四川 大 学 学 报 ( 医 学 版 )

　2005; 36 ( 1) : 20 23　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
J S ichuan Un iv (M ed Sc i Ed i)

抗人 A FP 单链抗体基因的构建和在大肠杆菌中的表达3

张　平, 蔡美英, 赵宗蓉, 魏大鹏, 黎　光, 毕建虹

四川大学华西基础医学与法医学院 免疫学教研室 ( 成都 610041)

　　【摘要】　目的　构建抗人 A FP 单链抗体 ( ScFv) 的基因并转入大肠杆菌 BL 221 (D E3) 中诱导表达。 分离纯化

ScFv 并鉴定其生物活性。方法　用 R T 2PCR 方法从能分泌特异性抗人 A FP 单克隆抗体的杂交瘤细胞中分离纯化
抗体 V H 和 VL 基因。用重叠延伸 PCR 方法将 V H 和 VL 拼接在一起, 构建抗人 A FP 单链抗体的基因。将 ScFv 基
因克隆至 p GEM 2T 载体构建, 用限制性内切酶切以及测序鉴定。将 ScFv 基因连接到 p ET 32 (a + ) 质粒, 转化 BL 221
(D E3) 细菌。 抗性生长的克隆用异丙基硫代2Β2D 2半乳糖苷 ( IPT G ) 诱导 4 h。 溶解细菌并纯化 ScFv, 通过 SD S 2
PA GE 电泳及竞争抑制 EL ISA 实验检测其活性。结果　获得的 V H 含 339 bp , 来自小鼠 IgG Χ链, VL 含 312 bp , 来
自小鼠 ϑ链。V H 和 VL 通过编码 ( G4S ) 3 连接肽的 45 bp 序列连接在一起构成含 696 bp 的 ScFv 基因。BL 221
(D E3) 中表达的 ScFv 抗体与融合蛋白 (T rxA ) 融合在一起并以包涵体的形式存在。T rxA 2ScFv 相对分子质量约 40
× 103 , ScFv 相对分子质量约 24 × 103。 竞争 EL ISA 实验显示: T rxA 2ScFv 可抑制 41% 的 M cA b 与抗原结合, 而
ScFv 抗体则可抑制 53% 的M cA b 与抗原结合。结论　我们成功构建了由 696 个碱基组成的抗人 A FP 单链抗体的
基因, 并在大肠杆菌获得了高效表达。 该单链抗体具有较高的抗原结合活性。
【关键词】
　ScFv 基因　构建和表达　ScFv 活性
【中图分类号】
　R 392. 12

Con struction and Expression of An ti- human AFP ScFv Gene in BL - 21 (D E3 ) E. coli 　 ZHAN G P in g , CA I M e i2
y in g , ZHAO Zon g 2ron g , W E I D a 2p e n g , L I Gua n g , B I J ia n 2hon g. 　D ep a rtm en t of Im m unology , W est C h ina
S chool of P reclin ica l and F orensic M ed icine, S ichuan U n iv ersity , Chengdu 610041, Ch ina
【 Abstract 】　 O bjective 　 To con struct an ti2hum an A FP sing le cha in fragm en t va riab le ( ScFv ) gene,
tran sfo rm it in to BL 221 (D E3) E. coli fo r exp ression, and iden tify its b ioactivity. M ethods　V H and VL genes of
an ti2hum an A FP m onoclona l an tibody w ere cloned by R T 2PCR from hyb ridom a. T he ScFv gene w a s sp liced by
sequence overlap ex tend ing ( SO E ) PCR , and then it w a s liga ted in to p GEM 2T vecto r to be iden tified by
endonuclea se d igestion, PCR and sequencing. ScFv gene w a s cloned in to p ET 32 (a + ) vecto r and tran sfo rm ed in to
BL 2 21 (D E3 ) E. coli. T he po sitive clones w ere screened ou t by IPT G induction, and the ScFv an tibody w a s
p u rified to be iden tified by SD S 2PA GE and com p etitive inh ib ition EL ISA test. Results　T he V H DNA con sisted of
339 ba ses, com ing from the m ou se IgG Χ cha in. T he VL DNA con sisted of 312 ba ses, com ing from the m ou se IgG
ϑ cha in. T he V H and VL genes w ere sp liced by 45 ba ses cod ing a (G4S ) 3 flex ib le linker. T he ScFv gene con sisted
of 696 ba ses. T he ScFv an tibody exp ressed by BL 221 (D E3 ) fu sed w ith T rxA tag p ro tein and fo rm ed inclu sion s.
T he rela tive m o lecu la r m a ss of T rxA 2ScFv fu sion p ro tein is abou t 40×10 and tha t of ScFv is abou t 24×10 . T he
3 3

ScFv an tibody ha s excellen t activity tested by com p etitive inh ib ition EL ISA , the T rxA 2ScFv cou ld inh ib it abou t
41% of the M cA b to b ind an tigen and ScFv cou ld inh ib it abou t 53%. Conclusion 　W e have successfu lly
con structed an an ti2hum an A FP ScFv gene w ith 696 ba ses; it can exp ress in BL 221 w ith h igh activity.
【Key words】
　　ScFv gene 　　Con struction and exp ression 　　ScFV activa tion

　　 近 年 来, 单 克 隆 抗 体 (m onoclona l an t ibody, 　　甲胎蛋白 ( a lp ha fetop ro tein , A FP ) 是一种重

M cA b ) 在临床疾病的诊断和治疗中发挥越来越重 要的肿瘤相关抗原。目前 A FP 是原发性肝癌诊断和
要的作用, 但目前所使用的单克隆抗体绝大部分是 生物治疗的一种重要的靶抗原。研究显示: 其由肝癌
鼠源性的, 使用后会发生人抗鼠抗体反应等毒副作 细胞分泌, 又可促进肝癌细胞生长, 在 97% 的肝癌
用。随着抗体在临床应用的增多, 其毒副作用引起了 细胞表面有 A FP 的表达[ 1 ]。 抗 A FP 的单链抗体
科学工作者的广泛关注。对抗体进行改造非常必要。 ( sing le cha in fragm en t va riab le, ScFv ) 进入体内后
可与 A FP 结合, 加速 A FP 的清除, 降低 A FP 对肝
3 四川省科技基金和四川大学青年基金资助 癌细胞的生长促进作用, 同时还可将125 I 标记该单链
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　J Sichuan U n iv (M ed Sci Ed i) V o l. 36 N o. 1 2005 21

抗体, 作为放射性成像诊断试剂, 用于术前肿瘤定 培养后提取质粒用 E coR g 和 X ho g 酶切及测序鉴

位, 术 后 残 留 灶 和 复 发 灶 的 监 测, 具 有 重 要 的 意 定。
义[ 2 ]。 1. 2. 4　包涵体的分离、溶解变性和复性　根据酶切
和测序鉴定结果, 取相应阳性克隆发酵、IPT G 诱导
1　材料和方法
培养, 收集细菌。用反复冻融的方法溶解。12 000×
1. 1　材料 g 4 ℃离心 20 m in。分别取上清和沉淀制备 SD S 2
杂交瘤细胞 4H 5D 1 ( 由本室制备) ; 细胞 RNA PA GE 电泳样品。沉淀用 3 m o lg
L 尿素洗涤 5 次, 纯
提 取 试 剂 盒, R T 2PCR 试 剂 盒, PCR 试 剂 盒, X ho 化包涵体。加入包涵体变性缓冲液 40 ℃孵育 1 h 溶
g , E coR g , DNA liga t ion k it ver. 2, DL 2000 解包涵体。在 2 L 的复性缓冲液中 4 ℃搅拌透析复
DNA M a rker, ΚDNA gH an d g DNA M a rker , 性 48 h, 每 24 h 更换透析液一次。再用 2 L PB S 平
IPT G, X 2Ga l ( T akaR a ) ; p GEM 2T 载体 ( 北京塞 衡 24 h。透析产物经 4 ℃, 12 000×g 离心 30 m in。
百盛) ; PET 32 ( a + ) 质粒载体, BL 221 (D E 3) E. coli 上清液用 5 0. 45 Λm 滤膜过滤, - 20 ℃保存。
( 由四川辉阳生物技术公司惠赠) ; 胶回收试剂盒, 质 1. 2. 5 　纯化和鉴定 ScFv 　将 5 0. 45 Λm 滤膜过滤
粒 纯 化 试 剂 盒 ( O ncogen ) ; PCR 仪 ( T herm o 产物送四川辉阳生物技术公司纯化。用 SD S 2PA GE
hyba id ) ; 细菌溶解液; 包涵体变性缓冲液; 复性缓冲 电泳和竞争 EL ISA 法检测 ScFv 活性 [ 5 ]。
2cggaa t tcagg t sm a rctgc2
液[ 3 ]; 引 物: A : V H ( fo r ) 5′
2　结果
ag sag tcw gg 23′
[ s: g, c; m : a, c; r: a, g; w : a, t ]5′
端
含 E coR g 酶切位点; B: V H (back ) 5′ 2accgccgga tc2 2. 1　克隆扩增的 VH、VL 和 ScFv 基因
caccaccgcccgagccaccgccacccg tgg tccct tggcc23′ ; C: 由图 1 可见, R T 2PCR 克隆获得的 V H 和 VL
VL 5 ( fo r ) 5′2gg tgg tgga tccggcgg tggcgg t tccgag 2 大约 300 bp 左右, ScFv 基因大约 750 bp 左右。
ctcacccag tct cca 23′ 2cgctcgag 2
; D : VL 3 ( back ) 5′ 2. 2　ScFv 基因的酶切和测序鉴定
ctaa t tg t t ta ty tccagct tgg tccc23′
[ y: c, t ]。 3′
端含 X ho 　　将 ScFv 基因连接到 T 载体 ( 图 2A ) 和 p ET 32
g 酶切位点 ( 北京塞百盛) 。 ( a + ) 质粒 ( 图 2B ) 后, 用 E coR g 和 X ho g 双酶切均
1. 2　方法 得到了一个 750 bp 大小的片段。 ScFv 的测序结果
1. 2. 1 　ScFv 基因的构建　 1 × 10 4H 5D 1 细胞提 7
均为:
取总 RNA , 用引物 A 和 B 配对扩增 V H , 用引物 C g tgaagctgcaggag tcaggacctgagctgg tgaagcctggagct tc2
和 D 配对扩增 VL , R T 2PCR 反应条件为: 50 ℃逆 aa tgaaga ta tcctgcaaggct tctgg t tactca t tcactggctacacc2
转录 30 m in, 94 ℃预变性 5 m in, 然后 94 ℃ 10 s, a tgaactggg tgaagcagagcca tggaaagaacct tgag tgga t tgg2
60 ℃ 10 s, 72 ℃ 10 s 30 个循环, 最后 72 ℃ 延伸 act ta t taa tcct tacaa tgg tgg tactagctacaaccagaag t tcaag2
10 m in。纯化 R T 2PCR 产物。V H 和 VL 等量混合后 ggcaaggccaca t taactg tagacaag tca tccagcacagcctaca tg2
加入 100 Λl 的 PCR 反应体系中, 94 ℃ 10 s, 58 ℃ gagctcctcag tctgaca tctgaggactctgcag tcta t tactg tgcaa2
10 s, 72 ℃ 10 s 7 个循环后, 补加引物 A 和 D 各 ga tggcaactacggctacact t t t tgctctactggggccaagggacca2
015 Λl, T ag DNA 酶 1 U , 再经 94 ℃ 10 s, 60 ℃ 10 cggg tggcgg tggctcggg tgg tgg tgga tccggcgg tggcgg t tc2
s, 72 ℃ 10 s 30 个循环后 72 ℃ 延伸 10 m in 。 cgagctcacccag tctccagcaa tca tg tctgca tctccaggggagaa2
[ 3, 4 ]

1. 2. 2 　ScFv 基因的鉴定　将 SO E 2PCR 产物纯化 gg tcacca tgacctgcag tgccagctcaag tg taag t taca tgcactg2
后连接到 p GEM 2T 载体上, 用 E coR g 和 X ho g 双 g taccagcagaag tcaggcacctcccccaaaaga tgga t t ta tgacac2
酶切, PCR 和测序鉴定。 a tccaaactggct tctggag tccctgctcgct tcag tggcag tggg tc2
1. 2. 3　ScFv 表达阳性克隆的筛选　用双酶切方法 tgggacctct tactctctcacaa tcagcagca tggaggctgaaga tgc2
将 ScFv 基因连接到 p ET 32 ( a + ) 质粒, 并转化大肠 tgccact ta t tactgccagcag tggag tag taacccg tacacg t tcgg2
杆菌 BL 221 (D E 3) [ 3 ]。所有抗性生长克隆增菌培养, aggggggaccaagctggaaa taaac
并用 0. 001 m o lg
L IPT G 诱导 4 h。收集 0. 001 L 菌 DNA 序列分析显示: ScFv 基因由 696 bp 构
液制备 SD S 2PA GE 电泳样品 。用空质粒转化菌及 [3]
成。包含 312 bp 中的 VL 和 339 bp 的 V H 和两者之
诱导前菌液作对照。经 3～ 12 g g L 凝胶电泳, 筛选具 间有 45 bp 的连接序列。V H 基因来源于小鼠 IgG Χ
有预期相对分子质量外援性蛋白表达的克隆, 发酵 链, VL 来自 ϑ链。
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 22 四川大学学报 ( 医学版) 2005 年第 36 卷第 1 期　

图 1　VH、VL 和 ScFv 基因
F ig 1　VH, VL and ScFv gene
A : V H and VL gene; B: ScFv gene; M : M arker

图 3　TrxA - ScFv 在 BL - 21 中表达

F ig 3　The expression of TrxA - ScFv in BL - 21
A : BL 221 con trast; B 2I: BL 221 that tran sfo rm ed w ith p ET 322
ScFv p lasm id; J 2O : BL 221 that tran sfo rm ed w ith p ET 32 ( a + )
p lasm id; M : P ro tein m arker

图 2　E coR g 和 X ho g 双酶切结果

F ig 2　The result of E coR g + X ho g d igested
A : p GEM 2ScFv p lasm id; B: p ET 322ScFv p lasm id. 1, 2, 4:
E coR g + X ho g d igestion; 3: DL 2000 m arker; 5: p ET 32 2ScFv
p lasm id; 6: ΚDNA g
H an d g m arker

2. 3　TrxA - ScFv 在 BL - 21 (D E3) 中的表达

与空质粒转化 ( 图 3, J 到 O 带) 和空菌对照比
较, D、F、G、H 4 个克隆有外源性基因表达。 根据迁
移率计算其相对分子质量约 40 × 103 , 空质粒表达
的融合蛋白 (T rxA ) 约 20×103 (J 和 L 带) 。
2. 4　ScFv 抗体的鉴定 图 4　SD S- PAGE 鉴定 ScFv
2. 4. 1　SD S 2PA GE 　细菌表达的 T rxA 2ScFv 融合 F ig 4　 Iden tif ica tion ScFv by SD S- PAGE
蛋白以包涵体的形式存在 ( 图 4 中 3、4 带) 。 包涵体 A : T he denatu ration and renatu ration of inclu sion; B: ScFv.
经过尿素反复洗涤后纯度较高 ( 图 4 中 5 带) , 包涵 1, 2: Sup ernatan t of bacterial lyses; 3, 4: P recip itation of bacterial

体经变性和复性处理后获得和 T rxA 2ScFv 蛋白相 lyses ( inclu sion ) ; 5: T he inclu sion w ashed in 3 m o lg
L u rea; 6, 7, 8:
T rxA 2ScFv; 9: ScFv; M : P ro tein m arker
对分子质量约 40 ×103 ( 图 4 中 6～ 8 带) , 最后纯化
获得的 ScFv 抗体相对分子质量约 24 ×103 ( 图 4 中 得到的 ScFv 组, OA = 0149, 可抑制 53% 的单克隆
9 带) 。 抗体与抗原 A FP 结合。
2. 4. 2　竞争 EL ISA 实验检测活性　以单克隆抗体
3　讨论
为阳 性 对 照, OA = 0171, 其 活 性 为 100% , T rxA 2
ScFv 组 OA = 01565, 可竞争抑制 41% 的单克隆抗 小分子抗体是继第一代多克隆抗体 (po lyclona l
体 与抗原A FP 结合 , 将T rxA 融合蛋白酶切后纯化 an t ibody, PcA b ) 和第二代单克隆抗体之后出现的
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第三代基因工程抗体的一种。 由于小分子抗体具有 232 个 氨 基 酸, 相 对 分 子 质 量 约 29 × 103。 SD S 2

分子小, 渗透性高, 易于进入组织与靶抗原结合, 无 PA GE 电泳显示: T rxA 2ScFv 大约 40×10 , 纯化后
3

HAM A R 等特点, 受到广大科技工作者的关注并成 的 ScFv 大约 24×103 , 与预期分子质量一致。

为基因工程抗体研究的热点。 T rxA 2ScFv 融合蛋白表达后在胞内形成了包
原发性肝癌是一种常见的恶性肿瘤。 目前的诊 涵体, 通过反复 10 次的冻融后细胞得到完全溶解。
断和治疗方法主要有手术、化疗、放疗、B 超和 CT 用 3 m o lg
L 尿素反复洗涤后可去除绝大部分的菌体
等。 但生物治疗和诊断仍然是最有希望彻底治疗和 蛋白, 获得具有较高纯度的包涵体。采用透析复性的
有效诊断的途径[ 6, 7 ]。A FP 是目前肝癌生物治疗和 方法可使包涵体得到良好的复性, 获得具有较高活
诊断中用得最多的靶抗原。抗 A FP 的 ScFv 在原发 性的抗体。竞争 EL ISA 实验显示, 制备的抗人 A FP
性肝癌的生物治疗和诊断中具有重要的作用[ 6 ]。 单链抗体具有较高的生物活性。
抗体的结构和功能显示, 在抗体 V 区的两端骨
参 考 文 献
架区在同种内高度保守。由于目前还未见抗人 A FP
抗体的 DNA 序列报道, 我们根据小鼠 IgG V H 和 1 王兴旺, 谢　弘. 甲胎蛋白在体外对人肝癌细胞生长的影响. 实
验生物学报, 1999; 32 (1) : 15.
VL 两端的保守序列设计两对引物, 在 V H 下游引
2 W u AM , Yazak i PJ. D esigner genes: recom b inan t an tibody
物的 5′ 端和 VL 上游引物的 5′ 端分别加入部分连接
fragm en ts fo r b io log ical im ag ing. Q J N ucl M ed, 2000; 44 ( 3) :
肽 G ly 4 Ser 3 的核苷酸序列, 两者有 18 bp 互补。通
( ) 268.
过 SO E 2PCR 可高效将 V H 和 VL 拼接在一起。 我 3 卢圣栋主编. 现代分子生物学实验技术. 第 1 版. 北京: 中国协和
们利用设计的两对引物, 经 R T 2PCR , SO E 2PCR 成 医科大学出版社, 1999: 61 477.
4 沈关心主编. 现代免疫学实验技术. 第 2 版. 湖北: 科学技术出版
功地从能分泌抗人 A FP 单克隆抗体的杂交瘤细胞
社, 2002: 41 63.
4H 5D 1 中分离出抗体的 V H 和 VL 基因, 并将两者
5 王　勇, 刘喜富. 抗人肺腺癌单克隆抗体重链和轻链可变区基因
拼 接 在 一 起, 构 建 了 由 696 bp 构 成 的 抗 人 的分离、克隆及序列测定. 遗传学报, 1996; 23 (2) : 9.
A FPScFv 基因, 与文献报道相近 。
[7 9]
6 黄建生, 郭秋明主编. 基因工程抗体. 第 1 版. 广州: 华南理工大
阳性克隆的筛选通常采用将抗性生长的克隆发 学出版社, 1997: 56 70.

酵培养后提取质粒, 分别进行酶切和测序鉴定[ 3 ]。若 7 K reb s B , R auchenberger R , R eiffert S. H igh 2th roughp u t

generation and eng ineering of recom b inan t hum an an tibod ies. J
抗性生长克隆较多, 将花费大量的时间和经费。本研
Imm uno l M ethod s, 2001; 254 (1 2) : 67.
究首先将 ScFv 基因克隆到 T 载体, 经酶切和测序 8 W h itting ton HA , H ancock J , Kem shead J T. Generation of a
鉴 定 后 再 连 接 到 表 达 载 体, 用 IPT G 诱 导, 通 过 hum an ized sing le chain Fv ( Scfv ) derived from the m onoclonal
SD S 2PA GE 电泳, 筛选具有预期相对分子质量外源 E ric21 recogn izing the hum an neu ral cell adhesion m o lecu le.

性蛋白表达的克隆, 再作酶切和测序鉴定, 大大节约 M ed Ped iatr O nco l, 2001; 36 (1) : 243.

9 任向荣, 高　辉, 粟宽源. 人源性抗 HB s 可变区单链抗体基因的
了时间和经费, 结果显示非常可靠。
构建及核酸序列测定. 生物医学工程学杂志, 2000; 17 (4) : 486.
p ET 32 ( a ) 质粒是一种原核细胞表达质粒, 带
+
(2004 03 12 收稿, 2004 05 16 修回)
有 T rxA 标记蛋白, 由 109 个氨基酸组成, 其相对分 编辑　于长谋
子质量约 13 × 103 , ScFv 基因由 696 bp 组成编码

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