陈宇萍等 　大容量人源噬菌体抗体库的构建 　第 5 期 ・463・

①
大容量人源噬菌体抗体库的构建
② ②
陈宇萍 　张国民 　乔媛媛 　王 　刚 　刘玉峰 　化 　冰 　王 　琰 　 (海军总医院中心实验科 ,北京 100037 )

　　中国图书分类号 　R392112 　　文献标识码 　A 　　文章编号 　1000 2484X( 2006) 05 20463 204

[摘 　要 ] 　目的 : 构建大容量易于改造成 D iabody的噬菌体单链抗体库 ,筛选人源性抗体 。方法 : 从正常成人外周血和新
生儿脐血中分离淋巴细胞提取 RNA ,经 RT2PCR 扩增轻重链可变区基因 ( VL 和 VH ) ,通过重叠 PCR ( over2lap PCR ) 将 VL 和
VH 拼接成单链抗体 ( ScFv)基因 (其中 VH 两侧是两个非同源的 loxp 基因 ) ,并克隆入噬菌体表达载体 PDF,得到初级噬菌体
抗体库 。将初级抗体库以高 MO I超感染 Cre +菌株 BS1365,通过 loxp 2cre定位重组系统 ,介导轻重链在菌内重组配对 ,然后低
感染 XL1 2B lue菌 ,得到大容量的次级抗体库 。以多种不同抗原对库进行筛选 ,得到多样性较好的特异性抗体 。结果 : 经超感
染重组 ,得到 112 ×1010的大容量抗体库 。经三种蛋白抗原筛选 ,均得到多株特异性较好的噬菌体抗体 ,并成功构建为活性较
好的 D iabody。结论 : 经 Loxp 2Cre定位重组系统在单细胞内重组 ,能够高效地构建大容量噬菌体单链抗体库 。
[关键词 ] 　噬菌体展示 ; 抗体库 ; Cre重组 ; 单链抗体

Establishm en t of large phage an tibody library

CHEN Yu 2P ing, ZHAN G Guo2M in, Q IAO Yuan 2Yuan, WAN G Gang, L IU Yu 2Feng, HUA B ing, WAN G Yan. Cen tra l
L abora tory of N avy Hospita l, B eijing 100037, Ch ina

[ Abstract] 　O bjective: To create a large human phage antibody library from which easy to get diabody and select human anti2
body clones. M ethods:VL and VH genes were amp lified by RT2PCR from RNA which came from normal adult peripheral blood and
new 2born cord blood lymphocytes. VL and VH genes were reamp lified to add a region of overlap in the ScFv linker to form ScFv genes
in which VH genes were flanked by two non 2homologous loxp sites. The ScFv genes were cloned into PDF to obtain a p rim ary library.
This p rim ary library was used to infect bacteria B s1365 ( exp ressing cre recombinase) w ith high multip licity of infection (MO I) 200 ∶
1.
This p rocedure resulted in a very large phage antibody library through VL and VH recombined by the cre recombinase. Follow ing re2
combination, phagem ide were derived from these bacteria and used to infect bacteria not exp ressing cre ( XL1 2B lue ) atMO I < 1 to cou2
p le phenotype and genetype, then the library was tested by selection on a number of different p rotein antigens. Results:A 112 ×10
10

phage antibody library was created by cre 2loxp mediated recombination. Antibodies were obtained against all three different p rotein anti2
gens and specifically recognized their antigens. A functional diabody was constructed successfully. Conclusion: It is efficient way in
creating very large phage ScFv library using loxp 2cre mediated recombination in single bacteria cell.
[ Key words] 　Phage disp lay; Antibody libraries; Cre recombinase; Single 2chain Fv ( ScFv)

　　噬菌体抗体库是 90 年代抗体工程领域的重大 用单载体细胞内重组的方法 , 成功地构建了大容量

进展 ,它已成为人源单抗研制的重要途径 。一个好 单链抗体库 , 有效率高 。本实验拟在 Sblattero 方法
的抗体库需具备大容量和良好的多样性 。长期以来 的基础上加以改进 , 构建具有广阔应用前景的大容
构建大容量抗体库一直是一个难题 。Loxp 2cre 重组 量抗体库 。
体系 ,是由 C re 蛋白介导的定位重组 ,重组位点 loxp
由 34 bp 的核苷酸组成 ,两端是 13 bp 的反向重复序 1 　材料与方法
[1] [2]
列 ,中间有 8 bp 的间隔 。 1994 年 Griffiths等 首 111 　菌株和载体 　大肠杆菌 XL1 2B lue, B S1365 (可
先将 loxp 2cre 定位重组系统应用于构建大容量抗体 表达 C re 蛋白 ) 和辅助病毒 VCSM13 由本室保存 。
库 ,他们应用双载体 ,经过 VL 和 VH 的重组配对 ,构 表达载体 PDF为在 pDNA5 基础上改建 。
建大容量抗体库 。这种双载体法有效率较低 , 未能 112 　主要试剂 　抗原 : 卵清蛋白 ( OA ) 和胃蛋白酶
[3]
得到广泛的应用 。 2000 年 Sblattero 等 报道了利 ( PEP )购自华美公司 。角蛋白 ( keratin ) 由研究生王
楠提供 。人淋巴细胞来自健康成人外周血和新生儿
①本课题受国家 863 计划 (2001AA215361)和博士后基金 (2004)资助
②第四军医大学西京医院皮肤科 ,西安 710032
脐血 。
作者简介 : 陈宇萍 ( 1964 年 - ) ,女 ,博士后 ,副研究员 ,主要从事基因 113 　主要引物 　用于 over2lap的两个引物 : 5 ′
2GGAG
工程抗体研究 。 GGTCGACCATAACTTCGTATAATGTATACTATACGA
 ・464・
AGTTATCCGGAGGCGGTACC 23 ′ 2GGATAACTTC
和 5′
GTATAGTATACATTATACGAAGTTATGGTCGACCCT
CCGGAAC 23 ′
。
114 　RT2PCR 扩增可变区基因 　收集 6 名健康成
人外周血及 10 例新生儿脐血 , 分离淋巴细胞 , Trizol
常规提取总 RNA。以 RNA 为模板进行逆转录合成
cDNA ,然后分别 PCR 扩增轻重链可变区基因 VL 和
VH ,回收备用 。
115 　ScFv 基因的获取 　将获得的不同亚群的 VL
和 VH 用外延引物进行二次 PCR , 加入相应酶切位
点及可重叠序列 ,然后进行重叠 PCR ( over2lap PCR )
将 VL 和 VH 拼接成 ScFv基因 ,纯化回收 。
116 　表达载体构建及初级抗体库的获得 　将载体
PDF 和 ScFv基因分别经 B ssH Ⅱ +Nhe Ⅰ消化后进
行连接 ,并电穿孔转化 XL1 2B lue 大肠杆菌 , 获得初
级噬菌体抗体库 。
117 　大容 量抗 体库 的获 取 　以 噬 菌 体 ∶
细菌 =
200 ∶1 的比例 (MO I = 200 ) , 将初级抗体库超感染
BS1365 细菌 , 37 ℃水浴 1 小时 , 使多副本噬菌体载
体进入同一细胞 , 加 SB 培养液震荡至 OD = 015 左
右 ,加入 VCSM13 诱导 , 30 ℃培养过夜 , 次日收集噬
菌体抗体库 ,测库滴度 。再以 MO I < 1 的比例 ,用回
收的超感染抗体库感染对数生长期的 XL1 2B lue 菌 ,
VCSM13 诱导 , 30 ℃过夜 ,次日收集上清 , PEG沉淀 ,
获得大容量重组噬菌体抗体库 。
118 　噬菌体抗体库的筛选 　抗原以 80 ～100 μg/m l
包被抗原管 , 4 ℃过夜 , 次日 215%脱脂奶粉 37 ℃封
闭 2 小 时 , 加 1 m l 噬 菌 体 抗 体 库 , 37 ℃ 2 小 时 ,
0105% tw een PB S洗 ,然后用两种方法回收结合于固
相的噬菌体抗体 。首先加 1 m l 新鲜 XL1 2B lue 菌 ,
37 ℃ 15 分钟 ,转入液体培养基 ; 然后再加入 1 m l洗
脱液 ( 011 mol/L 甘氨酸 2B SA 洗脱液 , pH 212 ) 37 ℃
15 分钟 , 40 μ l 2 mol/L Tris中和 , 加入 10 m l XL1 2
B lue菌感染 , 37 ℃ 15 分钟 , 转入液体培养基 。菌液
取少量铺盘测定 CFU , 其余 M13 诱导过夜 , 次日回
收沉淀 ,进行下一轮筛选 。 3～4轮后挑取克隆鉴定。
119 　噬菌体抗体的鉴定 　从筛选 3 ～4 轮的培养盘
中挑取集落 , 培养诱导 , 取上清以 EL ISA 方法进行
抗体特异性结合性能鉴定 : 抗原包被 EL ISA 板 , 以
215%脱脂奶粉 2PB S 封闭非特异结合部位 , 37 ℃ 1
小时 ,加待测上清 50 μ l/孔 , 37 ℃ 1 小时 ; 以 HRP 2抗
M13 为二抗进行结合反应 ,以底物邻苯二胺 OPD 显
色 ,测定 A490 OD 值 ,以 t检验进行统计学分析 。
1110 　可变区基因 DNA 指纹分析 　以筛选到的阳
性克隆为模板 , PCR 扩增 ScFv基因 , 以限制性内切
中国免疫学杂志 2006 年第 22 卷
酶 M va Ⅰ消化 , 然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳 , 根
据电泳情况分析基因的多样性 。
2 　结果
211 　重叠引物设计及载体构建 　为了将 VL 和 VH
拼接为 ScFv 基因 , 设计 linker重叠引物 , 其中包括
loxP511 重组位点 ,使 VH 在 C re +的菌中可与 VL 发
生重组配对 ; 另外尚包括两个 Acc Ⅲ切点 , 以利于
ScFv制备 D iabody时形成短 linker。构建的 ScFv表
达载体见图 1。
212 　初级噬菌体抗体库的获取 　将以上构建质粒
载体电穿孔转化 XL1 2B lue, 取少量细菌按一定比例
5
稀释后铺盘 ,次日计数集落 ,测定库容为 7 ×10 , 挑
取 20 个集落 ,限制性内切酶消化鉴定 , 库的连接正
确率 55% 。其余细菌液体培养基培养 , M13 诱导过
13
夜 ,次日收集上清沉淀 , 测定滴度为 2 ×10 和 1 ×
13
10 (两个初级库 ) 。
213 　大容量重组噬菌体抗体库的获取及鉴定 　初
级噬菌体抗体库 200 μ l (含噬菌体颗粒 4 ×10 ) 感
12
10
染 20 m l BS1365 菌 (含菌 4 ×10 ) ,MO I = 100 ∶1,通
过 Cre 2loxp 介导的定位重组系统 , 使多个轻重链在
同一个菌中进行重组互换 ,液体培养基中增殖诱导 ,
得到重组库滴度 1163 ×10 。将重组库上清以低
13
MO I (噬菌体颗粒 /菌 ≤1 ) 感染 XL1 2B lue 菌 , 获得库
容为 112 ×10 的次级大容量噬菌体抗体库 ,滴度为
10
1116 ×10 。随机挑取 100 个克隆 , 限制性内切酶
13
消化电泳鉴定 , 99 个克隆均放出 1 000 bp 左右带 ,
库的有效重组率为 99% ,见图 2。
214 　抗体库的筛选 　以角蛋白 、
胃蛋白酶 、
卵清蛋
白为抗原 ,分别对抗体库进行筛选 。筛选过程均见
到明显的富集现象 , 从第 3、4 轮回收的盘中挑取克
隆进行抗原特异性分析 ,结果见表 1,三组均筛到了
特异性结合的抗体 。每组挑取 36 个集落 ,其中抗角
蛋白有 29 个特异性结合的克隆 ,抗胃蛋白酶有 6 个
特异性结合的克隆 , 抗卵清蛋白筛到 4 个特异性结
合的克隆 。
215 　抗体基因 DNA 指纹分析 ( Finger p rints) 　为
证实所获抗体基因的多样性 , 我们对上述特异性结
合的抗体克隆质粒进行了 DNA 指纹分析 。可变区
基因消化后聚丙烯酰胺凝胶电泳 , 结果三种抗原均
获得 了 不 同 的 可 变 区 基 因 。图 3 显 示 部 分 克 隆
DNA 指纹电泳结果 (抗角蛋白 ) ,箭头处显示不同基
因而出现的不同图形 。其他克隆 DNA 指纹电泳结
果未显示 。
216 　功能性 D iabody 的构建 　从抗角蛋白抗体中
陈宇萍等 　大容量人源噬菌体抗体库的构建 　第 5 期 ・465・

选一个克隆提质粒 , Acc Ⅲ消化后自连 , 转化 XL1 2

B lue,提质粒酶切及序列测定核实为短 linker后 , 诱
导取上清进行抗原结合特异性分析 , 并与原克隆比
较 ,结果见表 2,其结合活性保持不变 , ScFv的 linker
由原长变为 5 bp 后 (可能抗体分子多数以 D iabody
形式存在 ) 活性保持不变 , 推测形成了功能性 D ia2
[ 4 26 ]
body,进一步的工作仍在进行中 。

图 3 　D NA 指纹 (抗角蛋白部分克隆 D NA 指纹电泳结果 )
F ig13 　D NA f in ger 2pr in t( partly clones of an ti2kera tin )
Note: 2, 5 shows different genes.

图 1 　ScFv表达载体图
F ig11 　ScFv expression vector
3 　讨论

传统的抗体制备 , 包括杂交瘤 2单 克隆抗体技

术 ,均需首先用抗原对机体进行免疫 ,所获抗体的性
能取决于体内免疫的有效性 。因此弱抗原 、 自身抗
原、 具有毒性的抗原的抗体以及人源性抗体的制备
均比较困难 。噬菌体抗体库技术模拟了体内抗体生
成过程 ,提供了不经免疫制备抗体的可能 ,以渐成为
制备人源抗体的重要手段之一 。一个好的抗体库需
具备大容量和良好的多样性 。目前库容主要受大肠
杆菌 转 化 率 的 限 制 , 用 最 有 效 的 电 穿 孔 法 , 1 μg
6 7
DNA 连接反应物可获得 10 ～10 左右库容 。经适
8
图 2 　电泳图 当努力一 般可 构建 10 左 右的 抗体 库 , 与 体内 的
F ig12 　Electrophoretogram repertoire大小相仿 , 但考虑到构建过程中 PCR 扩
Note: M 1Marker; O thers are clones digested by H ind Ⅲ + Nhe Ⅰ, 1 000 增、
半合成寡核苷酸的引入等因素产生的重复克隆
9
bp band were seen.
及无效克隆 ,其有效克隆要小得多 。欲得到 10 以
表 1 　抗 3 种抗原抗体的筛选及鉴定结果
上的抗体库就需通过增加转化次数来增加库容 , 工
Tab11 　An tibody selection and iden tify of 3 an tigen s [7]
作量很大 。如 Vanghan 等 经过上百次的电穿孔
Antigen Analyzed clones Specific clones
转化获得了 114 ×10 的抗体库 ,然而通过这样大工
10

Keratin 36 29
作量获得的抗体库却是有限的资源 , 因为随着抗体
PEP 36 6
库的扩增将不可避免地减少其多样性 , 这使得大容
OA 36 4
量抗体库的构建难以广泛开展 。本实验通过 Cre 2
loxp 定位重组系统增加轻链可变区和重链可变区的
表 2 　EL ISA 法测定 D ia body抗角蛋白活性 ( A490 ) 组合配对是一个有效构建大容量抗体库的途径 。我
Tab11 　B in d in g of d ia body to kera toprote in determ in ed by 们采用的是 Sblattero 报道的单载体细胞内重组法 ,
5
EL ISA ( A490 ) 初级抗体库库容为 7 ×10 , 轻重链随机重组配对后
次级库库容为 112 ×10 ,再次重组后抗体可具有不
10
D iabody Control

Clone 1 Clone 2 P N 同的多样性 。实验中所筛 3 种抗原 ,均得到了 2 ～6

A490 (OD) 1172 ±0103 1174 ±0104 1175 ±0105 0101 ±0100 种不同基因的特异性抗体 。
Note: P1Anti2keratop rotein scFv, as positive control; N 1Anti2RBC dia2 D iabody是一种形成双价 、
双特异小分子抗体的
body, as negative control; T test1 P < 0105. 有效方法 ,制备简单 ,可直接大肠杆菌表达 ; 无 Fc 片
段 ,可消除由 Fc 带来的不利影响 ,如旁杀伤效应 ,细
 ・466・ 中国免疫学杂志 2006 年第 22 卷

胞因子释放综合征等 ; D iabody 的分子量与 Fab 一 18: 74 280.

样 ,为 IgG的 1 /3,易于穿透组织 ,易从血清中清除 ; 4 　Holliger P, Prospero T, W inter G. “D iabodies”: small bivalent and

分子量比 ScFv大一倍 ,在组织中滞留时间及血清半 bispecific antibody fragments [ J ]. Proc Natl Acad Sci USA , 1993;
90: 6444 26448.
衰期相对较长 ,在一些临床应用中具有其特殊优势 。
5 　Lawrence L J, kortt A A , Iiades P et a l. O rientation of antigigen
另外 D iabody的短 linker 与 ScFv 的长 linker 相比 ,
binding sites in dim eric and trim eric single chain Fv antibody frag2
具有较强的抗蛋白酶消化作用 。可制备双特异 D ia2
[8] ments [ J ]. FEBS Letters, 1998; 425: 479 2484.
body,具有广阔的应用前景 。本研究所构建抗体
6 　陈宇萍 ,王 　琰 ,王雅明 et al. 抗红细胞双价小分子抗体的构建及
库载体可方便地制备 D iabody,这为其应用提供了更
表达 [ J ]. 中华微生物学和免疫学杂志 , 1997; 17 ( 3) : 231.
好的前景 。
7 　Vanghan T J, W illiam s S C, Pritchard K et a l. Human antibody w ith
subnanomolar affinities isolated from a large nonimmunized phage dis2
4 　参考文献
p lay library [ J ]. Nat B iotechnol, 1996; 14: 309 2314.
1 　Hoess R H, Abrem ski K. Interaction of the bacteriophage P1 recombi2 8 　 Holliger P, Manzke O , Span M et a l. Carcinoembryonic antigen
nase Cre with the recombining site loxP [ J ]. Proc Natl Acad Sci ( CEA ) 2specific T2cell activation in colon carcinoma induced by anti2
USA , 1984; 81 ( 4) : 1026 21029. CD3 ×anti2CEA bispecific dabodies and B7 ×anti2CEA bispecific fu2
2 　Griffiths A D , W illiam s S C, Hartley O et a l. Isolation of high affinity sion p roteins [ J ]. Cancer Res, 1999; 59: 2909 22916.
human antibodies directly from large synthetic repertoire [ J ]. EMBO
J, 1994; 13: 3245 23260.
[收稿 2004 209 229 　修回 2004 211 222 ]
3 　Sblattero D , B radbury A. Exp loiting recombination in single bacteria
(编辑 　许四平 )
to make large phage antibody libraries [ J ]. Nat B iotechnol, 2000;

(上接第 458 页 )
减轻由于充血 、 水肿等炎症反应导致的局部皮损厚 一步的研究 。
度及重量的增加 ,且两实验组间的抗炎作用也有显
4 　参考文献
著性差异 ( P < 0105 ) ,并与给药剂量相关 。 ( 3 ) 与阴
性对照组相比 ,两实验组虫草素溶液对小鼠脾指数 2脱 氧腺苷的超导核磁共振与红外
1 　陈顺志 ,诸景芝 . 虫草素及 2 ′
的影响未见明显差异 (均为 P > 0105 ) , 未见到三组 光谱鉴别 [ J ]. 中国抗生素杂志 , 1996; 21 ( 1) : 9 212.
脾脏组织间病理变化的差异 。由此可以推测虫草素 2 　李 　婧 ,姜汉英 . 虫草素的体内代谢特点及药理作用 [ J ]. 国外

进入体内以间隔 24 小时的给药方式是可以以剂量 医学 ・中医中药分册 , 2005; 27 ( 5) : 283 2285.

相关的方式表现出生物活性的 , 即抑制迟发型超敏 3 　尤立平 , 刘永生 , 刘东玉 . 皮炎煎剂对小鼠实验性接触性皮炎的

反应所致的炎症病理改变 ,同时 ,对于炎症反应时的 疗效及作用机理研究 [ J ]. 北京中医药大学学报 , 2004; 27 ( 6) :

脾脏增生没有明显影响 ,无毒性作用 。此外 ,迟发型 50 254.

4 　陈顺志 , 刘 　毅 , 陈 　野 et al. 虫草素的紫外与红外光谱特征
超敏反应主要是 T细胞介导的免疫应答 , IL 22、IL 210
[ J ]. 中国生化药物杂志 , 1996; 17 ( 1) : 18 220.
等众多细胞因子参与该过程 。目前大量研究发现
5 　Fernandez2Noval A , Leroy F. 3 ′
2deoxyadenosine and imp lantation of
IL 210 不仅强烈抑制 Th1 型淋巴细胞和单核细胞的
delayed blastocysts in m ice [ J ]. J Endocrinology, 1979; 81: 351 2
功能 ,而且减少炎性介质和前炎症细胞因子的产生 。
[6] 354.
Zhou 等 进行体外实验证实虫草素能明显促进人
6 　Zhou X X, Claudius U M , Peter S et al. Effect of cordycep in on inter2
外周血单个核细胞释放 IL 210, 同时抑制 PHA 诱导
leukin 210 p roduction of human peripheral blood mononuclear cells
的 IL 22 产生及外周单个核细胞的增殖 。结合本实
[ J ]. European J Pharmacology, 2002; 453: 309 2317.
验结果推测虫草素在体内有可能通过增强 IL 210 及
抑制 IL 22 的分泌对自身免疫性疾病 , 炎性疾病发挥
[收稿 2005 211 230 　修回 2005 212 208 ]
潜在的治疗作用 ,使机体免受过度的病理损伤 ,但其
(编辑 　徐 　杰 )
具体作用的分子机制及其他作用途径仍然有待于进