OBJETIVOS Conocer la actividad enzimtica de la alfa-amilasa.

Conocer cmo afectan las distintas condiciones en que acta la enzima alfaamilasa

INTRODUCCIN

La alfa-amilasa es una enzima proteica que se encuentra en la saliva humana y cataliza la degradacin del almidn, que es un polisacrido de reserva vegetal . El almidn est formado por dos tipos de molculas: la amilosa y la amilopectina, ambos polisacridos de glucosa. La amilosa se conforma por cadenas lineal es de glucosas unidas por enlaces a- C1- C4, mientras que la amilopectina tiene, adems de estos ltimos enlaces, uniones C1 con C6, formando cadenas ramificadas. La alfaamilasa rompe uniones C1- C4, tanto en la amilasa como en la amilopectina, dejando dextrinas lineales y ramificadas ( oligosacridos) como productos. Para medir la actividad enzimtica de la alfa-amilasa, se utilizar un test colorimtrico que detecta el almidn. Par a ello se contar con una solucin de iodo/ ioduro de potasio ( I2/ I K) , ya que el almidn en presencia de esta solucin adquiere una coloracin azulada caracterstica. Esto tiene una explicacin fsica: el iodo se coloca en el interior de la hlice que forma la amilosa ( en las regiones hidrofbicas) , formando un complejo de color azul. Cuando la alfa-amilasa acta, degrada la amilosa, se desintegra la hlice y por tanto en presencia de I2/ IK ya no dar una coloracin azul. Por lo tanto, en este TP mediremos la desaparicin de sustrato ( evidenciada por el test colorimtrico) para determinar la actividad de la enzima. Adems, analizaremos cmo afectan las distintas condiciones en que acta la enzima ( pH, temperatura, concentracin de NaCl ), as como los efectos que pueden causar diferentes pre tratamientos ( proteinasa, calor ). La dilucin ptima nos indicar cunto debemos diluir la saliva para que se logre el efecto acromtico dentro del rango propuesto ( 2- 8 minutos) .

METODOLOGA: Se parti de una muestra de saliva y se la recogi en un vaso de precipitado que se coloc en un recipiente con hielo para reducir la energa cintica ( para disminuir el contacto de las molculas, reduciendo las interacciones qumicas que se pudieran producir ) de compuestos presentes en la saliva que puedan afectar el funcionamiento de la protena.

A partir de la muestra, se tom una alcuota para impregnar un papel indicador de pH sobre un papel blanco. El pH obtenido fue entre 7- 8. Desde aqu , el trabajo se dividi en dos partes: una par a determinar la dilucin ptima y el tiempo de referencia y la otra, modificando una de las condiciones experimentales.

PAR T E 1: Se tom 1 ml de saliva de la muestra del vaso de precipitados y se lo diluy con 9 ml de agua destilada en un tubo de ensayo, obteniendo una dilucin 1/ 10. Luego se mezcl por inversin, evitando que la solucin adquiera energa cintica y se produzca la desnaturalizacin de la enzima de nuestro inters; y se lo coloc en hielo, por la misma razn antes expuesta. Se prepar una gradilla con 15 tubos, conteniendo cada uno una solucin ( de coloracin amarilla) de 5ml de agua de la canilla y una gota deI2/ IK 0,01M, que se mezcl por agitacin par a obtener una solucin homognea. Luego, se nos entreg una solucin de almidn 1% p/ v a bao trmico a 37 C ( par a que conforme una solucin homognea) . Se extrajeron 6 gotas con pipeta Pasteur de la solucin de almidn y se la volc en un tubo 0 de la gradilla, mezclndolo por inversin y obteniendo un color azul caracterstico del complejo Iodo- almidn.

Prontamente, se coloc en el tubo con almidn 1 ml de la di l ucin 1/ 10 de la saliva ( que contiene a amilasa) y en ese instante se comenz a cronometrar . A los 30 segundos, se retiraron 6 gotas de esta solucin a 37C donde deba ocurrir la reaccin y se las agreg al tubo 1 de la gradilla. Este procedimiento se debera haber repetido cada 30 segundos par a los siguientes tubos hasta que la muestra adquiriera un color parduzco, sin embargo, ya en el tubo 1, al mezclar lo por inversin con un tapn de goma, se obtuvo una coloracin parda. Como el efecto acromtico explicado en la introduccin se haba dado

antes de los 2 minutos, era evidente que la dilucin 1/10 no era la ptima. Por eso, se decidi una nueva dilucin 1/50. Par a obtener esta dilucin, se tom 1 ml de la 1/10 de saliva y se la coloc en un tubo de ensayos con 4 ml de agua destilada, mezclndolo por inversin. Se repiti el procedimiento anterior de la medicin de la reaccin enzimtica y de esta manera se determin el tiempo de referencia para la dilucin1/50, que ser la dilucin ptima.

PARTE 2: Se le asign un tratamiento distinto para analizar la actividad de la enzima alterando las condiciones anteriores (modificando una sola variable). Recib una solucin NaCl 0,1 M para analizar los efectos de la presencia de NaCl sobre la amilasa. Para realizar estar parte, se trabaj con una dilucin de saliva al doble de la dilucin optima (es decir, 1/100 de saliva). Se pipetearon 0,5 ml de la dilucin 1/50 de saliva para mezclarlos por inversin con 0,5 ml de NaCl. Se repiti el procedimiento realizado en la parte 1 y se encontr el tiempo en el que se logr el efecto acromtico para la saliva diluida con NaCl. No obstante, este tiempo no se puede comparar con la dilucin 1/50 de la saliva puesto que se t rata de diluciones de saliva distintas. Por lo tanto, se elabor una medicin control (con el mismo procedimiento anterior pero partiendo de una dilucin 1/100 de saliva en agua destilada sin NaCl). Para la medicin control se realizaron 17 tubos.

DISCUSIN: Para empezar, se ha de aclarar que las diluciones ptimas para salivas de diferentes personas son distintas porque las caractersticas y concentraciones de los compuestos varan de una persona a otra. Esto mismo ocurre con el pH salival y el tiempo de referencia. El rango de 2 a 8 minutos para el efecto acromtico elegido se debe a que los tiempos sean manejables en el trabajo prctico. Si se buscase un tiempo de referencia muy pequeo, los cambios no hubiesen sido apreciados. Por los experimentos que realizamos en el TP, no se puede conocer la forma en que el NaCl aumenta la actividad de la enzima, sin embargo, una vez finalizado el TP, nos informaron que recientes descubrimientos dieron a conocer que la alfa-amilasa contiene en los restos aminoaciditos de su sitio activo Cl- - , y por ello, al agregar NaCl, los aniones cloruro se unen al sitio activo aumentando la actividad enzimtica. Es decir, el cloro acta como cofactor de la enzima. La protenas K es una proteasa, es decir, tiene una actividad especfica la cual consiste en degradar protenas. La misma acta rompiendo los enlaces dbiles del poli pptido, hasta que adquiera su estructura primaria y, por lo tanto, pierda su funcionalidad. La proteinasa K (100 ml, disuelta en una solucin acuosa con buffer) se incuba con la dilucin de saliva (1 ml) durante 1h. a 50 grados Celsius (todo este proceso es el pretratamiento de la dilucin). Luego de este lapso de tiempo se agrega la saliva tratada con proteinasa a los 10 ml de almidn y se repite el procedimiento para la determinacin de la actividad enzimtica realizado en la Parte 1. Al ser la amilasa una protena, uno esperara que la proteinasa le haga perder su funcionalidad. Sin embargo, esto no ocurri, puesto que luego de un determinado periodo de tiempo se observ el efecto acromtico, es decir, la amilasa estaba actuando. Esto se puede explicar de diversas maneras. Por ejemplo, nunca averiguamos la concentracin de la enzima en la saliva, por lo tanto, tal vez era muy superior a la de la proteinasa y por eso no llego a cumplir se funcin. De la misma manera, hay que tener en cuenta el periodo de incubacin. Tal vez no fue suficiente para que la proteinasa k degrade a la amilasa. Por ltimo, cabe aclarar que se efectu un controlo de reaccin para no concluir errneamente. Se coloc en un tubo una dilucin de saliva pero son solo el buffer, para asegurarnos que no haya agentes externos que afecten los resultados.

En el pre-tratamiento de la enzima a una temperatura de 100 C durante 10 minutos se t rato previamente a la dilucin optima de saliva 1/50 durante 7 minutos en un bao de agua a 100o C, pero al medir la actividad enzimtica, con el mismo procedimiento descrito en la parte 1, no se observ ningn cambio del color azul, (por lo que se puede decir que no se produjo el efecto acromtico), durante 7 minutos ( que es el tiempo de referencia obtenido por el grupo 2 con pH salival entre 7 y 8). A partir de los resultados obtenidos se podra -amilasa se desnaturaliza al ser expuesta a una temperatura tan elevada, ya que se produce un exceso de choques entre las molculas presentes en la saliva como consecuencia del aumento de la energa cintica, produciendo la ruptura de las uniones dbiles (como puentes de hidrogeno, fuerzas de van der Waals, interacciones inicas), que afecta la estructura terciaria de la enzima y a su vez la conformacin de su sitio activo, perdiendo la capacidad de romper las uniones C1-C4 de las glucosas. Y es por esto que el color azul no desaparece en los tubos de ensayo. Con respecto a la influencia del pH del medio en la actividad enzimtica de la -amilasa, podemos decir que a pH extremos (es decir, muy cidos o muy bsicos) la enzima no funciona, o al menos disminuye notablemente su actividad. Esto podemos concluir a partir de los experimentos realizados por otros grupos, que, manteniendo el resto de las condiciones iniciales, midieron la act -amilasa en dos medios con pH extremos. El grupo 4 haba encontrado un tiempo de referencia de 6 minutos (aparicin del efecto acromtico) para su dilucin ptima y un pH salival de entre 6 y 7. Sin embargo, a un pH 2 (mas acido), no encontr cambios (es decir, no hubo efecto acromtico) en 10 minutos de reaccin. Algo parecido ocurri con el grupo 12, que haba encontrado un tiempo de referencia de 1 30 para un pH salival de entre 7 y 8, y cuando repiti el experimento en un medio con pH 12 (ms bsico) no hubo efecto acromtico en 4 minutos de reaccin. Todas las enzimas tienen un pH ptimo, en donde tienen mayor actividad, y a medida que se alejan de ese pH (para ambos lados) disminuyen su actividad. Esto se debe a que algunos restos aminoaciditos de las enzimas (en el caso de que sean protenas) tienen cargas y pueden ser los responsables tanto de mantener la estructura tridimensional de la protena como de interaccionar con el sustrato. El pH del medio (es decir, la presencia de iones H+ u OH- ) puede modificar las cargas de estos aminocidos y de este modo incluso desnaturalizar a la enzima. Debemos aclarar que aunque la enzima tenga actividad al pH salival de cada persona (siempre entre 6 y 8, segn la tabla), esto no quiere decir que este sea su pH ptimo. Para determinarlo experimentalmente, deberamos haber medido la actividad enzimtica a

diferentes pH para realizar una curva, pero no podemos determinar el pH ptimo amilasa a partir de los resultados de este TP.

En el tratamiento del efecto de la temperatura, se mide la actividad enzimtica como se efectu en la parte 1, pero incubando la reaccin a temperaturas diferentes de 37 C: a 0 C, a temperatura ambiente y a 70 C. A 0 C y a 70 C, no se presentaron cambios de color en los tubos de la gradilla, es decir que el color azul nunca desapareci. Por lo tanto, se podra decir que la amilasa no actu. En cambio, a temperatura ambiente si se presentaron cambios, pero en un tiempo mayor al de referencia del grupo que lo realizo. Esto era de esperarse, ya que cada enzima tiene un rango de temperatura optima y, en el caso de la amilasa, al encontrarse esta en el cuerpo humano (que siempre tiene una temperatura de 37 C), se supone que a temperatura ambiente no va a perder su actividad, pero si disminuirla, ya que los choques intermoleculares van a ser menores.

Sin embargo, al disminuir demasiado la temperatura, los choques entre las molculas disminuyen tambin, por lo que la actividad enzimtica baja hasta el punto en el que no se puede ver en el experimento. Por el contrario, al aumentar la temperatura de incubacin a 70 C, los choques entre las molculas se van a acrecentar de tal forma que la enzima se va a desnaturalizar. Es por ello que se presume que no se observaron cambios en los tubos.

BIBLIOGRAFIA

www.javeriana.edu.co/biblos/tesis/ciencias/tesis206.pdf

www.monografias.com/...pdf900/...amilasa/actividad-enzimatica-amilasa

www.scribd.com/doc/13590657/QUIMICA-CLINICA-AMILASA

www.alimentariaonline.com/media/MA002_enzimas4WSF.pdf - Mxico