De un tiempo a esta parte, la cuestin ms importante ha sido cmo perfeccionar el empleo de los excedentes por parte de los agricultores de los paises industrializados. Una segunda cuestin importante ha sido la necesidad de encontrar sustitutos a los productos disponibles en ese momento, sustitutos que nos evitaran depender de importaciones forneas. Los biocombustibles son productos alternativos fabricados a partir de la "biomasa", que es materia orgnica, como madera, plantas o desechos orgnicos, que puede ser convertida directamente en lquidos combustibles para propsitos de transporte. Estos biocombustibles estn siendo investigados y desarrollados como reemplazo de los combustibles derivados del

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petrleo y como sustitutos parciales de los aditivos, para de esta manera "estirar" las reservas de petrleo existentes y reducir la dependencia general de los combustibles fsiles. Fabricacin del etanol El etanol o etil alcohol es un combustible de alto octanaje, producido a partir de la fermentacin de las plantas de azcar. En Estados Unidos, el E-10 (10% etanol / 90% gasolina) es la combinacin alcohol/gasolina ms ampliamente disponible para la compraventa minorista del transporte, pero tambin se producen mezclas de combustibles para automviles superiores a E85. (La operacin con E-85 requiere de "vehculos de combustible flexible", fabricados especialmente (FFV), de los cuales actualmente hay en uso cinco millones). Aunque el etanol se est usando como oxigenante para el diesel tradicional, la mayora de las investigaciones y del mercadeo se centran en su uso en mezclas de gasolina. El maz es la principal reserva alimenticia para la fabricacin de etanol en Estados Unidos. El etanol tambin se produce a partir de fuentes orgnicas tales como cebada, trigo, arroz, soya, girasol, papa, mandioca y melaza. Fuera de Norteamrica, la caa de azcar y la remolacha de azcar son las reservas alimenticias ms comunes. Tambin puede producirse a partir de hierbas silvestres, paja de trigo y otros elementos orgnicos, comnmente considerados como basuras, tales como paja de arroz, desechos de maderamen y hojas y tallos de plantas (afrecho). El afrecho de maz es el desecho agrcola ms importante en toda Amrica. De acuerdo con la National Corn Growers Association, cerca del 13% del maz cultivado en Estados Unidos (unos 1,43 mil millones de bultos) se transformaron en etanol en 2005. Un bulto de maz produce cerca de 2,8 galones de etanol. La molienda hmeda y la molienda seca son dos mecanismos de produccin para generar etanol a partir del maz. En la molienda seca, el grano entero primero es convertido en harina de maz. El polvo con agua se transforma en una suspensin a la que se le agregan enzimas para convertir la fcula en dextrosa. Se agrega amonaco para control del pH y como nutriente para la levadura. La masa se procesa en una coccin a alta temperatura para reducir los niveles de bacterias. Luego se enfra la masa y se agrega la levadura. El proceso de fermentacin toma por lo general entre 40 y 50 horas. Luego se separa el etanol y se concentra a 190 grados, usando destilacin convencional; despus se deshidrata a etanol anhidro de 200 grados. Enseguida se mezcla con un desnaturalizador, como la gasolina u otros destilados del petrleo. En la molienda hmeda, el grano es embebido en agua y cido sulfuroso diluido por ms de 48 horas, para facilitar la separacin del grano en sus partes componentes. Despus de remojar, el compuesto acuoso de maz es molido para separar el germen del maz. Luego la fcula y cualquier remanente acuoso de la masa se fermentan en un proceso similar al del mtodo seco. Tambin hay mejoras en el potencial farmacutico de los alimentos Los isoflavonoides pueden actuar como fitoestrgenos, lo cual ha generado un gran inters en el uso de estos compuestos para tratar desrdenes hormonales en humanos. Los isoflavonoides slo se presentan en las leguminosas, en las cuales el primer paso de la biosntesis de las mismas est regulado por la isoflavona sintasa (IFS). Recientemente se ha clonado el gen que codifica para dicha enzima, lo cual ha abierto un nuevo campo de ingeniera para la formacin de isoflavonoides en plantas de cultivo que normalmente no presentaban dichos compuestos. Se ha realizado un experimento inicial en Arabidopsis thaliana introduciendo el gen IFS de soja por el promotor 35S, resultando la conversin de la naringenina en el isoflavonoide genisteina, que pertenece al grupo de los fitoestrgenos de alto inters mdico. En maz, las mutaciones recesivas de dos genes CHS: C2 y Whp dan como resultado polen estril de color blanco, producto de la ausencia de flavonoides en l. En la Petunia, la supresin de sentido de CHS causa flores blancas y esterilidad a la vez. La expresin antisentido de CHS en las anteras causa tambin esterilidad masculina. Por su parte en las plantas de tabaco, la

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introduccin y sobre-expresin del gen STS que codifica para la estibeleno sintasa, que compite con la CHS endgena por sustratos comunes, y por tanto tambin se produce esterilidad masculina y pigmentacin alterada de las flores (Forkmann, G., S. Martens. 2001). Estudios adicionales muestran que los fenotipos estriles pueden ser complementados por la adicin de flavonoles. Supresin de la fertilidad del polen La esterilidad masculina es un requisito para el desarrollo de sistemas de semillas hbridos, por tanto, la generacin de este hecho por ingeniera metablica es una meta muy importante. En consecuencia, la estrategia del antisentido o la supresin de sentido de FLS bajo el control de un promotor especfico es una alternativa a la supresin completa de la sntesis de los flavonoides. Parece ser que esta es la estrategia ms prometedora para la generacin de esterilidad masculina. Biosntesis de flavonoides por bacterias genticamente modificadas. Recientemente mediante la ingeniera gentica se ha logrado cultivar bacterias capaces de sintetizar flavonoides de tipo flavanonas. (Hwang E. I. , M. Kaneko , Y. Ohnishi , S. Horinouchi. 2003)

17.1.9.4.

Tolerancia a la sequa

Con el propsito de mejorar la tolerancia del maz y el trigo a condiciones de escasez de agua, se adoptaron varias estrategias, entre ellas, generar por medio de ingeniera gentica variedades que contienen diversas construcciones genticas que podran mejorar el desempeo de las variedades en condiciones desfavorables. Si bien existen ciertos asuntos que deben atenderse antes de que las variedades transgnicas lleguen a los agricultores (p. ej. propiedad intelectual, bioseguridad, conservacin del ambiente y seguridad de los alimentos humanos y animales), si se demuestra que los sistemas genticos basados en transgenes son efectivos, ofrecern la posibilidad de mejorar el comportamiento de las plantas en condiciones desfavorables. De particular importancia es la naturaleza (unignica y dominante) del transgene que hace ms fcil la transferencia y el mantenimiento de los sistemas en cualquier variedad, en comparacin con la de aquellos que se basan en genes mltiples y gentica cuantitativa. Los mecanismos moleculares de la respuesta a la escasez de agua se han estudiado principalmente en la planta modelo Arabidopsis thaliana. Los anlisis de la expresin de genes inducidos por deshidratacin han demostrado que por lo menos cuatro vas de sealizacin metablica independientes funcionan en la induccin de genes inducidos por factores desfavorables, en respuesta a la deshidratacin: dos son dependientes de ABA y dos son independientes. Varios de los genes inducidos por condiciones desfavorables, como rd29A en A. thaliana, son activados mediante una va metablica independiente de ABA. El gene 1 de Ligamiento al Elemento de Respuesta a la Deshidratacin (DREB1 por sus siglas en ingls) y DREB2 son factores de transcripcin que se unen al promotor de genes como rd29A, por lo que inducen la expresin en respuesta a la sequa, la sal y el fro. DREB1A ha sido sobreexpresado en plantas transgnicas Arabidopsis y el fenotipo resultante ha mostrado una slida induccin de la expresin de los genes objetivo en condiciones favorables, pero tambin se ha observado enanismo en los fenotipos de las plantas transgnicas. Las plantas tambin mostraron tolerancia al congelamiento y la deshidratacin. Por el contrario, la sobreexpresin de DREB2A produjo una expresin dbil de los genes objetivo en condiciones favorables y el crecimiento de las plantas transgnicas fue lento. La regulacin de la expresin del gene DREB1A por mediacin del promotor rd29A en condiciones desfavorables produjo

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plantas con mayor tolerancia al congelamiento, la sal y la sequa y sin cambios drsticos en el fenotipo normal de las plantas transformadas. 3 Avances: Se han generado varios cientos de eventos y se han probado en condiciones de escasez de agua en el invernadero de bioseguridad. Se ha confirmado que los eventos que han mostrado los ms altos niveles de tolerancia a las condiciones de escasez de agua contienen el gene DREB y se estn evaluando en condiciones de campo en el invernadero del CIMMYT en El Batn, Mxico. Si se observa que el comportamiento de los transgnicos mejora en las condiciones que se estn evaluando, se realizarn ms ensayos de campo. La sequa reduce la fijacin de nitrgeno en leguminosas. En condiciones de sequa, se produce una limitacin de carbono en los ndulos de las leguminosas que podra ser la causa del descenso de la fijacin de nitrgeno en las mismas. sta es una de las conclusiones que ha presentado Mara Dolores Glvez en su tesis defendida en la Universidad Pblica de Navarra. El trabajo doctoral se titula: Metabolismo nodular en Pisum sativum L. en respuesta a estrs hdrico. Interacciones carbono/nitrgeno y posibles molculas implicadas en la modulacin de la respuesta. Fijacin de nitrgeno y sequa. La fijacin biolgica de nitrgeno es un proceso de gran inters agronmico y ecolgico, puesto que el nitrgeno, despus del agua y el carbono, es el nutriente que limita en mayor medida el crecimiento vegetal y la produccin de los cultivos. Este proceso resulta particularmente sensible a condiciones ambientales adversas, como el estrs hdrico o sequa. Precisamente el objetivo de la tesis doctoral de Mara Dolores Glvez ha sido investigar cmo se produce la regulacin de la fijacin biolgica de nitrgeno en condiciones de sequa. La reduccin del nitrgeno atmosfrico a amonio, o fijacin de nitrgeno, la llevan a cabo nicamente determinados organismos procariotas. Entre ellos, los denominados genricamente rizobios son capaces de establecer simbiosis con plantas leguminosas dando lugar a la formacin de una nueva estructura radical: el ndulo. Por un lado, la planta se beneficia del microorganismo, que se encarga de tomar el nitrgeno del aire y transformarlo en amonio de forma que se lo facilita a la planta. Este amonio se incorpora a esqueletos de carbono para formar aminocidos y protenas. Por su parte, el microorganismo obtiene de la planta los nutrientes necesarios para su crecimiento. En condiciones de sequa, se detect un descenso de la actividad sacarosa sintasa nodular. Este descenso se produjo simultneamente al descenso de la fijacin de nitrgeno, pudindose establecer una elevada correlacin entre ambos procesos en condiciones adversas. Como consecuencia de la inhibicin de la actividad sacarosa sintasa, se observ tambin un descenso de la concentracin de azcares fosfato y cidos orgnicos, lo que indica un descenso en el flujo de carbono en los ndulos que limitara, a su vez, el suministro de carbono al bacteroide, vindose afectada la capacidad del bacteroide para fijar nitrgeno. Con el fin de profundizar en el proceso de percepcin y transduccin del estrs hdrico que lleva a la inhibicin de la fijacin de nitrgeno, Mara Dolores Glvez estudi tambin el cido abscsico y las especies de oxgeno activado como posibles molculas implicadas en la regulacin de la fijacin de nitrgeno.

17.1.9.5.
3

Resistencia a enfermedades

El proceso por el cual las plantas desarrollan una enfermedad se puede dividir en cinco fases. Como parte de las actividades del CIMMYT para aumentar la tolerancia a la sequa en el trigo, JIRCAS, por conducto del Dr. Shinozaki, proporcion el gene DREB1A de A. thaliana controlado por un promotor inducido por sequa, para probarlo primero en trigo y posteriormente en maz

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1. Inoculacin: Es la introduccin del agente patgeno dentro del tejido de la planta husped. Por ejemplo las esporas son los principales agentes transmisibles de los hongos. El agua o el viento pueden trasportar este agente, pero tambin los insectos, pjaros, mamferos. 2. Incubacin: Es un perodo de desarrollo durante el cual el agente patgeno experimenta una serie de cambios hasta llegar a una forma que le permite penetrar e infectar. Los hongos forman la estructura denominada anclaje de penetracin. 3. Penetracin: Es el proceso por el cual el agente se introduce dentro de la planta, puede ser un proceso activo como pasivo. Algunos agentes patgenos elaboran enzimas que disuelven las capas superficiales y la celulosa, o introducirse por los estomas, lenticelas o heridas. Algunas estructuras comunes son los apresorios. 4. Infeccin: Cuando el agente invade el tejido de una planta y se establece una relacin parasitaria. Tambin se generan nuevas esporas y la enfermedad se dispersa de forma exponencial. 5. Enfermedad: Cuando en la planta husped se manifiesta una respuesta a la presencia del agente, como clorosis o necrosis. Son los sntomas del patgeno que muchas veces reducen considerablemente el rendimiento. El mejoramiento para la resistencia a una enfermedad puede estar enfocado a cualquiera de esas etapas. Se pueden seleccionar genes que dificultan la penetracin, genes que bloquean la infeccin sistmica, o bien genes que disminuyen la severidad de los sntomas.

17.2.
17.2.1.

Metodologas innovadoras
Retrospectiva histrica del mejoramiento molecular de plantas

Evolucin del mejoramiento: de Darwin a Mendel hasta Hallauer, Watson y Crick Es cierto que Darwin deline los principios cientficos de la hibridacin y la seleccin. Mientras fue Mendel quien defini la asociacin fundamental entre el genotipo y el fenotipo. Por medio de sus teoras fue posible hacer mejoramiento con un enfoque cientfico a inicios del siglo 20 (e.g. Shull, 1909). A pesar de que algunos mejoradores reconocieron inmediatamente la importancia de la gentica mendeliana (gentica cualitativa), la integracin total se retrazo alrededor de 20 aos, hasta que la gentica cuantitativa reconcili los principios de Mendel con la continua variacin observada en la mayora de los rasgos considerados importantes por los mejoradores (Paul and Kimmelman, 1988). Los principios de gentica cuantitativa descritos en el famoso libro de Hallauer son primordiales para entender este proceso. Los subsecuentes avances en nuestro entendimiento de la biologa de plantas, anlisis e induccin de la variacin gentica, gentica celular y cuantitativa, biologa molecular, biotecnologa y ms recientemente de genmica, se han aplicado exitosamente para incrementar la base cientfica y su aplicacin en el proceso de mejoramiento de plantas (e.g. Baenziger et al., 2006; Jauhar, 2006; Varshney et al., 2006). La era de la biotecnologa de plantas comienza a inicios de los aos ochenta, con los conocidos reportes de produccin de plantas trasgnicas utilizando Agrobacterium (Bevan et al., 1983; Fraley et al., 1983; Herrera-Estrella et al., 1983). A partir de entonces se desarrollaron sistemas de marcadores moleculares para crear mapas genticos de alta resolucin y as explotar la relacin entre marcadores y caractersticas importantes de los cultivos (Edwards et al., 1987; Paterson et al., 1988). Para 1996 la comercializacin de cultivos transgnicos demostr la exitosa integracin de la biotecnologa en el mejoramiento de plantas y en los programas de mejora de cultivos (Koziel et

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al., 1993; Delannay et al., 1995). Como se observa en la Figura 17-8, la introgresin de uno, o algunos genes en un cultivo, comnmente utilizado retrocruzas, es una prctica comn de mejoramiento. Algunos mtodos de retrocruza asistida por marcadores fueron desarrollados rpidamente para hacer introgresin de caractersticas transgnicas y reducir el arrastre por ligamiento (linkage drag), en donde los marcadores moleculares se utilizaron para explorar el genoma y seleccionar aquellos individuos que contuvieran el transgen y la proporcin ms alta de alelos favorables del genoma parental recurrente (e.g. Ragot et al., 1995; Johnson and Mumm, 1996). Durante los ltimos 25 aos, el desarrollo y aplicacin continua de la biotecnologa de plantas, marcadores moleculares y genmica, han establecido nuevas herramientas para la creacin, anlisis y manipulacin de la variacin gentica, as como el desarrollo de cultivos mejorados. Ver reviews (Sharma et al., 2002;Varshney et al., 2006; Collard and Mackill, 2008). El mejoramiento molecular es actualmente una prctica estndar en varios cultivos, sobre todo en las empresas privadas de semillas. En las siguientes secciones revisaremos brevemente el impacto positivo tanto de la informacin molecular como de la ingeniera gentica, en el paradigma del mejoramiento de plantas.

17.2.1.1.

Principios y prcticas del mejoramiento

Esquemas de mejoramiento y concepto de ganancia gentica

Conceptualmente, el mejoramiento de plantas es simple: cruzar los mejores padres e identificar y recupera la progenie que supera a los padres. En la prctica, el mejoramiento consta de tres pasos, en el cual, poblaciones o colecciones de germoplasma con variacin gentica til son creadas o acopladas, se identifican los individuos con fenotipos superiores y se desarrollan cultivos mejorados a partir de los individuos seleccionados. Se ha desarrollado una amplia gama de acercamientos para hacer mejoramiento de plantas, dependiendo de la especie a cultivar y los objetivos del mejoramiento (Fehr, 1987; Stoskopf et al., 1993). Estos mtodos de mejoramiento difieren en los tipos de poblacin, procedimientos de seleccin y el producto final. En la figura x se muestra un resumen de los mtodos de mejoramiento que comnmente se emplean en programas de desarrollo de cultivos. Como ya se mencion, cuando la meta es mejorar un genotipo elite establecido, con caractersticas controladas por uno o pocos loci, se utiliza la retrocruza para lograr la introgrecin de un solo gen (Fig. 1A), o una pirmide de pocos genes (Fig. 1B). Para caractersticas genticas complejas, el desarrollo de germoplasma mejorado requiere la reorganizacin del genoma para producir nuevas combinaciones de genes favorables en la progenie. El mtodo de mejoramiento por pedigr genera estas nuevas combinaciones mediante la cruza y recombinacin entre padres superiores y complementarios, as como mediante la seleccin entre la progenie segregante para rendimiento mejorado (Fig. 1C). La seleccin peridica pretende incrementar de manera simultanea las frecuencias de alelos favorables en loci mltiples de la poblacin mejorada, a travs de la cruza entre individuos seleccionados (Fig. 1D). Para cultivos hbridos como el maz, la seleccin peridica podra extenderse para mejorar el rendimiento de poblaciones complementarias distintas (e.g. grupos heterocigotos) que se utilizan como padres para generar combinaciones hibridas superiores. A esta prctica se le conoce como seleccin peridica reciproca. Los principios de gentica cuantitativa han sido particularmente poderosos como la base terica tanto para el desarrollo de poblaciones, como para los mtodos de seleccin y estabilizacin de genotipos deseables (Hallauer, 2007). Un concepto importante en la gentica cuantitativa y el mejoramiento de plantas es la ganancia gentica (DG), el cual se refiere al cambio predicho del valor promedio de una caracterstica dentro de la poblacin donde ocurre la seleccin. Sin tener

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en cuenta la especie, la caracterstica de inters o el mtodo de mejoramiento utilizado, el valor DG sirve como una expresin universal simple para la mejora gentica esperada (Fehr, 1987; Falconer and Mackay, 1996). La figura 2 muestra la ecuacin de DG y una expansin de sus trminos para parmetros fundamentales de la gentica cuantitativa. Aunque el mejoramiento de plantas utiliza claramente una sobresimplificacin de los principios de la gentica cuantitativa, la ecuacin de ganancia gentica relaciona los cuatro factores centrales que influencian el proceso de mejoramiento: el grado de variacin fenotpica presente en la poblacin (representado por su SD, sP), la probabilidad de que una caracterstica fenotpica se transmita de los padres a la progenie (heredabilidad, h2)la proporcin de la poblacin seleccionada como padres de la siguiente generacin ( intensidad de seleccin, i, expresada como unidades de SD del promedio) y el tiempo necesario para completar un ciclo de seleccin (L). L, no slo es funcin del nmero de generaciones que re requieren para completar un siclo de seleccin, sino tambin, de que tan rpido se complete una generacin y el nmero de generaciones por ao. Es claro que DG se puede aumentar incrementando sP, h2 o i, y disminuyendo L. Por lo tanto, la ecuacin de ganancia gentica provee un marco de comparacin de la efectividad de estrategias particulares de mejoramiento, y comnmente se utiliza como una gua para asignar juiciosamente los recursos necesarios para alcanzar los objetivos de mejoramiento. Cuando se considera dentro del contexto de ganancia gentica, el mejoramiento molecular de plantas ofrece nuevos y poderosos acercamientos que permiten superar las limitaciones previas para maximizar DG. En las siguientes secciones se citan ejemplos en dnde le mejoramiento molecular de plantas ejerce un impacto positivo en DG y cada una de las variables que la integran. Por cuestin de brevedad, nos enfocaremos en ejemplos de maz, en donde el mejoramiento molecular est ms avanzado y se ha convertido en uno de los primeros cultivos en el que se han desarrollado hbridos comerciales mejorados.

El mejoramiento molecular de plantas expande la diversidad gentica til para la mejora de cultivos.
El mximo potencial para la ganancia gentica es proporcional a la variacin fenotpica (sP) presente en la poblacin fuente original, y se mantiene en los ciclos subsiguientes de seleccin. La variacin fenotpica est asociada positivamente a la diversidad gentica, aunque tambin depende de factores ambientales y de las interacciones entre genotipo y ambiente. La diversidad gentica se puede derivar de poblaciones cultivadas (naturales o sintticas), progenie segregante de la cruza de lneas parentales seleccionadas, materiales exticos que no estn adaptados al medio ambiente, cruzas interespecficas entre especies silvestres, mutaciones naturales o inducidas, introduccin de eventos transgnicos, o combinaciones de estos. Sin embargo, no todas las variaciones fenotpicas son iguales. Por ejemplo, el uso de germoplasma extico ha sido extremadamente exitoso para mejora varias especies de cultivo, pero puede haber dificultades si se introducen alelos no deseados, relacionados con prdida de adaptacin. La necesidad de diversidad gentica debe ser balanceada mediante desempeo elite, puesto que es clave escoger los mejores padres, para maximizar la probabilidad de una mejora exitosa. En contraste, el incremento esperado en el desequilibrio por ligamento entre las poblaciones elite, derivado de intensas selecciones previas, tambin puede limitar la creacin de nuevas combinaciones genticas para ganancia futura. Con el entrecruzamiento de especies fuente, para lograr la recombinacin gentica se puede superar este problema, pero esto retrasa el desarrollo del cultivo. Los marcadores moleculares y ms recientemente, los esfuerzos de secuenciacin del genoma con altos rendimientos, han incrementado dramticamente el conocimiento y la habilidad de caracterizar la diversidad gentica en el fondo comn de germoplasma, para esencialmente cualquier especie de cultivo. Usando maz como ejemplo, el reconocimiento de alelos de marcadores moleculares y la variacin en la secuencia nucleotdica han proporcionado

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informacin bsica sobre la diversidad gentica antes y despus de la domesticacin de su antecesor silvestre, el teosintle, entre razas domesticadas distribuidas geogrficamente y dentro de germoplasmas elite histricos (para una revisin, leer Cooper et al., 2004; Niebur et al., 2004; Buckler et al., 2006). Esta informacin enriquecerlas investigaciones sobre evolucin de plantas y genmica comparativa, contribuye a entender la estructura de la poblacin, proporciona medidas empricas de las respuestas genticas hacia la seleccin y sirve tambin para identificar y mantener reservas de variabilidad gentica para una futura mina de alelos benficos (McCouch, 2004; Slade et al., 2005). Adems, el conocimiento de las relaciones genticas entre recursos de germoplasma puede ser una gua al escoger padres para la produccin de hbridos o poblaciones mejoradas (e.g. Dudley et al., 1992; Collard and Mackill, 2008). Mientras que los marcadores moleculares y otras aplicaciones genmicas han sido altamente exitosas caracterizando la variacin gentica existente, la biotecnologa de plantas genera nueva diversidad gentica, que generalmente va ms aya de especies relacionadas (Gepts, 2002; Johnson and McCuddin, 2008). La biotecnologa permite acceso a genes que no estaban disponibles al utilizar cruzas y crea un fondo de variacin gentica esencialmente infinito. Los genes pueden ser adquiridos de los genomas existentes en todos los reinos de vida, o pueden ser diseados y ensamblados en el laboratorio. Ejemplos tanto sutiles como extremos, sobre el poder de los transgenes para introducir variacin fenotpica, se pueden encontrar en tres diferentes transgenes que desarrollan resistencia en maz y otros cultivos, contra los herbicidas de glifosfato. En el primer hbrido de maz tolerante al glifosfato, se utiliz una versin modificada del gen endgeno de maz que codifica para la 5-enol-piruvilshikimato-3-fosfato sintasa (Spencer et al., 2000). A este hbrido le siguieron una serie de eventos producidos por el gen de la 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintetasa aislado de Agrobacterium (Behr et al., 2004). Ms recientemente un gen sinttico con la actividad de glifosfato acetil transferasa aumentada, fue creado utilizando reordenamiento de genes (gene shuffling) y seleccin en sistemas microbianos (Castle et al., 2004). Cada uno de estos casos de maz tolerante al glifosfato, ilustra tambin otro beneficio de la biotecnologa, donde nuevas combinaciones de secuencias regulatorias (por ejemplo los promotores del virus del mosaico del la coliflor, y el de actina 1 de arroz) pueden ser usadas para lograr la expresin ptima de una caracterstica, con respecto a la actividad general y la distribucin relativa de tejido, lo que podra ser imposible con los genes endgenos (Heck et al., 2005).

El mejoramiento molecular de plantas incrementa la accin favorable de los genes

La gentica cuantitativa utiliza el concepto terico de heredabilidad para cuantificar la proporcin de la variacin fenotpica que es controlada por el genotipo. En la prctica, la heredabilidad est considerablemente influenciada por la arquitectura gentica de la caracterstica de inters, la cual esta descrita por el nmero de genes, la magnitud de sus efectos y el tipo de accin del gen sobre el fenotipo. Un mejor conocimiento de la arquitectura gentica y de la accin benfica de la accin de los genes (la cual es ms preferible para la seleccin) tiene un mayor impacto sobre la optimizacin de la ganancia gentica. Para la frmula de la ganancia gentica, la heredabilidad (h2) se utiliza en un sentido estricto, representando la proporcin de la variacin fenotpica debida a los efectos genticos (aquellos que reflejan sustituciones de alelos o cambios en su proporcin). Los efectos genticos aditivos tambin son considerados como valor de cultivo (valor de cra), puesto que su transferencia a la progenie es predecible. Las desviaciones de los afectos aditivos son significativas para muchas caractersticas, y estn divididas en efectos dominantes que reflejan las interacciones entre los diferentes alelos en el mismo lucus, y efectos epistticos resultado de las interacciones entre los diferentes loci.

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La accin de los genes y los valores de cultivo (valor de cra?) se caracterizan mediante pruebas de progenie, en las cuales los fenotipos de individuos de la poblacin se compran con los padres y hermanos producidos por autopolinizacin o cruza. Los esfuerzos previos para desarrollar un gran nmero de marcadores moleculares, mapas genticos de alta densidad y mapeo de poblaciones apropiadamente estructurado, han hecho rutina la habilidad de definir simultneamente la accin del gen y su valor de cultivo en cientos y a veces miles de loci distribuidos relativamente uniforme entre genomas completos, en una gran variedad de cultivos. Los resultados de estos estudios de mapeo proporcionan estimados altamente mejorados de el nmero de loci, efectos alelicos y accin del gen que controlan las caractersticas de inters. Y an ms importante, se pueden identificar fcilmente segmentos genmicos que muestren asociaciones estadsticamente significativas con caractersticas cuantitativas (loci de caractersticas cuantitativas, QTL por sus siglas en ingls). Adems del mapeo gentico en familias derivadas de cruzas biparentales, nuevos avances en la gentica de asociacin con genes candidatos y acercamientos que combinan el anlisis de desequilibrio por ligamiento en familias y poblaciones (Holland, 2007; Yu et al., 2008) en un futuro aumentaran el poder de los QTL.

La informacin sobre los QTL puede ser utilizada de diversas maneras para incrementar la heredabilidad y la accin benfica de los genes.
Para los rasgos que tienen heredabilidad moderada o baja, como el rendimiento de grano, los QTL y otros marcadores moleculares asociados generalmente cuentan ms para una mayor proporcin de efectos genticos aditivos, que el fenotipo solo. Adems, el conocimiento de la arquitectura gentica se puede explotar para aadir o eliminar alelos especficos que contribuyan al valor de cultivo. Cuando la epistasis o el ligamiento gentico entre loci con efectos antagnicos en una caracterstica limitan la ganancia gentica, la informacin de los QTL puede ser usada para romper estas indeseables relaciones. El xito para incrementar la ganancia gentica utilizando la informacin sobre QTL depende en gran medida de la magnitud de los efectos de los QTL, la estimacin precisa de su posicin, la estabilidad de sus efectos en mltiples ambientes y si los QTL son robustos en el germoplasma mejorado. La prediccin de la posicin de los QTL se puede aumentar con mapeos finos, los cuales facilitan las pruebas de los efectos de QTL y los valores en poblaciones adicionales. Cuando la densidad de las recombinaciones observadas se acerca a la resolucin de genes aislados, el cambio gentico causal del QTL puede ser determinado (para revisin, Salvi y Tuberosa, 2005; Yu and Buckler, 2006; Belo et al., 2008; Harjes et al., 2008). El aislamiento molecular de estos QTL permite el desarrollo de marcadores moleculares perfectos o funcionales con el potencial de resolucin de la unidad fundamental de la herencia, el nucletido, y aumenta dramticamente la especificidad y precisin con las cuales los efectos genticos se estiman y manipulan en los programas de mejoramiento. El uso de transgenes podra simplificar la arquitectura gentica de caractersticas deseables de formas superiores, o incluso que no son posibles cuando hay disponibles marcadores perfectos para QTL robustos de efecto amplio. Tpicamente los transgenes condicionan efectos genticos fuertes a particulares loci operacionales, los cuales tambin exhiben accin de genes dominantes en donde slo se necesita una copia del evento para lograr la mxima expresin en un cultivar hbrido. Las caractersticas de los transgenes pueden reducir el complicado proceso de mejora cuantitativa a una solucin directa y frecuentemente dramtica. Un excelente ejemplo es la expresin de toxinas proteicas insecticidas de Bacillus thuringiensis (Bt) en hbridos transgnicos de maz para reducir el dao por herbivora provocado por Ostrinia nubilalis y Diabrotica spp. La resistencia parcial de germoplasmas de maz a estas plagas haba sido caracterizada como una caracterstica cuantitativamente heredable con poca heredabilidad (Papst et al., 2004;

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Tollefson, 2007), pero los eventos transgnicos con Bt ofrecen una alternativa heredable simple que es eficientemente manipulada en los programas de mejoramiento. A travs de la simplificacin de la estructura gnica, los transgenes tambin permiten la interrupcin de las interacciones allicas entre factores que controlan el rasgo de inters y otras caractersticas de rendimiento importantes. Por ejemplo, utilizando un recurso transgnico de resistencia a insectos (por ejemplo un solo locus del transgen Bt) se puede facilitar la seleccin de alelos favorables para mejorar el rendimiento que estn reprimen fuertemente unidos a genes endgenos de resistencia a estas plagas. Adems, los eventos transgnicos pueden ser diseados para desacoplar efectos pleiotrpicos negativos en fenotipos benficos condicionados por mutaciones recesivas. Esta aplicacin se puede ilustrar con le uso de ARN interferente para disminuir especficamente la expresin del gen de almacenamiento de zena en semilla (Segal et al., 2003; Huang et al., 2004). Esta estrategia imita los efectos de la mutacin opaque2, mejorando el perfil de aminocidos en granos de maz para alimentacin animal, a la vez que evita la textura suave del endospermo y la susceptibilidad a hongos patgenos tpicamente asociados con opaque2. Los eventos transgnicos tambin pueden ser diseados para intervenir en pasos regulatorios clave para una ruta metablica completa o para rutas de desarrollo, tales como aquellos genes de accin para el rasgo correspondiente que son heredados en factores dominantes nicos que son menos sensible a los efectos ambientales. Algunos ejemplos incluyen la expresin de un factor de transcripcin que incrementa la tolerancia a la sequa (Nelson et al., 2007) y la alteracin del balance entre los niveles del factor de transcripcin GLOSS15 y su represor, el micro ARN 172, para retardar la floracin en hbridos de maz (Lauter et al., 2005). La biotecnologa tambin facilita el agrupamiento de transgenes que controlan un rasgo, o serie de rasgos, en un haplotipo de un solo locus definido por un evento transgnico. Ejemplos de esta estrategia incluyen, el Arroz Dorado inicial (Ye et al., 2000), el reciente lanzamiento de hbridos de maz triplemente trasgnico Yield-Guard VT, en el cual, las caractersticas de tolerancia a herbicidas y resistencia a mltiples insectos se integran en un solo locus genmico (http://www.yieldgardvt.com/VTScience/Default.aspx), o la combinacin de transgenes que simultneamente incrementan la sntesis y disminuyen el catabolismo de lisina en semillas de maz (Frizzi et al., 2008). Reportes recientes sobre mejoras en la tecnologa de marcaje de genes (Ow, 2007) y la construccin de minicromosomas de plantas meiticamente transmisibles (Carlson et al., 2007; Yu et al., 2007) preparan el terreno para introducir ms caractersticas con mayor complejidad. Con estos logros la biotecnologa es ahora en posicin de ensamblar diversidad gentica til, desde esencialmente cualquier recurso, en construcciones que concentren accin gentica favorable y maximice la heredabilidad para un conjunto de caractersticas muy amplio. Para cerrar esta seccin sobre cmo el mejoramiento molecular de plantas incrementa la accin benfica del gen, es importante enfatizar que los estudios de QTL, cuando se llevan a cabo con la escala y posicin adecuadas para identificar genes causales, representan una estrategia genmica funcional muy poderosa. La clonacin de QTL ha producido nuevas perspectivas acerca de la biologa de las caractersticas cuantitativas, que no hubieran sido descubiertas desde el anlisis de genes mediante estrategias de prdida de funcin, o sobreexpresin, en particulares impacto de la variacin regulatoria en la variacin fenotpica y en la evolucin (e.g. Cong et al., 2002; Clark et al., 2006; Yan et al., 2004; Salvi et al., 2007).

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Por otra parte, los marcadores moleculares, la genmica y la biotecnologa se aplican de una red de trabajo iterativa, explotando as la diversidad gentica para la mejora de cultivos. La informacin gentica permite el descubrimiento de alelos benficos mediante el mapeo y clonacin de QTL, seguido del uso de la informacin aprendida sobre caracterizacin molecular de QTL, para disear estrategias transgnicas ptimas para el mejoramiento de plantas.

El mejoramiento molecular de plantas incrementa la eficiencia de la seleccin

El mejoramiento convencional de plantas, que se basa slo en la seleccin de fenotipos, ha sido histricamente efectiva. Sin embargo, para algunas caractersticas, la seleccin fenotpica ha logrado poco progreso debido a los retos al medir fenotipos o identificar individuos con el mayor valor de mejoramiento. Los efectos de ambiente, interaccin ambiente- genotipo y errores de medicin, tambin contribuyen a las diferencias observadas. La evaluacin de genotipos en ambientes mltiples con rplicas permite una mejor estimacin del valor de mejoramiento, pero requiere gasto y tiempo adicionales. Para algunos rasgos, podra ser necesario sacrificar individuos para medir el fenotipo, o la expresin de un rasgo puede depender de condiciones variables del ambiente (por ejemplo, presin por enfermedades) y el estado de desarrollo (la calidad del grano solo se puede conocer despus de la floracin). Adems los mejoradores tpicamente den mejorar de manera simultnea una serie de caractersticas valoradas comercialmente, lo que podra limitar la cantidad de grano para seleccionar. As como el mejoramiento molecular ayuda a expandir la diversidad gentica, caracterizar la estructura gentica y modificar la accin del gen, sus mtodos tambin pueden ser aplicados para incrementrar la eficiencia de la seleccin. Una gran parte de la literatura ha considerado la utilidad de la seleccin asistida por marcadores moleculares y su ajuste con los diferentes mtodos de mejoramiento (Fig. 1)tupiendo al lector a un gran nmero de revisiones excelentes del tema (Dekkers and Hospital, 2002; Holland, 2004; Johnson, 2004; Varshney et al., 2006; Collard and Mackill, 2008). Los genotipos de marcadores moleculares que se utilizan dentro de genes o muy cercanos a los QTL, que influencian rasgos bajo seleccin, pueden ser empleados como un suplemento a las observaciones fenotpicas en una gua de seleccin (Lande and Thompson, 1990). En los casos donde las correlaciones genticas son altas, se pueden ganar eficiencias adicionales sustituyendo la seleccin genotpica por la fenotpica, durante algunos ciclos de seleccin, lo que puede reducir los esfuerzos de fenotipaje, as como el nmero de ciclos que permitan el uso de viveros fuera de temporada. Johnson (2004) resume un ejemplo anticipado de combinar los datos fenotpicos y las puntuaciones de marcadores moleculares para incrementar las ganancias en rendimiento de maz y resistencia a plagas debida a la seleccin. Una estrategia efectiva para modificar simultneamente caractersticas mltiples, es el uso de ndices de seleccin que consideren mltiples factores para escoger el fenotipo mejorado final. Recientemente Eathington et al. (2007) reportaron su resultados sobre el uso de ndices de mltiples caractersticas y la seleccin asistida por marcadores en cerca de 250 poblaciones nicas de maz El uso de marcadores moleculares incrementan la eficiencia de la mejora alrededor de 2 veces en relacin a la seleccin fenotpica, tambin con ganancias similares en poblaciones de soya (Gyicine max) y girasol (Helianthus annuus). La seleccin asistida por marcadores tambin puede aumentar significativamente la ganancia gentica para caractersticas en las que el fenotipo es difcil de evaluar ya sea por su costo, o por su dependencia e condiciones ambientales especficas. Los marcadores moleculares se pueden utilizar para fomentar la probabilidad de identificar realmente genotipos superiores, concentrndose en probar recursos de genotipos con el mayor potencial (i.e. con la eliminacin temprana de genotipos inferiores), disminuyendo el nmero de la progenie que se necesita analizar para recuperar un nievel dado de ganancia, y permitiendo la mejora simultanea de caractersticas que estn negativamente correlacionadas (Knapp, 1998).Algunos ejemplos exitosos incluyen resistencia de la soya a nematodos (Young, 1999), resistencia a enfermedades

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en cereales (revisado por Varshney et al., 2006) y tolerancia a sequa en maz (Ribaut and Ragot, 2007; Tuberosa et al., 2007). La eficiencia de la seleccin fenotpica para lagunas caractersticas complejas se puede incrementar si se incluyen fenotipos bioqumicos o fisiolgicos como caractersticas secundarias, cuando estos exhiben correlaciones genticas fuertes con la caracterstica de inters y alta heredabilidad. Los recientes avances en genmica funcional permiten escalar a nivel de poblacin el perfil de abundancia de RNA, niveles y actividades de protenas y metabolitos que estn asociados con caractersticas importantes. A parte de los marcadores moleculares que identifican variaciones en la secuencia de ADN, estas estrategias genmicas podran proveer fenotipos secundarios adicionales como objetivos de seleccin (Jansen and Nap, 2001; Johnson, 2004), particularmente para aquellas caractersticas definidas por su respuesta a factores como medio, estado fisiolgico o desarrollo. La seleccin asistida por marcadores, tambin acelera el uso de transgenes en cultivares comerciales. Tpicamente, esto se ha logrado mediante la retrocruza asistida por marcadores. Sin embargo, para mejoras futuras en biotecnologa, como tolerancia a la sequa o a la limitacin de nutrientes, el mejoramiento directo podra requerir de la cooptimizacin de expresin del transgen y el origen gentico, puesto que los genes endgenos y los factores ambientales, podran tener el potencial de influir en los fenotipos resultantes de las modificaciones transgnicas (Mumm, 2007). Por supuesto, que el uso de marcadores moleculares, podra tambin contribuir con los esfuerzos de mejoramiento directo. Alternativamente los esfuerzos por descubrir genes adicionales o QTL, que son necesarios para el desempeo fiable de una caracterstica, podran proponer el diseo de nuevas construcciones de transgenes que agrupen transgenes primarios con modificadores genticos, en una segunda generacin de eventos transgnicos.

Incremento en la aprobacin del mejoramiento molecular de plantas

La aceptacin de las estrategias de mejoramiento molecular de plantas ha ocurrido a diferentes ritmos, dentro de las especies y las instituciones comprometidas con el mejoramiento de estos, debido a la influencia combinada de factores cientficos, econmicos y sociolgicos. Algunas barreras cientficas importantes, incluyendo la recalcitrancia de los cereales a la transformacin mediada por Agrobacterium y la falta de conocimientos sobre el control gentico, son definidas como objetivos importantes del mejoramiento. El desarrollo continuo de investigacin y tecnologa ha superado los obstculos presentes en la transformacin de plantas, en casi todos los cultivos y especies de horticultura de importancia econmica (Wenzel, 2006). De manera similar la informacin obtenida de la investigacin genmica en plantas y otros organismos ha generado bastante informacin sobre estructura y funcin gnica, as como grandes cantidades de marcadores moleculares para ser usados en el mejoramiento de plantas. A pesar de estos recursos, la gentica especficamente de QTL robustos permanece ambigua, amenos que los programas de mejoramiento y los sistemas de manejo de la informacin asociada, sean reestructurados para integrar por completo el conocimiento sobre pedigres, fenotipos, y marcadores de genotipos que puedan ser influenciados para optimizar la respuesta a la seleccin (Cooper et al., 2004; Eathington et al., 2007). An con una integracin de este tipo, modificar las funciones regulatorias sigue siendo un reto cientfico de mejoramiento molecular, puesto que es difcil determinar la secuencia de bases responsable de los cambios regulatorios y predecir los efectos fenotpicos (Morgante and Salamini, 2003). Una vez que las tecnologas en biotecnologa y genmica estn disponibles, los factores econmicos generalmente dictan el grado en que estas innovaciones se integren a los programas existentes de mejora de plantas. El costo de ganar la aprobacin regulatoria gubernamental, para la liberacin comercial de variedades transgnicas (recientemente estimadas por Kalaitzandonakes et al., 2007, entre $7-$10 millones) es una barrera econmica

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significativa. El costo asociado con el desarrollo, establecimiento y operacin del mejoramiento molecular de plantases mayor que para las prcticas convencionales de mejoramiento (Koebner and Summers, 2003; Morris et al., 2003), pues requiere inversiones importantes en nueva infraestructura de investigacin y capacidad intelectual. Estos recursos slo existen de forma inicial en compaas agrcolas privadas y en un puado de instituciones pblicas, promoviendo la aceleracin con tendencia a incrementar la industrializacin de los programas de mejoramiento en cultivos mayores como maz, soya, algodn (Gossypium hirsutum) y trigo (Johnson, 2007). Cuando ha habido aceptacin por las compaas, la balanza favorece a la biotecnologa sobre los QTL, para mejorar caractersticas complejas, a pesar de aumentar los costos de desarrollo del producto, ya que los transgnicos pueden ser diseados para producir efectos fenotpicos ms fuertes, incluso dramticos y generalmente se pueden desplegar ms rpido en un amplio rango del germoplasma, resultando en nuevas soluciones an ms rpido. A pesar de que actualmente el mejoramiento molecular es considerado por las grandes compaas, como un componente esencial en los esfuerzos de mejoramiento de cultivos mayores, la amplia aplicacin de las estrategias moleculares modernas a las tcnicas de mejoramiento convencionales, sigue siendo un tema de debate entre algunos mejoradores de plantas que participan en el sector pblico, particularmente, para cultivos menores (e.g. Gepts, 2002; Goodman, 2004). Adems de los muy vlidos factores cientficos y econmicos, que han retrazado o prevenido, la aceptacin de las estrategias moleculares para alcanzar algunos objetivos del mejoramiento molecular, al menos hay tres razones adicionales que contribuyen a esta visin. En primera, el mejoramiento molecular de plantas requiere entrenamiento y experiencia en biologa molecular y mejoramiento de plantas. Los esfuerzos educativos que otorgan este tipo de entrenamiento interdisciplinario fueron establecidos a inicios de 1990, pero continan limitados a un pequeo grupo de instituciones acadmicas con tradicin en mejoramiento de plantas (Guner andWehner, 2003; Gepts and Hancock, 2006; Guimaraes y Kueneman, 2006). Una segunda razn que reduce el entusiasmo para que la biotecnologa sea abrazada por los mejoradores, son los problemas de aceptacin de cultivos transgnicos entre algunos gobiernos y grupos de consumidores, como ha sucedido al posponer variedades de trigo con transgenes que brindan resistencia hacia los herbicidas con glifosfato (Sokstad, 2004). Finalmente, la exaltacin sobre el potencial del mejoramiento molecular de plantas, tambin estimula cambios en el financiamiento de instituciones publicas para incrementar la capacidad intelectual y la infraestructura de las investigaciones en genmica y gentica molecular, lo cual ocurre, ironicamente, a expensas de el mejoramiento convencional (Knight, 2003). Este nfasis puede ser temporalmente necesario para establecer los fundamentos de la biologa de plantas de siglo 21, pero actualmente, hay un reconocimiento creciente de que el incremento en la inversin en capacidad de mejoramiento de plantas y en investigacin de transferencia, uniendo los mtodos moleculares con los objetivos de mejoramiento, necesita del desarrollo del potencial de los avances recientes en biotecnologa y genmica (Guimaraes and Kueneman, 2006; National Research Council, 2008).

17.2.1.2.

CONCLUSIN

A pesar de los recientes avances y ejemplos exitosos del mejoramiento molecular de plantas, uno de los grandes retos actuales en la biologa de plantas es identificar aquellas combinaciones de genes que llevan a una mejora significativa de cultivos. Este comentario se concluye sugiriendo que la estrategia ms efectiva para acelerar estos esfuerzos, es integrar mejor las diferentes disciplinas de investigacin y las actividades centrales que conforman el mejoramiento molecular de plantas. Como aqu se describe, y anteriormente por otros (e.g. Gepts y Hancock, 2006; Bliss, 2007), esta integracin requiere el conocimiento de la organizacin genmica y de la funcin de los genes, fundamentos slidos en estrategias estadsticas par estimar los efectos genticos, bases fuetes sobre biologa de plantas, experiencia con los mtodos de laboratorio sobre biologa molecular y genmica funcional, as como en prctica en campo sobre

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mejoramiento, y la habilidad de manejar grandes conjuntos de datos de diversos tipos. Aunque se reconoce, con conciencia y apreciacin la importancia de cada una de estas disciplinas por todos los cientficos de plantas la formacin de estudiantes, y los esfuerzos de entrenamiento, los fondos de financiamiento y los programas de investigacin, todava enfatizan en subgrupos especficos del paradigma de mejoramiento molecular de plantas. Lo anterior se justifica dada l a amplitud de las disciplinas involucradas, sin embargo, se necesita hacer mayores esfuerzos para implementar programas educativos y de investigacin que promuevan la participacin activa en el mejoramiento molecular de plantas para la mejora de cultivos. Este tipo de programas debera ser desarrollado fomentando las colaboraciones entre grupos con experiencia complementaria. Absolutamente, las agencias de financiamiento deben expandir su portafolio de proyectos que da apoyo para la transferencia tecnolgica mediante requerimiento de propuestas que integren esfuerzos en investigacin bsica y tambin en productos tangibles de mejoramiento de plantas. Algunos ejemplos dignos de imitarse incluyen el programa Harvest-Plus (http://www.harvestplus.org/), el MASwheat (Dubcovsky, 2004), y el U.S. Department of Agriculture Coordinated Agricultural Projects. El sector privado tambin debe seguir con inversiones que estimulen la integracin y brinde el ambiente de entrenamiento apropiado para los futuros cientficos que se integren a la fuerza de trabajo del mejoramiento molecular. Adems de apoyo directo para entrenamiento de graduados y el patrocinio de investigacin, las compaas seguido pueden proporcionar apoyo "en especie" que ayude a reducir la brecha en tecnologa en expansin entre el sector de investigacin en mejoramiento molecular de plantas pblico y privado. Con los esfuerzos colectivos de la amplia comunidad de cientficos comprometidos con la biologa de plantas y la mejora de cultivos, el mejoramiento molecular de plantas podr expandir su impacto y contribuciones que dan respuesta a las necesidades de incremento sustentable de la produccin agrcola. Tarea 17-1 Haga un resumen en espaol de los siguientes prrafos:
Plant breeding has a long history of integrating the latest innovations in biology and genetics to enhance crop improvement. Prehistoric selection for visible phenotypes that facilitated harvest and increased productivity led to the domestication of the first crop varieties (Harlan, 1992) and can be considered the earliest examples of biotechnology. Darwin outlined the scientific principles of hybridization and selection, and Mendel defined the fundamental association between genotype and phenotype, discoveries that enabled a scientific approach to plant th breeding at the beginning of the 20 century (e.g. Shull, 1909). Despite the immediate recognition among some plant breeders of the importance of Mendelian genetics, full integration was delayed for nearly 20 years until quantitative genetics reconciled Mendelian principles with the continuous variation observed for most traits considered important by most plant breeders (Paul and Kimmelman, 1988). Subsequent advances in our understanding of plant biology, the analysis and induction of genetic variation, cytogenetics, quantitative genetics, molecular biology, biotechnology, and, most recently, genomics have been successively applied to further increase the scientific base and its application to the plant breeding process (e.g. Baenziger et al., 2006; Jauhar, 2006; Varshney et al., 2006). The plant biotechnology era began in the early 1980s with the landmark reports of producing transgenic plants using Agrobacterium (Bevan et al., 1983; Fraley et al., 1983; Herrera-Estrella et al., 1983). Molecular marker systems for crop plants were developed soon thereafter to create high-resolution genetic maps and exploit genetic linkage between markers and important crop traits (Edwards et al., 1987; Paterson et al., 1988). By 1996, the commercialization of transgenic crops demonstrated the successful integration of biotechnology into plant breeding and crop improvement programs (Koziel et al., 1993; Delannay et al., 1995). As depicted in Figure 1, introgression of one or a few genes into a current elite cultivar via backcrossing is a common plant breeding practice. Methods for markerassisted backcrossing were developed rapidly for the introgression of transgenic traits and reduction of linkage drag, where molecular markers were used in genome scans to select those individuals that contained both the transgene and the greatest proportion of favorable alleles from the recurrent parent genome (e.g. Ragot et al., 1995; Johnson and Mumm, 1996). During the past 25 years, the continued development and application of plant biotechnology, molecular markers, and genomics has established new tools for the creation, analysis, and manipulation of genetic variation and the development of improved cultivars (for review, see Sharma et al., 2002;Varshney et al., 2006; Collard and Mackill, 2008). Molecular breeding is

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currently standard practice in many crops, with the following sections briefly reviewing how molecular information and genetic engineering positively impacts the plant breeding paradigm.

17.2.2.
Metodologas empricas Seleccin y serendipia.

Modernizacin de viejas herramientas

Metodologas clsicas Hibridizacin, recombinacin, seleccin por pedigr. Metodologas modernas Marcadores moleculares, fisiologa, bioqumica. Metodologas innovadoras Estrategias de fenotipo, dobles haploides, MARS, transformacin, etc.

Metodologas de mejoramiento:

Unidad de seleccin:
Metodologas clsicas Fenotipo Poblaciones. Seleccin en base a grupos de individuos. Pools de genes. Genotipo Plantas. Lneas individuales. Seleccin en base al genotipo de un solo individuo. Metodologas innovadoras Haplotipo Combinacin de alelos individuales. Seleccin en base a haplotipos.

17.2.2.1.

Parmetros primarios y secundarios

En maz, el parmetro agronmico ms importante es el rendimiento de grano por hectrea. Este por su parte puede ser expresado en dos componentes: el nmero total de granos (KN de kernel number) multiplicado por el peso promedio de ellos (KW de kernel weight). Para seleccionar lneas de maz, por lo regular se les compara en trminos de los rendimientos de sus combinaciones hibridas. Es decir, no importa tanto el rendimiento de la lnea per se, sino mas bien el rendimiento de los hbridos que puede formar esa lnea con algn probador del grupo heterotico opuesto. Adicionalmente a los parmetros primarios de rendimiento, existen otros parmetros que tambin son caractersticos de cada genotipo. Estos pueden ser por ejemplo, el nmero de mazorcas por planta (EPP de Ear number per plant), los das de floracin femenina (SD de Silking days), das de floracin masculina (AD de anthesis days), intervalo de floracin femenina-masculina (ASI de anthesis-silking interval), la senescencia (SEN), el enrollamiento de las hojas bajo sequa (ROL), el contenido de clorofila en determinada etapa de desarrollo (SPAD), etc. A estos y otros parmetros que no son primariamente de rendimiento de grano se les llama carcteres secundarios (secondary traits). Por lo regular son ms fciles o ms rpidos de medir que el rendimiento final de grano. Algunos de los parmetros secundarios mas importantes, son el nmero promedio de mazorcas por planta (EPP) y el intervalo de floracin (ASI), sobre todo bajo condiciones de sequa.

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17.2.2.2.

ndices de Seleccin

Muchas veces, al agricultor no solo le interesa un solo carcter sino varios. Los ndices de seleccin se usan precisamente cuando uno quiere evaluar varios parmetros al mismo tiempo.
Ejemplo de un anlisis multicaracter en animales: Aunque las hijas del toro 1 produzcan ms leche que las hijas del toro 2 estas pueden tener mejor calidad de las protenas para la produccin de queso. Por ello se utilizan herramientas matemticas para combinar todos los parmetros de seleccin en una sola ecuacin. El resultado se expresa como un indice de seleccin. De esta forma se puede seleccionar no solo para un nico caracter (produccin de leche) si no tambin para una combinacin de varios caracteres a la vez (produccin y calidad). Por ejemplo, nos puede interesar la produccin de queso en trminos de kilos de queso de buena calidad por vaca, ms que la produccin de litros de leche por vaca. Los factores que se le asignan a cada variable que se usa para calcular el ndice de seleccin permiten darle un peso diferente a cada uno de los parmetros de inters. Ejemplo de un anlisis multicaracter en plantas:

El ndice de seleccin tambin permite incluir parmetros secundarios para as mejorar la seleccin de un carcter primario. La inclusin de caracteres secundarios ayuda a reducir el error de las mediciones y de los experimentos. De esta forma se puede discriminar mejor los genotipos que son genticamente superiores a pesar de una variabilidad ambiental muy grande. Veamos un ejemplo que se refiere a un experimento de campo bajo condiciones de sequa:
Rendimiento de grano GYF (ton/ha) 3.00 1.60 3.46 2.99 3.23 4.87 2.71 4.95 3.19 Floracin Masculina AD (days) 60 63 60 63 63 62 63 63 64 Intervalo Floracin ASI (days) 6 13 12 13 10 8 3 1 2 Mazorcas por planta EPP 1.05 0.66 1 0.88 1.04 1.1 1.46 1.52 1.3 Indice de Seleccin Selection Index -0.22 -4.46 -1.22 -2.32 -0.87 1.34 1.62 4.41 1.71

Genotipo

REP 1 2 3 1 2 3 1 2 3

PLOT 1 4 7 2 5 8 3 6 9

ENTRY 1 1 1 2 2 2 3 3 3

Tomando los datos de la tabla arriba debemos encontrar el mejor genotipo (ENTRY). En primer lugar nos interesa el rendimiento de grano en campo (GYF). Para ello calculamos los promedios de las 3 repeticiones por entrada y obtenemos la siguiente tabla resumen: PROMEDIOS
ENTRY GYF (ton/ha) AD (days) 61.0 62.7 63.3 ASI (days) 10.3 10.3 2.0 EPP 0.9 1.0 1.4 Selection Index -2.0 -0.6 2.6

1 2 3

2.69 3.70 3.62

Parece que la entrada 2 con 3.7 toneladas es la que mas rinde, sin embargo, es una diferencia significativa? Para contestar esa pregunta debemos calcular los errores estndares y hacer las pruebas T.

494

Errores Estndar

ENTRY

GYF (ton/ha)

AD (days) 1.00 0.33 0.33

ASI (days) 2.19 1.45 0.58

EPP 0.12 0.07 0.07

Selection Index 1.28 1.06 0.92 Selection Index (p value) 0.23 0.03 0.04

1 2 3 Pruebas T (valor de P)

0.56 0.59 0.68

ENTRY

GYF (p value) 0.14 0.18 0.47

AD (p value) 0.12 0.07 0.12

ASI (p value) 0.50 0.03 0.01

EPP (p value) 0.26 0.02 0.01

1 vs 2 1 vs 3 2 vs 3

Podemos ver que los errores estndares del rendimiento son de 0.56 a 0.68, que son mas grandes que las diferencias de rendimiento entre genotipos. La prueba T de la comparacin entre la entrada 2 y la 3 nos da un valor de p no significativo (p=0.47). De hecho, si consideramos solo el rendimiento, ningn genotipo es significativamente mejor o peor que el otro ya que los valores p son mayores a 0.05. Que se hace en esos casos? Una opcin es volver a sembrar esos mismos genotipos ya sea con muchas ms repeticiones o en ms localidades. Solo as se obtendrn suficientes datos de rendimiento para tener mayor certeza de escoger el genotipo superior. Sin embargo, repetir ensayos o hacerlos ms grandes es bastante laborioso y caro. Afortunadamente los mejoradores han desarrollado algunos procedimientos para ahorrarse estos costos. El uso de parmetros fisiolgicos secundarios y el clculo de ndices de seleccin es un ejemplo. De muchos experimentos anteriores bajo condiciones de sequa se ha visto que el rendimiento de grano (GYF) esta correlacionado con el intervalo de floracin (ASI) y tambin con el nmero de mazorcas por planta (EPP). La correlacin es positiva para EPP y negativa para ASI. Si el rendimiento es el parmetro primario, al EPP y ASI se les llama parmetros secundarios. Si queremos ver cual genotipo es mejor, adicionalmente a buscar la entrada que tenga el GYF mayor, tambin se puede considerar el genotipo con el EPP mayor o el ASI menor. Si revisamos la tabla de resultados vemos que el genotipo 3 tiene un EPP mayor y un ASI menor a los dems. Los tres genotipos son muy parecidos en trminos de rendimiento. Sin embargo, si adicionalmente consideramos el EPP y el ASI podemos ver que la entrada 3 es mucho mejor que todas las dems. Esto lo concluimos de los datos que ya tenemos del ensayo sin necesidad de repetir el experimento. Es decir, el uso correcto de las matemticas y la estadstica a veces nos ayuda a ahorrarnos trabajo experimental. Para combinar los diferentes parmetros en un solo indice, primero hay que estandarizar los valores numricos de cada parmetro. No podemos sumar toneladas con das de floracin o nmero de mazorcas. Las unidades de cada medicin son muy diferentes. Si no normalizamos los datos no podremos calcular un indice de seleccin. Una forma de estandarizar los datos es restarle el valor promedio a cada dato, y el resultado dividirlo entre la desviacin estndar. De esta forma obtenemos un valor sin unidades, que se refiere a que tantas desviaciones estndares arriba (valor positivo) o abajo (valor negativo) del promedio se encuentra cada genotipo con relacin al parmetro secundario. El selection index se calcula entonces sumando o restando los diferentes valores estandarizados dependiendo si estn positivamente o negativamente correlacionados con el rendimiento. El ndice de seleccin de las tablas anteriores fue calculado tomando en cuenta los datos estandarizados de GFY, EPP y ASI de la siguiente manera: Selection Index = GYFest - ASIest + EPPest

495

GYFest =

GYF - Promedio(GYF) DesviacinEstandard(GYF) EPPest =

ASI est =

ASI - Promedio(ASI) DesviacinEstandard(ASI)

EPP - Promedio(EPP) DesviacinEstandard(EPP)

Selection Index 4 3 2 1 index 0 -1 -2 -3 1 2 3

Rendimiento GYF 5.0 4.5 4.0 3.5 ton/ha 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 1 2 Entrada 3 -4

Entrada

Figura 17-7. Grafica de rendimiento de grano (grain yield field GYF). Las diferencias de GYF no son significativas. A la derecha se muestra la grafica con los valores del indice de seleccin. Las diferencias si son significativas.

17.2.2.3. 17.2.2.4.

Parmetros fisiolgicos Parmetros bioqumicos

496

17.2.2.4.1. Carotenos y lpidos

17.2.2.4.2. Triptfano y protenas 17.2.2.4.3. Antocianinas y antioxidantes 17.2.2.4.4. Almidn y azucares en grano y tallo

17.2.3.
17.2.3.1. 17.2.3.2. 17.2.3.3. 17.2.3.4.
Input FGM

Aprovechamiento de la informacin molecular disponible

Informacin sobre rutas metablicas Informacin sobre QTLs Informacin sobre genes Informacin sobre factores de transcripcin

Ejemplo ruta de carotenos. Input NPR

17.2.4.

Seleccin asistida por marcadores

Tradicionalmente, la nica forma de saber si la descendencia de una cruza en particular haba heredado caracteres tiles (p. ej. tolerancia a la sequa, resistencia a enfermedades o calidad de

497

grano) era sembrando los materiales en parcelas y evaluando las plantas adultas. La seleccin asistida por mejoradores acelera el proceso de mejoramiento, ya que hace posible rastrear la presencia de genes tiles en cada generacin. Esto no excluye la necesidad de hacer evaluaciones en el campo, pero hace muchsimo ms eficiente el proceso. Para la seleccin en el campo necesitamos tiempo, espacio y recursos, y nuestra capacidad es limitada", explica Gary Atlin, mejorador de maz del CIMMYT, pero si aplicamos MAS podremos emplear los recursos de manera ms eficaz, concentrndonos en las mejores lneas y filtrando aquellas que no hayan heredado los caracteres que nos interesan. Cuando los investigadores quieren saber si una lnea de trigo o de maz en particular tiene la versin til de un gene (por ejemplo, resistencia en lugar de susceptibilidad a las enfermedades), emplean secciones adyacentes e identificables de DNA conocidas como marcadores, a las cuales se aplica tintura fluorescente para distinguirlas. Las distintas versiones de marcadores y genes se llaman alelos. El DNA que se encuentra junto al cromosoma suele mantenerse unido durante generaciones, de manera que cierto alelo de un marcador, por lo general, es heredado junto con el alelo til de un gene adyacente. Con el uso de nuevas mquinas de electroforesis capilar, la muestra es forzada a travs de un tubo capilar estrecho bajo la influencia de una corriente elctrica. Un lser al final del tubo detecta los diferentes alelos de los marcadores fluorescentes y esto indica al cientfico si la muestra contiene los alelos que est buscando. Adems de ser rpida y menos costosa en lo que respecta a mano de obra, la electroforesis capilar permite hacer pruebas con ms de un marcador y colocar ms de una muestra al mismo tiempo en cada tubo. Al utilizar colores de tintura fluorescente ligeramente distintos para cada muestra, es posible distinguir los marcadores en cada una de ellas, igual que los grupos de corredores que utilizan camisetas de distintos colores. Para lograr una mxima eficiencia, los cientficos pueden tambin formar grupos de muestras que pueden examinar con pequeos intervalos de tiempo, igual que cuando los corredores se preparan para el momento de salir. El CIMMYT podr incluso generar un marcadores tipo SNP (single nucleotide polymorphism), que son automatizables y permiten hacer ensayos con numerosos caracteres simultneamente y aporta muchos ms datos por muestra. Todo esto quiere decir que las nuevas mquinas tienen mayor capacidad de produccin y que se pueden analizar ms muestras con la misma cantidad de mano de obra, reduciendo de manera impresionante el costo individual de las muestras. Actualmente la mayor limitante del uso de los marcadores es el costo. Si la seleccin asistida por marcadores fuera significativamente ms econmica, sin duda la empleara en el mejoramiento de maz dentro de instituciones de mejoramiento pblicas. En efecto, se puede hacer la transferencia de genes en variedades mejoradas en poco tiempo. Si uno hace una retrocruza entre un donador que contiene una caracterstica gentica y un progenitor mejorado con buen comportamiento agronmico, est tratando de seleccionar una caracterstica del donador, aunque distinta de todos sus otros genes. Con varios marcadores, la seleccin asistida por marcadores indica exactamente cul progenie posee la combinacin de los genes deseados de un donador y los genes buenos del otro progenitor. Se pueden obtener resultados en dos generaciones, en comparacin con las cuatro o cinco que normalmente haba que evaluar. El problema de la seleccin asistida por marcadores es encontrar genes con efectos substanciales, en especial de caracteres complejos, como la tolerancia a la sequa en el maz. Se que an habr que encontrar esos genes. En el pasado, era difcil aplicar en el mejoramiento donadores con genes o caracteres nicos tiles pero que por lo dems poseen cualidades agronmicas pobres, en virtud de que esto implicaba introducir mucho material que no era de utilidad. Por medio de la seleccin asistida por marcadores nos podemos deshacer del material que no es til, y esto nos abre la posibilidad de encontrar el gen til en una amplia variedad de progenitores. La tecnologa de los genotipos est volvindose menos costosa y ms eficiente

498

para identificar genes todo el http://www.cimmyt.org/spanish/wps/news/2007/aug/genetic.htm

tiempo."

Fuente:

El mejoramiento gentico actual se base en el efecto infinitesimal, basndonos en fenotipos y genealoga. Se aplica una metodologa estadstica y se predicen cules son los mejores alelos (mide la parte aditiva del fenotipo de un individuo). La idea es poder usar marcadores moleculares o los propios genes para tener la inferencia genotpica, lo que no nos ahorra hacer lo que hemos mencionado. Si desconocemos el gen, entonces podemos estudiar un microsatlite que est asociado al gen. En estos caso se habla de Marker Assisted Selection (MAS). Si en cambio s usamos el gen porque lo conocemos entonces se llama Gene Assisted Selection (GAS). Puedo tener marcadores directos (en el mismo gen mayor) o indirectos (ligado al gen mayor). Lo ideal seria tener un marcador directo, pero tambin presenta problemas. MAS es til para caracteres: Unigenicos o oligognicos. limitados a un solo ambiente no disponible en la estacin experimental. difciles o caros de medir, como la resistencia a enfermedades. mesurables solo cuando la planta madura, como el rendimiento. El MAS en especialmente til en animales para caracteres: de baja heredabilidad, como los reproductivos. limitados a un sexo, como la produccin de leche. difciles o caros de medir, como la suceptibilidad a enfermedades. mesurables despus del sacrificio del animal, como por Ej., la calidad de la carne

17.2.5.

Nuevos esquemas de mejoramiento

Haplotipo

Cambio de enfoque para la unidad de seleccin Individuo Ejemplo de nuestro proyecto de GCP

Unidad de seleccin:
Metodologas clsicas Fenotipo Poblaciones. Seleccin en base a grupos de individuos. Pools de genes. Genotipo Plantas. Lneas individuales. Seleccin en base al genotipo de un solo individuo. Metodologas innovadoras Haplotipo Combinacin de alelos individuales. Seleccin en base a haplotipos.

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500

Figura 17-8. Common breeding and selection schemes. Each vertical bar is a graphical representation of the genome for an individual within a breeding population, with colored segments indicating genes and/or QTLs that influence traits under selection. Genes associatedwith different traits are shown in different colors (e.g. red, blue). X indicates a cross between parents, and arrows depict successive crosses of the same type. Asterisk below an individual signifies a desirable genotype. A, Backcrossing. A donor line (blue bar) featuring a specific gene of interest (red) is crossed to an elite line targeted for improvement (white bar), with progeny repeatedly backcrossed to the elite line. Each backcross cycle involves selection for the gene of interest and recovery of increased proportion of elite line genome. B, Gene pyramiding. Genes/QTLs associated with different

501

beneficial traits (blue, red, orange, green) are combined into the same genotype via crossing and selection. C, Pedigree breeding. Two individuals with desirable and complementary phenotypes are crossed; F1 progeny are self-pollinated to fix new, improved genotype combinations. D, Recurrent selection. A population of individuals (10 in this example) segregate for two traits (red, blue), each of which is influenced by two major favorable QTLs. Intermating among individuals and selection for desirable phenotypes/genotypes increases the frequencies of favorable alleles at each locus. For this example, no individual in the initial population had all of the favorable alleles, but after recurrent selection half of the population possesses the desired genotype. For hybridized crops, recurrent selection can be performed in parallel within two complementary populations to derive lines that are then crossed to form hybrids; this method is called reciprocal recurrent selection.

Figura 17-9. The genetic gain equation and its component variables. The top portion illustrates an idealized distribution showing the frequency of individuals within a breeding population (y axis) that exhibit various classes of phenotypic values (x axis). Mean phenotypic value (m0) of the original population (shown as entire area under the normal curve) and mean (mS) for the group of selected individuals (shaded in blue) are indicated. In this generalized example, trait improvement is achieved by selecting for a lower phenotypic value, e.g. grain moisture at harvest in maize. Components of variation (s2) that contribute to the SD of the phenotypic distribution (sP) are indicated below the histogram.

17.3.

Retos para el futuro

Ejemplos de nuestro proyecto de GCP Uso de NIR como marcador bioqumicos Uso de pirosecuenciador para genotipaje (marcadores mas baratos) Cri conservacin de polen (facilidad para hacer cruzas de prueba para mejoramiento) Agente que incremente la tasa de recombinacin gentica (tamao de haplotipos mas pequeos) Agente que afecte la metilacin del DNA y de esta forma se reduzca la Heterosis. Tener plantas con vigor hibrido sin que sean cruzas. Compaas semilleras interesadas en mejor produccin de semilla hibrida.

502

Mutacin inducida en ciertos genes (oligos) sin que sea transgnico Dobles haploides (ya se esta haciendo con maz para generar lneas homocigticas mucho mas rpido)

503

18. Mejoramiento Gentico de Maz

18.1. Introduccin
Dar una pequea introduccin sobre este capitulo. Considerar los antecedentes de los dems captulos. Si en los otros se hablo ms general sobre mejoramiento, en este se hablara muy especficamente sobre el maz. La evolucin del maz La radiacin de las angiospermas. El maz y las gramneas (Poaceae) Teocinte. La aparicin del Maz. Evolucin y seleccin emprica. La agricultura. Desde sus inicios hasta antes de la revolucin verde. El mejoramiento moderno del maz: La aplicacin de conceptos de la ciencia: La revolucin verde. Mejoramiento del rendimiento por seleccin. Variedades de polinizacin libre, lneas, hbridos. Mejoramiento de la calidad nutricional y tolerancia a sequa. Maz QPM, Vitamaz, etc. El maz transgnico Conclusiones: el futuro prximo

18.1.1.

Caractersticas distintivas del Maz

Describir que es lo que hace especial al maz. Que lo distingue de todos los dems cultivos. Caractersticas genticas (genoma, transposones, etc.), morfolgicas (crecimiento determinado, flores separadas), fisiolgicas (fotosntesis C4), bioqumicas (almidn en endospermo), etc.

18.1.1.1.

Morfolgicas

Algunas plantas poseen flores separadas en las que se presentan nicamente partes masculinas o partes femeninas. Cuando las flores femeninas y masculinas se presentan en individuos diferentes, a este tipo de plantas se les llama dioicas. A menudo las flores masculinas o femeninas se encuentran en la misma planta, como es el caso del maz, el trigo y el frjol. A estas plantas se les llama monoicas. Estas pueden presentar rganos femeninos y femeninos en una sola inflorescencia, o bien flores separadas estaminadas o pistiladas. En el frjol y el trigo, las flores son bisexuales, mientras que en el maz, la inflorescencia femenina (jilote) y masculina (espiga) estn fsicamente separadas. Planta con flores separadas, etc. Explicar morfologa y trminos jilote, totomoxtle, etc mostrar fotos El jilote en Mxico es de tanta importancia que tuvo incluso su propia diosa, Xilonen, asumida bajo la forma de Chicomecatl, la diosa del maz en general, a veces tambin xilote (nhuatl: xilotl, cabello) es el nombre americano dado al maz tierno en referencia a las barbas del maz joven, es decir, a la mazorca de maz cuando sus granos todava no han cuajado.

504

Figura 18-1. Jilote En algunas regiones de Mxico es habitual el referirse a las hojas secas de la mazorca del maz con el nombre de totomoxtle. La mazorca despus de ser cosechada es transportada a los lugares de almacenamiento donde es depositada a granel, estos pueden ser zarzos o cualquier tipo de lugar que rena las condiciones optimas de ventilacin, que este seco, protegido de roedores, aves etc. (Figura 18-2) El grano es utilizado en alto porcentaje para el autoconsumo y alimentacin de aves, ganado de traspatio y un bajo porcentaje es destinado al mercado a travs de acaparadores e intermediarios regionales y consumidores directos.

Figura 18-2. Aprovechamiento http://148.235.138.11/cadenas/guias/guiasPDF/aprovechamiento

del

totomoxtle.

La polinizacin es la transferencia del polen desde una antera hacia el estigma. La autofecundacin se da cuando el polen se transfiere desde la antera de una flor hasta un estigma de la misma planta. La autopolinizacin se puede dar de manera natural como en el trigo y en arabidopsis, cuando el polen cae sobre el estigma o las anteras se frotan con la superficie del estigma. Tambin se puede dar de manera controlada como en el maz. Para ello se debe cubrir el jilote y la espiga, para usar el polen para la fecundacin de la misma planta. Cuando la transferencia del polen desde una antera de una planta hasta el estigma de otra planta se llama polinizacin cruzada. Este tipo de polinizacin es fomentada principalmente por la accin de insectos como abejas y escarabajos. En algunos casos, la polinizacin cruzada se da por la accin del viento, como es el caso en el maz, los pastos, y algunos rboles como los pinos. Una vez que se realizo la polinizacin, un diminuto tubo crece hacia el interior del ovario. Un gameto procedente del grano de polen desciende por el tubo polnico, para liberarse en el ovario

505

a travs del micrpilo. El gameto del polen se fusiona con la clula del ovario. A esta unin se le denomina fertilizacin. En las plantas, se da el fenmeno de la doble fecundacin. Esto se refiere a que el segundo ncleo espermtico que fue llevado por el tubo del polen hacia el vulo se une a los dos ncleos polares para formar una estructura triploide, que da lugar al tejido del endospermo. Una vez realizada la doble fertilizacin, empieza a desarrollarse la semilla. El cigoto, diploide formara el embrin, en cambio en ncleo triploide formara el endospermo, mientras que la pared del ovario, que es un tejido materno diploide, dar lugar a la cscara de la semilla. Las semillas son seres vivos que se encuentran en estado latente o inactivo, las cuales presentan tres estructuras: una envoltura seminal, un aporte de nutrientes de reserva que es el cotiledn o endospermo y un embrin. La envoltura seminal protege a la semilla. Los cotiledones es la porcin nutritiva, necesaria para el embrin hasta que la planta joven pueda elaborar su propio alimento. El embrin a su vez consta de tres partes: un brote joven (plmula), un tallo (hipcotilo) y una raz (radcula).

18.1.1.2.

Genticas

Genoma diploide (pseudotetraploide) Transposones >60% del genoma son secuencias repetitivas Genes saltarines (Brbara Maclintock)

18.1.1.3.

Bioqumicas

Fotosntesis C4 Sntesis de almidn de endospermo (AGPasa citoplsmica)

18.2.

Origen y razas del Maz

Poner aqu un breve resumen sobre las distintas razas de maz. El maz fue el primer cultivo que se implant en Norteamrica hacia el ao 200 D.C. Cuando llegaron los primeros colonos europeos, stos aprendieron de los indios a cultivar el maz, de tal manera que de su cultivo lleg a depender su sobrevivencia y tradiciones. Antes de que Coln descubriera el Nuevo Mundo, los cultivos europeos ms importantes como el trigo apenas ofrecan resultados suficientes para abastecer a una poblacin hambrienta. El xito del cultivo del maz ah se debi a la oferta de una alternativa de alta produccin con relacin a otros granos y a que requera relativamente poco trabajo. La papa, se ha convertido en la base de la dieta de las comarcas pobres desde Irlanda hasta Alemania. Por otra parte, el tomate, que se tachaba de venenoso y de no ofrecer ventaja, despus de varios siglos se ha convertido en un producto esencial. El propio maz, al principio, se destinaba nicamente para alimentar al ganado, ya que los europeos lo encontraban muy duro. Teosinte Criollos Maz Palomero Cnico Toluqueo Maz Norteamericano (Flint y Dent) VARIEDADES BOTNICAS DEL MAZ. Zea mays TOMADO (Parker, 2000).

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TIPO Maz dentado

VARIEDAD Indentata.

Maz vtreo Maz harinoso Maz dulce

Indurata Amylacea Saccharata

CARACTERSTICAS. Principal maz para la alimentacin. Granos amarillos o blancos. Producido para la obtencin de almidn. Se produce para elaborar harina de maz. Granos azucarados cuando son inmaduros. Su endospermo fibroso revienta cuando se pone en contacto con el calor. Es un antecesor del maz. Los granos individuales se encuentran encerrados en cscaras o vainas. No es comercial.

Maz reventn o palomero Praecox

Maz envainado.

Tunicata

18.3.
18.3.1.

Heterosis
Magnitud del vigor hbrido en maz

La heterosis es uno de los fenmenos ms importantes para la agricultura. Es un fenmeno que todava no se entiende del todo. Existen varias teoras que tratan de explicar la heterosis, pero hasta ahora, ninguna puede explicar satisfactoriamente todas las observaciones. Los efectos de endogamia como los tipos de vigor hbrido no son un simple efecto aditivo de la ausencia de genes, sino que es un efecto sinrgico de la presencia de ciertos alelos. Cientficamente sigue siendo un enigma, como es que la cruza entre dos lneas puede dar lugar a un hbrido F1 con tan alto rendimiento. En el caso del maz, el efecto absoluto y porcentual de heterosis es espectacular. Un hbrido F1 por lo regular rinde ms de 300% de cualquiera de las lneas parentales. Tpicamente, las lneas rinden de 1 a 3 ton/ha de grano mientras que los hbridos F1 rinden de 8 a 13 ton/ha. Actualmente no se conoce ningn efecto gentico que sea de mayor relevancia para incrementar el rendimiento de grano como la heterosis. La magnitud del vigor hibrido se puede apreciar mejor al comparar las mazorcas de los hbridos con sus respectivas lneas parentales (ver siguiente figura)

507

Figura 18-3. Ejemplo de mazorcas de dos lneas homocigticas y el hbrido F1 (CML460xCML461) que se forma de la cruza de esas lneas parentales. El tamao de la mazorca del hbrido y su respectivo rendimiento es ms del triple que la suma de las dos lneas por s solas.

18.3.2.
18.3.2.1.

Teoras y Explicaciones
Teora de dominancia

Describir teora de heterosis basado en un efecto gentico de dominancia. Faltan genes en algunos genotipos. En teora seria posible construir un genotipo con todos los alelos favorables.

18.3.2.2.

Teora de sobredominancia

Describir teora de heterosis basado en un efecto gentico de sobredominancia. El heterocigoto es ms que la suma de los homocigotos. En teora no es posible construir un genotipo con todos los alelos favorables. Siempre se tienen que hacer cruzas.

18.3.2.3.

Teora mixta de diferentes tipos de heterosis

Input de Axel sobre los dos tipos de heterosis. Efecto gentico, y efecto epigentico.

18.3.3.

Grupos heterticos

Flint y Dent en germoplasma templado. Diversos grupos heteroticos en germoplasma tropical.

508

18.3.4.

Aprovechamiento de heterosis en maz

Describir las particularidades del mejoramiento para la heterosis. Explicar grupos heterticos y estrategias de seleccin reciproca recurrente. Explicar cruzas de prueba para determinar patrones heterticos.

18.4.

Manejo de Cultivo y Fitotecnia

INPUT DE UN AGRONOMO Describir aqu el manejo agronmico de maz Preparacin de terreno Siembra Riego Fertilizacin Cultivos Agricultura de conservacin Control de malezas Control de insectos Control de hongos Control de otros tipos: bacterias, virosis, etc. Consideraciones para la cosecha Tipos de aprovechamientos: Aprovechamiento para grano Aprovechamiento como forraje Aprovechamiento para totomoxtle (hojas para tamales) Aprovechamiento para biomasa y biorefinacin

509

19.
19.1. 19.2.
1903 1918

Anexos
Fundamentos varios Cronologa de algunas teoras genticas

19201930 1937 1940 19501970

Redescubrimiento de las leyes de Mndel. Se comienza a aplicar la mejora gentica animal. Mtodo infinitesimal de Fisher: (matemtico) comenz a pensar en trminos de varianza y poblacin. 1 poblacin: VF = VG + VE Por lo que comenz a descomponer cada una de estas varianzas en diferentes componentes (modelo infinitesimal). Como los caracteres son descritos por 1 slo gen se puede asumir que los de distribucin continua estn regulados por numero genes (y cada uno tiene una influencia pequea componente aditivo que se va sumando). Los modelos matemticos permiten aproximar la distribucin de estos caracteres con una dist.normal. As nace la gentica biomtrica. Waight y Haldane aplicaron Fisher tanto en la seleccin artificial como natural. Se crearon modelos tericos para explicar la evolucin en base de seleccin, mutacin, migracin y deriva gentica. Son la base de la gentica cuantitativa o de poblaciones. Luz aplic estos modelos en la mejora gentica a animales y vegetales, tambin Hazle hizo mejora. Lush lo aplic a la mejora de la produccin de leche en poblaciones reales. Teora de los ndices de seleccin Lush y Hazel: Modelos matemticos que tienen en cuenta muchos caracteres para llevar a cabo la seleccin. Adems se da diferente importancia para cada carcter. Mtodo BLUP de Henderson: Desarroll un mtodo matemtico (Best Line Prevission) que lleva a cabo matrices fenotpicas para ordenar o realizar un ranking de los mejores valores genticos de los individuos. Comparando los valores genticos de las hijas. Ejemplo-Toros: Queremos saber cul de los 10 es mejor para producir leche. Se cruzan con muchas hembras recogiendo los datos de las mejores hijas. Asumimos (por Fisher) que G y E determinan P (recordemos que Fisher consider genes infinitos y de igual peso). Tendremos en cuenta pues los valores fenotpicos y los mismos de los parientes. Si como promedio los parientes del individuo 1 son mejores que los del 2, los genes de 1 sern mejores llevaremos a cabo la seleccin. Gentica molecular: Se produjeron avances que permitieron observar los genes (Aparece la gentica molecular) que poda darnos informacin directa de los individuos no infundada matemticamente. Pero sta no trata de sustituir la cuantitativa por la molecular sino de tener herramientas complementarias. Se introducen trminos como QTL y tcnicas como el MAS (seleccin asistida por marcadores): QTL (Loci de un Caracter Cuantitativo): Regin del genoma donde hay genes que intervienen para 1 carcter cuantitativo. Datos necesarios para detectar estos QTLs: Datos genticos y datos fenotpicos. En el mbito de la gentica veterinaria (perro y pollo) fueron las primeras especies domsticas con mapas genticos. Hasta que no se obtuvieron estos mapas no se poda determinar los QTLs. A partir de los caracteres cuantitativos existen otros genes en los animales domsticos que siguen una gentica mendeliana. Despus de implantar la tecnologa del DNA se comienzan a realizar experimentos ms directos para detectar patgenos, identificaciones de animales, pruebas de paternidad, genotipeado de genes de inters productivo: caracteres

1990

510

cuantitativos implicados en enfermedades

19.3.
1.1.

Catlogo de preguntas interesantes

Catlogo de Preguntas Interesantes

Cmo se remueven los intrones del ADN? Se sabe que los intrones son removidos del ARN mediante un proceso denominado empalme del ARN, el cual es una especie de "edicin" del contenido del ARN (es decir, es un proceso de remocin de intrones), que ocurre dentro del ncleo de una clula. Existen diferentes mtodos de empalme del ARN. La mayora requiere de la ayuda de protenas que reconocen secuencias especficas en el pre-ARN. (PONER DIBUJO y EXPLICAR EN MAS DETALLE) Qu hacen los intrones? Esta pregunta sigue siendo tema de estudio. La denominada "teora exnica de los genes"[6] sugiere que los exones son los bloques constructores de las protenas y que los genes se crean a partir de las combinaciones de estos bloques constructores. Esta teora nos lleva hacia la "hiptesis de barajeo de exones"[3], la cual afirma que los intrones incrementan el porcentaje de recombinacin de los exones, haciendo ms fcil moverlos y crear nuevos genes. Walter Gilbert afirma que: [7]"...los intrones [estadsticamente hablando] representan puntos de gran propensin a la recombinacin: por su mera presencia y longitud, incrementan el porcentaje de recombinacin, y en consecuencia incrementan el barajeo de exones por factores del orden de 106 a 108". Hay evidencia que parece sugerir que los exones pueden corresponder a subunidades estructurales y funcionales de las protenas, incluyendo ejemplos especficos del mismo exn, que existe en diferentes genes donde se requiere la misma estructura o funcionamiento de dos protenas distintas. De acuerdo a esta teora, la estructura intrn-exn de los genes eucariticos, motiva la formacin de nuevos genes a partir de sub-unidades estructurales y funcionales de los genes existentes, en lo que constituye un proceso ms eficiente que construir los nuevos genes a razn de un nucletido a la vez. Ante esta teora, la pregunta que resulta ms obvia es: si los intrones son tiles para la recombinacin, entonces por qu slo aparecen en los organismos eucariotas y no en los procariotas? TRANSFERENCIA VERTICAL VS. TRANSFERENCIA HORIZONTAL La informacin gentica se transmite de padres a hijos verticalmente. La recombinacin como ya mencionamos, es la unin de la informacin gentica de dos individuos coetneos por medio de la reproduccin sexual. Visto as, se trata de un mecanismo transmisin de informacin que incluye adems del aspecto estrictamente vertical un aspecto de transferencia horizontal de informacin gentica. La probabilidad de que dos alelos existan en estado homocigoto (digamos AA y BB) en un mismo individuo a partir de otro aabb y sin que haya recombinacin mediada por la reproduccin sexual ser la probabilidad de que "A" mute a "a" al cuadrado multiplicada por la probabilidad de que B mute a "b" al cuadrado. El efecto de la recombinaciones entonces aumentar la probabilidad desaparicin de combinaciones genticas en varios rdenes de magnitud. ste efecto se hace ms manifiesto si consideramos una mayor cantidad de genes determinando el fenotipo sujeto a estudio. Para varios genes el fenmeno se hace con una probabilidad de un milln de veces ms (diez mil millones de millones de veces) que si consideramos nicamente dos genes. Cada gene que agregamos, por su efecto en un fenotipo polignico, incrementa la relevancia de la recombinacin en seis rdenes de magnitud al ser comparada con la mutacin como fuente de variacin gentica. Algunos fenotipos resultan afectados por decenas de genes y esto causa que la relevancia de la recombinacin en tales casos sea muy clara. TRANSFERENCIA DE GENES VS. TRANSFERENCIA DE GENOMAS.

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Uno de los aspectos ms interesantes a considerar, es la diferencia en cuanto a su mecanismo y las implicaciones que tiene la transferencia de un gene sobre todo el genoma. La especie es comnmente definida como aquel grupo de individuos que comparten la misma poza gnica. En este caso, la transferencia horizontal especfica es una va de la reproduccin sexual junto con la recombinacin, constituyen fenmenos comunes; pero si consideramos que la transferencia se lleva a cabo entre individuos de especies diferentes, no se debe considera en este caso. Est transferencia cuando existe, llega a desempear un impacto central sobre la manera de generar nueva variabilidad. Supongamos por un momento que los genes de la fotosntesis rebasaran los lmites especficos transfirindose a un hetertrofo multicelular: constituira entonces un organismo que en la actualidad no existe. De hecho la ingeniera gentica trata primordialmente este tipo de transferencia; por ejemplo, transferir genes de resistencia a la sequa entre plantas diferentes es la versin biotecnolgica de un fenmeno que ha prevalecido en la naturaleza por mucho tiempo. As como en cada evento de reproduccin sexual se ponen en contacto dos genomas distintos, podramos imaginar la transferencia de un genoma de una especie a otra distinta. La teora endosimbitica del origen del cloroplasto y la mitocondria es un tpico caso de esta clase de transferencia. Aqu no slo se rebasan las barreras entre especies sino que la cantidad de material gentico que se moviliza es tal, que el variante producido crea una novedad que difcilmente se obtendra de otra manera. Como sabemos existen especies de bacterias y de otros organismos que no tienen reproduccin sexual; en la mayora de ellas, la recombinacin no juega un papel importante. El mismo principio no parece aplicarse al estudiar los genes presentes en plsmidos (genomas circulares fsicamente independientes del cromosoma), en los cuales se han localizado, por ejemplo, los genes responsables de la resistencia a algunos antibiticos y que pueden ser transferidos en forma horizontal. Una pregunta que parecera central para abordar este problema en poblaciones naturales es, cmo se puede detectarla transferencia horizontal, y cmo sera posible estimar la tasa de ocurrencia en la naturaleza? DETECCIN DE TRANSFERENCIA HORIZONTAL Un experimento que se antoja til para detectar la transferencia horizontal consistira en usar a un organismo marcado con ciertos genes e introducirlo a una poblacin con otros marcadores genticos, registrando as el paso de ellos entre las cepas. Est experimento podra hacerse con mayor factibilidad en bacterias, dado lo breve de su ciclo de vida, para una revisin as, la tasa de transferencia y la tasa de fijacin combinadas es del orden de la tasa de mutacin como se ha sugerido para genes cromosomales en bacterias, digamos10 9 est fenmeno sera difcil de detectar sobre todo si consideramos que el marcador gentico puede aparecer en la poblacin con esa misma tasa. Si se quisiera obtener un nivel de sensibilidad mayor, entonces se pueden usar tres marcadores genticos, detectando el paso de dos de ellos que estn ligados; en cambio si la tasa es mayor y se utiliza una fuerte presin selectiva para hacer que la tasa de fijacin sea igual a uno, entonces este enfoque puede ser usado para detectar la transferencia, pero si no se halla de esta manera, hay que argumentar las siguientes razones: a) el gene o los genes que se utilizaron probablemente estn localizados en regiones del genoma que no se transfieren o bien, b) la sensibilidad de la metodologa usada tal vez no sea eficaz para revelar valores mnimos de transferencia. Piero, D. 1988. Revista Ciencias. La transferencia horizontal de genes (HGT, por sus siglas en ingls) consiste en la transmisin del genoma o parte de ste de un organismo a otro que no forma parte de su descendencia. Por el contrario, el tipo de transferencia habitual, o transferencia vertical de genes, es la que se da desde un ancestro a su descendencia, como ocurre por ejemplo en la reproduccin sexual Desde hace tiempo se conoce la importancia del proceso de HGT en procariotas, como en el caso de la conjugacin bacteriana, descubierto a mediados del siglo pasado, en la que una clula transfiere informacin gentica a otra diferente con la mediacin de plsmidos. Estos

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procesos son muy importantes como fuente de variacin gentica, equivalentes en cierto modo a la recombinacin cromosmica de los organismos con reproduccin sexual. Sin embargo, la HGT en bacterias ira ms all, dado que tambin se produce transferencia gentica entre especies alejadas filogenticamente, lo cual permite la formacin de genomas extraordinariamente heterogneos y dinmicos. Sin embargo, en los ltimos aos se han acumulado evidencias de que este proceso puede ser mucho ms generalizado de lo que se pensaba en un principio, no estando reducido a ciertos tipos de bacterias. La transferencia horizontal de genes parece haber tenido una gran importancia en todos los grupos de seres vivos, incluyendo plantas superiores y animales, al menos en las primeras etapas de la evolucin. Hoy sabemos que gran parte del genoma humano est constituido por ADN vrico, incorporado al material gentico de la clula. El papel de la HGT en la evolucin es uno de los puntos ms activos de discusin en biologa evolutiva. Desde aquellos que la consideran una fuente ms de variacin gentica, hasta algunos investigadores que creen que nos hallamos ante un nuevo paradigma biolgico, que no se limitara a completar la nueva sntesis evolutiva, sino incluso a sustituirla en buena parte. La transferencia horizontal de genes en plantas y animales Como nos referimos ms arriba, la transferencia de genes bacterianos a genomas de eucariotas parece estar facilitada por endosimbiontes, desde las mitocondrias y plastos (Margullis, 1967; 1970; Gupta, 2000), pasando por los bien conocidos procesos de transmisin bacteriana a algunos hongos como Saccharomyces o la bacteria Wolbachia pipientis en la lnea germinal de algunos eucariotas. Gupta (2000) tambin describe importantes parentescos entre genes implicados en la transmisin gentica en eucariotas y arqueobacterias, as como los implicados en el metabolismo celular eucaria y las eubacterias. Recientemente se ha comprobado la integracin del genoma de Wolbachia en insectos y nemtodos en porciones de tamao variable, desde 500 pares de bases hasta el genoma completo de la bacteria. Tambin recientemente, ha sido referida la transferencia horizontal de genes bacterianos en rotferos (Gladyshev, Meselson & Arkhipova, 2008). Algunos de estos genes no son operativos en el organismo receptor, pero otros s son transcritos, indicando que este fenmeno representa un mecanismo real para la adquisicin de nuevos genes. La incorporacin de genoma vrico a las clulas procariotas y eucariotas se ha revelado tambin en los ltimos aos como un fenmeno no solo habitual, sino importantsimo en la incorporacin de genes reguladores de la expresin e incluso, codificadores de protenas muy similares en distintos grupos de animales, y tan variadas como las DNA polimerasas (Villareal & DeFilippis, 2000), protenas involucradas en el desarrollo de la placenta (MI et al., 2000), en los procesos autoinmunitarios o en la espermatognesis (Jamain et al., 2001). Algunos autores afirman que la explicacin a la presencia de genes reguladores similares en diferentes grupos de organismos -como los genes HOX, implicados en el control del desarrollo embrionario (Ronemus y Martienssen, 2005)- podran tener un origen vrico (Sandn, 2000, 2002). Se ha llegado a calcular que entre el 60 y el 80% de los intrones (Recuerde que son, genes no codificadores de protenas) de animales contemporneos fueron adquiridos por insercin despus de la divergencia evolutiva de animales y plantas (Fedorov et al. 2003). Trabajos recientes apuntan hacia el hecho de que virus y bacterias no se limiten a transferir sus propios genes al organismo eucariota, sino que puedan servir de vectores para el intercambio g racin de variacin que la tradicional recombinacin cromosmica en la meiosis. A pesar de que la controversia sobre el origen de los virus es tan antigua como su descubrimiento, los ltimos datos alimentan la hiptesis de que las partculas virales pudieran ser fragmentos de ADN o ARN independizados de las clulas, aunque otros autores opinan que los

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virus no solamente no proceden de estructuras celulares, sino que tienen una entidad propia vital en la evolucin (Sandn, 1998). En cualquier caso, los virus e incluso las bacterias podran representar un verdadero sistema de mensajera interespecfica, y no nicamente un sistema de transmisin unidireccional. Las consecuencias de esto, obviamente, son importantsimas para la biologa evolutiva. Es incompatible la transmisin horizontal de genes con la teora sinttica? Muchos autores asumen estos mecanismos, incluso los ms complejos, como una fuente ms de variacin (Kidwell & Lisch 1997), sobre la que la seleccin natural trabajara posteriormente del modo habitual, de igual forma que la endosimbiosis (Margullis, 1995). Otros especialistas creen que si la incorporacin de genes nuevos mediante la HGT es algo tan generalizado como algunos datos parecen indicar, cuestionara la teora sinttica en sus propios cimientos, tanto en cuanto al papel de la mutacin como fuente de variacin, como al de la seleccin natural como fuerza modeladora (Sandn, 2005). Sin embargo, muchas de estas crticas se basan ms en motivos que podramos llamar filosficos, presentando un rechazo visceral -y habra que decir poco cientfico- al concepto de competencia y seleccin del ms apto sin detenerse en explicar cul sera el mecanismo alternativo de seleccin de toda est inmensa variabilidad producida por los incansables mensajeros. Particularmente, quiz se trate de un enfoque ms integrador el que la propia Margullis (1995) realiza sobre la simbiognesis -que podra considerarse como la transmisin horizontal total. http://jmhernandez.wordpress.com/2008/07/08/entendiendo-la-evolucion-transferencia-horizontalde-genes/: Eventualmente, tenemos que comprender que la seleccin natural opera, no tanto actuando sobre mutaciones al azar, que son a menudo dainas, sino sobre nuevas clases de individuos que evolucionan por simbiognesis por incorporacin de genes o incluso genomas completos.entico entre distintos huspedes, incluso alejados filogenticamente entre s. Esto podra suponer un mecanismo de recombinacin global, infinitamente ms poderoso en la gene Cul es el origen de los intrones? Existen dos teoras comnmente aceptadas: la teora de los "intrones tempranos" y la de los "intrones tardos". Segn la primera, los ancestros de los eucariotas y los procariotas posean intrones, pero stos ltimos los perdieron durante su proceso evolutivo. De acuerdo con la segunda teora, estos ancestros no posean intrones y los eucariotas los obtuvieron durante el proceso evolutivo. (Revista UNAM) La teora de los "intrones tempranos" sugiere que el ltimo ancestro comn de los procariotas y los eucariotas, tena intrones en su genoma. Para dar cabida a sus cortos perodos reproductivos y de vida, los procariotas, subsecuentemente, perdieron los intrones de sus genomas debido a la seleccin natural que busc incrementar la eficiencia de la expresin de sus genes, as como una reduccin en el tamao de sus genomas. Segn esta teora, el precio que hubieron de pagar los organismos procariotas por esta mayor eficiencia, fue el decremento en el potencial para evolucionar ms en el futuro, ya que se perdieron los intrones que podran ayudar al barajeo de exones. Los organismos eucariotas, por su parte, continuaron evolucionando con la asistencia de sus intrones y dieron lugar a formas de vida mucho ms complejas. De ah que haya mucho menos complejidad y variacin en los organismos procariotas que en los eucariotas. La teora de los "intrones tardos" sugiere que stos se desarrollaron en el proceso evolutivo eucaritico. Puesto que los organismos procariotas han sido considerados tradicionalmente ms primitivos que los eucariotas, el genoma an ms primitivo del ancestro comn de estos dos tipos de organismos, se supone que asemejara a un genoma procariota en lo referente a su fuerte organizacin. Segn esta teora, los intrones habran sido insertados en los genomas

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eucariticos, poco despus de haberse originado la divisin entre los dos tipos de organismos (eucariotas y procariotas). Ambas teoras han sido debatidas y tienen puntos a favor y en contra. El paradigma NeoDarwiniano todava no ha llegado a un consenso respecto a este asunto, y existe actualmente un acalorado debate en torno a estas dos posturas. Por que al descubrise cambio la visin Evolutiva. Por qu es importante dar a conocer a la sociedad a los transgnicos? Los cientificos no solamente deben trabajar y conocer sobre los transgnicos, sino por tres principales razn deben intervenir en el conocimiento de la sociedad en su conjunto sobre ellos. En primer lugar, por que es una necesidad primordial que la sociedad conozca de su importancia, de los logros y alcances, de la magnitud del desafo, as como de las problemticas tanto con que se enfrenta, como las que puede conllevar este tipo de investigacin cientfica. En segundo lugar porque debe existir una etica y responsabilidad en cada investigador sobre lo que esta haciendo. En tercer lugar Continuar en la investigacin aparte de aportar nuevos conocimientos, en que est sea en pro de la sociedad y el ambiente con la conciencia y responsabilidad de que todo se le puede dar un mal uso. En ese sentido es importante que los cientficos tambin intervengan en la normatividad, y poner candados para el mal uso de la nueva tecnologas, como pretenden las multinacionales. Tareas. Responda verdadero o falso. 1.- Todos los suelos se originan a partir de la arcilla. 2.- El limo posee las partculas ms pequeas del suelo. 3.- El drenaje del suelo influye sobre el tipo de planta que en l puede crecer y el grado en el que se puede crecer y desarrollar. 4.- La atmsfera contiene un 78% de nitrgeno. 5.- El potasio es un micronutrientes. 1.- Defina con sus palabras suelo. 2. Explique qu es el perfil del suelo y cmo se diferencian. 3.-Qu es la erosin? 4.- Cules son los tipos de erosin. 5.- Qu se puede hacer para prevenir la erosin? 1.- Cite cuatro sustancias que formen el suelo. 2-. Cul es el pH neutro del suelo? 3.- Cules son los cuatro efectos beneficiosos que la materia orgnica ejerce sobre el suelo? 4.- En qu se basa el nuevo sistema de clasificacin de los suelos? RESPUESTAS A LAS TAREAS: Respuesta a la pregunta 2.2. Una hiptesis sera, que como los prehispanicos se alimentaron preferentemente de plantas, pero tambin de peces e insectos, a estos preferentemente se les puso atencin y se les cultivo y domestico, y a los animales solamente se les cazaba cuando requeran carne, y no se les domestico. Si a esto le sumamos que no haba mamferos grandes para usarlos como medios de transporte y carga (slo la llama y el guanaco en Sudamrica) Respuesta pregunta 2.3. 1983 Barbara McClintock recibe el Premio Nobel por su descubrimiento de los genes "intercambiables" Barbara McClintock naci el 16 de junio de 1902 en Hartford (Connecticut, Estados Unidos). En 1919 se matricul en la Facultad de Agronoma de la Universidad de Cornell, en Nueva York. Ya

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desde su poca de estudiante se dedic plenamente a la investigacin, desarrollando un mtodo para la identificacin de los cromosomas del maz, con cuya ayuda se poda distinguir cada uno de los cromosomas en la dotacin cromosmica de cada clula; esta tcnica la seguira desarrollando a lo largo de toda su vida. En la Universidad de Cornell desempe el puesto de profesora de botnica y perteneci al grupo de investigacin. A partir de 1936 trabaj como profesora ayudante en la Universidad de Missouri, en Columbia, en donde permaneci durante cinco aos. En 1942 obtuvo un puesto en el departamento de Gentica de la Carnegie Institution en Cold Spring Harbor de Long Island (Nueva York). Muri el 3 de septiembre de 1992. Las investigaciones de Barbara McClintock se centraron en el campo de la gentica, y al igual que los estudios de Mendel, el creador de esta especialidad, los trabajos de la investigadora americana no tuvieron una excesiva acogida dentro del mundo dedicado a esa rama de la biologa. McClintock recibi el Premio Nobel treinta aos despus de haber comunicado sus hallazgos y de que la comunidad cientfica reconociera el valor de sus descubrimientos y la importancia que haban tenido para el posterior desarrollo de la gentica Por qu producen los genes protenas suficientemente similares como para sustituir unas por otras pero bastante distintas como para hacerlo imperfectamente? El grupo de Pilpel ha propuesto que las pequeas variaciones entre los genes intercambiables, tales como las diferencias entre las condiciones que hacen que se activen, imparten a cada uno una funcin nica. Esas diferencias en la funcin los hacen suficientemente vitales como para ser preservados por la evolucin pero, los habilitan, cuando es necesario, para reemplazar a un gen de un equipo diferente, como un jugador sustituto. Respuesta tarea 2-6 Ver el articulo Elaboracin de un Protocolo de Anlisis Cuantitativo Heat Shock Protein 70 in Heat Stressed Sugar Beet Protenas de choque trmico 70 en calor Subray la remolacha azucarera (Beta vulgaris L.) KATERINI KARETSOU KATERINI KARETSOU 1,2,* 1,2, * , OLGA KOUTITA , OLGA KOUTITA 1 1 and GEORGE SKARACIS y GEORGE SKARACIS Biologa molecular de plantas reporter 23: 195-195j. Junio del 2005. Respuesta tarea 2.7. El organismo que tiene mayor plsticidad de los mensionados ah es la bacteria. Escherichia Coli, El 30%, Una molcula de ADN consiste en dos hebras que se encuentran arrolladas una alrededor de la otra formando una doble hlice. Las bases de las dos hebras se disponen en manera tal que cuando en una de ellas hay una adenina en la enfrentada hay timina y, cuando hay guanina en la otra hay citosina. Esto satisface la regla de Chargaff en manera tal que: la cantidad de adenina = a la cantidad de timina (A = T) la cantidad de guanina = a la cantidad de citosina (G = C) Respuesta 2.8. No necesariamente A tiene ms genes que B, los factores que determinan la cantidad de genes o de DNA son la seleccin natural que reduce la diversidad gnica, tambin las mutaciones y la deriva gnica. As como la presencia de intrones y DNA basura Respuesta 2.9. Realice un dispositivo o una frmula que relacione el tamao del mRNA con el tamao del gene, el nmero de intrones, el tamao medio de intrones, y el tamao de la regin reguladora. En la nterior tabla se puede ver el tamao del genoma, nmero de genes y densidad gnica en diferentes especies. El tamao del genoma en eucariotas se define como el valor C o cantidad de DNA por genoma haploide, tal como el que existe en el ncleo de un espermatozoide. Se denomina C, por constante o caracterstico, para indicar el hecho de que el tamao es prcticamente constante dentro de una especie as mRNA = Intrones + exones + regin reguladora Tarea 2 10 a) 3 CGAAGGGUUCCA 5 b) 3 Thr,leu, gly, ser. 5

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5 Thr, Arg, Val, Pro. 3 5Ala, Ser, Gln, Gly 3 Tarea 2.11. a) el fenotipo dominante es gris b) los genotipos son: Ratn 1: Dominante homocgoto. Ratn 2: Dominante homcgoto Ratn 3: Dominante heterocgoto. Ratn 4: recesivo homocigoto. Cruza 3 x 4 Aa x aa negro y gris Tarea 2.12. doble fecundacin ocurrida en el saco embrinario, la 1 fecundacin resulta de la unin de un Anterozoide con la Osfera para formar los elementos de la plntula o eje embrionario de la semilla( plmula o gmula, talluelo, radcula), el 2 anterozoide al fecundarse con el nucleo secundario del saco embrionario formar en tejido triploide donde almacenar las sustancias de reserva( cotiledones). Tarea 2.13. Dimorfismo son las diferencias entre los machos y hembras de una misma especie. La relacin con el polimorfismo son los mltiples alelos de un gen entre una poblacin, normalmente expresados como diferentes fenotipos (p.e. el color de la piel es un polimorfismo). Esto permite que la seleccin natural pueda facilitar a una variedad sobre otra ante los cambios en el ambiente. Tarea 2.14. Poblacin; Es el conjunto de individuos de la especie que habitan en el mismo lugar y tiempo. Comunidad: Conjunto de poblaciones diferentes que habitan el mismo ecosistema o bioma

Cmo se remueven los intrones del ADN? Se sabe que los intrones son removidos del ARN mediante un proceso denominado empalme del ARN, el cual es una especie de "edicin" del contenido del ARN (es decir, es un proceso de remocin de intrones), que ocurre dentro del ncleo de una clula. Existen diferentes mtodos de empalme del ARN. La mayora requiere de la ayuda de protenas que reconocen secuencias especficas en el pre-ARN. (PONER DIBUJO y EXPLICAR EN MAS DETALLE) Qu hacen los intrones? Esta pregunta sigue siendo tema de estudio. La denominada "teora exnica de los genes"[6] sugiere que los exones son los bloques constructores de las protenas y que los genes se crean a partir de las combinaciones de estos bloques constructores. Esta teora nos lleva hacia la "hiptesis de barajeo de exones"[3], la cual afirma que los intrones incrementan el porcentaje de recombinacin de los exones, haciendo ms fcil moverlos y crear nuevos genes. Walter Gilbert afirma que: [7]"...los intrones [estadsticamente hablando] representan puntos de gran propensin a la recombinacin: por su mera presencia y longitud, incrementan el porcentaje de recombinacin, y en consecuencia incrementan el barajeo de exones por factores del orden de 106 a 108". Hay evidencia que parece sugerir que los exones pueden corresponder a subunidades estructurales y funcionales de las protenas, incluyendo ejemplos especficos del

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mismo exn, que existe en diferentes genes donde se requiere la misma estructura o funcionamiento de dos protenas distintas. De acuerdo a esta teora, la estructura intrn-exn de los genes eucariticos, motiva la formacin de nuevos genes a partir de sub-unidades estructurales y funcionales de los genes existentes, en lo que constituye un proceso ms eficiente que construir los nuevos genes a razn de un nucletido a la vez. Ante esta teora, la pregunta que resulta ms obvia es: si los intrones son tiles para la recombinacin, entonces por qu slo aparecen en los organismos eucariotas y no en los procariotas? Cul es el origen de los intrones? Existen dos teoras comnmente aceptadas: la teora de los "intrones tempranos" y la de los "intrones tardos". Segn la primera, los ancestros de los eucariotas y los procariotas posean intrones, pero stos ltimos los perdieron durante su proceso evolutivo. De acuerdo con la segunda teora, estos ancestros no posean intrones y los eucariotas los obtuvieron durante el proceso evolutivo. (revista UNAM) La teora de los "intrones tempranos" sugiere que el ltimo ancestro comn de los procariotas y los eucariotas, tena intrones en su genoma. Para dar cabida a sus cortos perodos reproductivos y de vida, los procariotas, subsecuentemente, perdieron los intrones de sus genomas debido a la seleccin natural que busc incrementar la eficiencia de la expresin de sus genes, as como una reduccin en el tamao de sus genomas. Segn esta teora, el precio que hubieron de pagar los organismos procariotas por esta mayor eficiencia, fue el decremento en el potencial para evolucionar ms en el futuro, ya que se perdieron los intrones que podran ayudar al barajeo de exones. Los organismos eucariotas, por su parte, continuaron evolucionando con la asistencia de sus intrones y dieron lugar a formas de vida mucho ms complejas. De ah que haya mucho menos complejidad y variacin en los organismos procariotas que en los eucariotas. La teora de los "intrones tardos" sugiere que stos se desarrollaron en el proceso evolutivo eucaritico. Puesto que los organismos procariotas han sido considerados tradicionalmente ms primitivos que los eucariotas, el genoma an ms primitivo del ancestro comn de estos dos tipos de organismos, se supone que asemejara a un genoma procariota en lo referente a su fuerte organizacin. Segn esta teora, los intrones habran sido insertados en los genomas eucariticos, poco despus de haberse originado la divisin entre los dos tipos de organismos (eucariotas y procariotas). Ambas teoras han sido debatidas y tienen puntos a favor y en contra. El paradigma NeoDarwiniano todava no ha llegado a un consenso respecto a este asunto, y existe actualmente un acalorado debate en torno a estas dos posturas. Por que al descubrise cambio la visin Evolutiva. Tareas. Responda verdadero o falso. 1.- Todos los suelos se originan a partir de la arcilla. 2.- El limo posee las partculas ms pequeas del suelo. 3.- El drenaje del suelo influye sobre el tipo de planta que en l puede crecer y el grado en el que se puede crecer y desarrollar. 4.- La atmsfera contiene un 78% de nitrgeno. 5.- El potasio es un micronutriente. 1.- Defina con sus palabras suelo. 2.. Expolique qu es el perfil del suelo y cmo se diferencian. 3.-Qu es la erosin? 4.- Cules son los tipos de erosin. 5.- Qu se puede hacer para prevenir la erosin? 1.- Cite cuatro sustancias que formen el suelo. 2-. Cuyl es el pH neutro del suelo?

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3.- Cules son los cuatro efectos beneficiosos que la materia orgnica ejerce sobre el suelo? 4.-En qu se basa el nuevo sistema de clasificacin de los suelos?

19.4.

Catlogo de respuestas a las tareas

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