5.

3 微生物的分离和纯培养
5.3.1 无菌技术
微生物 的特点 ：
分布广 泛、 繁殖迅 速、 所需 条件简 单
（目 标微 生物＋ 其他 微生物 ）均 非常容 易在营
养基 质上 生长

微生物 研究及生产 中，防

止其他 微生物污染
 器具（三角瓶、移液管、平皿、试管等）
设备（发酵罐等）
接种环、接种钩、接种铲
无菌箱、超净工作台
空间
无菌技 术 隔离衣
棉塞、纱布
消毒剂
火焰（酒精灯、煤气喷灯等）
培养基
主要手 段有 ：
高压蒸 汽灭 菌
高温干 热灭 菌
甲醛 熏蒸
紫外线
75 ％乙醇
火焰 烧灼
空气 过滤
等等
 器具（三角瓶、移液管、平皿、试管等）
设备（发酵罐等）
接种环、接种钩、接种铲
无菌箱、超净工作台
空间
无菌技 术 隔离衣
棉塞、纱布
消毒剂
火焰（酒精灯、煤气喷灯等）
培养基
移液 管的包 扎
p2 16

吸口端塞入少许脱脂棉
棉塞的制作 p216
棉塞： 防止 杂菌污 染， 并保证 通气 良好
棉塞优 劣对 实验结 果有 很大影 响：
形状 、大小 、松 紧合适
棉花： 纤维 长的较 好。 不用脱 脂棉 （纤
维间 孔隙大 ，过 滤除菌 效果 差；
易吸 水变湿 ，造 成污染 ；价 格较
高）
牛皮纸 、报纸、锡 箔纸

功能： 防止灭 菌后棉 塞遇 冷，空 气中微

生物进入 棉塞 内部， 造成 棉塞污 染；防
止湿热灭 菌时 蒸汽打 湿棉 塞
超净工 作台（无菌 箱）
无菌环 境
1 ）火焰中 上部 无菌
区
无菌环 境

2 ）超净工 作台 、无菌 室
3 ）过滤空 气
棉塞 、多层 纱布 等

PIII
无菌操 作

Movie 1 － 4
无菌操 作

其他示意 图： p223, 10-6 ； p243, 10-16 ；

p244, 10-18 ； p251, 10-23 ， 10-24
无菌技术的两个目的
1 ） 获得纯培养
2 ） 防止污染
5.3.2 微生物的分离方 法

?
 筛选
用途 广泛 育种
纯化

平皿划线分离 法
方法 稀释分离法
单细胞挑取法
1. 平皿划线分离法
Movie 1 － 6
1. 平皿划线分离法
步骤 ：
1 ）接 种环 烧灼灭菌 ，冷 却
2 ）取 菌
3 ）放 置平 板，使第 一次 划线 的地方 尽量 靠
近不 拿接 种环的 一只 手内侧
3 ）如 图第 一次划线
4 ）烧 灼
5 ）第 二次 划线，开 始先 经过 第一次 划线 2
～3次
6 ）依 据情 况，重复 3 ～ 4 次
7 ）烧 灼
注意 划线 的力量 均匀 ，平滑 。
2. 稀释分离法

涂布平 板法
稀释倒 平板 法
P129 ，图 5-9 下： Movie 1-11
3. 单细胞挑取法
采用显 微操作 仪， 用毛细 吸管 或显
微针挑 取单个 细胞 或孢子 ，进 而培
养
5.3.3 微生物的培养

好氧培 养 & 厌氧 培养
分批培 养 & 连续 培养
混菌培 养

实验室 & 生产
1. 好氧培养

氧气来 源： 空气（ 无菌 ）

实验室： 平皿 ，斜面 培养（ 表面 培

养）

固体

生产：自 然对 流或机 械通风

曲种的 生产 － 通风槽 法
1. 好氧培养

氧气来 源： 空气（ 无菌 ）

实验室： 三角 瓶（摇 床培 养，
减少装液 量）
液体
生产：发 酵罐 （搅拌 ＋
压缩无菌 空气 ）
通用式 发酵罐
2. 厌氧培养

生产：
无通气 装置

半固体
（深层 培养）

液体
（深层 ＋还原
剂） 巯基 醋酸 盐液体 培养 基
 厌氧 培养皿 、厌 氧罐

使用时 ，先装入待 培养的对象 ，然后密闭 罐盖，接着

可采用 抽真空→灌 氮→抽真空 →灌氮→抽 真空→灌混
合气 (N2 ∶C O2 ∶H 2= 80 ∶1 0∶10 ， V/V ) 。这样 ，罐
内少量 剩余氧在钯 催化剂作用 下，可被灌 入的混合气
中的 H2 还原 成水，从而 造成很高 的无氧状态 。这时指
示剂美 蓝被还原成 无色
3. 分批培养

传统发 酵工 业采用 （分 批发酵 法）

菌体接 种到 一定量 营养 基质中 ，经 过
培养， 最终 一次性 收获 菌体或 代谢 产
物。也 可以 中间补 料。
特点： 营养 利用率 高， 但发酵 效率 较
连续培 养低 。微生 物生 长符合 典型 生
长曲线 。
4. 连续培养

培养过 程中 ，不断 补充 新鲜营 养物 质

，同时 以同 样速度 排出 老菌液
分恒化 连续 培养、恒浊 连续培 养
特点：发酵 效率高 ，自 动化水 平高 ，
节省人 力
依据生 长曲线
恒化器

无菌培养
基贮存器

恒化器
泵
恒化连 续培养法
恒化器 是一 种设 法使培 养液 流速保 持不变 ，
并使微 生物始终在 低于 其最 高生长 速率 条件
下进行 生长繁殖的 一种 连续 培养装 置。

通过流加限 制性生 长因 子来控 制 ：生

长速度 可以通过控 制各 种营 养物质 的浓 度很
大范围 调控，而最 终产 量只 与限制 性生 长因
子有关 。

常用作 生长规 律研 究， 如某种 营养要素的

作用。
恒化器

无菌培养
基贮存器

恒浊器
泵

浊度计
恒浊连 续培养法
恒浊器 是根 据培 养器内 微生 物的生 长密度 ，
并借光 电控制系统 来控 制培 养液流 速， 以取
得菌体 密度高、生 长速 度恒 定的微 生物 细胞
的连续 培养器 。

通过浊度计 来控制 ： 最大生 长速 度

常用工 业生产 ，获 得大量 菌体 及代谢 物

思考？
某微生物最适生 长温度 37 ，但发
酵温度 33 ，如何实现连 续培养

两级连续 培养
固定化 细胞连续培 养法

近年来 的新技术
通过包 埋、微胶囊 、吸 附等 种种手 段， 将细
胞固定 在载体内部 或表 面
优点： 菌体 密度 高；减 少细 胞流失 ，反复 使
用；简 化分离工艺
4. 混菌培养

例如， 酸奶 双株发 酵
活性 污泥