Biotecnologia de microalgas

Dunaliella: uma fonte natural de beta-caroteno com potencialidades de aproveitamento biotecnolgico

Henriques, N.M.1 ; Navalho, J.C.2 ; Varela, J.C.1 ; Cancela, M.L.1
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Universidade do Algarve (UCTRA) Lab. Biologia Molecular 2.13. Campus de Gambelas. 8000 FARO
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Necton - Companhia Portuguesa de Culturas Marinhas, SA. Belamandil. 8700 OLHO

em lamelas que depois ingeriam (Navalho, 1998). Quando cultivadas em meios adequados, certas espcies de microalgas podem duplicar a sua biomassa diariamente, produzindo matria seca com um teor proteco superior a 50% e alcanando 2 produtividades de 30-50 g/m /dia em peso seco (Goldman, 1980). Como qualquer outro microrganismo, as microalgas reagem a variaes do meio exterior com alteraes do seu meio intracelular. Desta maneira, a manipulao de condies de cultivo, nomeadamente a presena ou ausncia de determinados nutrientes, estimula a biossntese de compostos que vo desde enzimas a frmacos estimulantes da tiride e antioxidantes naturais, alguns de elevado valor comercial (Fig. 1). Este facto foi pela primeira vez referenciado por Tamiya (1957) in Richmond (1990), que modificou a composio da biomassa de Chlorella, principalmente no seu teor em lpidos e protenas, variando as condies de cultivo da alga. Na dcada seguinte (1964), deuse incio produo de microalgas em larga escala, no Japo (Chlorella). Poucos anos decorridos, surge a primeira unidade de

Resumo
As microalgas constituem-se como um dos mais eficientes sistemas biolgicos de transformao de energia solar em compostos orgnicos, atravs da fotossntese. Dado que apresentam uma distribuio ubqua global, podendo ser cultivadas nos mais inspitos locais, tais como lagos salinos adjacentes a desertos ou nos mares rtico e Antrctico, elas possuem um enorme potencial de aproveitamento, quer como fontes de alimento, quer como reservatrios dos mais diversos compostos qumicos de interesse. O facto destes microrganismos se reproduzirem normalmente por uma simples diviso binria, sendo raras as espcies que apresentam estdios sexuais diferenciados, permite que se complete um ciclo celular em poucas horas. Esta caracterstica, aliada sua relativa simplicidade de cultivo, torna as microalgas num dos objectos de pesquisa prioritrios das mais modernas reas de investigao, nomeadamente a biotecnologia e melhoramento gentico (Benemann et al., 1987; Sukenik & Falkowski, 1987; Vorst, 1995). Neste contexto, o gnero Dunaliella compreende duas das mais importantes espcies de microalgas alvo da actual curiosidade cientfica, industrial e comercial: Dunaliella salina e Dunaliella bardawil. Este facto deve-se sua extraordinria capacidade de sintetizarem e acumularem enormes

quantidades de um pigmento carotenide de extrema importncia numa cada vez mais alargada gama de domnios, que se estendem desde a nutrio medicina humana: o beta-caroteno.

Introduo
O conceito de utilizao das microalgas em biotecnologia obedece aos mesmos pressupostos que serviram de base agricultura terrestre: fazer uso da sua capacidade fotossinttica com o objectivo de produzir biomassa, a qual usada como fonte alimentar, energtica ou de produtos qumicos. A utilizao de microalgas na alimentao humana remonta a tempos imemoriais, tendo sido usadas como fonte de protenas por tribos indgenas do Chade e por ndios Aztecas, os quais as secavam

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produo de Spirulina (1974), na Cidade do Mxico. Actualmente, dado o sucesso de explorao comercial destas microalgas, existem vrias unidades de produo consolidadas espalhadas pelo globo, produzindo s de Chlorella, cerca de 600 toneladas/ano. A biomassa extrada atinge preos comercialmente interessantes, de 25 USD/Kg e 20 USD/Kg para Chlorella e Spirulina, respectivamente (Benemann, 1994 in Navalho, 1998). Em 1831, Wackenroder isolou pela primeira vez, a partir da cenoura, molculas s quais deu o nome de carotenos, e em 1837, Berzelius denominou de xantfilas os pigmentos amarelados que encontrou em folhas de rvore, durante o Outono. Estes dois factos marcam o incio da pesquisa sobre carotenides, a qual ainda hoje se reveste de uma grande importncia, no que diz respeito aos temas de investigao a aprofundar e esclarecer (cf. Navalho, 1998).

Figura 2. Estrutura qumica das molculas de beta-caroteno,

trans-retinol

(vitamina A) e cido retinico (trans). menores, nos rins, orgos genitais e pele (Armstrong, 1997). A sua estrutura qumica geral caracterizada pela existncia de uma cadeia de 40 tomos de carbono, que inclui uma cadeia principal de 9 ligaes duplas conjugadas, flanqueadas por estruturas anelares ou quase anelares de 6 carbonos em cada extremidade. Esta estrutura qumica responsvel pela sua colorao caracterstica, dado que as ligaes duplas absorvem parte do espectro luminoso que nelas incide (Goodwin, 1980; Yamano et al., 1994; Armstrong & Hearst, 1996). Os carotenides podem ser divididos em pequenas sub-famlias de pigmentos, denominadas carotenos e xantfilas. Os primeiros so compostos exclusivamente por tomos de carbono e hidrognio, enquanto que as xantfilas contm igualmente tomos de oxignio na sua constituio qumica. O beta-caroteno um dos compostos carotenides mais bem estudados. Na ltima dcada adquiriu um papel relevante no contexto da nutrio e medicina. Este carotenide, que confere a muitos frutos e vegetais a sua pigmentao amarelada, desempenha um importante papel fisiolgico, sendo convertido em vitamina A (retinol) e cido retinico no corpo humano (Yamano et al., 1994; Armstrong & Hearst, 1996; Armstrong, 1997; Fig. 2). Na sua maior parte, esta converso processa-se nos intestinos e no fgado. Outros carotenides podem igualmente desempenhar tal funo, mas do origem a uma nica molcula de vitamina. O betacaroteno, pelo contrrio, d origem a duas molculas de retinol (Passwater, 1984). Por esta razo, o betacaroteno por vezes apelidado de pr-vitamina A, funcionando como um reservatrio vitamnico (Armstrong & Hearst, 1996). Ao contrrio da vitamina A, txica quando presente em quantidades excessivas, o betacaroteno no parece causar efeitos txicos quando tomado em grandes quantidades. O beta-caroteno em excesso, face s necessidades fisiolgicas, armazenado nos tecidos adiposos ou limita-se a permanecer disponvel, circulando na corrente sangunea (Gaby & Singh, 1991). Os nveis mximos de ingesto de vitamina A recomendados so de 10.000 unidades internacionais (UI). Por seu lado, o beta-caroteno pode ser tomado em doses dirias que ultrapassam as 300.000 UI (180 mg),

Carotenides / Beta caroteno: caracterizao e importncia biolgica

Das vrias classes de pigmentos existentes na natureza, os carotenides encontram-se entre as mais abundantes e importantes, dada a diversidade e relevncia das funes que assumem, podendo ser encontrados nas trs principais linhas evolutivas (archaebacteria, eubacteria e eucarya; Armstrong & Hearst, 1996). Compreendem uma numerosa famlia de compostos qumicos liposolveis, de cor laranja, vermelha, amarela e acastanhada. Embora os carotenides possuam diferentes propriedades biolgicas, exibem propriedades fisico-qumicas similares. Esta famlia de pigmentos, que engloba mais de 600 compostos diferentes, tende a acumular-se nos tecidos gordos, particularmente no fgado mas tambm, em quantidades

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sem que se observem efeitos nefastos (Passwater, 1984). Alm de ser precursor de vitamina A, em anos recentes tm sido encontrados indcios de que o beta-caroteno possui actividade anticancergena e propriedades benficas para o sistema cardio-vascular e imunitrio. Parece prevenir tambm desordens de natureza fotossensvel e estimula a comunicao intercelular atravs das junes "gap" (Passwater, 1984; Stahelin et al., 1991; Tsuchihashi et al., 1995; Eicholzer et al., 1996). Contudo, estudos recentes revelam que o beta-caroteno tomado em quantidades farmacolgicas pode ter um efeito adverso em indivduos fumadores, incluindo a potenciao do aparecimento de tumores (Albanes et al., 1995, 1996). Os mesmos autores referem, no entanto, que os indivduos com nveis sanguneos de beta-caroteno (e vitamina E) mais elevados apresentavam uma menor incidncia de cancro. Embora os efeitos benficos do beta-caroteno sejam aceites por grande parte da comunidade mdica e cientfica, o mecanismo protector dos carotenides ainda objecto de debate. Aparentemente, uma das funes do beta-caroteno em clulas vegetais (incluindo as microalgas) de proteger o aparelho fotossinttico de fenmenos de fotoxidao, desencadeados por um eventual excesso de luz (Ben-Amotz & Shaish, 1992; Armstrong & Hearst, 1996; Armstrong, 1997; Havaux, 1998). Na presena de luz forte, as clorofilas produzem nveis elevados de espcies reactivas de oxignio (ERO), tais como os perxidos e radicais de oxignio. As ERO podem reagir com os lpidos membranares, dando origem a radicais e perxidos lipdicos. Estes produtos txicos, por sua vez, geram reaces de (per)oxidao em cadeia, que podem afectar inclusivamente o material gentico das clulas. A aco antioxidante do beta-caroteno parece centrar-se no atenuamento da aco dos radicais de oxignio nas membranas celulares, reagindo com os radicais lipdicos gerados pelas ERO, inibindo deste modo a reaco de oxidao em cadeia (Tsuchihashi et al., 1995, Havaux, 1998). As propriedades anti-oxidantes do beta-caroteno so atribudas sua estrutura. De facto, trata-se de uma molcula constituda por uma longa cadeia de 11 ligaes duplas alternadas. Estas permitem a absoro da energia das ERO (ou o composto intermdio gerado por estas), canalizando-a atravs da longa cadeia de ligaes duplas que se encontram em ressonncia (Tsuchihashi et al., 1995; Armstrong, 1997). A energia finalmente libertada sob a forma de calor, voltando a molcula de beta-caroteno ao seu estado inicial (regenerao). Os mecanismos da regenerao do beta-caroteno so ainda mal compreendidos, mas pensa-se que a interaco com outras molculas antioxidantes - tais como o cido ascrbico (vitamina C) e o alfatocoferol (vitamina E) - desempenhe um papel importante. A actividade anti-oxidante do beta-caroteno efectuada principalmente em reas do corpo onde existem baixas concentraes de oxignio. Uma vez que as vitaminas C e E, a glutationa peroxidase e a catalase no actuam eficientemente nestas condies, o beta-caroteno poder desempenhar um papel complementar ao desses anti-oxidantes (Gaby & Singh, 1991). Homem e outros organismos) e verificou-se que os nveis sanguneos da forma em trans so superiores ao do ismero em cis (Stahl et al., 1993, 1995; Tamai et al., 1995; Ben-Amotz & Levy, 1996; Johnson et al., 1997). Alguns dos autores referidos sugerem que este resulado indicativo de uma maior absoro do trans-beta-caroteno por parte do intestino. Todavia, a maior parte destes estudos no determinou os nveis de beta-caroteno acumulado em tecidos, em especial no fgado, o que implicaria a realizao de bipsias (seres humanos) ou o sacrifcio dos animais em estudo (cf. Mokady et al., 1990). Alm disso, no nico estudo em que se determinou os nveis dos dois ismeros em tecidos (mucosa bucal), os autores no excluem a possibilidade dos seus resultados terem sido falseados por fenmenos de isomerizao (Johnson et al., 1997). Por conseguinte, so necessrios estudos de absoro e acumulao dos dois ismeros de beta-caroteno mais rigorosos de modo a determinar se existe uma absoro preferencial de um dos ismeros. A importncia de se saber qual dos dois ismeros absorvido preferencialmente prende-se com o facto do cis-beta-caroteno apresentar uma actividade anti-oxidante mais elevada (in vitro e in vivo), quando comparado com a do ismero em trans (Levin & Mokady, 1994; BenAmotz & Levy, 1996; Levin et al., 1997). No seu conjunto, estes resultados sugerem que o betacaroteno de origem "natural" tem um efeito anti-oxidante superior ao sintetizado industrialmente (cf. Nagasawa et al., 1989). A produo total de carotenides na natureza foi estimada em 100.000.000 toneladas / ano, tendo a procura de beta-caroteno atingido um valor comercial que ronda os 40.000.000 USD / ano (Falkowski & Raven, 1997). Recentemente, foi tambm demonstrado atravs da anlise ao soro e leito materno que mais de 50 carotenides, englobados na dieta humana, podem ser 14

Beta-caroteno "natural" vs. o beta-caroteno "farmacolgico"

O beta-caroteno sintetizado industrialmente consiste apenas na forma isomrica trans-beta-caroteno. Por seu lado, nas preparaes de beta-caroteno de origem "natural" (extrados de microalgas) co-existem dois ismeros: o trans-(linear) e cisbeta-caroteno em propores iguais. Foram realizados vrios estudos de absoro dos dois ismeros (no

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absorvidos por seres humanos. Por conseguinte, torna-se evidente a importncia do beta-caroteno a nvel nutricional e medicinal, como tambm a nvel econmico e comercial. Dunaliella Todas as algas produzem pequenas quantidades de betacaroteno de modo a assegurarem a manuteno da sua integridade durante a fotosntese. A microalga volvocale Dunaliella, acumula elevadas quantidades de beta caroteno (Ben-Amotz, 1980), tendo sido pela primeira vez considerada como uma possvel fonte de produo de beta-caroteno por Massyuk, em 1966 (Borowitzka & Borowitzka, 1988). Dunaliella salina (Fig. 3), produz cerca de 10 a 100 vezes mais beta-caroteno do que a sua segunda fonte mais importante, a cenoura. Porm, muito difcil efectuar a separao do beta-caroteno a partir das fibras de cenoura. Esta situao desenrola-se igualmente no corpo humano, j que apenas 20 a 25% do beta-caroteno proveniente de cenoura absorvido como nutriente. Dunaliella salina possui um espectro muito mais amplo do que a cenoura, no que se refere ao tipo de carotenides presentes. A cenoura apresenta na sua composio, em propores importantes, apenas dois carotenides: alfa-caroteno e trans-

Figura 4. Dunaliella salina cultivada em condies no indutoras de carotenognese (A 1000x) e indutoras de acumulao de beta-caroteno (B - 400x) visualizada sob microscopia ptica.

beta-caroteno. Dunaliella contm beta-caroteno em propores iguais entre os seus ismeros cis e trans (50%-50%), para alm de possuir alfa-caroteno (6 a 10%). Em Dunaliella, esto igualmente presentes carotenides oxigenados, como a lutena e zeaxantina em percentagens que podem chegar a atingir 10% do total de carotenides presentes.

Induo da Carotenognese
Sob condies de cultivo no indutoras de carotenognese, Dunaliella salina apresenta uma colorao verde, contendo apenas 0,3% de beta-caroteno, percentagem semelhante ao seu contedo noutras algas e folhas de plantas (Ben-Amotz & Avron, 1990) (Fig. 4A).

Aps se ministrarem os necessrios estmulos indutores da carotenognese e se colocar Dunaliella salina em crescimento sob condies de cultivo adequadas, o beta-caroteno comea a ser acumulado no interior de vesculas lipdicas no espao intertilacide do cloroplasto, podendo atingir, em percentagem, cerca de 10% do peso seco da microalga, o qual representa o mais elevado contedo em betacaroteno de qualquer alga, planta ou qualquer outro organismo j estudado (Ben-Amotz & Avron, 1989) (Fig. 4B). O nvel de acumulao deste pigmento, bem como o ritmo da sua biossntese esto dependentes de certos parmetros fisiolgicos associados ao crescimento da alga, como sejam a intensidade luminosa, concentrao salina, temperatura e

Figura 3. Ilustrao cientfica de Dunaliella salina ( Necton SA).

Figura 5. Culturas de Dunaliella salina realizadas sob condies diferenciais de induo de carotenognese ( Necton SA). Dezembro 1998 - Boletim de Biotecnologia n 61

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de Dunaliella salina, quer as suas funes na clula: Armazenamento de Carbono. O betacaroteno acumulado e armazenado como um produto extra da fotossntese, para posterior utilizao sob condies de crescimento limitadas. No entanto, as clulas de Dunaliella no consomem betacaroteno acumulado, mesmo aps serem transferidas para condies de sombra ou para um meio de cultivo sem carbono. O beta-caroteno poderia assim funcionar como um mecanismo pelo qual a clula eliminaria o excesso de carbono existente (Ben-Amotz, & Shaish, 1992). Supressor de radicais de oxignio. Atravs de tcnicas especficas, verificou-se que as vesculas de betacaroteno se encontram bastante distantes das molculas de clorofila. Assim, certos autores defendem que o beta-caroteno no poderia funcionar como agente protector em Dunaliella contra as aces oxidativas dos radicais livres uma vez que estes tm um perodo de vida muito curto e a distncia compreendida entre os glbulos de beta-caroteno e as molculas de clorofila bastante grande. Desta maneira, pelo menos nesta microalga, segundo tais autores, o beta-caroteno no teria as mesmas funes antioxidativas que exibe noutros organismos, nomeadamente no Homem. Efeito de absoro. O beta-caroteno protege as clulas de leses causadas por excesso de radiao como filtro, sob condies indutoras de crescimento da alga, absorvendo desta maneira o excesso de radiao incidente (Ben-Amotz, & Shaish, 1992).

Figura 6. Esquema ilustrativo da biossntese de beta-caroteno em Dunaliella.

deficincia em alguns nutrientes, nomeadamente sulfato e nitrato (Lers et al., 1990; Levy et al., 1993). A maioria dos parmetros que retardam o crescimento induzem a acumulao de beta-caroteno em condies de forte intensidade luminosa (Fig. 5). Dunaliella salina cultivada em meios com concentraes de NaCl de 4M, ou superiores, cresce com cor laranja. O mesmo resultado pode ser obtido atravs da induo da carotenognese em situaes de stress que induzem uma inibio de crescimento tais como alteraes de temperatura, deficincia do meio de cultivo em sulfato, nitrato ou fosfato. A quantidade de beta-caroteno acumulado sob tais condies de stress fisiolgico est directamente correlacionada com o integral da quantidade de energia absorvida pela alga durante um ciclo de diviso celular. Quanto mais elevada for a intensidade luminosa e menor a taxa de crescimento, maior ser o contedo em beta-caroteno das clulas (Ben-Amotz & Avron, 1989, 1990). Estudos sobre o efeito da qualidade da luz incidente nas culturas de Dunaliella salina, como indutora da carotenognese, vieram demonstrar que a acumulao e biossntese de beta-caroteno se processa independentemente da qualidade da luz incidente na regio da radiao fotosinteticamente

activa. A quantidade de luz absorvida pelas molcula de clorofila, independentemente da fonte de radiao, suficiente para desencadear o processo de carotenognese (Ben-Amotz, & Shaish, 1992).

Biossntese de betacaroteno
Em Dunaliella, o processo de biossntese do beta-caroteno pode ser dividido em 4 etapas (Fig. 6): (1) Formao de geranilgeranilpirofosfato (GGDP) desde cido mevalnico; (2) Condensao de GGDP para formar fitoeno; (3) Desaturao de fitoeno em licopeno e, finalmente, (4) a ciclizao da molcula de licopeno dando origem a beta-caroteno (BenAmotz, & Shaish, 1992).

Funes do beta-caroteno em Dunaliella salina

Em Dunaliella, constata-se que o beta-caroteno vai sendo progressivamente acumulado pelas clulas, mesmo em situaes em que a sua quantidade presente seja mais do que suficiente para fazer face s necessidades da clula. Vrias razes tm sido apontadas para tentar explicar, quer este aumento da biossntese de beta caroteno por parte

Perspectivas Futuras
No que se refere investigao cientfica aplicada a este contexto particular, pensa-se que assistiremos no futuro a um incremento das investigaes sobre carotenides 16

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focadas essencialmente no seu papel fisiolgico. No passado, a pesquisa foi sendo efectuada principalmente no domnio dos carotenides enquanto fonte de vitamina A. Hoje em dia, os investigadores parecem mais interessados em tentar esclarecer quais os mecanismos atravs dos quais os carotenides so absorvidos, transportados no corpo e a funo que cada um desempenha a nvel bioqumico. A nvel nutricional, esto em curso vrios estudos visando esclarecer a importncia do beta caroteno na preveno do cancro e arteriosclerose bem como analisar as propriedades que os carotenides exibem e que so responsveis pela proteco do organismo. Dada a importncia crescente dos carotenides, e em especial do betacaroteno, como elementos essenciais na manuteno do bem estar e sade pblica, a explorao comercial de Dunaliella apresenta boas perspectivas futuras de rentabilidade e expanso. Este facto deve-se sobretudo, como foi j anteriormente referido, ao facto de Dunaliella se constituir como a principal fonte de obteno de beta-caroteno de origem natural, graas quer facilidade de extraco do pigmento, quer quantidade que consegue sintetizar e acumular quando comparada com quaisquer outras fontes de betacaroteno existentes na natureza.
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Boletim de Biotecnologia 1/2 pgina (interior, p/b)....................................12.500$00 1 pgina (interior, p/b).......................................20.000$00 1 pgina (interior, cores)....................................30.000$00 Verso da capa (cores)........................................45.000$00 Contra capa (cores)...........................................40.000$00 Os fotolitos, caso no sejam entregues, sero pagos em separado. A Sociedade Portuguesa de Biotecnologia aceita realizar contratos de publicao com scios colectivos durante 4 nmeros e com a periodiciade referida, oferecendo uma reduo de 15% no custo total de publicidade. Os anncios devero ser entregues atenpadamente na sede da Sociedade:
Morada: Laboratrio de Engenharia Bioqumica Instituto Superior Tcnico Av. Rovisco Pais Rovisco Pais 1096 LISBOA CODEX Telefone: 01-841 7000 Fax: 848 0072

Proposta de scios colectivos

A Sociedade Portuguesa de Biotecnologia admite scios colectivos que, alm de receberem o boletim da SPBT, podem utiliza-lo para divulgar os seus produtos ou publicar notcias internas, inserir anncios, inscrever pessoas gratuitamente ou a preos especiais nas realizaes da SPBT e auferir de redues nas exposies de produtos e equipamentos em congressos e simpsios organizados pela sociedade. Podem utilizar a lista de endreos de scios para comunicaes directas. A quota anual de 20 000$00.
Declaro que desejo entrar para scio colectivo da Sociedade Portuguesa de Biotecnologia

Instituio ou Firma_________________________________________ _________________________________________________________ Morada para cobrana de quotas _____________________________ _________________________________________________________ _________________________________________________________ Data ____ / ____ / ____ ________________________________ (Assinatura)

Dezembro 1998 - Boletim de Biotecnologia n 61

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