BAB III

METODE PENELITIAN
Desain Penelitian
Jenis penelitian yang akan dilakukan pada penelitian ini adalah menggunakan metode eksperimental laboratorium, mengenai uji potensi antijamur ekstrak daun jarak pagar (Jatropha curcas L.) terhadap Candida albicans dan Micropsorum gypseum secara in vitro.

Lokasi dan Waktu Penelitian

1. Penelitian ini dilakukan di laboratorium Mikrobiologi Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan, Universitas Muhammadiyah Yogyakarta.

2. Pengekstrakan daun jarak pagar (Jatropha curcas L.) dilakukan di

laboratorium Biologi Fakultas Farmasi, Universitas Gadjah Mada Yogyakarta.

3. Waktu yang digunakan untuk penelitian ini adalah dimulai dari

pertengahan bulan Mei 2011 sampai pertengahan bulan Juni 2011.

Populasi dan Sampel Penelitian

1. Subjek penelitian ini adalah daun segar jarak pagar (Jatropha curcas L.)

yang berasal dari Wates, Kulon Progo, Yogyakarta.

2. Bahan uji yang digunakan adalah kultur jamur Candida albicans dan

Microsporum gypseum yang berasal dari Balai Laboratorium Kesehatan Provinsi Yogyakarta.

Variabel dan Definisi Operasional

1. Variabel a. Variabel bebas Daya antijamur pada ekstrak daun jarak pagar (Jatropha curcas L.) (KHM dan KBM). b. Variabel terikat Pertumbuhan jamur Candida albicans dan Microsporum gypseum pada media. c. Variabel terkendali Konsentrasi ekstrak daun jarak pagar (Jatropha curcas L.) Jumlah jamur, waktu inkubasi jamur, dan suhu inkubasi jamur. d. Variabel terganggu 1) Kontaminsasi mikroba lain

2) Ketelitian pada pengamatan 2. Definisi Operasional

a.

Ekstrak daun jarak pagar (Jatropha curcas L.) adalah daun jarak

pagar yang telah melalui proses ekstraksi dengan metode perkolasi yang menggunakan pelarut ethanol 80%.
b.

Candida albicans termasuk flora normal pada kulit dan membrane

ukosa manusia yang pada bentuk patogennya dapat menyebabkan candidasis. Jamur ini tampak sebagai ragi lonjong, sel bertunas, dan berukuran 2-3 x 4-6 m yang memanjang menyerupai hifa (pseudohifa). Pada media Sabouroud agar tampak sedikit menimbul dari permukaan medium dengan permukaan halus, licin, atau berlipatlipat, berwarna putih kekuningan dan berbau ragi. Candida albicans yang digunakan dalam penelitian ini berasal dari Balai Laboratorium Kesehatan Provinsi Yogyakarta
c.

Microsporum gypseum adalah jamur spesies geofilik umum yang

dapat berupa ektorisks berspora besar dan menyebabkan tinea kapitis dan tinea korporis. Pada media Sabouraud agar, pertumbuhan bakteri bisa lambat atau cepat pada suhu 25oC, memiliki diameter koloni yang bervariasi antara 1 sampai 9 cm setelah 7 hari diinkubasi. Microsporum gypseum yang digunakan dalam penelitian ini berasal dari Balai Laboratorium Kesehatan Provinsi Yogyakarta.

d.

Uji potensi antijamur adalah menguji suatu zat yang diduga

mempunyai daya antijamur dengan memanfaatkan jamur sebagai indicator pengujian. Kegunaan uji antijamur ini adalah diperolehnya suat system pengobatan yang efektif dan efisien. Metode uji antijamur yang akan digunakan dalam penelitian ini adalah metode dilusi e. Antijamur adalah suatu zat yang dapat menghambat atau

membunuh jamur.
f.

KHM (Kadar Hambat Minimal) adalah konsentrasi minimal dari

suatu zat yang dapat memhambat pertumbuhan suatu mikroorganisme, KBM (Kadar Bunuh Minimal) adalah konsentrasi minimal dari suatu zat yang dapat membunuh suatu mikroorganisme. Satuan yang digunakan dalam menentukan nilai KHM dan KBM dapa penelitian ini adalah %.

Instrument Penelitian
1. Alat :

a. Alat penggiling b. Mesin pengering c. Percolator d. Cawan petri berdiameter 10 cm e. Tabung reaksi

f. Rak tabung reaksi g. Pipet dan mikropipet h. Lidi kapas i. Lampu Bunsen j. Incubator memert k. Alat timbangan 2. Bahan :
a. Ekstrak daun jarak pagar (Jatropha curcas L.) b. Jamur Candida albicans c. Jamur Microsporum gypseum

d. Aquades steril e. Standar Mc Farland f. Larutan NaCl fisiologis

g. Media Sabouroud Dextrosa Agar

h. RPMI

Cara Pengumpulan Data

1. Penyiapan mikroba uji :

a. Kultur Jamur Candida albcans

Candida albicans dibiakkan pada media Sabouroud Dextrosa Agar kemudian diinkubasikan selama 48 jam pada suhu 25o-30oC. Pertumbuhan Candida albicans dari hasil biakkan diambil 1 ose Candida albicans, ditanam pada 2 mL media CYG, dan diinkubasikan selama 3-5 jam pada suhu 25o-30oC. Setelah itu, suspense Candida albicans dibuat dengan cara menambahkan NaCl pada media CYG tersebut sehingga kekeruhannya sama dengan standar Mc Farland I yakni konsentrasi kuman sebesar 108 CFU/mL. kemudian suspense tersebu diencerkan sebanyak 100 kali sehingga didapat konsentrasi Candida albicans sebesar 106 CFU/mL.
b. Kultur Jamur Microsporum gypseum

Jamur Microsporum gypseum diambil dari suatu biakan dengan menggunakan ose sebanyak satu koloni. Kemudia digoreskan pada media Sabouroud Dextrosa Agar (SDA) pada suatu tabung yang kemudian diinkubasikan selama 18-24 jam pada temperature kamar. Setelah biakan tumbuh, tabung disimpan sebagai stok pada suhu kamar. Pada dua minggu sekali dilakukan phasase di nutrient agar untuk stok persediaan. Kemudian diambil 1 ose biakan jamur yang berumur 2 hari, kemudian dimasukkan ke dalam tabung yang berisi 2 mL larutan NaCl fisiologis 0,9%, dicampurkan samapai homogen, kemudian disamakan dengan standar Mc Farland(108 CFU/mL) kemudian diencerkan dengan media aquades.

2. Cara pembuatan ekstrak

Pengekstraksian daun jarak pagar (Jatropha curcal L. ) terjadi dalam dua tahap:
a. Tahap penyerbukan

Daun jarak pagar (Jatropha curcas L.) dicuci terlebih dahulu, lalu dikeringkan dengan mesin pengering pada suhu 45o sampai 50oC selama 2 hari. Lalu, masukkan ke dalam mesin penggiling dengan diameter penyaring 1 mm. b. Tahap pembasahan Serbuk daun jarak pagar (Jatropha curcas L.) yang telah dibuat, dicampurkan dengan pelarut ethanol 80% sebanyak sampai banyak dari bobot tersebut sedikit demi sedikit, lalu diaduk perlahan. Campuran tersebut kemudian direndam selama 2 jam. Tahap ini disebut juga tahap perkolasi. Pada tahap ini, percolator diisi dengan kapas, kemudian diberikan kertas saring di atasnya. Setelah itu, tambahkan dengan serbuk yang telah basah dan ditambahkan pelarut sampai lebih kurang bagian dari percolator. Diamkan selama semalam, kemudian kran percolator dibuka perlahan. Tamping percolator dalam wadah yang disediakan. Perkolasi dilanjutkan hingga cairan di atas serbuk menjadi jernih. Kemudian perkolasi diuapkan dalam cawan porselin dengan pemanas air disertai dengan pengurangan tekanan hingga diperoleh ekstrak yang kental.

3. Penentuan kadar hambat minimal dan kadar bunuh minimal

tanaman jarak pagar (Jatropha curcas L.)

a. Disediakan 33 tabung volum 5 mL dengan 3 seri pengenceran.

Pengulangan yang akan dilakukan adalah sebanyak 3 kali.

b. 1 mL aquades steril dimasukkan ke dalam tabung ke-2 sampai

tabung ke-8, kemudian dimasukkan 1 mL ekstrak daun jarak pagar (Jatropha curcas L.) ke dalam tabung ke-1 dan tabung ke-2 sehingga tabung-1 berisi ekstrak daun jarak pagar (Jatropha curcas L.) dengan konsentrasi 50%, dan tabung-2 berisi ekstrak daun jarak pagar (Jatropha curcas L.) dengan konsentrasi 25%.
c. Kemudian dilakukan seri pengenceran secara seri dari tabung-2

sampai ke tabung-8 dengan cara memindahkan 1 mL larutan ekstrak daun jarak pagar (Jatropha curcas L.) dari tabung-2 ke tabung-3, kemudian dicampurkan sampai homogen. Diambil kembali 1 mL dari tabung-3 ke tabung-4, dicampurkan sampai homogen, demikian seterusnya sampai tabung-8 diambil 1 mL dan dipindahkan ke tabung9.
d. Masukkan masing-masing 1 mL suspense jamur yang telah dibuat

ke dalam tabung-1 hingga tabung ke-11, kecuali tabung ke-10. Pada tabung ke-10 dan tabung ke-11 dimasukkan media yaitu RPMI sehingga tabung ke-10 hanya berisi media sebagai control negative, sedangkan tabung ke-11 berisi campuran dari media dan suspense

jamur sebagai control positif. Volume akhir pada tabung-1 sampai tabung-9 adalah sebesar 2 mL. Konsentrasi akhir dari ekstrak daun jarak pagar (Jatropha curcas L.) pada tiap tabung adalah tabung-1 50%, tabung-2 25%, tabung-3 12,5%, tabung-4 6,25%, tabung-5 3,125%, tabung-6 1,5625%, tabung-7 0,78125%, tabung-8 0,390625%, dan tabung-9 0,1953125%.
e. Selanjutnya, semua tabung diberi tanda nomor 1 sampai nomor 9.

Pada tabung ke-10 diberi tanda control negative, sedangkan tabung ke11 diberi tanda control positif, kemudian semua tabung diinkubasikan pada suhu 37oC selama 24 jam.
f. Diamati

ada tidaknya pertumbuhan Candida albicans dan

Microsporum gypseum dengan cara membandingan dengan kontrol positif.

g. Kadar hambat minimal diperoleh dengan mengamati tabung

subkultur yang tidak menunjukkan adanya pertumbuhan Candida albicans dan Microsporum gypseum dengan konsentrasi terendah.
h. Tabung-tabung subkultur yang tidak memperlihatkan adanya

pertumbuhan mikroba, selanjutnya digoreskan pada media Sabouraud Dextrosa Agar dan diinkubasikan pada suhu 35oC selama 48 jam. i. Kadar bunuh minimal ditunjukkan dengan tidak adanya

pertumbuhan mikroba pada medium agar nutrient dengan konsentrasi terendah.

Pengolahan dan Metode Analisa Data

Pengolahan dan metode analisa data pada penelitian ini adalah dengan membandingkan KHM dan KBM ekstrak daun jarak pagar (Jatropha curcas L.) terhadap jamur Candida albicans dan Microsporum gypseum.