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LOS CIDOS NUCLEICOS

1) Caracteres generales
1.1) Definicin Los cidos nucleicos son molculas que, como lo indica su nombre, fueron primero aisladas del ncleo de las clulas. Sin embargo, se descubri despus que existen cidos nucleicos no slo en el ncleo, sino tambin en el citoplasma de las clulas. Existen dos tipos de cidos nucleicos: - El ADN (cido desoxiribonucleico), que se localiza esencialmente en el ncleo de las clulas (cuando ste es individualizado, como en los eucariotes). - El ARN (cido ribonucleico), que se encuentra esencialmente en el citoplasma de las clulas. 1.2) Inters Es en la sntesis de las protenas, componentes fundamentales de la clula, soportes de la mayora de las actividades biolgicas, que los cidos nucleicos ADN y ARN desempean un papel esencial. De manera muy esquemtica: El ADN contiene la informacin necesaria para esta sntesis, el programa servir para dictar el orden de los aminocidos que formarn finalmente a la protena adecuada. Adems, contiene la informacin necesaria para la regulacin de la sntesis proteica. El ADN es un elemento permanente de la clula. Las informaciones que contiene sern transmitidas a los descendientes. Se dice que el ADN es el soporte de la herencia. Los ARNs permiten la ejecucin de la sntesis proteica.

1.3) Estructura Los cidos nucleicos son molculas muy largas, formadas por la repeticin de subunidades llamadas nucletidos.

2) Los nucletidos
2.1) Elementos constituyentes del nucletido Un nucletido se constituye de 3 elementos: cido fosfrico + azcar + base. 2.1.1) La base En los nucletidos, existen dos tipos posibles de bases: Las bases pirimdicas Las bases pricas
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Frmulas de las bases pirimdicas y pricas. (No se represent los tomos de C, tampoco los H unidos a los C).

Para simplificar, por convencin, cuando se representan estas frmulas, no se escriben los tomos de carbono (C), sino simplemente los tomos de nitrgeno (N). Bases pirimdicas. Las bases pirimdicas poseen: - Un ciclo pirimidina - Diversos sustitutos que van a aadirse a este ciclo.

Las bases pirimdicas (formas tautmeras C-OH).

En efecto, para cada una de estas tres bases, existe un equilibrio entre las dos formas tautmeras siguientes. Por ejemplo, para el uracilo:

Las formas tautmeras del uracilo.

A pH fisiolgico, la forma C=O predomina sobre la forma C-OH, mientras que la forma CNH2 (por ejemplo en la citosina) predomina sobre la forma C=NH. Anteriormente, se presentaron las frmulas del uracilo, de la citosina y de la timina en forma didctica, pues es ms fcil abordar las frmulas de las bases por sus formas tautmeras C-OH. Sin embargo, las 3 bases pirimdicas tendrn que ser escritas de la manera siguiente:

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Bases pricas. Las bases pricas poseen: - Un ncleo de purina - Diversos sustitutos que vienen a aadirse a este ncleo.

Las bases pricas (formas tautmeras C-OH).

La hipoxantina no pertenece a las 5 bases (A, T, C. G y U) incorporadas en los cidos nucleicos durante su sntesis.

Las bases pricas (formas tautmeras C=O). Al pH fisiolgico, la forma C=O predomina sobre la forma C-OH.

En el caso de las bases pricas, tambin es la forma tautmera C=O que, con un pH fisiolgico, predomina sobre la forma C-OH. 2.1.2) El azcar En los cidos nucleicos, se encuentran 2 tipos de azcares. Ribosa (D-ribosa). La ribosa es un azcar con cinco carbonos (C5):

La D-ribosa. No se representaron los tomos de C en 1, 2, 3, 4 as como los H unidos a estos C.

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Este nombre proviene de las iniciales del instituto que le descubri: Rockfeller Institute of Biochemistry, en Nueva-York (RIBosa). Se enumeran los tomos de carbono de la ribosa con primas para evitar confusiones con los nmeros de las bases. Desoxiribosa (2desoxi-D-ribosa). La desoxiribosa es una ribosa en la cual hace falta un OH en 2 (este OH ha sido reemplazado por un H).

La 2desoxi-D-ribosa.

2.1.3) El cido fosfrico El cido fosfrico es un tri-cido. Dos de las tres funciones cidas sern esterificadas en los ADN y los ARN.

El cido fosfrico.

2.2) Asociacin de los tres elementos constituyentes de un nucletido 2.2.1) Enlace azcar-base El enlace que une el azcar a la base es un enlace -osdico. Se forma por eliminacin de una molcula de agua entre el OH semi-aldehdico del azcar y un H de la base pirimdica (H en carbono 1) o prica (H en carbono 9). Este ensamblaje azcar-base se llama nuclesido (no confundir con nucletido).

Enlace azcar-base.

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2.2.2) Enlace H3PO4-azcar El enlace entre el azcar y el cido fosfrico es un enlace ster. Esta unin se forma por eliminacin de una molcula de agua entre: - OH de un cido: se trata aqu de un OH de H3PO4 - H de un alcohol: se trata aqu del hidrgeno de la funcin alcohol en 5 del azcar.

Enlace H3PO4-azcar.

2.3) Denominacin de los diferentes nucletidos 2.3.1) Nucletidos con base pirimdica 1er caso: el azcar es la ribosa. La regla de nomenclatura puede ser esquematizada de la siguiente manera:
B SB PSB = Base = Nuclesido: radical + idina = Nucletido: radical + idlica. Uracilo Uridina UMP (uridina monofosfato) (cido uridlico) Citosina Citidina CMP (cido citidlico) Timina Timidina TMP (cido timidlico)

2do caso: el azcar es la desoxiribosa Cuando se trata de nucletidos en los cuales el azcar es una desoxiribosa, la abreviacin del nucletido est precedida de la letra d. Ej.: dCMP = cido desoxicitidlico. 2.3.2) Nucletidos con base prica 1er caso: el azcar es la ribosa. La regla de nomenclatura, tambin puede ser esquematizada de la siguiente manera:
= Base = Nuclesido: radical + osina (S: azcar) = Nucletido: radical + lica (P: fostato) Hipoxantina Inosina IMP (inosina monofosfato) (cido inosnico) Adenina Guanina Adenosina Guanosina AMP (cido adenlico) GMP (cido guanlico)
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B SB PSB

2ndo caso: el azcar es la desoxiribosa. De la misma manera, se aade una d minscula para mencionar que se trata de un nucletido con desoxiribosa. Ej.: dAMP = cido desoxiadenlico. 2.4) Asociacin de los nucletidos en un cido nucleico 2.4.1) Enlaces entre los nucletidos En un cido nucleico, los nucletidos son ensamblados entre ellos por enlaces ster. Una molcula de agua es eliminada entre: - OH de un cido: se trata aqu de un OH de H3PO4 - H de un alcohol: se trata aqu del hidrgeno de la funcin en 3 del azcar. As, el cido fosfrico compromete dos funciones cidas en enlaces llamados fosfodister (una funcin ster sirve para formar el nucletido, la segunda para unir dos nucletidos). La tercera funcin cida de H3PO4 se queda libre y confiere as propiedades cidas a los cidos nucleicos ADN y ARN. 2.4.2) Convencin de lectura de un cido nucleico De la misma manera que, por convencin, se lee las protenas desde la extremidad NH2 hasta la extremidad COOH, existen reglas de lectura para los cidos nucleicos. En una cadena nucleica: Una extremidad contiene el grupo fosfato con dos funciones cidas libres, es llamada extremidad 5P Otra extremidad contiene un OH libre en 3, sobre el azcar, se la denomina extremidad 3OH.

Encadenamiento de varios nucletidos.

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Por convencin, siempre se leer una cadena de cidos nucleicos en el sentido 5P hacia 3OH. Para simplificar, se suele indicar sobre cada secuencia de ADN, slo las cifras 5 y 3. En el caso de un ADN circular, ya no se distinguen una extremidad 5 P con dos funciones cidas libres y una extremidad con un grupo OH libre. Sin embargo, se suele leer segn la direccin 5 hacia 3.

3) El ADN
3.1) Estructura y caractersticas del ADN 3.1.1) Los constituyentes del ADN El ADN (cido desoxiribonucleico) est formado de numerosos nucletidos unidos entre ellos por enlaces ster. Tres caractersticas son propias del ADN y lo diferencian del ARN. El azcar. Como lo indican las iniciales ADN, el azcar que entra en la constitucin del ADN es una desoxiribosa (y no una ribosa como es el caso en los ARN). Las bases. Las bases constituyentes del ADN son: A, G, C y T. Se encuentran: - Dos bases pricas: adenina (A) y guanina (G) - Dos bases pirimdicas: citosina (C) y timina (T). En el ADN, nunca se encuentra el uracilo (U), mientras que en los ARN, el uracilo reemplazar a la timina. Las dos cadenas de nucletidos. Una molcula de ADN est habitualmente formada de 2 cadenas de nucletidos, mientras que una molcula de ARN contiene una sola cadena (a excepcin de algunos virus). 3.1.2) Caractersticas de las 2 cadenas de ADN Estas 2 cadenas tienen 3 propiedades esenciales. Se dice que son: - Antiparalelas - Complementarias - Helicoidales. Antiparalelas. Antiparalelo significa que las dos cadenas de nucletidos son paralelas, pero tienen direcciones opuestas: En el ejemplo de un ADN linear: Para una cadena: en el esquema siguiente, la direccin 5 3 es de arriba hacia abajo Para la segunda cadena: la direccin 5 3 ser entonces al revs, de abajo hacia arriba.

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Lo que puede escribirse, por ejemplo:

Las 2 cadenas de nucletidos antiparalelas de un ADN.

Complementarias Reglas de complementariedad. La regla de complementariedad es la siguiente: A al frente de T C al frente de G As, si se conocen las bases de una cadena, gracias a la regla de complementariedad, se podr deducir las bases de la cadena opuesta. Por ejemplo: 5A T3 C G G C A T 3C G5 Cadena 1 Cadena 2
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Esta complementariedad entre las 2 cadenas se explica por las razones siguientes: Por razones espaciales, al frente de: - Una purina, que est constituida de 2 anillos cclicos, se encuentra obligatoriamente una pirimidina, que posee un solo anillo cclico, y recprocamente. Dos purinas (= 4 anillos cclicos en total), ocuparan demasiado espacio. Dos pirimidinas (= 2 anillos cclicos en total), estaran demasiado alejadas para formar enlaces estables. As, cada par de bases tiene la misma dimensin, lo que permite la estructura regular de la doble hlice. Por razones de enlaces hidrgeno Las bases complementarias ubicadas frente a frente estn unidas entre ellas por enlaces hidrgeno. Al frente de un grupo NH2 en C6 de una base prica, se encuentra un grupo C=O de una base pirimdica, y recprocamente, al frente de un grupo NH2 de una base pirimdica, se encuentra un grupo C=O de una base prica. As, al frente de A (6-aminopurina) se encuentra una T (4-cetopirimidina) C (4-aminopirimidina) se encuentra una G (6-cetopurina). Adems, para la pareja C-G, Al frente de un grupo NH2 en C2, se encuentra el grupo C=O en 2 de C. Nmero de enlaces hidrgeno: Son 2 para la pareja A:::T As, se nota 1 H entre 1 N (enlace covalente) y 1 O (enlace hidrgeno) 1 H entre 1 N (enlace hidrgeno) y 1 N (enlace covalente). (Se dio la vuelta a la frmula de A con respecto a la representacin usual).

Los 2 enlaces hidrgeno de la pareja Adenina-Timina.

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Son 3 para la pareja C:::G. As, se nota 1 H entre 1 O (enlace hidrgeno) y 1 N (enlace covalente) 1 H entre 1 N (enlace covalente) y 1 N (enlace hidrgeno) 1 H entre 1 N (enlace covalente) y 1 O (enlace hidrgeno). (De la misma manera, se dio la vuelta a la frmula de G). Se escogi aqu una presentacin muy esquemtica con el propsito de ensear lo ms sencillamente posible los tomos implicados en los diferentes enlaces hidrgeno.

Los 3 enlaces hidrgeno de la pareja Citosina-Guanina

En efecto, son posibles dos configuraciones sin o antidel enlace C-N que unen cada base al azcar. Es decir que una base puede ocupar dos posiciones con respecto a la desoxiribosa. En el ADN (ADN-A o ADN-B), todas las bases pricas y pirimdicas tienen la misma conformacin (anti). No obstante, en el ADN-Z, la citosina presenta una forma anti, la guanina una forma sin (ocurri una rotacin de la base alrededor del enlace glicosdico), y las conformaciones anti y sin alternan.

Las dos conformaciones sin y anti.

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Representacin esquemtica. En resumen, se puede representar una molcula de ADN de manera muy esquemtica (sin tener en cuenta la forma espacial), como una escalera donde: - Los lados estaran formados de desoxiribosas y de cido fosfrico - Los escalones estaran constituidos de bases complementarias colocadas frente a frente.

Representacin esquemtica de una molcula de A, Grupo fosfato.

La secuencia de las bases de un ADN. Es importante tener bien claro que la desoxiribosa y H3PO4 son los mismos a lo largo de un ADN. No es el caso en cuanto a las 4 bases. El orden de sucesin de las bases, la secuencia de bases es caracterstica de cada cadena de ADN. Por convencin y para simplificar, se representa una cadena de cido nucleico mencionando solamente las bases. Se puede escribir en el sentido vertical o en el sentido horizontal. Ejemplo: 5 C G 3 T A A T G C C G G C G C 3 A T 5 o 5 CTAGCGGA 3 3 GATCGCCT 5

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Sin embargo, no se debe olvidar de que se trata de hecho de nucletidos, y que estas letras significan: C: nucletido de citosina, T: nucletido de timina, A: nucletido de adenina y G: nucletido de guanina. Helicoidales. Las dos cadenas de ADN presentan en el espacio una configuracin helicoidal (como una espiral). Se enrollan alrededor de un eje central imaginario formando una doble hlice retorcida hacia la derecha. Existen varias formas de ADN en doble hlice hacia la derecha, ADN-A, ADN-B, etc. Esta clasificacin se basa en criterios fsico-qumicos: As, estos tipos de ADN difieren ligeramente por el dimetro de su hlice y por la orientacin de sus pares de bases. El ADN-B es la forma biolgicamente ms importante. Los planos de las bases son perpendiculares al eje de la hlice. Estas bases con esqueleto hidrofbico se apilan unas sobre otras con cierto desfase. Los anlisis fsico-qumicos del ADN-B fueron primero efectuados sobre fibras cristalinas: se encuentran 10 pb por vuelta de espiral. La distancia entre dos espirales que corresponden al paso de la hlice (es decir 10 pb) es de 3.4 nm. El dimetro de la hlice es de 2.4 nm.

La doble hlice del ADN.

Esta estructura del ADN fue descrita por Crick y Watson en 1953. Por este descubrimiento fundamental que ha generado tantos otros descubrimientos, recibieron en 1962 el premio Nobel de fisiologa y medicina. 3.13) Desnaturalizacin del ADN Si se calienta el ADN, se produce, a una temperatura determinada llamada de manera inapropiada temperatura de fusin, una ruptura de las uniones hidrgeno entre las bases. Se deshace la doble hlice, se separan las dos cadenas: se dice que el ADN est desnaturalizado.
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Mientras ms numerosas son las bases C:::G en el ADN, ms alta ser la temperatura de fusin. (Eso se entiende fcilmente, debido a que las bases C:::G estn unidas por 3 enlaces hidrgeno, mientras que las bases A::T estn unidas por slo 2 enlaces hidrgeno). La desnaturalizacin del ADN (la separacin de las 2 cadenas de ADN) se acompaa de modificaciones importantes de sus propiedades fsicas. Por ejemplo: - La viscosidad disminuye - La absorcin de la luz UV se intensifica - La densidad aumenta. La desnaturalizacin es reversible: cuando la temperatura baja progresivamente, las 2 cadenas de ADN pueden volver a hibridarse, es decir acercarse segn las reglas de complementariedad de las bases (renaturalizacin). As, para mantener una desnaturalizacin deseada, es preciso enfriar inmediatamente la muestra de ADN. 3.1.4) Por qu existen diferencias de estructura entre ADN y ARN? Es sorprendente constatar que el ADN y el ARN difieren finalmente por 3 elementos menores: T U, desoxiribosa o ribosa, 2 o 1 hlice(s). Cmo pueden tales diferencias justificarse en el curso de la evolucin? Por qu T en el ADN y U en el ARN?. Desaminaciones accidentales (oxidativas) hacen que la citosina (C) pueda perder espontneamente su NH2 (reemplazado por OH) y transformarse en uracilo (U), lo que ocasionara una mutacin. Afortunadamente, existen enzimas de reparacin que reconocen U. Pues U no se encuentra normalmente en el ADN, y conviertan U en C (excisin de U y reemplazo por C). As, la base T puede ser considerada en el ADN como la base correcta, y la presencia de U en el ADN debe ser considerada como un error. Si el ADN estuviera normalmente constituido de U, las enzimas de reparacin no podran distinguir los U correctos de los U provenientes de una desaminacin de la citosina. En cuanto al ARN, no se puede diferenciar un U correcto del U ocasionado por una desaminacin accidental de la citosina. Sin embargo como T requiere ms energa que U para su fabricacin (metilacin en T), y como es esencial preservar la integridad del ADN (y no la del ARN), el ARN no se ha beneficiado del mismo sistema de proteccin que el ADN. Por qu desoxiribosa en el ADN y ribosa en el ARN? Las hlices constituidas de ribosa no seran tan estables que las constituidas de desoxiribosa, debido a la presencia de 2 OH en 2 y 3 sobre la ribosa. As, la desoxiribosa confiere al ADN un elemento de estabilidad. Adems, el OH en posicin 2 de la ribosa es utilizado en la excisin de los intrones de los pre-ARNm. Por qu 2 hlices en el ADN y 1 hlice en el ARN? En una molcula de ADN, la existencia de 2 cadenas complementarias representa un respaldo de la informacin. En el caso de deterioro de una cadena, la informacin es conservada sobre la otra cadena. En cuanto al ARN, se trata de una copia entre mil otras copias.
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3.2) El ADN de los diferentes seres vivientes El ADN de todos los seres vivientes, ya sea de un animal, una planta, una bacteria o un virus, posee: - El mismo tipo de estructura, es decir 2 cadenas (excepto algunos tipos de virus) constituidas cada una de una sucesin de miles de nucletidos. Lo que difiere de una especie a otra es: El nmero de molculas de ADN en un virus o una clula: 1 molcula de ADN en los virus o en E. coli y varias en una clula animal o vegetal. Su longitud: unos miles de nucletidos o unos billones (repartidos sobre varios cromosomas). Se usa como unidad de longitud del ADN el centimorgan, equivalente a aproximadamente 1000 kb (es una longitud tal que la probabilidad de sufrir un crossingover es de 1% por meiosis). Su forma: linear o circular. Su localizacin en la clula: ADN separado o no del citoplasma por una membrana nuclear. Es esencialmente la secuencia de bases que ser caracterstica de cada molcula de ADN. Las secuencias van a desempear un papel biolgico determinante: secuencias de bases diferentes darn mensajes diferentes. 3.2.1) Los virus Los virus son los seres vivientes (si se puede considerarlos como tales pues son incapaces de reproducirse solos o efectuar sntesis) que poseen los cidos nucleicos ms pequeos. Se distinguen los virus de ADN y los virus de ARN. El ADN (de los virus de ADN) est formado con algunos miles o con algunas decenas de miles de nucletidos. 3.2.2) Los procariotes En los procariotes (ej.: E. coli), el ADN no se encuentra en un ncleo, sino en el citoplasma donde constituye el nico cromosoma. Tiene una forma circular. El trmino circular no se refiere a la forma geomtrica de la cadena de ADN, sino a su continuidad. El ADN de los procariotes es ms largo - aproximadamente mil veces ms- que el ADN viral. As, el ADN de E. coli contiene unos 4 millones de pares de nucletidos. En los procariotes, se encuentran a veces plsmidos. Los plsmidos son pequeos fragmentos circulares de ADN ubicados junto al cromosoma e independientes del ADN principal. 3.2.3) Los eucariotes En los eucariotes (seres cuyas clulas poseen un ncleo), el ADN se encuentra en el ncleo. Cada cromosoma contiene una molcula de ADN muy larga, replegada y ovillada. El nmero total de nucletidos en una clula humana es muy grande, aproximadamente mil veces ms que en el caso de las bacterias. As, el total es poco ms o menos de unos 3 billones de pares de nucletidos en las molculas de ADN que constituyen los 46 cromosomas humanos. Este ADN se asocia con protenas para formar la cromatina.
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No existe una relacin sistemtica entre la cantidad de ADN y la complejidad de un organismo. Por ejemplo, ciertos batracios, ciertas plantas tienen 30 veces ms de ADN por clula (sus cromosomas son muchos ms largos) que el humano. En los eucariotes, tambin se encuentra ADN fuera del ncleo, en las mitocondrias y en los cloroplastos. 3.3) El ADN de las mitocondrias (ADNmt) Las mitocondrias son organitos (u organelos) presentes en el citoplasma de las clulas eucariotas. Contienen esencialmente las protenas de la cadena respiratoria implicada en la sntesis del ATP. Las protenas de la mitocondria tienen un doble origen. La mayora son codificadas por el ADN nuclear, sintetizadas en el citoplasma y transportadas a las mitocondrias. Sin embargo, algunas (protenas que pertenecen a la membrana interna y desempean un papel esencial en la fosforilacin oxidativa) son codificadas por el ADN mitocondrial, pues la mitocondria posee su propia maquinara para sintetizar protenas. El ADN de las mitocondrias humanas: - Est constituido de 2 cadenas - Es circular y cerrado (16569 pb) - Codifica ARNr, ARNt y ARNm mitocondriales. Una de las 2 cadenas contiene ms genes - No contiene intrones (mientras que el ADN de las mitocondrias de levaduras s contiene) - 2 de sus genes son superpuestos, con un cuadro de lectura diferente (se trata del gen que codifica para la subunidad 8 de la ATPasa y el gen que codifica para la subunidad 6) - El cdigo gentico mitocondrial es ligeramente diferente del cdigo nuclear - La herencia del ADN mitocondrial es citoplasmtica. Un embrin hereda el ADN del ncleo del espermatozoide y del ncleo del vulo, pero tambin del ADNmt del citoplasma del vulo. No se transmiten las mitocondrias del espermatozoide. As, las mitocondrias slo son transmitidas por la madre y, cuando el ADN mitocondrial materno contiene mutaciones la cadena respiratoria puede ser perturbada (enfermedades de origen mitocondriales transmitidas por la madre). 3.4) Topoismeros y topoisomerasas 3.4.1) Topoismeros Definicin. Se llaman topoismeros a 2 molculas de ADN circulares con exactamente la misma secuencia de bases, que difieren sin embargo entre ellas en lo que se conoce como nmero de enlaces, es decir el nmero de vueltas que hace una de las cadenas alrededor de la otra. Las nociones presentadas a continuacin (tensin) slo se aplican tericamente a anillos de ADN, pero no a ADN linear (donde las extremidades son libres de girar). Sin embargo, un ADN linear puede comportarse como un ADN circular si cada una de sus 2 extremidades est fijada, como en el caso de las clulas.
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El "nmero de enlaces" es una constante topolgica: cualquier deformacin que sufra el ADN con extremidades fijas, no cambiar el nmero de enlaces. El cambio del nmero de pares de bases por vuelta, en un sitio de un bucle de ADN, ser necesariamente compensado por un superenrollamiento opuesto (es decir positivo o negativo), corriente arriba (upstream) o abajo de este sitio (downstream). Diferentes estados de topoismeros Estado relajado. En el estado relajado, la tensin sobre la doble hlice es mnima. Es la configuracin ms estable de la molcula. Los anlisis fsico-qumicos efectuados sobre fibras cristalinas de ADN-B han indicado que este en estado se observan 10 pb por vuelta. En las clulas, el ADN tiene una conformacin parecida a la del ADN-B. Sin embargo, en el estado sin tensin, el ADN posee un promedio de 10.5 pb por vuelta de espiral en vez de 10. Este valor es en efecto un promedio y puede variar sobre distancias cortas de ADN, pues el ADN est asociado a protenas. Estado superenrollado. El eje de la doble hlice puede enrollarse sobre s mismo para formar una superhlice. Dos formas de superenrollamiento son tericamente posibles: - Superenrollamiento positivo: el nmero de enlaces ha sido aumentado. El enrollamiento de la doble hlice derecha se efecta en el mismo sentido, lo que conduce a una superhlice derecha. Superenrollamiento negativo: el nmero de enlaces ha sido disminuido. El eje de la doble hlice se enrolla segn una superhlice negativa, izquierda, que gira en el sentido opuesto al de la doble hlice derecha. De esta manera, favorece el desenrollamiento y la separacin local de las dos cadenas. Superenrollados negativos = desenrollamiento

Las topoismeras del ADN. a) Forma relajada, b) Forma superenrollada negativamente, c) Forma superenrollada positivamente.
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La mayora de las molculas de ADN de la naturaleza forman superhlices hacia la izquierda (desenrollamiento de aproximadamente 1 vuelta por 200 pb). El superenrollamiento ejerce una fuerza sobre la molcula y provoca una torsin del ADN superenrollado, tanto positiva como negativamente. La obtencin de ADN superenrollado (positiva o negativamente) necesita un aporte energtico (lo cual es lgico ya que se pasa de un estado sin tensin a un estado con tensin). Las formas de ADN superhlices izquierdas presentan la doble ventaja de ser a la vez ms compactas (como lo seran igualmente superhlices derechas), y ms accesibles a las enzimas de la transcripcin y de la replicacin. En los eucariotes, el ADN forma una superhlice izquierda enrollndose alrededor de protenas histonas. Cabe indicar que el ADN de las mitocondrias no est unido con histonas. Simplemente tiene la forma de anillos, tal como el ADN de las bacterias.

Las topoismeras del ADN. a) Forma relajada, b) y c) Formas superenrolladas negativamente, (b: el esqueleto de la hlice no puede permanecer en un plan; c: formacin de una superhlice: forma torcida).
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El superenrollamiento negativo (= supervueltas en la direccin opuesta de la doble hlice) permite a las dos cadenas separarse localmente).

En resumen: En las clulas, el ADN presenta dos estados: - Estado relajado (sin tensin) - Estado torcido, que resulta de un superenrollamiento negativo es decir tpicamente (-) 1 vuelta/200 pb). Se puede separar topoismeros por electroforesis sobre gel. Generalmente, cuanto ms desenrollado (superenrollado negativamente) est un anillo de ADN, ms torcido y compacto ser. Sin embargo, tericamente, mientras ms compacto est un anillo, ms rpido migrar. No obstante, la movilidad electrofotortica depende de numerosos factores. En algunos casos, la forma superenrollada migra ms rpidamente que la forma linear. En otros casos, puede ser el contrario. Se puede visualizar las molculas de ADN por irradiacin del gel con rayos UV, despus de tratar el gel con bromuro de etidio (BET), sustancia que se intercala entre las bases apiladas de un cido nucleico, y que produce una fluorescencia anaranjada bajo el efecto de una excitacin por los rayos UV. La reaccin ocurre con un cido nucleico simple o doble cadena (sin embargo, la afinidad es menor con los cidos nucleicos simple cadena, y por lo tanto la fluorescencia, es mucho ms dbil). 3.4.2) Topoisomerasas Definicin. Las topoisomerasas son enzimas que modifican el nmero de enlaces. Son capaces de introducir o eliminar superenrrollamientos en una doble hlice de ADN. Para modificar el nmero de enlaces, es preciso que sean cortadas una o dos cadenas del ADN. Las diferentes topoisomerasas. Dos tipos de topoisomerasas son generalmente descritas: Las topoisomerasas I. Producen el corte transitorio y la soldadura de una sola cadena de ADN doble cadena. Son por ejemplo las enzimas relajantes las que suprimen superenrrollamientos negativos. Devuelven el ADN superenrollado (bajo tensin) a su conformacin inicial, es decir su forma relajada (sin tensin). Las enzimas relajantes actan segn la secuencia siguiente:

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Corte de una cadena de ADN. El corte de la cadena de ADN se realiza al nivel de un enlace fosfodister: el OH en 3 del ADN es momentneamente liberado mientras que el fosfato en 5 esterifica la tirosina de un sitio activo de la topoisomerasa. Esta reaccin de transesterificacin crea un complejo transitorio ADN-topoisomerasa: la energa del enlace fosfodister del ADN es momentneamente conservada por el enlace fosfotirosina. Rotacin de la cadena de ADN cortada. La cadena de ADN puede girar libremente alrededor de la cadena intacta. Soldadura de la cadena de ADN. El enlace fosfodister se restablece gracias a la energa conservada por el enlace fosfotirosina. Entonces, estas topoisomerasas generalmente no requieren aporte de ATP. ADN y topoisomerasas son finalmente regenerados, pero el ADN ha adquirido una configuracin sin tensin. En el ser humano se encuentran topoisomerasas I. Sin embargo, su estructura difiere de las bacterianas y pueden relajar no slo supervueltas negativas, sino tambin supervueltas positivas.

Modo de accin de la topoisomerasa I.

Las topoisomerasas II. Cortan de manera transitoria y luego sueldan las dos cadenas de ADN. Las topoisomerasas II son dimricas; cada cadena de ADN ser cortada por una subunidad. En este grupo, se encuentra la girasa bacteriana. Es una enzima capaz de introducir supervueltas negativas en una doble hlice de ADN (es decir que desenrollan el ADN). Esta reaccin acompaa la hidrlisis de una molcula de ATP. Inters bioqumico de las topoisomerasas Virus y procariotes. El papel conjugado de los 2 tipos de topoisomerasas es muy importante: Primero, el ADN superenrollado negativamente, es decir torcido, es ms compacto que su equivalente circular relajado. As, in vivo, el ADN contiene numerosas torsiones, lo que permite el empaquetamiento de una molcula muy larga de ADN dentro de un pequeo volumen.
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Adems, las topoisomerasas facilitan la replicacin, la transcripcin y la reparacin del ADN (por recombinacin con otros fragmentos de ADN). En efecto, numerosas protenas, indispensables en el inicio de estos mecanismos, se unirn al ADN slo cuando este ltimo est superenrollado negativamente es decir desenrollado (es el caso por ejemplo de la ARN polimerasa durante la transcripcin). As, se entiende el inters de las topoisomerasas capaces de introducir supervueltas negativas. El papel de las enzimas que relajan las supervueltas negativas es ms enigmtico. Es probable que permitan ajustar el grado correcto de superenrollamiento. Este resultara de un equilibrio entre las topoisomerasas de superenrollamiento negativo y las topoisomerasas relajantes. Gracias a las topoisomerasas, se puede evitar los enredos complejos que, sin ellas sucederan durante la progresin de la ADN o de la ARN polimerasa. Eucariotes. Se concibe el inters de las topoisomerasas I que relajan supervueltas negativas y positivas. En cuanto a las topoisomerasas II, parece que sobretodo tienen la capacidad de desenredar los nudos de ADN: ellas cortan un ADN doble cadena, el tiempo que otro segmento de doble cadena pase a travs de la mella, y luego cierran la mella. Se conocen las isoformas y ; la forma tiene una extremidad COOH terminal ms larga que la forma .

Accin de las topoismeras II (eucariotes) que desenredan nodos de ADN.

3.5) ADN de izquierda o ADN-Z 3.5.1) Caractersticas del ADN-Z El ADN de izquierda no es la imagen del ADN de derecha reflejada en un espejo. Tiene una conformacin diferente. Por ejemplo: - El esqueleto azcar-fosfato est en zigzag, en vez de formar una espiral regular como en el ADN-B, por ello ha recibido la apelacin de ADN-Z - El ADN-Z forma una hlice ms esbelta y menos torcida que el ADN-B. Se compone de un nmero ms elevado de pares de bases por vuelta de hlice. As, se encuentran 12 pares de bases por vuelta de espiral (en vez de 10/10.5 pares de bases en el ADN-B). El paso de la hlice es de 4.6 nm (en vez de 3.4 nm para el ADN-B) y el dimetro de 1.8 nm (en vez de 2.4 nm para el ADN-B) - Las bases estn, al igual que para el ADN-B, situadas en el interior de la doble hlice, pero mientras que en el ADN-B son completamente inaccesibles - conformacin anti-, en el ADNZ estn ms expuestas conformacin anti para la citosina (o la timina) y syn para la guanina (o la adenina). Es la alternancia anti-syn la que produce el aspecto en zigzag del esqueleto de la doble hlice Z. A la diferencia del ADN-B, el ADN-Z presenta sobre una misma cadena el oxgeno del ciclo pentagonal orientado alternativamente de arriba hacia abajo.

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El ADN-Z (hlice izquierda) y el ADN-B (hlice derecha).

As, el ncleo imidazol de la guanina (particularmente N7 y C8) es ms accesible en el ADNZ. La alternancia de pirimidina y purina favorece la conformacin ADN-Z. La tendencia de los dinucletidos pirimidina-purina a formar secuencias de ADN-Z es en orden decreciente: m5CG>CG>TG = CA>TA (m5C = citosina metilada en 5) Parecera que el ADN de procariotes forma ADN-Z ms fcilmente que el ADN de eucariotes. Eso podra provenir del hecho de que secuencias CG son mucho ms numerosas en el ADN de los procariotes que en el de los eucariotes. En las soluciones fisiolgicas, el ADN-Z es menos estable que el ADN-B, debido a las repulsiones electroestticas entre los grupos fosfato cargados negativamente. Estos fosfatos estn ms cercanos en el ADN-Z (hlice ms esbelta) que en el ADN-B donde las dos cadenas estn ms alejadas. Inters del ADN-Z Todava no se conoce exactamente la funcin del ADN-Z. Sin embargo, es probable que juegue un papel biolgico importante. Secuencias CG parecen implicadas en el control de la expresin de los genes, por lo menos en los eucariotes superiores. Adems parecera que exista una relacin inversa entre la metilacin de estas secuencias y la expresin de los genes. As, ms frecuentemente, estas secuencias seran metiladas (sobre la citosina) en los genes inactivos e inversamente, no metiladas en los genes que se expresan. Sin embargo, la metilacin de las secuencias CG favorece altamente la formacin de ADN-Z. Falta demostrar si, in vivo, estas secuencias CG, una vez metiladas, son capaces de tomar una conformacin ADN-Z (doble hlice izquierda) en medio de una zona con doble hlice derecha. Adems, ciertas protenas son capaces de unirse especficamente al ADN-Z, pero no al ADN-B. Es
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probable que estas Z-DNA binding protein desempeen un papel regulador importante. En resumen: El ADN contiene no slo una informacin codificante que dirige la sntesis del ARN (eso por su secuencia en nucletidos), sino tambin una informacin conformacional debida a ciertas secuencias nucleotdicas (por ej.: sucesin de CG). Estas informaciones conformacionales permitiran as que fragmentos de ADN adopten conformaciones diferentes (por ej.: ADN-Z) que podran desempear un papel importante en ciertas regulaciones biolgicas, particularmente al nivel de la transcripcin. As, el ADN ya no es considerado como una molcula esttica, sino ms como una estructura dinmica, flexible donde diferentes conformaciones estn en equilibrio unas con otras. 3.6) Los elementos genticos mviles: transposones y retrotransposones 3.6.1) Los transposones Los transposones son secuencias de ADN mviles que pueden desplazarse de un sitio a otro del ADN. Esta movilidad no implica que estos elementos genticos puedan existir bajo una forma libre. Los transposones existen en el ser humano, pero fueron primero estudiados al nivel molecular en bacterias. Los transposones ms sencillos son las secuencias de insercin de las bacterias. Estas secuencias slo codifican para enzimas necesarias para su propia transposicin, de all su nombre de ADN egosta. Los transposones, que son ms anchos que las simples secuencias de insercin, pueden transportar otros genes. A cada extremidad de un transposn, se encuentra una secuencia repetida. Se trata de una repeticin invertida, es decir que la 2nda secuencia a la derecha es complementaria (invertida pues leda sobre esta misma cadena de 3 hacia 5) de la 1ra secuencia a la izquierda (leda de 5 hacia 3). Es decir, la 1ra secuencia de izquierda leda en 5-3 sobre una cadena, es idntica a la 2nda secuencia de derecha leda en 5-3 sobre la otra cadena. Cuando un transposn se inserta en un ADN, es flanqueado por 2 secuencias cortas repetidas. Esta vez, se trata de una repeticin directa. Antes de la insercin, el sitio recibidor del ADN contiene una sola secuencia. Por ejemplo: ATGCA TGCGT Luego de la transposicin, una copia de esta secuencia est presente en ambos lados del transposn. Esta duplicacin de la secuencia del ADN blanco se explica de la siguiente manera. Durante la insercin, el ADN es cortado al nivel de la secuencia blanco formando un corte no franco sino adhesivo. El transposn se inserta dentro. Los huecos son rellenados (por una ADN polimerasa + ligasa). As, aparecen 2 repeticiones directas de cada lado del transposn.

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La insercin de un transposn genera al nivel del ADN blanco 2 secuencias repetidas directas (aqu ATGCA). El transposn posee en cada extremidad una secuencia repetida invertida (aqu AATAAGCTC). (El nombre de las bases presentadas se escogi arbitrariamente para ilustrar lo que son secuencias repetidas directas o indirectas).

Ocurre que el elemento transposable se duplica y entra en un segundo sitio de ADN mientras permanece en el primer sitio. Cuando un transposn se inserta en el ADN, puede ocasionalmente insertarse en un gen. Inactiva entonces este gen, el cual tal vez no recobrar su actividad cuando se quite el transposn. Estos elementos saltadores son capaces de desplazarse sobre una molcula de ADN y tambin pueden saltar de un cromosoma a otro. 3.6.2) Los retroposones (o retrotransposones) Los retroposones son fragmentos insertos de ADN mviles (de origen retroviral o no) cuya transposicin pasa por una forma intermediaria de ARN, es decir por etapas de transcripcin y de retrotranscripcin. Los retroposones poseen en su secuencia un marco de lectura abierta, ORF (Open Reading Frame) que codifica potencialmente para una retrotranscriptasa. En el ser humano, los retroposones son insertados al nivel de algunos miles de sitios que pueden variar de un individuo a otro. Su papel no es conocido. Sin embargo, como disocian los genes cuando se integran dentro de ellos, probablemente jugaron un papel importante a lo largo de la evolucin; el genoma evolucion, adquiriendo nuevas secuencias y arreglando secuencias existentes.

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3.6.3) Las secuencias repetitivas (ej.: los telmeros, las secuencias Alu) Adems de las secuencias nicas que existen en una sola copia en el genoma humano y de otros mamferos, se encuentran secuencias repetidas numerosas veces, llamadas repetitivas y cuyo papel es todava desconocido. 3.6.3.1) Secuencias repetitivas agrupadas Ciertas secuencias repetitivas estn agrupadas y se siguen en tndem, es decir que la extremidad 3 de una secuencia est seguida de la extremidad 5 de otra secuencia idntica (as, estn alineadas en la misma direccin). Se trata por ejemplo de las secuencias de ADN satlites ubicadas en la regin de los centrmeros y repetidas miles de veces. Tambin es el caso de las secuencias repetidas ubicadas en los telmeros. 3.6.3.2) Telmeros, en las extremidades del ADN de los eucariotes Los telmeros estn formados de secuencias repetidas de ADN. Se ubican en la extremidad de los cromosomas. Los telmeros estn constituidos de un encadenamiento, en la extremidad 3, de varias copias (250 a 1500) de un hexmero rico en G, por ejemplo TTGGGG (en Tetrahymena, protozoario ciliado donde los telmeros han sido los ms estudiados) o tambin TTAGGG en el ser humano (y en los tripanosomas, protozoarios flagelados frecuentemente utilizados como modelo). En la extremidad 5, se encuentran secuencias complementarias, es decir ricas en C.

Esquema de la replicacin. Finalmente, luego de la accin de la ADN polimerasa I (que elimina los iniciadores de ARN y vuelve a sintetizar ADN) y de la ligasa, las extremidades 5 de un ADN linear estn disminuidas. (Para simplificar, se represent un solo punto de iniciacin).

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Un problema importante debe ser resuelto en el curso de la replicacin de ADN lineares eucariotes. En efecto, la sntesis del ADN se produce por elongacin de un iniciador de ARN (producido por la transcripcin del ADN por la ARN polimerasa). Al final de la sntesis del ADN, la parte ARN es eliminada y reemplazada por ADN. Sin embargo, el iniciador ARN ms externo no podr ser reemplazado por ADN, y por consecuencia, el ADN ser disminuido de unos diez nucletidos en cada ciclo de replicacin. Es para evitar este fenmeno que interviene otro sistema enzimtico, en el cual la telomerasa, combinada a una matriz de ARN permite, por desplazamientos sucesivos hacia la extremidad, un alargamiento artificial de los cromosomas. 3.6.3.3) La telomerasa Caractersticas de la telomerasa: La telomerasa es una enzima particular cuyas caractersticas esenciales son las siguientes: Es una telmero-terminal-transferasa: aade secuencias telomricas en 3 de una cadena de ADN. Como toda ADN polimerasa, slo puede alargar un cido nucleico. Este alargamiento se efecta en el sentido 5 hacia 3. Sin embargo, no necesita matriz exgena como modelo de ADN. En efecto, esta enzima es una ribonucleoprotena que utiliza una matriz interna de ARN. Como sintetiza el ADN a partir de un modelo de ARN, se trata de una retrotranscriptasa. Modo de accin de la telomerasa. La telomerasa se coloca en la extremidad 3 y alarga esta extremidad 3 utilizando como modelo su matriz interna. Luego, se desplaza. La sntesis de la cadena telomrica rica en G, por la telomerasa, comprende 2 etapas repetidas varias veces: sntesis de una secuencia telomrica rica en G, complementaria y antiparalela a la secuencia de ARN de su matriz interna; translocacin. Cmo se sintetiza la cadena telomrica complementaria y rica en C? Segn el modelo propuesto por Vermeesch y Price, una primasa sintetiza un iniciador de ADN, tomando como modelo la extremidad de la cadena telomrica rica en G. Luego, la ADN polimerasa alarga este iniciador (rellenando as el hueco que se encuentra entre este iniciador y la extremidad 5 de ADN no telomrica). Una ligasa realiza la soldadura. As, se sintetiza una copia antiparalela, complementaria, de la cadena telomrica rica en G. Finalmente, el iniciador ARN en la extremidad 5 de la cadena rica en C es hidrolizado, de tal manera que la cadena rica en G sobrepasar un poco con respecto a la cadena rica en C.

Modelo propuesto para la sntesis de los telmeros ricos en C (cadena complementaria) en la extremidad 5 (segn Vermeesh.y Price, simplificado).

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Sntesis de los telmeros ricos en G en la extremidad 3 del ADN, por la telomerasa.

En clulas normales en cultivo, la telomerasa est inactiva (estando reprimida su produccin o su actividad). Los telmeros presentes se acortan en cada replicacin. As, los cromosomas pierden finalmente sus telmeros lo que los vuelve inestables. Finalmente se detendrn las divisiones celulares. Por el contrario, en las clulas germinales y en las clulas cancergenas, la telomerasa est activa. Las clulas cancergenas pueden as multiplicarse indefinidamente sin que sus cromosomas disminuyan de tamao. Es por ello que varios trabajos se orientan hacia la bsqueda de inhibidores de la telomerasa como agentes antitumorales. 3.6.4) Secuencias repetitivas dispersas. Otras secuencias repetitivas estn dispersas a lo largo del genoma. Estn separadas por secuencias nicas. Estas secuencias repetitivas no son necesariamente repeticiones exactas. 3.6 4.1) Minisatlites o VNTR. Existen secuencias dispersas altamente repetitivas de una misma secuencia nucleotdica. Son por ejemplo los minisatlites o VTNR (Variable Number of Tandem Repeats), cortas secuencias en tndem que se encuentran en la parte no codificante del ADN. El nmero de repeticiones de estas secuencias vara de un individuo a otro y se transmite hereditariamente.
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3.6.4.2) Microsatlites. Los microsatlites son repeticiones en tndem de una secuencia muy corta de nucletidos (1 a 15 nucletidos). Los ms frecuentes son los microsatlites de tipo (CA)n/(GT)n. 3.6.5) Las secuencias reguladoras En el ADN, corriente arriba de los genes, existen elementos cis-reguladores que desempean un papel en la transcripcin. 3.6.6) Enzimas de restriccin y estudio de secuencias de ADN Dos molculas diferentes de ADN: - Tienen las mismas molculas de fosfato y de azcar, pero - Difieren por sus bases. Ms precisamente, difieren por la secuencia de bases, es decir el orden de sucesin de todas las bases de este ADN. Establecer la frmula qumica de un ADN es entonces conocer la secuencia de las bases de este ADN. As, se necesitar: Cortar el ADN en sitios precisos, mediante el uso de enzimas llamadas endonucleasas de restriccin, o enzimas de restriccin. Analizar los fragmentos obtenidos. 3.6.7) Corte del ADN por las enzimas de restriccin Las enzimas de restriccin son verdaderas herramientas utilizadas en el laboratorio para cortar el ADN. El corte se realiza en un sitio particular reconocido por la enzima. Cada enzima de restriccin reconoce una secuencia nucleotdica diferente y especfica de ella. Cules son las secuencias nucleotdicas reconocidas por las enzimas de restriccin? Las secuencias de nucletidos habitualmente reconocidas por las enzimas de restriccin son palndromas. En literatura, un palndroma es una palabra, una frase que se puede leer tanto de derecha a izquierda como de izquierda a derecha (ej.: radar). Por analoga, en bioqumica, se llama palndroma a secuencias de ADN de simetra invertida, como la secuencia presentada abajo, donde la sucesin de nucletidos es la misma para la cadena I leda de la izquierda a la derecha (de 5 hacia 3) que para la cadena II leda de la derecha a la izquierda (igualmente de 5 hacia 3). 5...CCAGAATTCCAT...3 3...GGTCTTAAGGTA...5 Cadena I Cadena II

Los palndromas reconocidos por las enzimas de restriccin estn generalmente constituidos de secuencias de 4 a 6 pares de bases. Cul es el origen de estas enzimas de restriccin? Las enzimas de restriccin son aisladas a partir de microorganismos, generalmente bacterias. En efecto, las bacterias pueden ser infectadas por virus de ADN defendindose a travs de la sntesis de enzimas de restriccin que cortan el ADN viral.
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A las enzimas de restriccin, se le dan nombres de 3 (o 4) letras que recuerdan el origen del microorganismo de donde fueron aisladas. La 1ra letra (en maysculas) es la 1ra letra del nombre del gnero; la 2nda y la 3ra (en minsculas) son las 2 primeras letras del nombre de la especie; a veces, existe una 4ta letra (ej.: Hind), que indica la cepa bacteriana de donde la enzima fue extrada. La cifra en romano concierna el orden de caracterizacin de las enzimas, cuando varias enzimas han sido aisladas a partir de una misma cepa bacteriana. La letra R, cuando es mencionada, indica que se trata de una endonucleasa (por oposicin a M que indica una metilasa). Por ejemplo, por informacin: EcoRI. Aislada de Escherichia coli, esta enzima reconoce el palndroma: 5...GAATTC...3 3...CTTAAG...5 HpaI. Aislada de Haemophilus parainfluenzae, esta enzima reconoce el palndroma: 5...GTTAAC...3 3...CAATTG...5 HindIII. Aislada de Haemophilus influenzae, esta enzima reconoce el palndroma: 5...AAGCTT...3 3...TTCGAA...5 Cmo se realiza el corte por las enzimas de restriccin? Se observan 2 tipos de cortes: Corte que produce extremidades francas. El corte de una molcula de ADN puede realizarse en medio de un palndroma.

Corte que produce extremidades cohesivas. Otros tipos de enzimas cortan de una y otra parte del centro de simetra de un palndroma.

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Ulteriormente, en el manual de Ingeniera gentica (tcnicas de biologa molecular), se estudiar el inters de estos dos tipos de cortes. As, sobre la totalidad de un ADN, una enzima de restriccin es capaz de reconocer ciertas secuencias caractersticas. En el ejemplo de la enzima EcoRI que reconoce la secuencia ...GAATTC...CTTAAG..., si esta secuencia se encuentra 5 veces en una molcula de ADN; la enzima cortar este ADN en 5 sitios. As, el ADN dar 5 fragmentos si se trata de un ADN circular (o 6 en el caso de un ADN linear). Por supuesto, otra enzima de restriccin reconocer una secuencia diferente de la reconocida por EcoRI. Segn la enzima utilizada, un mismo ADN ser cortado diferentemente 3.6.8) Determinacin de la secuencia de bases en los fragmentos de ADN obtenidos Luego del corte de una molcula de ADN por enzimas de restriccin, se obtienen fragmentos con, por ejemplo, unos cientos nucletidos, cuya secuencia puede ser determinada. Las tcnicas de biologa molecular utilizadas son presentadas en el captulo referente a la ingeniera gentica. 3.6.9) Las enzimas de modificacin Las enzimas de modificacin son enzimas que las bacterias poseen para protegerse de una autodestruccin. En efecto, las bacterias utilizan enzimas de restriccin para cortar el ADN de un virus que les infecta. Las bacterias tambin contienen ADN y, para que las enzimas de restriccin, sintetizadas por la bacteria con el fin de luchar contra los virus, no corten el propio ADN bacteriano, intervienen enzimas llamadas metilasas de modificacin o enzimas de metilacin. Estas metilasas metilan la citosina (sobre el carbono 5), o la adenina (sobre el nitrgeno 6). Son muy especficas pues la metilacin se efecta sobre citosinas y adeninas que pertenecen a sitios de restriccin. Por eso, difieren de otras metilasas bacterianas susceptibles de metilar indiferentemente citosinas y adeninas fuera de los sitios de restriccin. Debido a que el sitio de restriccin es palindrmico, la base a metilar se encuentra sobre las dos cadenas. Ya sea que est plenamente metilado (es decir sobre las dos cadenas) o hemimetilado (es decir sobre una sola cadena), el sitio no ser cortado por la enzima de restriccin. As, durante el perodo corto que sigue la sntesis de una cadena de ADN, el ADN doble cadena, constituido del ADN sintetizado (que todava no ha sido metilado) y de la cadena parental (metilada), ser protegido del corte por una enzima de restriccin. En resumen, sobre un sitio hemi-metilado, puede actuar una metilasa (para metilar la segunda cadena), pero no una enzima de restriccin (para cortar la molcula de ADN). En el ejemplo de la enzima de restriccin es HindIII que reconoce el palndroma: 5...A*AGCTT. ..3 3...TTCGA*A. .5 Tras la metilacin de la adenina (representada por el asterisco), este palndroma ya no es reconocido por la enzima de restriccin HindIII y por eso, no puede ser cortado.

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4) Los ARN
4.1) Caractersticas de los ARN Los ARN (cidos ribonucleicos) estn esencialmente caracterizados por: El azcar: en el ARN, el azcar es la ribosa, a diferencia del ADN, donde el azcar es la desoxiribosa. Las bases: las bases encontradas en los ARN son A, C, G y U en vez de T. Una sola cadena de nucletidos (y no 2 como en el ADN). Adems, esta cadena puede ser mucho ms corta que las cadenas de ADN. 4.2) Reglas de apareamiento Se puede observar el apareamiento entre bases complementarias ya sea entre 2 molculas de ARN diferentes (pues una molcula de ARN posee una sola cadena), o sobre una misma molcula de ARN, en una regin doblada en horquilla (regin donde existe una autocomplementariedad). Las reglas de apareamiento entre dos cadenas de ARN sern las mismas que entre dos cadenas de ADN en lo que concierne C y G, mientras que U reemplaza a T en el apareamiento con A. A:::U C:::G 4.3) Los diferentes ARN Las clulas contienen esencialmente 4 tipos de ARN: - ARNr (ribosmico), - ARNt (de transferencia), - ARNm (mensajero), - ARNsn (pequeos nucleares, small nuclear). Los ARNr son los ms abundantes ARNs de la clula (aproximadamente 82%), mientras que los ARNt no representan ms que un 16%, los ARNm 2% y los ARNsn menos de 1% de la totalidad de los ARN en la clula. 4.3.1) ARN ribosmicos (ARNr) Los ARNr y las r-protenas. Los ribosomas son partculas necesarias para la sntesis de las protenas. Se ubican en el citoplasma. Son verdaderas fbricas de protenas de la clula. Tambin se encuentran ribosomas en las mitocondrias (donde se realizan sntesis de unas cien protenas mitocondriales). E. coli es la clula cuyos ribosomas han sido ms estudiados. Un ribosoma (70S) de E. coli est formado de 2 subunidades: Una subunidad grande (50S)
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- Una subunidad pequea (30S) (S para Svedberg - la unidad Svedberg es la unidad de medicin de la velocidad de sedimentacin). El coeficiente de sedimentacin de una partcula depende no slo de su tamao, sino tambin de su forma y de su rigidez (lo que explica que el ensamblaje de las subunidades 50S y 30S puedan dar un ribosoma 70S). Cada una de las 2 subunidades est constituida de una mezcla de: - Protenas: r-protenas - ARN: ARNr. Los ARNr son los mayores constituyentes del ribosoma (aproximadamente el 65%). Se han realizado numerosos progresos para entender la estructura del ribosoma, por estudios bioqumicos, as como tambin por tcnicas de inmunologa y de microscopia electrnica. Para mayor informacin: La subunidad 30S contiene: 1 ARNr 16S de 1542 nucletidos (una sola copia) 21 protenas-r diferentes, presentes en una sola copia. Se denominan estas protenas como S1, S2... S21 (en el caso de las protenas-r, S significa small, es decir protena-r de la pequea subunidad, mientras que en el caso de los ARNr, S significa unidad Svedberg y acompaa la constante de sedimentacin).

El conjunto ARNr + protenas-r tiene un peso molecular de aproximadamente 900 000 Da (daltons). La subunidad 50S contiene: 1 ARNr 5S de 120 nucletidos (una sola copia) 1 ARNr 23S de 2 904 nucletidos (una sola copia) 34 protenas-r designadas por L1, L2... (L para Large, es decir grande subunidad. 30 protenas-r existen en una sola copia y 1 protena-r se presenta 4 veces).

El conjunto forma una masa de aproximadamente 1.6 millones Da. Cuando se ensamblan la pequea y la gran subunidad, se forma entre las 2 subunidades un surco en el cual pasar el ARNm. En los eucariotes, los ribosomas son un poco ms grandes (80S, siendo las 2 subunidades de 40S y de 60S). Su composicin es ligeramente diferente: se encuentran ms protenas y los ARNr son un poco ms largos (adems, se encuentran 4: 18S en la pequea subunidad, 5S, 5.8S y 28S en la subunidad grande). Esta diferencia de constitucin de los ribosomas presenta un inters considerable. Algunos antibiticos, aquellos que actan al nivel de los ribosomas, tendrn as una accin especfica sobre los ribosomas bacterianos, sin daar los ribosomas humanos.

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Los ARNr y las protenas-r.

Papel de los ARNr. Todava, no se conoce precisamente el papel de los ARNr. No obstante, tienen: Un papel estructural, pues constituyen en parte la materia del ribosoma Un papel para facilitar la fijacin de los dems ARN (ARNt, ARNm) sobre el ribosoma En las bacterias, un papel en el reconocimiento, sobre el ARNm, del sitio de iniciacin de la traduccin (AUG): hibridacin de una secuencia ubicada en la extremidad 3 del ARNr 16S con una secuencia corta (llamada Shine-Dalgarno) ubicada a unos nucletidos corriente arriba de AUG. En los eucariotes, todava no se sabe si el ARNr reconoce una secuencia prxima de AUG.

ARN de transferencia (ARNt) Que es un ARNt? Se los denomina as porque van a transferir, transportar los aminocidos que se encuentran en el citoplasma hasta el ribosoma, lugar de la sntesis proteica. Estructura de un ARNt. Un ARNt posee la estructura general de los ARN. Sin embargo cules son las caractersticas propias de una cadena de ARNt? Nucletidos atpicos. Un ARNt contiene nucletidos atpicos, es decir inhabituales, por ejemplo por la naturaleza de las bases que comprende. As, se encontrar la hipoxantina, cuyo nucletido correspondiente es IMP (el IMP interviene en el wobble (base fluctuante). Adems, se encuentran bases como la timina, lo que no es habitual en un ARN, as como otras bases metiladas. Estas bases inhabituales no se incorporan de esa manera en el momento de la sntesis del ARNt. Son formadas secundariamente, por modificacin de una de las 4 bases (A, U, C, G) normalmente utilizadas durante la sntesis. As, IMP proviene de la desaminacin de la adenina en el AMP (NH2 es reemplazado por OH), TMP proviene de la metilacin de UMP. Forma espacial de los ARNt. La cadena del ARNt (constituida de unos cien nucletidos) se repliega para dar un aspecto general en forma de trbol. Eso se explica as: - Las ramas del trbol se forman por enlaces hidrgeno entre bases complementarias: son doble-hlices cortas - Los bucles al contrario son formados de nucletidos no apareados: aqu se encuentran entre otros los nucletidos atpicos.

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Forma en trbol de un ARNt.

En efecto, en el espacio, esta molcula se dobla para dar una forma en L. (Esto proviene del hecho de que una doble-hlice se forma en 2 sitios de este ARNt y que estos 2 fragmentos helicoidales se disponen perpendicularmente uno con respecto al otro). Esta estructura tridimencional del ARNt se revel gracias a estudios cristalogrficos con rayos X. Representacin esquemtica de los ARNt. Para simplificar, aqu se representa esquemticamente al ARNt. Ya que el ARNt se asocia al ARNm de manera antiparalela, se escribe por convencin el ARNm (en el sentido 5 3) de la izquierda hacia la derecha. El ARNt ser ledo (en el sentido 5 3) de la derecha hacia la izquierda como es representado a continuacin.

ARNm y ARNt son antiparalelos.

Dos sitios importantes en un ARNt. - La extremidad 3OH: la extremidad de todos los ARNt se termina por los 3 nucletidos siguientes: CCA. En efecto, CCA simboliza 3 nucletidos, y no slo 3 bases. As, cada ARNt se termina por 3 nucletidos: CMP, CMP y AMP. A la extremidad CCA ser fijado el aminocido a transportar.

El aminocido es llevado a la extremidad 3de un ARNt.

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- El anticodn: se llama anticodn a un grupo de 3 nucletidos (se dice tripleta) ubicado sobre un bucle del ARNt. Este anticodn juega un papel importante porque reconocer el codn, grupo de 3 nucletidos ubicado sobre el ARNm. Este apareamiento codn-anticodn se hace con enlaces dbiles (enlaces hidrgeno) de manera: - Antiparalela - Complementaria entre las bases del codn y del anticodn. En las representaciones que implican codones y anticodones, es ms fcil escribir el codn en el sentido 5 3 y el anticodn en el sentido opuesto. Si, para comentar una figura, se necesita escribir en el texto un anticodn en el sentido contrario del sentido 5 3, es preciso indicar las cifras 3 y 5 por ambas partes de este anticodn. 3UAC5 es equivalente a 5CAU3. Dado que existen 61 codones diferentes (que codifican 20 aminocidos), se podra pensar que existan 61 anticodones diferentes y entonces 61 ARNt diferentes. Ms abajo, (vase prrafo sobre el wobble, o base fluctuante) se demostrar que este nmero es inferior a 61 y superior a 20. Eso significa que un aminocido podr ser transportado por varios ARNt especficos de este aminocido pero diferente por su anticodn, mientras que un mismo ARNt puede transportar un solo aminocido.

El anticodn (sobre el ARNt) es complementario y antiparalelo al codn (sobre el ARNm).

Cmo se hace el enlace ARNt-aminocido (o aminocil~ARNt)? Tipo de enlace. El ARNt trae el aminocido al ribosoma, despus de haberlo enganchado con un enlace covalente. Se trata de una unin ster. Este enlace se efecta por eliminacin de una molcula de agua entre una funcin cida trada por el aminocido y una funcin alcohol trada por el ARNt.

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Enlace ster entre el aminocido y el ARNt.

Esta reaccin necesita una fuente de energa proveniente del ATP, la cual es una molcula con dos enlaces de alto potencial energtico llamadas enlaces ricos en energa y representadas por el smbolo ~. Para formar una molcula de aminocil~ARNt, se requieren dos enlaces ricos en energa. Las diferentes etapas. La reaccin de esterificacin se realiza en 2 etapas: 1ra etapa: enganchamiento del aminocido sobre el AMP. Esta etapa se llama activacin del aminocido. Conduce a la obtencin del aminocil~AMP.

El enlace entre el aminocido y el AMP es un enlace anhidro. Se elimina una molcula de agua entre la funcin cida del aminocido y una funcin cida del cido fosfrico del nucletido AMP. Un enlace anhidro es un enlace rico en energa. El pirofosfato formado en esta reaccin es hidrolizado por una pirofosfatasa. As, se forman 2 molculas de fosfatos minerales (o Pi, i para inorgnico).

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2nda etapa: transferencia del aminocido (desde el aminocil~AMP) sobre el ARNt. Esta etapa conduce a la formacin del aminocil~ARNt. Ahora, se trata de un enlace ster entre el aminocido y la funcin alcohol de la ribosa llevada por el ltimo nucletido del ARNt, es decir por el AMP. El OH de la ribosa que participa en este enlace ster puede ser, ya sea el OH en 2, o el OH en 3. Una vez constituido el enlace, el grupo aminoacil puede saltar entre las posiciones 2 y 3. El balance final de estas dos ecuaciones es el siguiente:

Balance final de las dos ecuaciones

Frmula del ATP

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Frmula general de aminoacil~AMP

Frmula general de un aminoacilARNt.

En resumen: tanto en la 1ra como en la 2da etapa, el aminocido se une por su funcin cido a 1 AMP, pero: - En la 1ra etapa (donde hay formacin del aminoacilAMP), se trata de un enlace anhidro entre el aminocido y el AMP.

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Anhidro Aminoacil AMP Enlace anhidro entre el aminocido y el AMP En la segunda etapa (donde hay formacin del aminoacilARNt, se trata de un enlace ster entre el aminocido y el ltimo AMP del ARNt.

Frmula esquematizando la extremidad 3 de un aminoacilARNt.

El enlace ster aminocilARNt es rico en energa.. Sin embargo, habitualmente, un enlace ster no es rico en energa. Aqu, la energa que estaba contenida en el enlace anhidro (aminoacilAMP) es transferida al enlace ster (aminocilARNt). As, los diferentes ARNt llevarn no slo los aminocidos, sino tambin la energa necesaria para el enganchamiento de los aminocidos uno con otro en el momento de la sntesis proteica, (este enlace entre 2 aminocidos ser un enlace amido llamado enlace peptdico). Para formar este enlace ster del aminoacilARNt, se requiere consumir 2 enlaces ricos en energa proveniente de una molcula de ATP. - El 1er enlace rico consumido da el aminoacilAMP (por transferencia desde el aminoacilARNt). - El 2ndo enlace rico consumido se debe a la hidrlisis del pirofosfato. Estos dos enlaces ricos en energa permiten formar un enlace ster rico en energa y, gracias a la hidrlisis del pirofosfato, la reaccin que da el aminocido activado es irreversible. Intervencin de la aminoacilARNt sintetasa. Se puede preguntar por qu un ARNt reconoce su aminocido aunque los diferentes ARNt terminen todos de la misma manera, por CCA. En realidad, el enlace ster no se efecta slo por reaccin entre un ARNt y un aminocido que se encuentren libres en el citoplasma. En efecto, se requiere la intervencin de una enzima llamada aminocilARNt sintetasa. Esta enzima reconoce a la vez:

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- El aminocido correcto, y - El ARNt correcto correspondiente. Es sobre esta enzima que se producen sucesivamente: - La activacin del aminocido en aminoacil~AMP. - El enlace del aminocido activado al ARNt para dar finalmente el aminoacil~ARNt. La aminoacil~ARNt sintetasa acoge el aminocido, el ATP, ARNt y todas las reacciones mencionadas ms arriba podrn efectuarse sin que los intermediarios aminocidos activados abandonen la enzima. La aminoacil~ARNt sintetasa reconoce el aminocido. Las aminoacil~ARNt sintetasas son enzimas muy especficas. Esta etapa donde se forman los aminocil~ARNt es muy importante. No deben producirse errores a este nivel. Una valina, por ejemplo, es muy parecida a una isoleucina. Si por error, se activa una Val, el Val~AMP formado no ser fijado al ARNt de Ile. La enzima (la isoleucil~ARNt sintetasa) es capaz de corregir sus propios errores. En efecto, la enzima hidrolizar esta Val~AMP errneamente formada (en un sitio hidroltico diferente del sitio de sntesis). La aminocil~ARNt sintetasa reconoce al ARNt. Los ARNt deben tener una estructura parecida debido a que todos los ARNt intervienen al nivel del ribosoma. Sin embargo, cada ARNt contiene elementos estructurales propios que les permiten ser reconocidos por una de las 20 aminocil~ARNt sintetasas. La naturaleza de los elementos estructurales reconocidos puede ser muy diferente. Se distinguen esencialmente dos casos: El elemento de reconocimiento es el anticodn. En este grupo, se encuentran, por ejemplo en E. coli: ARNtGly, ARNtLis, ARNtArg, ARNtMet, etc. As, para el ARNtMet, el anticidn 3ARNt5 es un elemento mayor (cuando no es el nico) de reconocimiento para la metionilARNt sintetasa. El elemento de reconocimiento es un par de bases. Para otros ARNt, como por ejemplo ARNtSer, ARNtAla de E. coli, el anticodn no parece desempear un papel importante en el reconocimiento por la aminoacilARNt sintetasa.

Importancia de las bases GU en la posicin 3-70 en el reconocimiento del ARNtAla por la AlaARNt sintetasa
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4.3.3) ARN mensajeros (ARNm) Definicin. Se llama mensajero a este tipo de ARN porque lleva una parte de la informacin gentica contenida al nivel del ADN hasta el ribosoma donde se efectuar la sntesis de las protenas. El concepto de mensajero fue formulado por Jacob y Monod en 1961. Longitud de vida. El tiempo de vida de los ARNm es muy corto, al contrario de los ARNt cuya tiempo de vida es mucho ms grande (pues un mismo ARNt lleva su aminocido al nivel del ribosoma, libera este aminocido y ser utilizado de nuevo varias veces). En las bacterias, el tiempo de vida de un ARNm es de aproximadamente unos minutos. En los eucariotes, los ARNm son ms estables (de algunos minutos a algunos das). Los ARNm se renuevan muy rpidamente; son producidos y degradados en poco tiempo. Un ARNm podr ser ledo varias veces al nivel del ribosoma. Estructura. Como los dems ARN, el ARNm es formado de una sola cadena de nucletidos con el mismo tipo de bases: A, U, C, G. Los nucletidos, y ms precisamente la secuencia de las bases, constituyen en efecto un mensaje, bajo la forma de un cdigo. Cada grupo de 3 nucletidos sobre el ARNm forma un codn. Cada codn codificar un aminocido particular. La decodificacin del mensaje llevado por el ARNm se har al nivel del ribosoma. As, el codn AUG significar enganchamiento de una metionina en la protena en sntesis, el codn UUU significar enganchamiento de la fenilalanina, etc.

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