第六章

免疫 组织化 学的

双重 或多重 标记
 要 求：

1. 掌握 IHC 多重标记染色的基本

原理

和技术要求

2. 了解常 用方法类型及 其优缺点

概 述

应用 IHC 的方法在同一张 组织

切片上 同时或先后 显示两种或 两种以上

的抗原 成分，即谓 双重或多重 免疫标记

。
常用方 法类型有：

按标记 物分：免疫 荧光双重

标记 (FITC-TRITC) ，免疫 酶双重标记
( 单酶双底物 -HRP:DAB 与 4CN/
H2O2);AP: 萘酚 AS-MX/ 坚固红 与坚固
蓝；双 酶双底物 (HRP 与 AP ， DAB
/H2O2 与萘酚 AS-MX / 坚固红 ) ；免 疫
 按标记 抗体分： 直接、间接
法、复 合物法等

按抗体 制备动物来 源分： 异

种动物 抗体法与 同种动物抗 体法。

按有否 洗脱去除第 一重抗原

抗体复 合物分： 洗脱法与非 洗脱法。
 一般 多采用荧光 或酶标间接 法

，混合 试剂，不 洗脱，光镜 以双荧光或

双底物 酶标记为 多，颜色区 别。电镜以

胶体金 不同直径 颗粒 (5nm 与 15nm) 标

记为多 ，颗粒大 小区别。

一、基 本原理

双重或 多重标记是 利用免疫

学和细 胞化学原 理，在同一 张切片上同

时采用 或先后采 用不同颜色 的荧光色素

或酶促 产物，或 采用不同直 径大小颗粒

胶体金 来原位标 记两种或两 种以上抗原

抗体复 合物，
达到在 同一细胞 或亚细胞水 平显示

不同抗 原成分 ( 定性、定位、定

量 ) ，分析不同 抗原成分相 互间的

功能关 系，操作 遵循的原则 与要求

同单标 免疫组化 方法。

 为了避 免前重免疫 标记与

后重标 记的交叉、 重叠，其间可 采用

酸洗破 坏 ( 洗脱法 ) 或饱和封闭 ( 非

洗脱法 ) 加以克服。
二、光 镜下的多 重免疫标记 染色

（一） 双重免疫 荧光标记染 色

采用呈 现不同颜色 的荧光色

素配伍 ，分别标 记不同的抗 体，再通过
各自与 同一切片 上的相应抗 原特异性结
合而加 以区别显 示所建立起 来的双重或
多重免 疫组化染 色技术。
 常用的 荧光素配伍 主要为：
异硫氰 酸荧光素 (FITC) 呈绿色与罗丹
明 (RB200) 或异硫 氰酸四甲 基罗丹明
（ TRITC ）呈红色。

技术方 法敏感、特 异，需选

用各自 特定的激发 滤光片分 别观察或二
次曝光 显影，样本 不能长期 保存。
 技术类 型：有直接 法和间接
法之分 。前者特异 、快速， 后者敏感、
多用。

所用抗 体试剂可为 异种动物

抗体， 也可为同种 动物抗体 。

异种动 物抗体常混 合应用，

操作步 骤少，脱片 率相对较 低。
 同种动 物抗体多分 别应用，

操作步 骤加倍，脱 片机率相 对较高，前

后重免 疫荧光标记 交叉重叠 机会多，需

用酸性 洗脱或多聚 甲醛蒸气 处理。

 操作举 例：垂体腺 瘤 ----
ACTH 与 GH 双重免疫荧光标 记染色
（间接 法）

(1) 石蜡切 片，厚 5µ m ，常规 二甲

苯脱蜡 ，梯度酒精 水化，入 PBS(pH7.4,
0.01mol/L) 。
(2)1 ％人血清白蛋 白（ HAS ）孵 育
10min

（亦可 用 10 ％正常 羊血清代之 ）

，不洗 。

(3) 抗 ACTH 血清（ McAb ） 1:200 ，孵

育

30min 37℃ ，湿盒。

(5) 羊抗鼠 IgG-TRITC 1:100 ，湿盒 ，室

温避光 反应 1h 。

(6)0.05mol/L TBS(pH7.4) 洗，

10min×3 ， ( 第一重 ACTH-TRITC 标记

染色已 完成 ) 。
(7) 切片 逐级酒精脱 水，二甲苯 透明，
空气干 燥后，置 于装有多聚 甲醛粉末的
密闭容 器内，放 在 80℃ 烤箱或温箱内
以甲醛 蒸气固定 2 ～ 4h ，使第一重染
色中二 抗的抗原 结合部位失 活。

(8) 切片 以 TBS 洗， 5min×4

(9)1 ％ HSA （或 10 ％正羊 血清）孵育
30min ，室温，湿盒 ，不洗。

(10) 抗 GH 血清 (McAb) 1:400 ，孵育

30min ， 37℃ ，湿盒。

(11)0.05mol/L TBS(pH7.4) 洗， 10min×3

(12) 羊抗鼠 IgG-FITC 1:100, 湿盒，室
温避光 反应 1h 。

(13)0.05mol/L TBS(pH7.4) 洗， 10min×3

( 第二重 GH-FITC 标记染色完 成 ) 。

(14) 缓冲甘油封片 。
(15) 荧光显微镜下分 别以 546nm 及

490nm 波长的激发光观 察切片组织 内

TRITC 及 FITC 所标示 的 ACTH 及 GH

抗原（ TRITC 阳性细胞呈 红色， FITC

阳性细 胞呈绿色） 。
(16) 用彩色底片对切 片同一部位 用

546nm 及 490nm 波长激发光分别 作

两次曝 光，即可在 同一张照片 上显

示不同 颜色标示的 ACTH 与 GH 两

种抗原 。
 Fab 被灭
TRITC-GAM 游离 Fab 活
IgG
T T
T
鼠抗 人 ACTH
（ IgG ）

GH 抗
原
ACTH 抗原
F F
T
TITC-GAM
IgG

鼠抗 人 GH
（ IgG ）

图 1 同种动 物抗 体间 接法（ 分步 固定） 双重免 疫荧 光荧色

原理
二、多 重免疫酶标 记染色

以酶催 化不同底物 呈现不同

颜色产 物标示同一 切片内两 种或两种以
上抗原 为理论基础 所建立起 来的多重免
疫标记 染色方法。 在光镜下 可以同时观
察和对 比，样品保 存时间相 对较长，一
次曝光 即可成像， 故较双重 免疫荧光染
色法更 为常用。
 ★ 常用标记酶 与底物的配 伍

单酶双 底物 --HRP--DAB( 棕色 ):4CN( 蓝色

AEC( 红色 ):4CN( 蓝色 )

AP- 萘酚 AS-MX- 坚固红 (fast

red 红色 )- 坚固蓝 (fast blue 蓝

双酶双 底物 --HRP(DAB):AP( 萘酚 AS.MX- 坚固
蓝)

HRP(4CN):AP( 萘酚 AS.MX- 坚固
红)

（直接 法、间接 法、桥法均 可使用，灵

敏度以 桥法中的 复合物法最 高，特异性
 操作方 法类同单酶 标记，有

直接法 、间接法、 复合物法 之分。

间接法 与复合物法 较常采用

★ 操作举 例 淋 巴瘤轻链

κ 、 λ 的双重酶标记（双酶双底物）
(1) 石蜡切 片常规脱蜡 进水（若 用含汞
固定液 固定的组织 则需用 0.5% 碘的乙
醇溶液 脱汞 5min ，乙醇浓度 为 70 ％，
经自来 水洗后，以 2.5% 硫代硫 到钠浸
洗 1min ，水洗 ) ；

(2)0.3% H2O2 甲醇液 浸泡切片 30min, 自

来水洗 ，蒸馏水洗 , 入 PBS(0.01mol/L

(3) 滴加正 羊血清 1:10 ，湿盒， 室温，

10min ，不洗；

(4) 加一抗 ( 抗人 κ PcAb 与抗人 λMcAb

的混合液 )1:200 ，湿盒， 37℃ ， 45min

或更长；

(5)PBS 液， 5min×3
(6) 加二抗 (GARG ＋ GAMG 混合液
1:200) ，温盒， 37℃ ， 30min ；

(7)PBS 洗， 5min×3;

(8) 加酶抗 酶抗体复合 物 ( 兔 PAP ＋鼠

APAAP 混合液 1:100) ，湿盒，
37℃ ， 30min ；

(9)PBS 洗， 5min×3 ；
(10) 过氧化物酶显色 反应：以 DAB
H2O2 液显色 7 ～ 10min( 镜下控制显色
程度 ) ， PBS 洗， 5min×3 ；

(11) 硷性磷酸酶显色 反应：以萘 酚

AS.MX 及坚固蓝 (fast blue) 显色 10 ～
15min( 镜下控制显 色程度 ) ， PBS 洗、
自来水 洗；

(12) 缓冲甘油封片， 光镜下观察

注：若 为同种动物 抗血清，可分 别进

行标记 染色，其间 应经多聚甲醛 蒸气

处理 4h 或用 pH2.2 的甘氨酸 --- 盐酸

溶液处 理 2h ，以避 免彼此的交 叉反

应。
兔 PAP P A 鼠 APAAP
P P A A

GAR IgG GAM. IgG

兔抗 K 鼠抗 人

Ag
κ λ
图 2 双酶双 底物 ( 复合物法 ) 双重酶 标染色
原理
★ 其它双 重标记法

1. 免疫荧 光法与免疫 酶法联合应用 ( 先

酶标

后荧光 )

2. 免疫荧光法 与免疫金银 法联合应用

(先

免疫金银标 记后荧光标 记 )
3. 免疫酶法与免疫 金法联合应 用 (20nm,
红

色不宜 用银液放大 ，吸附干扰 )

4. 免疫金银法与免 疫酶法联合 应用 ( 对
比明

显)
三、电 镜下的双重 及多重免疫 标记

电镜下 的双重免疫 标记染

色不是 靠颜色区分 ，而是靠标 记物的
不同电 子密度或颗 粒的不同大 小来区
别不同 抗原，有别 于光镜下的 双重免
疫标记 方法。
 常用的 方法多为双 重免疫金 标记

优点： 高电子密度 ，分辨 率高，抗

原定

位精确，颗 粒大小可
人工控 制，

标记试剂易 制备。

缺点： 试剂 质量要求高 ，非特异吸 附

 类型有 直接法、间 接法（异

种动物 抗体或同种 动物抗体） ---- 双面

染色， 分步固定。 标记用的胶 体金颗粒

，直径 多采用 5nm, 15nm 组合 ，标记不

同类别 抗体 ( 特异 性一抗 --- 直接法，

间接抗 体 --- 间接法 ) 。

 应用直 接法进行多 标，简便

、快速 、准确、效 果佳，尤 多用于细胞

表面抗 原的双重或 多重标记 。

缺点： 敏感性较低 ，金标抗 体纯度要求

高。
 金标抗 体双重抗原 标记常用
间接法 显示，且多 采用异种 动物抗体混
合同步 操作。

优点： 敏感性提高 ，操作步 骤减少

缺点： 标记二抗质 量要求高 ，背景染色

深。

可通过 采用固相吸 附或过量

二抗封 闭，或用多 聚甲醛蒸 气处理，使
 举例： 垂体组织生 长激素
(GH) 和促肾上腺 皮质激素 (ACTH) 双重
免疫电 镜染色 ( 间接法 )---- 分步固定 。

(1) 取新鲜垂体腺瘤 组织 1mm3 ，蒸馏

水洗， 不经饿酸固 定，常规 酒精脱水，
用 Lowicryl k4M 包埋，超薄 切片厚
40nm ，置无 支持膜的镍 网上；
 (2) 以 0.05mol/L TBS(pH7.4 含
1 ％ Triton X-100 ，下同 ) ，浸洗
5min ；

(3) 加入 1 ％ HSA 5min ；不洗 ；

(4) 以兔抗 ACTH 血清 (1:200) 孵育，

4℃ ， 20h ，室温下 2h ， TBS 洗，用
上述一 抗重复孵育 1 次， TBS 喷射冲
洗，然 后浸洗 10min ， 3 次， TBS
 (5)0.02mol/L TBS (pH8.2) 浸洗 5min ；

(6)1 ％ HSA 孵育 5min ，不洗；再以

5nm 胶体金标 记的羊抗 兔， IgG 孵育
10min ； 0.02mol/L TBS (pH8.2) 喷射冲
洗， 0.05mol/L TBS (pH7.4) 冲洗及 浸洗
，时间 同前；
 (7) 蒸馏水 浸洗后，空 气中干燥；

(8) 置盛有 多聚甲醛粉 末的密闭容

器内， 80℃ 温箱 中以多聚甲 醛蒸气

处理 1h ，冷却取出 ，入蒸馏水 ，换

洗 2 次。
 (9) 再按 (4)----(8) 步骤作第二 重抗原染
色，这 次一抗用鼠 抗 GH 单克隆抗体
(1:400) ；二抗 用 15nm 胶体金标记的羊
抗鼠 IgG ，在二抗孵育并 清洗后，入
2 ％的戊 二醛及 3 ％多聚 甲醛的 TBS
(pH7.4) 溶液中固定 30min ，经蒸馏水
换洗 3 次，再以 1 ％醋酸铀和 构橼酸铅
作常规 电子密度的 染色。
(10) 电镜观察

结果：见 ACTH 细胞和 GH 细

胞的分 泌颗粒分别 被 5nm 和 15nm 的胶

体金颗 粒所显示， 除很少量背 景染色外

，标记 位置精确， 无交叉重叠 与弥散现

象。
四、注 意事项

1. 标记染 色的顺序 确定需视组 织标

记抗原 的性质，量 少、脆弱先 标记，量

多、耐 受后标记。
2. 结构保存与抗原 保护并重 ，一般忌用

饿酸后 固定， PG 固定液 中的戊二醛

(G) 浓度不宜超过 2 ％。

3. 严格操作步骤， 洗涤需彻 底，洗涤用

的 TBS 中需加入 1 ％ Triton×100 或

Saponin 。
4. 保证试剂的清洁 度与纯度 ( 双蒸水，

亲和免 疫层析 ) 。

5. 封片剂选择应注 意显色剂 的溶解特性

，一般 多采用水 封片 (10% 缓冲甘

油 ) ，保存时间 不长，应及 时观察记录

结果。