LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI UMUM

ISOLASI DAN PEMURNIAN MIKROBA, TEKNIK PEMELIHARAAN KULTUR MURNI DAN PERHITUNGAN ANGKA LEMPENG TOTAL (Total Plate Count= TPC)

Oleh: Ahmad Soni 0810910002 Kelompok I

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI JURUSAN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG 2010

BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Mikroba yang ditemukan di suatu lingkungan ditemukan dalam populasi campuran, sangat jarang sekali yang ditemukan sebagai satu spesies tunggal. Penelitian mengenai mikroorganisme biasanya memerlukan teknik untuk memisahkan populasi campuran pada permulaanya, atau biakan campuran, menjadi spesies-spesies yang berbeda-beda sebagai biakan murni. Biakan murni terdiri dari suatu populasi sel yang berasal dari satu sel induk (Prescott, 2003). Hal lain yang perlu diperhatikan adalah pemeliharaan kemurnian isolat selama penyimpanan, agar produk atau metabolisme suatu mikroba termasuk kapang tetap terjaga. Pengetahuan akan nutrisi pertumbuhan akan membantu di dalam mengkultivasi, mengisolasi dan mengidentifikasi mikroba, karena mikroba memiliki karakteristik dan ciri yang berbeda-beda di dalam persyaratan pertumbuhannya. Suatu jenis koloni mikroba yang terpisah dari koloni campurannya akan lebih mudah untuk diamati. Selain itu teknik untuk memisahkan dan mendapatkan koloni tunggal serta pemeliharannya terdapat beberapa jenis. Teknik-teknik tersebut memiliki kelebihan dan kelemahan. Beberapa cara dapat dilakukan untuk menentukan jumlah bakteri yang terdapat pada bahan pemeriksaan. Cara yang paling sering digunakan adalah cara penghitungan koloni pada lempeng pembiakan (plate count), atau juga dapat dilakukan penghitungan langsung secara mikroskopis mempelajari teknik (Burrows, 2004). Oleh karena itu, untuk mikroba, serta keuntungan dan isolasi, pemurnian

kelemahannya, maka praktikum Isolasi dan Pemurnian Mikroba, Teknik Pemeliharaan Kultur Murni penting untuk dilakukan. 1.2 Tujuan Praktikum ini bertujuan untuk mempelajari teknik penyimpanan kultur murni dan mengkarakterisasi pertumbuhan koloni murni hasil isolasi.

1.3 Manfaat Setelah melakukan praktikum ini mahasiswa akan mempunyai keterampilan serta keahlian dalam mengisolasi, memurnikan dan memelihara suatu biakan dengan beberapa macam teknik, sehingga memudahkan isolasi, pemurnian yang dilakukan di lapangan serata menyimpan biakan tersebut.

BAB II TINJAUAN PUSTAKA Media agar merupakan substrat yang sangat baik untuk memisahkan campuran mikroorganisme sehingga masing-masing jenisnya menjadi terpisahpisah. Teknik yang digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme pada media agar memungkinkannya tumbuh dengan agak berjauhan dari sesamanya, juga memungkinkan setiap selnya berhimpun membentuk koloni, yaitu sekelompok massa sel yang dapat dilihat dengan mata telanjang. Bahan yang diinokulasikan pada medium disebut inokulum, dengan menginokulasi medium agar nutrien (nutrien agar) dengan metode cawan gores atau media cawan tuang, sel-sel mikroorganisme akan terpisah sendiri-sendiri. Setelah inkubasi, sel-sel mikroba individu memperbanyak diri secara cepat sehingga dalam waktu 18 sampai 24 jam terbentuklah massa sel yang dapat dilihat dan dinamakan koloni. Koloni dapat terlihat oleh mata telanjang. Setiap koloni merupakan biakan murni satu macam mikroorganisme (Pelczar dan Chan, 2007). Kemampuan mikroorganisme untuk tumbuh dan tetap hidup merupakan suatu hal yang penting untuk diketahui. Pengetahuan tentang faktor-faktor yang mempengaruhi pertumbuhan mikroba sangat penting di dalam mengendalikan mikroba. Berikut ini faktor-faktor penting yang mempengaruhi pertumbuhan mikroba (Suriawiria, 2005): a. Suplai Energi Mikroba sama dengan makhluk hidup lainnya, memerlukan suplai nutrisi sebagai sumber energi dan pertumbuhan selnya. Unsur-unsur dasar tersebut adalah : karbon, nitrogen, hidrogen, oksigen, sulfur, fosfor, zat besi dan sejumlah kecil logam lainnya. Ketiadaan atau kekurangan sumber-sumber nutrisi ini dapat mempengaruhi pertumbuhan mikroba hingga pada akhirnya dapat menyebabkan kematian. Kondisi tidak bersih dan higinis pada lingkungan adalah kondisi yang menyediakan sumber nutrisi bagi pertumbuhan mikroba sehingga mikroba dapat

tumbuh berkembang di lingkungan seperti ini. Oleh karena itu, prinsip daripada menciptakan lingkungan bersih dan higinis adalah untuk mengeliminir dan meminimalisir sumber nutrisi bagi mikroba agar pertumbuhannya terkendali. b. Suhu/Temperatur Suhu merupakan salah satu faktor penting di dalam mempengaruhi dan pertumbuhan mikroorganisme. Suhu dapat mempengaruhi mikroba dalam dua cara yang berlawanan. Apabila suhu naik maka kecepatan metabolisme naik dan pertumbuhan dipercepat. Sebaliknya apabila suhu turun, maka kecepatan metabolisme akan menurun dan pertumbuhan diperlambat. Apabila suhu naik atau turun secara drastis, tingkat pertumbuhan akan terhenti, kompenen sel menjadi tidak aktif dan rusak, sehingga sel-sel menjadi mati. Berdasarkan hal di atas, maka suhu yang berkaitan dengan pertumbuhan mikroorganisme digolongkan menjadi tiga, yaitu : Suhu minimum yaitu suhu yang apabila berada di bawahnya maka pertumbuhan terhenti. Suhu optimum yaitu suhu dimana pertumbuhan berlangsung paling cepat dan optimum. (Disebut juga suhu inkubasi). Suhu maksimum yaitu suhu yang apabila berada di atasnya maka pertumbuhan tidak terjadi. Berdasarkan ketahanan panas, mikroba dikelompokkan menjadi tiga macam, yaitu : Peka terhadap panas, apabila semua sel rusak apabila dipanaskan pada suhu 60oC selama 10-20 menit. Tahan terhadap panas, apabila dibutuhkan suhu 100oC selama 10 menit untuk mematikan sel. Thermodurik, dimana dibutuhkan suhu lebih dari 60oC selama 10-20 menit tapi kurang dari 100oC selama 10 menit untuk mematikan sel. c. Keasaman atau Kebasaan (pH) Setiap organisme memiliki kisaran pH masing-masing dan memiliki pH optimum yang berbeda-beda. Kebanyakan mikroorganisme dapat tumbuh pada kisaran ph 8,0 8,0 dan nilai pH di luar kisaran 2,0 sampai 10,0 biasanya bersifat merusak.

d. Ketersediaan Oksigen Mikroorganisme memiliki karakteristik sendiri-sendiri di dalam kebutuhannya akan oksigen. Mikroorganisme dalam hal ini digolongkan menjadi Aerobik : hanya dapat tumbuh apabila ada oksigen bebas. Anaerob : hanya dapat tumbuh apabila tidak ada oksigen bebas. Anaerob fakultatif : dapat tumbuh baik dengan atau tanpa oksigen bebas. Mikroaerofilik : dapat tumbuh apabila ada oksigen dalam jumlah kecil (Tortora, 2002). Metode-metode yang dapat digunakan untuk mengisolasi biakan murni mikroorganisme antara lain cawan gores (sterak plate), cawan tebar, dan cawan tuang. 1. Teknik Dilusi (Pengenceran)

Gambar 1. Teknik Dilusi (Rachdie, 2008) Teknik dilusi sangat penting di dalam analisa mikrobiologi. Karena hampir semua metode perhitungan jumlah sel mikroba mempergunakan teknik ini, seperti TPC (Total Plate Count). Cara Kerja : Dari larutan kultur kita ambil 1 ml dan kita masukkan ke dalam 9 ml Dari larutan dilusi 1/10 kita ambil 1 ml dan kita masukkan ke dalam 9 ml Dari larutan dilusi 1/100 kita ambil 1 ml dan kita masukkan ke dalam 9 ml Dari larutan dilusi 1/1000 kita ambil 1 ml dan kita masukkan ke dalam 9 aquades atau larutan buffer pepton untuk memperoleh dilusi 1/10 bagian. aquades atau larutan buffer pepton untuk memperoleh dilusi 1/100 bagian. aquades atau larutan buffer pepton untuk memperoleh dilusi 1/1000 bagian.

ml aquades atau larutan buffer pepton untuk memperoleh dilusi 1/10.000 bagian. Dan seterusnya Maksud dari 1/10, 1/100, 1/1000, 1/10.000 dst adalah suatu rasio dilusi yang apabila pada tiap dilusi ditumbuhkan ke dalam suatu media dan koloninya yang tumbuh dapat dihitung, maka jumlah sel mikroba dapat diketahui dengan cara : Jumlah koloni x Misal : Apabila pada dilusi 1/100 tumbuh sebanyak 20 koloni, maka dapat diketahui jumlah sel adalah : 20 koloni x 1 1/100 = 2000 sel 1 Pengenceran

Apabila pada dilusi 1/1000 tumbuh sebanyak 3 koloni, maka dapat diketahui jumlah sel adalah : 2 koloni x 1 1/1000 = 3000 sel

Oleh karena itu, dengan metode dilusi kita dapat memperkirakan jumlah sel mikroba pada suatu benda atau produk. 2. Teknik Pour Plate (Lempeng Tuang) Teknik Pour Plate adalah suatu teknik dalam menumbuhkan

mikroorganisme dalam media agar dengan cara mencampurkan media agar cair dengan stok kultur. Teknik ini umumnya digunakan pada metode Total Plate Count (TPC). Sedangkan teknik streak plate adalah suatu teknik dalam menumbuhkan mikroorganisme dalam media agar dengan cara menggores (streak) permukaan agar dengan jarum yang telah diinokulasi dengan kultur mikroba. Teknik ini menjadikan mikroorganisme tumbuh dan tampak pada goresan-goresan inokulasi bekas jarum (Radchie, 2008).

3. Teknik Streak Plate

Gambar 2 . Teknik Streak Plate (Rachdie, 2008) Teknik streak plate (lempeng gores) adalah suatu teknik di dalam menumbuhkan mikroorganisme di dalam media agar dengan cara menstreak (menggores) permukaan agar dengan jarum ose yang telah diinokulasikan dengan kultur bakteri. Dengan teknik ini mikroorganisme yang tumbuh akan tampak dalam goresan-goresan inokulum bekas dari streak jarum enten. 4. Pemeliharaan Kultur pada Slant Agar

(a)

(b)

Gambar 3. Teknik Slant Agar. (a) memasukkan kultur pada slant agar (b) bagianbagian yang akan dipindahkan (Rachdie, 2008) Agar slants adalah kultivasi biakan mikroba ke dalam agar miring di dalam tabung reaksi untuk melihat karakteristik koloni bakteri yang tumbuh. Tiap bakteri memiliki karakteristik koloni yang berbeda. Karakteristik yang diamati pada koloni bakteri yang tumbuh adalah (Rachdie, 2008):

Karakteristik Pertumbuhan Koloni Bakteri Ukuran : Diameter koloni yang diukur di dalam mm atau cm Bentuk Keseluruhan Koloni : Sirkular, irregular, punctiform, rhizoid Tepi / Margin : Entire, lobate, erose, undulate Elevasi : Datar (flat), raised, convex (cembung), pulvinate, umbonate, crateriform Permukaan : Wrinkled, rough (kasar), concentric rings, dull, glistening, waxy Pigmentasi : Warna : merah, kuning, krim, putih, tidak berwarna Kelarutan dalam air : larut dalam air, tidak larut dalam air Opasitas : Transparan, translucent, opaque Bau : manis, putrefactive, fruity

BAB III METODE PRAKTIKUM 3.1 Waktu dan Tempat

Praktikum Isolasi Dan Pemurnian Mikroba, Tehnik Pemeliharaan Kultur Murni Dan Penghitungan Angka Lempeng Total (Total Plate Count=TPC) ini dilaksanakan pada hari Kamis, 01 April 2010 pada pukul 13.00 16.35 WIB. Praktikum dilaksanakan di laboratorium Mikrobiologi, Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Brawijaya, Malang. 3.2 Cara Kerja 3.2.1 Teknik Dilusi (Pengenceran) Sampel (tanah murni dan tanah yang ditambah dengan pestisida) ditimbang sebanyak 5 mg dan dimasukkan ke dalam 45 ml garfis atau larutan buffer pepton untuk memperoleh dilusi 1/10 bagian. Dari larutan dilusi 1/10 diambil 1 ml dan dimasukkan ke dalam 9 ml garfis atau larutan buffer pepton untuk memperoleh dilusi 1/100 bagian. Dari larutan dilusi 1/100 diambil 1 ml dan dimasukkan ke dalam 9 ml garfis atau larutan buffer pepton untuk memperoleh dilusi 1/1.000 bagian. Dari larutan dilusi 1/1.000 diambil 1 ml dan dimasukkan ke dalam 9 ml garfis atau larutan buffer pepton untuk memperoleh dilusi 1/10.000 bagian. Dari larutan dilusi 1/10.000 diambil 1 ml dan dimasukkan ke dalam 9 ml garfis atau larutan buffer pepton untuk memperoleh dilusi 1/100.000 bagian. Dari larutan dilusi 1/100.000 diambil 1 ml dan dimasukkan ke dalam 9 ml garfis atau larutan buffer pepton untuk memperoleh dilusi 1/1.000.000 bagian. 3.2.2 Teknik Pour Plate (Lempeng Tuang) Diambil sampel sebanyak 1 ml dari masing-masing pengenceran berseri pada teknik dilusi dan dimasukkan ke dalam cawan petri steril, cawan segera ditutup agar terhindar dari kontaminan. Masing-masing cawan petri berisis hasil pengenceran ditambahkan dengan Potato Dextrose Agar (PDA) untuk kapang, dan media Nutrient agar (NA) untuk bakteri. Segera setelah media dimasukkan, cawan petri diputar secara perlahan-lahan di atas meja horizontal untuk mengaduk campuran media agar dengan dilusi kultur mikroba. Setelah memadat, cawancawan tersebut diletakkan dalam posisi terbalik. Inkubasi dilakukan pada suhu kamar, untuk kapang dan bakteri dilakukan inkubasi minimal selama 3x24 jam. Karakteristik koloni yang tumbuh diamati.

3.2.3 Teknik Streak Plate (Lempeng Gores) Teknik Streak plate diawali dengan teknik aseptis. Jarum ose atau enten dibakar dari bagian pangkal dalam terus hingga ke bagian ujung sampai berpijar merah. Kemudian bibir tabung reaksi yang berisi kultur bakteri atau kapang dibakar dengan cara memutar tabung sehingga semua bagian bibir tabung terkena api. Jarum enten atau ose segera dimasukkan ke dalam cawan petri hasil pour plate, lalu segera dikeluarkan. Ketika memasukkan jarum enten atau ose jangan sampai menyentuh dinding tabung dan dilakukan di dekat pembakar Bunsen. Masing-masing cawan berisi biakan bakteri diambil sedikit dengan ose dan sedikit di congkel bagian bakteri yang ingin dimurnikan. Sedangkan untuk kapang yang sangat berserabut, cukup sedikit digores pada bagian agak ke tepi. Jarum enten atau ose yang mengandung koloni kapang atau bakteri segera di sentuhkan pada cawan petri lain yang berisi Potato Dextrose Agar (PDA) untuk kapang dan Nutrien Agar (NA) untuk bakteri yang telah mengeras pada bagian tengah. Hasil dari Streak Plate untuk kapang tersebut kemudian diinkubasi. Inkubasi dilakukan pada suhu 300C, untuk kapang dan bakteri dilakukan inkubasi minimal selama 3x24 jam. Inkubasi dilakukan dengan posisi cawan terbalik. 3.2.4 Penyimpanan Biakan Murni Untuk menguasai teknik penyimpanan biakan murni, diperlukan ketrampilan menguasai teknik agar slants. Agar slants adalah kultivasi biakan mikroba ke dalam agar miring di dalam tabung reaksi. Selain digunakan untuk penyimpanan kultur murni, teknik ini juga digunakan untuk melihat karakteristik koloni bakteri atau kapang yang tumbuh. Langkah menuang media agar ke dalam tabung reaksi secara aseptis, kemudian didinginkan dalam keadaan miring ( 20-30 derajat Celcius). Kemudian di-streak dengan biakan mikroba dengan menggunakan jarum ose secara aseptis, lalu diinkubasi ke dalam inkubator dan diamati bentuk koloni yang tumbuh. BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Analisis Prosedur

4.1.1 Teknik Dilusi (Pengenceran) Teknik dilusi sangat penting di dalam analisis mikrobiologi, karena hampir semua metode perhitungan jumlah sel mikroba diawali teknik ini. Teknik dilusi dilakukan untuk benar-benar mendapatkan koloni tunggal. Sampel (tanah murni dan tanah yang ditambah dengan pestisida) ditimbang sebanyak 5 mg dan dimasukkan ke dalam 45 ml garfis atau larutan buffer pepton untuk memperoleh dilusi 1/10 bagian. Dari larutan dilusi 1/10 diambil 1 ml dan dimasukkan ke dalam 9 ml garfis atau larutan buffer pepton untuk memperoleh dilusi 1/100 bagian. Dari larutan dilusi 1/100 diambil 1 ml dan dimasukkan ke dalam 9 ml garfis atau larutan buffer pepton untuk memperoleh dilusi 1/1.000 bagian. Dari larutan dilusi 1/1.000 diambil 1 ml dan dimasukkan ke dalam 9 ml garfis atau larutan buffer pepton untuk memperoleh dilusi 1/10.000 bagian. Dari larutan dilusi 1/10.000 diambil 1 ml dan dimasukkan ke dalam 9 ml garfis atau larutan buffer pepton untuk memperoleh dilusi 1/100.000 bagian. Dari larutan dilusi 1/100.000 diambil 1 ml dan dimasukkan ke dalam 9 ml garfis atau larutan buffer pepton untuk memperoleh dilusi 1/1.000.000 bagian. Maksud dari 1/10, 1/100, 1/1000, 1/10.000 hingga seterusnya merupakan suatu rasio dilusi yang apabila pada tiap dilusi ditumbuhkan kedalam suatu media dan koloninya yang tumbuh dapat dihitung. Pengenceran dilakukan untuk mendapatkan koloni yang akan diisolasi dengan meminimalkan kontaminasi dan penambahan nutrisi untuk mikroba 4.1.2 Teknik Pour Plate Pada teknik pour plate, mula-mula diambil sampel sebanyak 1 ml dari masing-masing pengenceran berseri pada teknik dilusi dan dimasukkan ke dalam cawan petri steril, cawan segera ditutup agar terhindar dari kontaminan. Potato Dextrose Agar (PDA) merupakan media yang digunakan untuk menumbuhkan kapang, sedangkan Nutrient Agar (NA) merupakan media yang digunakan untuk menumbuhkan bakteri, media ini dipanaskan agar mencair, kemudian sedikit didinginkan sehingga suhunya kira-kira 40-50C, pendinginan ini dilakukan untuk mendapatkan suhu yang ideal sehingga agar tidak mengeras namun tidak terlalu panas yang mengakibatkan kematian koloni yang akan dibiakkan.. Masing-masing cawan petri berisi hasil pengenceran ditambahkan dengan Potato Dextrose Agar

(PDA) untuk kapang, dan Nutrien Agar (NA) untuk bakteri. Segera setelah media dimasukkan, cawan petri diputar secara perlahan-lahan di atas meja horizontal untuk mengaduk campuran media agar dengan dilusi kultur mikroba. Setelah memadat, cawan-cawan tersebut diletakkan dalam posisi terbalik. Cawan diletakkan dalam posisi terbalik berfungsi untuk mencegah kondensasi menitis dari bawah ke atas permukaan agar yang dapat memfasilitasi pergerakan organisme antara koloni (Sciencestuff, 2008). Inkubasi dilakukan pada suhu 300C (jika tergolong mikroba mesofil) dengan lama inkubasi 24 jam untuk bakteri dan paling sedikit 3x24 jam untuk kapang. Perbedaan waktu inkubasi adalah karena waktu pertumbuhan dan perkembangbiakkan antara bakteri dan kapang berbeda. Inkubasi dilakukan untuk memberikan suasana yang memungkinkan (optimal) untuk pertumbuhan bakteri dan kapang hingga terbentuk koloni. Inkubasi dilakukan dengan posisi cawan terbalik. Hal ini dilakukan agar untuk mencegah kondensasi menitis dari bawah ke atas permukaan agar yang dapat memfasilitasi pergerakan organisme antara koloni (Sciencestuff, 2008). Karakteristik koloni yang tumbuh diamati. 4.1.3 Teknik Streak Plate (lempeng gores) Teknik Streak plate diawali dengan teknik aseptis. Jarum enten dan ose dibakar dari bagian pangkal dalam terus hingga ke bagian ujung sampai berpijar merah, hal ini dilakukan agar jarum enten dan ose bebas dari kontaminan. Pada biakan kapang digunakan jarum enten karena biasanya kapang memiliki struktur yang berserabut dehingga dengan jarum enten akan diperoleh serabut atau hifa dari kapang dan dibiakkan, sedangkan jarum ose digunakan untuk mengambil biakan bakteri karena ukuran bakteri yang sangat kecil. Kemudian bibir tabung reaksi yang berisi kultur bakteri dan kapang dibakar dengan cara memutar tabung sehingga semua bagian bibir tabung terkena api untuk memastikan tidak ada mikroba lain yang masuk ke dalam media biakan. Jarum enten atau ose segera dimasukkan ke dalam cawan petri hasil pour plate, lalu segera dikeluarkan. Ketika memasukkan jarum enten atau ose jangan sampai menyentuh dinding tabung dan dilakukan di dekat pembakar Bunsen karena akan menyebabkan kontaminasi. Masing-masing cawan berisi biakan bakteri diambil sedikit dengan ose dan sedikit di congkel bagian bakteri yang ingin dimurnikan, namun jangan sampai bagian

agar terambil atau jika terpaksa bagian agar terambil, diusahakan seminimal mungkin. Sedangkan untuk kapang yang sangat berserabut, cukup sedikit digores pada bagian agak ke tepi. Pemilihan bagian tepi ini bertujuan agar biperoleh biakan murni dengan umur yang relatif sama. Teknik streak untuk kapang tidak sama dengan bakteri, karena umumnya kapang memiliki karakteristik yang berserat atau terdiri dari banyak hifa, maka dilakukan penempelan jarum enten pada agar dan kapang akan berkembang. Jarum enten yang mengandung koloni kapang segera di sentuhkan pada cawan petri lain yang berisi Potato Dextrose Agar (PDA) yang telah mengeras pada bagian tengah, hal ini dilakukan agar kapang dapat tersebar dengan merata sesuai dengan diameter cawan petri. Hasil dari Streak Plate untuk kapang dan bakteri tersebut kemudian diinkubasi. Inkubasi dilakukan pada suhu 300C (jika tergolong mikroba mesofil) dengan lama inkubasi 24 jam untuk bakteri dan paling sedikit 3x24 jam untuk kapang. Perbedaan waktu inkubasi adalah karena waktu pertumbuhan dan perkembangbiakkan antara bakteri dan kapang berbeda. Inkubasi dilakukan untuk memberikan suasana yang memungkinkan (optimal) untuk pertumbuhan bakteri dan kapang hingga terbentuk koloni. Inkubasi dilakukan dengan posisi cawan terbalik. Hal ini dilakukan agar untuk mencegah kondensasi menitis dari bawah ke atas permukaan agar yang dapat memfasilitasi pergerakan organisme antara koloni (Sciencestuff, 2008). Kemudian diamati pertumbuhan koloni tersebut. 4.1.4 Pemurnian Biakan Murni Pemurnian biakan murni bertujuan untuk mendapatkan satu spesies dalam satu tabung pemeliharaan kultur. Langkah-langkah pemurnian biakan murni adalah sebagai berikut, koloni dengan karakter morfologi tertentu (koloni tunggal) dapat dipisahkan satu dengan lainnya dengan cara mengambilnya dengan ose (diusahakan koloni yang berjauhan). Kemudian digoreskan pada media nutrien agar atau medium agar pemurnian yang lain. Pengambilan dengan ose dapat memisahkan koloni tunggal dengan yang lainnya. Untuk memurnikan kapang, ambil koloni dengan karakter morfologi tertentu dengan cara mengambilnya dengan jarum enten kemudian menaruhnya pada satu titik media PDA pada cawan petri. Jarum ose dan jarum enten yang digunakan untuk memindahkan sedikit biakan bakteri dan kapang ke gelas obyek harus disterilisasi dengan cara

dipanaskan diatas lampu bunsen agar terbebas dari mikroba (steril), begitu pula dengan bibir cawan petri tempat koloni fungi. Medium buatan berfungsi sebagai medium pertumbuhan biakan murni bakteri. Pada medium bakteri dapat tumbuh dan berkembang biak. Inkubasi dilakukan pada suhu 300C (jika tergolong mikroba mesofil) dengan lama inkubasi 24 jam untuk bakteri dan paling sedikit 3x24 jam untuk kapang. Perbedaan waktu inkubasi adalah karena waktu pertumbuhan dan perkembangbiakkan antara bakteri dan kapang berbeda. Inkubasi dilakukan untuk memberikan suasana yang memungkinkan (optimal) untuk pertumbuhan bakteri dan kapang hingga terbentuk koloni. Inkubasi dilakukan dengan posisi cawan terbalik. Hal ini dilakukan agar untuk mencegah kondensasi menitis dari bawah ke atas permukaan agar yang dapat memfasilitasi pergerakan organisme antara koloni (Sciencestuff, 2008). 4.1.5 Penyimpanan Biakan Murni Penyimpanan biakan murni menggunakan teknik agar miring yang berisi media Potato Dextrose Agar (PDA) untuk kapang serta Nutrien Agar (NA) untuk bakteri. Pada teknik ini, agar didinginkan dalam kedaan miring untuk memperoleh luar permukaan yang lebih besar sehingga koloni yang berkembeng diharapkan lebih banyak. Tujuan utama preservasi, yaitu mereduksi atau mengurangi laju metabolisme sekecil mungkin dengan tetap mempertahankan viabilitas (daya hidupnya) ciri-ciri genetiknya tetap stabil dan tidak berubah dan memelihara sebaik mungkin biakan, sehingga diperoleh angka perolehan (recovery) dan kehidupan (survival) yang tinggi dengan perubahan ciri-ciri yang minimum. Caranya hampir sama dengan pemurnian biakan, yaitu dengan mengambil sedikit koloni bakteri dengan menggunakan jarum enten kemudian menaruhnya pada media NA yang telah disediakan, sedangkan untuk kapang pada bagian tengah Potato Dextrose Agar (PDA) dalam tabung reaksi. Sterilisasi mulut tabung reaksi dilakukan dengan melewatkan mulut tabung pada api bunsen. Hal ini dilakukan sebelum dan sesudah menginokulasikan biakan. Kemudian dilakukan inkubasi ke dalam inkubator dan diamati bentuk koloni yang tumbuh. Inkubasi dilakukan untuk memberikan suasana yang memungkinkan (optimal) untuk pertumbuhan kapang hingga terbentuk koloni.

4.2 Data Hasil Praktikum Tabel 1. Hasil Penghitungan Bakteri No. P1 Pengenceran 10 10-3 10-4 10-5 10-6 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
-2

Koloni Cawan Ulangan I Ulangan II 128 49 5 1 3 42 7 12 3 32 17 15 2 3 43 18 15 3 2

Sel Mikroba Tiap ml/gr bahan 8 x 105

NP 2

4,25 x 105

Tabel 2. Hasil Penghitungan Kapang No. P1 Pengenceran 10 10-3 10-4 10-5 10-6 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
-2

Koloni Cawan Ulangan I Ulangan II 8 4 1 3 2 11 4 1 8 2 1 1 1

Sel Mikroba Tiap ml/gr bahan 9,5 x 104

NP 2

4.3 Analisa Hasil Berdasarkan hasil praktikum yang telah dilakukan diketahui bahwa hasil TPC berhubungan dengan seri pengenceran. Hal ini dikarenakan dengan melakukan pengenceran berseri, maka jumlah mikroba yang tersuspensi di dalam cairan menjadi lebih kecil., hal ini terlihat dari jumlah mikroba yang teramati setelah pengenceran hingga ke enam kalinya, bahwa umumnya semakin banyak pengenceran yang dilakukan maka jumlah mikroba yang terhitung semakin sedikit.

Berdasarkan pengamatan yang dilakukan, didapatkan bahwa jumlah koloni pada media dengan penambahan pestisida lebih banyak daripada koloni nonpestisida. Hal ini bisa disebabkan karena bakteri maupun kapang yang ditumbuhkan pada media dengan penambahan pestisida memiliki resistensi yang sangat tinggi dibandingkan pada media non-pestisida, sehingga jumlah koloni yang terbentuk pun akan semakin banyak. Karakterisasi Bakteri Media Nutrient Agar Non Pestisida Bentuk bakteri yang telah didapat dari hasil isolasi murni adalah dengan bentuk bulat, berfilamen, dan tidak teratur. Konfigurasi bakteri yang didapat adalah dengan tepi yang menyeluruh, erose, lobate, dan beralun. Kebanyakan dari konfigurasi bakteri adalah menyeluruh. Elevasi merupakan bentuk pada permukaan bakteri dengan permukaan cembung dan pulvinat. Tekstur dari bakteri yang didapat sebagian besar adalah berkontur. Tekstur berkontur merupakan tekstur dimana permukaan dari sel bakteri adalah licin dan beralun secara tidak teratur. Konsistensi pada sel bakteri seperti mentega dan pertumbuhannya mengikuti bekas garsan bekas inokulasi. Ciri optik pada bakteri adalah opalesens yaitu seperti warna putih-kebiruan atau warna susu dengan ciri warna yang kelihatan berubah-ubah, dan berkilat. Pigmentasi pada bakteri sebagian besar memiliki warna kuning, putih tulang, dan putih.

Media Nutrient Agar Pestisida Bentuk dari bakteri pada media NA dengan pestisida semua berbentuk bulat. Konfigurasi pada bakteri semuanya adalah menyeluruh. Elevasi pada bakteri adalah cembung dan menaik dengan tekstur berkontur. Konsistensi seperti mentega dengan ciri optik berkilat dan opalesens. Pigmentasi pada bakteri berwarna putih, hitam, dan tidak berwarna. Karakterisasi Kapang Media Potato Detroxa Non Pestisida

Karakterisasi pada kapang PDA non pestisida hanya berdasarkan pigmentasi, garis radial, dan ada tidaknya miselium. Pigmentasi pada kapang berbeda-beda. Terdapat kapang yang pigmentasinya pada bagian depan dan belakang memiliki warna yang sama. Terdapat juga pigmentasinya pada bagian depan dan belakang tidak sama, bahkan terdapat tiga warna pada bagian depan, tengah, dan belakang. Kapang pada media PDA non pestisida semuanya tidak memiliki garis radial. Dengan miselium kompak dan renggang. Miselium kompak adalah miseliumnya memiliki panjang yang sama atau sejajar. Sedangkan renggang yaitu bentuk miseliumnya masih terdapat jarak antara satu dengan yang lain.
Media Potato Detroxa Agar Pestisida

Pigmentasi pada kapang dengan media PDA dengan pestisida memiliki pigmentasi antara depan dan belakang memiliki warna yang sama. Tidak memiliki garis radial dan tidak memiliki miselium. Pengamatan yang telah dilakukan menunjukkan bahwa terdapat beberapa kesalahan yang terjadi, diantaranya tumbuhnya koloni bakteri pada media PDA. Hal ini disebabkan karena PDA mengandung nutrisi yang mencukupi untuk pertumbuhan bakteri, sehingga bakteri juga mampu tumbuh pada media PDA. Selain itu, tidak diberikannya antiseptic pada media PDA yang digunakan, sehingga bakteri akan mengkontaminasi kapang pada media PDA tersebut. TPC merupakan salah satu teknik penghitungan koloni mikroba yang paling sederhana. Kelebihan TPC ialah tidak membutuhkan keahlian yang sangat baik serta hanya membutuhkan biaya yang relative lebih murah. Adapun kekurangan TPC ialah bahwa metode ini tidak dapat digunakan jika ingin mengetahui jumlah koloni secara tepat, dan hanya bias digunakan untuk menghitung jumlah bakteri yang bersifat aerob saja. Penghitungan TPC dapat dipengaruhi oleh beberapa faktor, diantaranya adalah ketepatan penghitungan koloni yang kurang teliti serta ketidakmampuan TPC dalam menghitung jumlah koloni secara tepat (Curtis, 2004). Teknik Pour Plate memiliki kelebihan yaitu mikroba yang tumbuh dapat tersebar merata pada media agar. Metode ini memboroskan bahan da waktu, namun tidak memerlukan ketrampilan yang terlalu tinggi. Sedangkan teknik Streak Plate dapat menghemat bahan dan waktu, namun untuk dapat memperoleh

hasil yang baik, sangat diperlukan ketrampilan dari pengalaman. Oleh karena itu kesabaran dan pengalaman sangat penting untuk dapat menghasilkan koloni murni mikroba, khususnya bakteri, seperti yang diinginkan. Teknik ini memiliki beberapa kendala, di antaranya kemungkinan terjadinya perubahan genetik melalui seleksi varian, peluang terjadinya kontaminasi, dan terjadi kekeliruan pemberian label. Teknik agar slants adalah teknik penyimpanan jangka pendek yang paling umum dilakukan, dimana koloni bakteri hasil isolasi dipindahkan ke tabung reaksi yang telah berisi media agar dengan posisi miring. Teknik ini sering juga disebut dengan teknik agar miring (Lim D, 2006). Tujuh (7) isolat bakteri telah diisolasi dari berbagai limbah cair industri dan diuji kemampuannya dalam menggunakan senyawa adiponitril. Diantara 7 isolat bakteri tersebut, satu isolat mampu menggunakan adiponitril (suatu senyawa yang terkandung pada pestisida) sebagai satu-satunya sumber energi, karbon dan nitrogen untuk substrat pertumbuhannya. Isolat bakteri tersebut teridentifikasi sebagai Pseudomonas sp. Pseudomonas sp. mampu tumbuh pada adiponitril pada konsentrasi yang cukup tinggi (100 mM), dan pertumbuhan maksimum dicapai pada konsentrasi adiponitril 40 mM. Pertumbuhan Pseudomonas sp pada 40 mM adiponitril mempunyai waktu penggandaan (td) dan laju pertumbuhan spesifik () sebesar 2 jam dan 0,346 jam-1. Dapat dikatakan bahwa Pseudomonas sp. Merupakan salah satu bakteri pendegradasi pestisida (Sulistinah, 2006).

BAB V PENUTUP

5.1 Kesimpulan Teknik penyimpanan mikroorganisme terlebih dahulu dilakukan Isolasi. Isolasi mikroorganisme dilakukan dengan teknik dilusi atau pengenceran, dimana hasil dari teknik ini adalah 6 sampel, yaitu 10-1 - 10-6 pengenceran. Pengenceran ini merupakan langkah awal untuk mendapatkan isolat jamur yang baik. Tahap berikutnya adalah menggunakan teknik Pour Plate. Teknik ini akan memisahkan koloni murni dari populasi campuran mikroorganisme, dimana dilakukan dengan mencampurkan media agar cair dengan kultur bakteri hasil dilusi. Teknik selanjutnya adalah teknik Streak Plate atau lempeng gores. Teknik ini dilakukan dengan cara menumbuhkan jamur di dalam media dengan cara menggores permukaan media dengan jarum ose yang telah diinokulasi dengan kultur jamur. Setelah inkubasi maka akan mendapatkan koloni murni dari jamur yang diinginkan. Seluruh metode ini harus dilakukan pada keadaan yang aseptis untuk mencegah terjadi kontaminasi. Pemeliharaan bakteri dapat dilakukan pada agar slants atau biasa disebut agar miring. Karakteristik mikroorganisme dilakukan melalui pengamatan langsung dibawah mikroskop. Karakteristik bakteri terdiri atas bentuk, konfigurasi, elevasi, tekstur, konsistensi, ciri optik dan pigmentasi. Sedangkan karakteristik jamur ditentukan miselium, bentuk, konfigurasi, garis radial dan pigmentasi. 5.2 Saran Hendaknya para praktikan sangat berhati-hati dalam melakukan teknik isolasi dam pemurnian agar tidak terjadi kontaminasi. Selain itu, para praktikan diharapkan memakai masker untuk meminimalisir terjadinya kontaminasi.

DAFTAR PUSTAKA

Burrows, W., J.M. Moulder, and R.M. Lewert. 2004. Texbook of Microbiology. W.B. Saunders Company, Philadelphia. Curtis, L., A. Lieberman, M. Stark, W. Rea & M. Vetter. 2004. Isolation. http:// www.e-dukasi.net /. Diakses pada tanggal 17 April 2010 Lim,D. 2006. Microbiology, 4th Edition. McGrow-hill book, New york. Pelczar, M. J., Chan, E.C.S. 2007. Elements of Microbiology. Mc Graw Hill Book Company. New York. Prescott, L.M. 2003. Microbiology 5th edition. Mc Graw Hill. New York Rachdie. 2008. Faktor yang Mempengaruhi Pertumbuhan Mikroba.

http://rachdie

.blogsome.com/2006/10/14/faktor-yang-mempengaruhi-

pertumbuhan-mikroba/. Diakses pada tanggal 17 April 2010 Sulistinah, N. 2006. Mikroba Pentranformasi Adiponitril di Palembang. Jurnal Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia : 1-8 Suriawiria, U. 2005. Mikrobiologi Dasar. Papas Sinar Sinanti, Jakarta. Tortora,G. Y, Berdell.R.F, Christine,L.C. 2002. Microbiology an Introduction. Benjamin Cummings, Addrson Wesley Long man Inc. New York