Metoda orizontala pentru detectarea bacteriilor din genul Salmonella

Actiuni si /sau masuri preventive 6.2.1Protectia personalului Obligatorie purtarea halatului alb (din bumbac) de de protectie si a bonetei Folosirea lampei bacteriologice de U.V. Iinainte si dupa insamantare) Folosirea hotei de insamantare cu flux laminar Pipetele sunt prevazute cu dop de vata nehidrofila pentru a preveni aspirarea accidentala a materialului potential patogen.dupa utilizare pipetele vor fi depuse in recipieni de sticl cu solutie dezinfectant Culturile si subculturile realizate in diferite etape ale procesului analitic vor fi manipulate cu atentie maxima Flambarea ansei se face intai la baza flacarii si apoi la varf pentru a impiedica raspandirea germenilor Dezinfectia suprafetelor de lucru cu solutii dezinfectante bactericide zilnic si de cate ori este nevoie 6.2.2 Protectia mijloacelor de incercare si / sau masurare Sticlaria sterile se pastreaza in dulapuri speciale pentru a evita contaminarea sau deteriorarea ambalajului in care au fost sterilizate si folosite in maximum 6 zile Balantele cu care se efectueaza cantarirea se instaleaza pe suprafete plane,fara trepidatii,schimbari bruste de temperature Executarea periodica a serviciilor de intretinere si curatire zilnica a aparaturii utilizate Verificarea si inregistrarea zilnica temperaturii din incaperea de lucru in fisele de temperature 6.2.3. Verificarea starii de functionare si confirmarea metrological la mijloacelor de masurare Verificarea de doua ori pe zi a temperaturii incubatoarelor ( 8 si 15) Teste privind efectuarea corecta a sterilizarii. - indicatorii chimici utilizati sunt:BAG Dry Check pentru etuva de sterilizare a sticlariei la 180C (banda vireaza culoarea din verde in maro);BAG Chemo Strip 121C,pentru autoclave (banda vireaza din rosu in verde cand s-a realizat temperature de 121C) - indicatorii biologici utizati sunt:STEROTEST 120,prin care se obtin informatii - asupra duratei mentinerii temperaturii de sterilizare in controlul bacteriologic al sterilizarii la autoclave Controlul indirect al sterilizarii controlul sterilitatii materialelor de laborator (cutii Petri,cilindri,eprubete,baloane),prin teste de de sanitatie. 5. MOD DE LUCRU Pregatirea probei de analiza si preimbogatirea In vederea evitarii contaminarii mediului si a probei luata in lucru,se recomanda a se lucra in incaperi speciale sau in nisa cu flux laminar.Anumite produse cunoscute a

contine foarte putine microorganisme (produse pasteurizate,mancaruri preparate,etc.), se vor examina totdeauna primele,urmate de alt produs cunoscut ca avand o contaminare mai ridicata. Probele se vor manipula astfel incat sa se evite orice risc de contaminare.Pentru a se realize aceasta se vor lua urmatoarele precautii: - cand nu se lucreaza in nisa,se lucreaza in vecinatatea flacarii; - pentru produsele ambalate,se curata suprafata ambalajului unde va fi deschis,cu etanol 70%,daca este posibil se flambeza - orice instrument care este folosit pentru deschiderea ambalajului deschizator,foarfece, etc) trebuie sa fie steril. In cazul probelor cu consistenta solida se preleveaza fragmente din diverse zone, astfel ca in cantitate necesara pentru analiza,produsul sa fie corect reprezentat . Produsele congelate,se lasa in recipientul de recoltare la temperatura de 5-10 C pana la decongelare totala sau pana cand se poate preleva cantitatea necesara pentru analiza. Se cantareste,in mod aseptic,25 g din proba de analizat. Dupa cantarire,omogenizarea probei cu consistenta solida sau semisolida se face cu ajutorul omogenizatorului electric Stomacher.Alimentele in bucati mari (carne,preparate din carne,branzeturi) se vor marunti anterior operatiei de omogenizare propriu-zisa;in acest scop se utilizeaza forfeci,bisturie,pense sterile. In cazul alimentelor cu continut mare de grasime (unt,margarina,maionez,icre,etc), anliza se executa pe faza apoasa a acestora,care se obtine prin mentinerea probei la 45C In baie de apa termoreglabila,pana la topirea completa. Dupa omogenizare,se adauga mediu de preimbogatire,225 ml.Se lucreaza in nisa cu flux laminar. In general,se iau 25 g (ml) din proba de analizat si se adauga 225 ml mediu de prembogatire (bulion semi-Fraser) si se introduce in termostat la 30C 1 C,pentru incubare timp de 24h 2h. Daca masa specificata a probei pentru analiza este alta decat 25 g,se foloseste cantitatea necesara de mediu de prembogatire,pentru a se obtine o dilutie de 1:10 (mas la volum). 7.2.Imbogatirea secundara Dupa incubarea suspensiei initiale (imbogatie primara) timp de 24 h 2 h se transfera 0,1 ml din cultura obtinuta(fara a se tine seama de culoarea ei,intr-o eprubeta cu 10 ml mediu de mbogatire secundara (bullion Fraser). Se incubeaza mediul nsamantat,timp de 48 h 2 h la 35C sau 37C 7.3 Striere si identificare Fig.1

Prima plac

A doua plac

Placile cu mediu de izolare selective insamantate (4 placi) se pun la incubat la 37C timp de 24 ore,cu capacul in jos nu mai mult de 6 in coloana si sa nu fie in contact cu peretii si nici cu partea superioara a incubatorului. 7.4. Alegerea coloniilor pentru confirmare Coloniile tipice de Salmonella crescute pe agar XLD au centru negru si o zona transparenta luminoasa de culoare rosiatica datorata schimbarii culorii indicatorului. Nota Variantele de Salmonella H2S-negative crescute pe agar XLD este galbena cu sau fara negreala. Coloniile tipice de Salmonella crescute pe agar Wilson-Blaire sunt de culoare neagra inconjurate de o zona maro-negru cu luciu metallic pentru Salmonella Typhi si colonii negre fara halou in jurul coloniilor pentru S.Enteritidis. Coloniile tipice de Salmonella crescute pe agar Kristensen,au o culoare roz,sunt netede,plate,inconjurate de o zona clara de culoare rosie a mediului. Pentru confirmare,din fiecare placa cu fiecare din cele doua medii selective,se ia cel putin o colonie considerate a fi tipica sau suspecta si alte 4 colonii,daca prima este negative. Daca se gaseste o placa cu mai putin de cinci colonii tipice sau suspecte,se retin toate coloniile tipice sau suspecte. Se insamanteaza coloniile selectate,pe suprafata uscata in prealabil a placilor cu agar nutritive,astfel incat sa se obtina dezvoltarea de colonii isolate. Se incubeaza placile astfel inoculate,in thermostat la 371C,timp de 243 ore. Pentru confirmarae biochimica si serologica se folosesc culture pure. 7.5. Confirmarea biochimica 7.5.1 Confirmarea biochimica cu mediile de cultura Cu ajutorul unei anse efilate se insamanteaza,cu fiecare din culturile obtinute din coloniile retinute,urmatoarele medii: Agar TSI Se insamanteaza coloana agarului TSI,prin intepare,iar panta prin striere.. Se in cubeaza in termostat la 371C,timp de 243 ore. Se interpreteaza modificarile ce se produc,in modul urmator. Coloana galbena-glucozo-pozitiva (fermentarea glucozei) - rosie sau neschimbata - -glucozo-negativa(lipsa fermentarii glucozei) - neagra-formare de hidrogen sulfurat - bule sau fisuri formare de gaz din glucoza Panta-galbena-lactozo si/sau zaharozo-pozitiva (fermenteaza lactoza si/sau zaharoza) rosie sau neschimbata lactozo si zaharozo-negativa (nu fermenteaza nici lactoza si nici zaharoza). Culturile tipice de Salmonella corespund unei pante alcaline (rosie),cu formarea (in 90% din cazuri) hidrogenului sulfurat(innegrirea agarului). Atunci cand se izoleaza o Salmonella lactoza pozitiva,panta agarului TSI este galbena.In consecinta,o confirmare preliminara a culturilor de Salmonella nu trebuie sa se bazeze doar pe rezultatele obtinute pe agarul TSI. Agar cu uree Se insamanteaza panta agarului prin striere.Se incubeaza in termostat la 371,timp de 243 ore si se examineaza din cand in cand. In cazul reactiei positive,descompunerea ureei produce degajarea amoniacului,facand sa vireze rosu de fenol la roz,apoi la rosu inschis.Reactia este deseori vizibila dupa 2-4 ore.

 Mediu pentru decarboxilarea L-lizinei Se incubeaza mediul lichid,sub suprafata.Se incubeaza in termostat la 371C,timp de 243 ore. Turbiditatea si o coloratie purpurie,dupa incubare,indica o reactie pozitiva,o culoare galben indica o reactie negative. Evidentierea -galactozei Se disperseaza o ansa din colonia suspecta,intr-o eprubeta ce contine 0,25 ml solutie salina,se adauga o picatura toluene si se agita eprubeta.Se introduce eprubeta in baia de apa termoreglabila,reglata la 37C si se lasa sa stea cateva minute (aproximativ 5 minute). Se adauga 0,25 ml reactiv pentru evidentierea -galactozidazei si se amesteca. Se reintroduce eprubeta in baia de apa termoreglabila (Anexa 4),reglata la 37 C si se lasa 243 ore.O culoare galbena indica o reactie pozitiva.Reactia este de obicei vizibila dupa 20 minute. Daca se folosesc discuri de hartie preparata,se respecta instructiunile fabricantului. Mediu pentru reactia Voges-Proskauer (VP) Se disperseaza o ansa din colonia suspecta,intr-o eprubeta ce contine 3ml mediu VP.Se incubeaza in termostat la 371C,timp de 243 ore. Dupa incubare,se adauga doua picaturi din solutia de creatina,trei picaturi din solutia alcoolica de 1-naftol si apoi doua picaturi din solutia de hidroxid de potasiu,agitnd dupa adaugarea fiecarui reactive.Formarea unei coloratii roz pna la rosu aprins,intr-un interval de 15 min.indica o reactie pozitiva. Mediu pentru evidentierea indolului Se insamanteaza o eprubeta ce contine 5 ml mediu triptona/triptofan,cu colonia suspecta. Se incubeaza in thermostat la 37 1C,timp de 243 ore.Dupa incubare se adauga 1 ml reactiv Kovacs.Formarea unui inel rosu indica o reactie pozitiva,un inel galben-brun indica o reactie negativa. Tabel nr.1-Interpretarea testelor biochimice Specia de Salmonella S.Paratyphi S.Paratyphi S.Paratyphi A B B Rea ctia + % b) 100 Rea ctia + % c) Rea ctia + % c)

S.Typhi

Alte specii

Rea ctia Mediu TSI formare de acid datorita fermentarii glucozei Mediu TSI formare gaz din glucoza Mediu TSI formare de acid datorita fermentarii lactozei Mediu TSI formare +

% b) 10 0 0 2

Rea ctia +

% b) 10 0 92 1

_d) _

+ _

100 100

+ _

+ _

+ _

acid datorita fermentarii zaharozei Mediu TSI formare de hydrogen sulfurat Hidroliza ureei Decarboxilarea lizinei Reactia Bgalactozidazei Voges-Proskauer Formare de indol

_ + + _ -

0 97 0 98 0 0 0

_ _ _ -

0 10 0 0 0 0 0

_ + + _ -

_ + + _ -

_ + + _ -

1 92 1 95 2 e) 0 1

a)Preluat din referinta SR EN ISO 6579/2003

b)Aceste procente indica ca nu toate izolatele de serotipuri de Salmonella dau reactii marcate cu + sau -.Aceste procente pot varia ntre si in cadrul serotipurilor din cauza otravirii serotipurilor de la diverse componente ale alimentului. c) Procentele nu sunt date in literatura publica d) Salmonella Typhi este anaerogenica c) Salmonella enterica subspecia arizonae da o reactie lactozo-pozitiva sau negative,dar este ntotdeauna galactozidazo-pozitiva.Pentru studiul acestor specii este necesara efectuarea de teste suplimentare. 7.5.2 Confirmarea biochimica cu analizorul microbiologic mini API 7.5.2.1 Principiul metodei Testul biochimic se efectueaza cu galleria ID 32 E,care utilizeaza 32 substante biochimice in 32 microtuburi.Microtuburile se insamanteaza cu suspensia din cultura selectionata si se incubeaza 24 ore la 37C,apoi se adauga reactivi specifici si se citeste la analizorul microbiologic mini API prevazut cu un program soft dedicate identificarii speciei bacteriene 7.5.2.2 Modul de lucru Din culturile obtinute cu colonii carcateristice pe mediul XLD se face testul oxidazei cu reactivi OX din trusa,apoi se prepara inoculul.Din coloniile carcateristice se realizeaza o suspensie bacteriana folosind mediul de suspensie NaCl 0,85 % cu opacitate de 0,5 Mc Farland,masurat cu densitometru.Din suspensia astfel realizata se inoculeaza cate 55 l cu pipeta electronica ATB in fiecare microtub din galerie.Microtuburile cu testele ODC,ADH,LDC,,URE,LARL si 5KG se acopera cu doua picaturi de ulei de parafina.Galeria astfel pregatita se incubeaza la 37C timp de 24 ore in conditii aerobe intr-o cutie inchisa care are un recipient cu putina apa,sau intr-o tavita cu un tampon de vata umeda.Dupa 24 ore de incubare se adauga in microtubul IND (cupula 00),o picatura reactive JAMES.Citirea automata se realizeaza cu programul soft.Cititorul inregistreaza culoarea din fiecare microtub si transmite informatia spre computer. Citirea vizuala se realizeaza cu ajutorul unei fise in care sunt notate toate rezultatele.Identificarea este obtinuta folosind soft-ul prin introducerea manuala a profilului numeric format din 11 cifre. Rezultatele obtinute prin reactia de culoare din cele 32 microtuburi (cupule),sunt prezentate in tabelul anexa.

Anexa:TABEL DE CITIRE

CUPULA TEST 1.0 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9 1.A 1.B 1.C 1.D 1.E 1.F 0.0 ODC ADH LDC URE LARL GAT 5KG LIP RP GLU MAN MAL ADO PLE GUR MNT IND*

REACTIE ornitin-decarboxilaza aginin dihidrolaza lizin-decarboxilaza ureaza L-arabitol(acidificare) Galacturonat(acidificare) 5-etogluconat (acidificare) Lipaza Rosu-fenol(acidificare) -glucozidaza Manitol(acidificare) Maltoza(acidificare) Adonitol(acidificare) Palatinoza(acidificare) -glucuronidaza Malonat Indol(producere)

REZULTATE NEGATIV POZITIV galben/galbenrosu/ portocaliu portocaliu galben-verde Galben/galben portocaliu Albastru-albastruverde Incolor Rosu-portocaliu incolor Albastru/albastruverde albastru violet roz-violet Galben/verdegalbui albastru galben albastru Galben/verde-galbui

incolor galben/verde pal

galben Albastruverde/albastru JAMES imediat

0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 0.A

NAG GAL GLU SAC LARA DARL -GLU -GAL TRE RHA

N-acetil--glucozaminidaza -galactozidaza glucoza(acidificare) zaharoza(acidificare) L-arabinoza(acidicare) D-arabitol(acidificare) -glucozidaza -galactozidaza trehaloza(acidificare) ramnoza(acidificare)

JAMES Incolor/galben/ Bej incolor albastru incolor galben albastru/albastru- galben/verde-galbui verde

incolor

galben

albastru/albastru- galben/verde-galbui verde

0.B 0.C 0.D 0.E 0.F

INO CEL SOR -MAL AspA

inozitol(acidificare) celobioza(acidificare) sorbitol(acidificare) -maltozidaza Acid L-aspartic arilamidaza

incolor/galben foarte pal incolor/galben foarte pal

galben galben

O culoare bej-maro trebuie sa fie observata in cupula inainte de adaugarea reactivului. 7.5.3.Confirmare serologica Sunt mai multe tipuri de seruri aglutinante,continand anticorpi fata de unul sau multi factori antigenici O,adica antiseruri continand unul sau mai multe grupe O(antiseruri monovalente sau polivalente),antiseruriVi si antiseruri continand anticorpi fata de unul sau mai multi factoriH (antiseruri monovalente sau polivalente). Trebuie sa ne asiguram ca antiserurile folosite pot identifica toate serotipurile de Salmonella. Cercetarea antigenelor O,Vi sau H de Salmonella se efectueaza prin aglutinare pe lama cu seruri adecvate,din colonii pure si dupa eliminarea tulpinilor autoaglutinabile. Eliminarea tulpinilor autoaglutinabile. Se depune,pe o lama de sticla curate,o picatura de solutie salina.Se disperseaza in aceasta picatura,o fractiune din colonia de testat,in asa fel incat sa se obtina o suspensie omogena si tulbure.Se misca lama timp de 30-60 secunde. Daca bacteriile se aduna in gramezi mai mult sau mai putin distincte,tulpina este considerate autoaglutinabila sin u mai trebuie supusa examinarilor ulterioare. Evidentierea antigenelor O Dintr-o colonie pura,cunoscuta ca neautoaglutinabila,se procedeaza ca la eliminarea tulpinilor aglutinabile,dar in locul solutiei saline se foloseste o picatura de antiser O. Daca se produce aglutinare,reactia se considera pozitiva.Se utilizeaza serurile poli si monovalente,unul dupa altul. Evidentierea antigenelor VI Se procedeaza ca la fel ca la eliminarea tulpinilor aglutinabile,utilizand o picatura de antiser VI.Daca se produce aglutinare,reactia este considerate pozitiva. Evidentierea antigenelor H. Se insamanteaza un agar nutritive semisolid cu o colonie pura neautoaglutinabila.Se incubeaza in termostat la 37C,timp de 18-24 ore.Se utilizeaza aceasta cultura pentru examenul antigenelor H,procedand ca la eliminarea tulpinilor aglutinabile cu o picatura de antiser H.Daca se produe aglutinare,reactia este considerate pozitiva. Interpretarea reactiilor biochimice si serologice

Recatii biochimice Tipice Tipice Tipice Reactii netipice Reactii netipice

Autoaglutinare Nu Nu Da Nu/Da Nu/Da

Tabel 2 Reactii serologice Interpretare Antigen O,VI sau H pozitiv Toate reactiile negative Netestat)5.7.5.6.1) Antigen O,Vi sau H pozitiv Toate reactiile negative Tulpini considerate ca fiind Salmonella Ar putea fi Salmonella

Nu sunt considerate a fi Salmonella

Confirmare definitive Tulpinile considerate ca fiind Salmonella (Tab.2),se trimit la un centru agreat (Institutul Cantacuzino Bucuresti) pentru identificarea acestor germeni,pentru dterminarea definitive a serotipului. Exprimarea rezultatelor In functie de rezultatul interpretarii,se indica germenilor din genul Salmonella in 25 grame(25 ml),10 grame respective 1 gram (1 ml) din proba de analizat,conform diagramei modului de lucru reprezentata in figura 2. 7.5.4

Fig.2.

DIAGRAMA MODULUI DE LUCRU

Prembogaire

Apa peptonata-tamponata la temperatura camerei

Incubare timp de 182h la 371C

mbogaire selectiva

0,1 ml cultur + 10 ml bullion RVS Incubare timp de 243ore la 41,51C

1 ml cultur + 10 ml bullion MKTTn Incubare timp de 243 ore la 371C

Izolare

Mediul XLD si al doilea agar la alegere Incubare timp de 243 ore la 371C

De pe fiecare placa se testeaza o colonie caracterisic.Dac rezultatul este negative,se testeaz alte 4 colonii

Agar nutritive Incubare timp de 243 ore la 371C

Confirmare

Confirmare biochimica Exprimare rezultate

Confirmare serologica

Fig.3 SCHEMA UTILIZARII TULPINILOR DE REFERINTA TULPINA DE REFERINTA

Cultivata o data

Subcultura

Verificari de puritate si teste biochimice

Retinere in conditii specifice (4C, 30 zile)

Materiale de lucru (medii de cultura)

Controlul de calitate regulat / zilnic

Pt. BIBLIOGRAFIE SR EN ISO 6579/2003 - Microbiologia produselor alimentare. Metoda orizontala pentru detectarea bacteriilor din genul Salmonella. 3.1.2 ISO 7218/2000 Directive generale pentru examene microbiologice. 3.1.3 SR ENV-ISO 11133-1/2002 Partea 1. Ghidul general pentru asigurarea calitatii pentru pregatirea mediilor de cultura in laborator. 3.1.4 STAS ISO 3100-2/1992 - Carne si produse din carne. Pregatirea esantioanelor pentru analiza in vederea examenului microbiologic Partea 2. 3.1.5 STAS 12922/1 1990 - Peste si produse din peste. Luarea si pregatirea probelor pentru analiza microbiologica. STAS 6343/1981 - Lapte si produse lactate. Pregatirea probelor pentru analiza