PRAKTIKUM IX UJI ANGKA LEMPENG TOTAL

I.

Tujuan Pada akhir praktikum diharapkan mahasiswa dapat menetapkan cemaran bakteri yang terdapat dalam sediaan makanan, minuman, kosmetika, obat atau obat tradisional

II.

Pendahuluan Uji angka lempeng total merupakan metode yang umum digunakan untuk

menghitung adanya bakteri yang terdapat dalam sediaan yang diperiksa. Uji angka lempeng total dapat dilakukan dengan dua teknik, yaitu: 1) Metode Cawan Tuang (Pour Plate) Sampel uji dituang dahulu ke dalam cawan Petri, kemudian ditambah media Agar yang telah dicairkan. Setelah itu digoyang-goyangkan agar tercampur homogen. Ketika sudah membeku/mengeras, diinkubasi dan selanjutnya dihitung koloni yang tumbuh. Keuntungan khusus. Kerugian : hanya sesuai untuk mikroba yang tahan panas dan membutuhkan : dapat diperoleh suspensi yang homogen dan tidak perlu teknik

suspensi yang cukup banyak. 2) Metode Cawan Sebaran (Spread Plate) Media Agar dituang dahulu pada cawan Petri, kemudian ditunggu hingga mengeras/membeku. Sampel uji diratakan di atas permukaan media Agar dengan spreader, diinkubasi, dan selanjutnya dihitung koloni yang tumbuh. Keuntungan : dapat dilakukan baik untuk mikroba yang tahan maupun tidak

tahan terhadap panas serta sediaan yang diperlukan untuk diuji lebih sedikit dibandingkan dengan metode cawan tuang. Kerugian : diperlukan teknik khusus, sebab jika saat meratakan sampel

dengan spreader pada medianya kurang baik, dapat mengakibatkan koloni yang tumbuh akan menumpuk dan sulit dihitung jumlahnya.

Pada prinsipnya dilakukan pengenceran terhadap sediaan yang diperiksa kemudian dilakukan penanaman pada media lempeng agar. Jumlah koloni bakteri yang tumbuh pada lempeng agar dihitung setelah inkubasi pada suhu dan waktu yang sesuai. Perhitungan dilakukan terhadap petri dengan jumlah koloni bakteri antara 30-300. Angka lempeng total dinyatakan sebagai jumlah koloni bakteri hasil perhitungan dikalikan faktor pengencer.

III.

Alat dan Bahan Alat

1) Petri 2) Tabung reaksi 3) Labu Erlenmeyer 4) Blue tip 5) Gelas ukur 10 ml Bahan 1) Sampel yang diperiksa (serbuk jamu) 2) Medium Plate Count Agar (PCA) dalam larutan fisiologi

IV.

Cara Kerja

Timbang 1 gram sampel yang akan diperiksa kemudian dilarutkan dalam 10 ml larutan pengencer Lakukan pengenceran sampai 10-5 Tuang sebanyak 1 ml suspensi hasil pengenceran pada cawan petri Tuangkan medium PCA (suhu 40C) yang telah disterilkan ke dalam setiap cawan petri Inkubasi pada suhu 37C selama 24 jam dalam posisi terbalik Lakukan perhitungan koloni dan angka lempeng total bakteri yang tumbuh pada cawan petri

Perhitungan: Dipilih cawan petri dari satu pengenceran yang menunjukkan jumlah koloni antara 30-300. Jumlah koloni rata-rata dari kedua cawan petri dihitung lalu dikalikan dengan factor pengencernya. Hasil dinyatakan sebagai Angka Lempeng Total dalam tiap gram contoh. Untuk beberapa kemungkinan lain yang berbeda dari pernyataan di atas, maka diikuti petunjuk sebagai berikut: Bila hanya salah satu diantaranya kedua cawan petri dari pengenceran yang sama menunjukkan jumlah antara 30-300 koloni, dihitung rata-rata dari kedua cawan dikalikan dengan factor pengenceran. Bila pada cawan petri dari kedua tingkat pengenceran yang berurutan menunjukkan jumlah antara 30-300 koloni, maka dihitung jumlah koloni dan dikalikan factor pengenceran kemudian diambil angka rata-rata. Jika pada tingkat pengenceran yang lebih tinggi didapati koloni yang lebih besar dua kali jumlah koloni pada pengenceran dibawahnya, maka dipilih tingkat pengenceran terendah. Bila dari seluruh cawan petri tidak satupun yang menunjukkan 30-300 koloni, maka dicatat angka sebenarnya dari tingkat pengenceran terendah dan dihitung sebagai Angka Lempeng Total perkiraan. Bila tidak ada pertumbuhan pada semua cawan petri dan bukan disebabkan karena inhibitor, maka Angka Lempeng total dilaporkan sebagai kurang dari satu dikalikan dengan factor pengencer paling rendah Bila jumlah koloni per cawan lebih dari 300, maka cawan dengan tingkat pengenceran tertinggi dibagi dalam beberapa sector (2,4 atau 8). Jumlah koloni dikalikan dengan factor pembagi dan fakor pengencerannya. Hasil dilaporkan sebagai Angka Lempeng Perkiraan Bila jumlah koloni lebih dari 200 pada 1/8 bagian cawan, maka jumlah koloni adalah 200 x 8 x factor pengenceran. Angka lempeng total perkiraan dihitung sebagai lebih besar dari jumlah koloni yang diperoleh.

V.

Hasil Pengamatan Gambar Pengamatan Faktor Pengenceran Jumlah Koloni Angka Lempeng Total

1x

85

85

10x

10

100x

400

1000x

3000

10000x

10000

100000x

11

1100000

VI.

Pembahasan Percobaan ini bertujuan agar mahasiswa dapat menetapkan cemaran bakteri yang

terdapat dalam obat tradisional. Obat tradisional yang akan ditetapkan cemaran bakterinya, yaitu jamu NIRAN. Jamu NIRAN adalah obat yang berkhasiat/berguna untuk memelihara kesehatan dan daya tahan tubuh serta membantu memelihara fungsi hati. Sediaan jamu dalam kemasan botol biasanya dinyatakan steril, namun pernyataan ini tidak menjamin bahwa sediaan tersebut bebas dari kontaminan khususnya

mikroorganisme. Dengan demikian perlu dilakukan penetapan cemaran bakteri dalam sediaan dengan salah satunya uji angka lempeng total, dimana sediaan tersebut memenuhi aturan Departemen Kesehatan RI jika angka lempeng total kurang dari 106.

(Hogg, 2005) Pada percobaan ini uji angka lempeng total menggunakan metode cawan tuang. Metode ini mempunyai keuntungan, yaitu tidak diperlukan keahlian khusus dalam pelaksanaannya dan dapat diperoleh suspense koloni yang homogen, tetapi metode ini hanya cocok untuk mikroba yang tahan terhadap pemanasan. Adanya koloni bakteri pencemar dalam sediaan jamu tersebut dapat disebabkan oleh adanya kontaminasi mikroba udara pada saat pengemasan. Pada prinsipnya, uji angka lempeng total dilakukan dengan pengenceran terhadap sediaan yang diperiksa kemudian dilakukan penanaman pada media pertumbuhan. Jumlah koloni bakteri yang tumbuh dihitung setelah inkubasi pada suhu dan waktu yang sesuai. Perhitungan dilakukan terhadap petri dengan jumlah koloni bakteri antara 30-300. Angka lempeng total dinyatakan sebagai jumlah koloni bakteri hasil perhitungan dikalikan faktor pengencer. Medium pertumbuhan yang digunakan adalah Plate Count Agar (PCA). Medium yang digunakan untuk menumbuhkan bakteri harus memenuhi persyaratan berikut. 1. Susunan nutrisi harus memenuhi kebutuhan bakteri untuk tumbuh seperti sumber nitrogen dan karbon. 2. 3. 4. 5. Derajat keasaman (pH) relatif normal. Temperatur optimum. Tekanan osmotik harus isotonis. Sterilitas terjaga. (Sylvia, 2008) Pada percobaan ini pertama-tama dilakukan penimbangan 1 gram sampel (serbuk jamu NIRAN) dan dilarutkan dalam 10 ml larutan pengencer. Larutan pengencer yang digunakan adalah larutan saline (mengandung 0,9% NaCl). Digunakan larutan saline sebagai pengencer agar tekanan osmotik sitoplasma sama dengan tekanan osmotik medium dan menghindari lisis atau mengerutnya sel bakteri yang ada dalam sediaan uji. Dan tujuan dilakukannya pengenceran agar bakteri yang tumbuh tidak menumpuk dan

tidak

mempersulit

pengamatan.

Kemudian, dibuat seri pengenceran 100, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, dan 10-5. Hal ini dilakukan untuk melihat dan

membandingkan jumlah koloni yang tumbuh pengenceran. pada masing-masing

(Benson, 2001) Setelah itu, dituang 1 ml suspense hasil pengenceran pada cawan petri. Kemudian, ke dalam setiap cawan petri tersebut dituangkan medium PCA (suhu 40C) yang telah disterilkan. Suhu medium perlu ditunggu sampai 40C sebelum dituang, agar bakteri tidak mati dan suhu medium tidak boleh terlalu dingin agar tidak terjadi pemadatan medium sehingga medium tidak dapat dituang ke cawan petri. Setelah itu, petri diinkubaasi pada suhu 37C selama 24 jam dalam posisi terbalik. Suhu perlu diset 37C, karena merupakan suhu optimum pertumbuhan bakteri. Dan diinkubasi selama 24 jam, karena diasumsikan sudah ada bakteri yang tumbuh dari cemaran sediaan uji, sehingga sudah dapat dilakukan pengamatan. Percobaan ini dari pengenceran sampai dimasukkannya medium PCA ke dalam petri dan ditutup dilakukan di dalam LAF (Laminair Air Flow) dan alat-alat yang dimasukkan ke dalam LAF disemprotkan dengan alcohol agar syarat kerja aseptis terpenuhi. Hal lain yang perlu diperhatikan adalah pemberian label pada cawan petri berupa keterangan yang penting agar tidak terjadi kesalahan pendataan karena tertukarnya data. Berdasarkan hasil pengamatan, pengenceran yang dipilih untuk perhitungan angka lempeng total berdasarkan prosedur perhitungan yaitu pengenceran 10-0 karena koloni yang tumbuh 85 koloni, dimana jumlah koloni yang tumbuh berada di antara 30-300 koloni. Jadi dari hasil perhitungan, angka lempeng total sediaan uji yaitu 85, dimana lebih kecil dari pada batas kemanan Departemen Kesehatan RI yaitu 106, sehingga dapat disimpulkan bahwa sediaan ini aman untuk dikonsumsi. Berdasarkan hasil pengamatan juga dapat dilihat bahwa koloni yang tumbuh pada faktor pengenceran 1x adalah 85 koloni, 10x adalah 1 koloni, 100x adalah 4 koloni, 1000x adalah 3 koloni, 10000x adalah 1 koloni, dan 100000x adalah 11 koloni. Hal ini tidak sesuai teori, dimana semakin besarnya pengenceran, semakin sedikit jumlah koloni yang

tumbuh. Pengamatan ini belum menunjukkan hasil yang sebenarnya karena tidak dibuat kontrol media seperti blanko yaitu medium tanpa penambahan apapun untuk mengetahui apakah media steril dan pengerjaan dilakukan sudah aseptis, adanya penumpukkan bakteri dan perhitungan koloni dilakukan secara manual.

VII.

Kesimpulan

1) Hasil pengamatan menunjukan bahwa jamu NIRAN yang digunakan sebagai sampel aman dikonsumsi karena berdasarkan hasil pengamatan didapatkan angka uji angka lempeng totalnya adalah 85. Dimana angka lempeng total ini kurang dari batas keamanan Departemen Kesehatan RI yaitu 106. 2) Berdasarkan hasil pengamatan, koloni yang tumbuh pada pengenceran 100.000x lebih besar dari pengenceran 10.000x. Hal ini tidak sesuai dengan teori dimana semakin besarnya pengenceran, semakin sedikit jumlah koloni yang tumbuh. Hal ini dapat disebabkan oleh adanya kontaminan.

VIII.

Daftar Pustaka

Benson, 2001, Microbiological Application Lab Manual, 8th ed, The McGraw-Hill Companies, New York Hogg, Stuart, 2005, Essential Microbiology, John Wiley & Sons Ltd., England Pratiwi, sylvia, 2005, Buku Ajar Mikrobiologi Farmasi, Fakultas Farmasi UGM, Yogyakarta

Yogyakarta, 14 Desember 2011 Asisten Koreksi, Praktikan,

____________________

Dwinita A. Palilu (FA/08627)

Lampiran Jawaban Pertanyaan 1. Metode cawan tuang dan sebaran dilakukan dengan cara sebagai berikut: Metode Cawan Tuang (Pour Plate) Sampel uji dituang ke dalam Petri, kemudian ditambahkan media agar yang telah dicairkan. Lalu digoyang-goyangkan agar tercampur homogen. Tunggu hingga mengeras dan diinkubasi kemudian dihitung koloni yang tumbuh. Metode Cawan Sebar (Spread Plate) Media agar dituang terlebih dahulu pada Petri, ditunggu hingga mengeras. Setelah itu, sampel uji diratakan di atas permukaan media agar dengan bantuan spreader glass. Kemudian diinkubasi serta dihitung koloni yang tumbuh. Percobaan ini dilakukan dengan metode cawan tuang. 2. Metode Cawan Tuang Keuntungan Kerugian : diperoleh suspensi yang homogen : mikroba bisa mati jika media dituang dalam keadaan terlalu panas

Metode Cawan Sebar Keuntungan Kerugian : mikroba tidak akan mati karena media sudah mengeras (dingin) : Jika kerataan sampel kurang sempurna, maka bisa mengakibatkan

koloni yang tumbuh menumpuk dan sulit diamati sehingga perhitungan koloni juga susah.

MIKROBIOLOGI FARMASI

PERCOBAAN IX UJI ANGKA LEMPENG TOTAL

Nama NIM Golongan Kelompok Kelas Tanggal Praktikum Pengampu Asisten

: Dwinita A. Palilu : 10/302169/FA/08627 : IV :3 :C : 8 Desember 2011 : Dr. Erna : Raisha

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI BAGIAN BIOLOGI FARMASI FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS GADJAH MADA YOGYAKARTA 2011