GENETIK MHEND SLIGI

Soru: A A IDA VERILEN KEL MELER UYGUN SIRAYLA 2 BA LIK ALTINDA TOPLAYIP 2 ANLAMLI TMCE YAPINIZ! Ti Ri T-DNA T-DNA Ur veya tumor olu turan Saak kk olu turan Agrobacterium rhizogenes Agrobacterium tumefaciens 217594 (217.6 kb) baz ifti uzunlu unda 194140 (194.1 kb) baz ifti uzunlu unda Yakla k 20000 (20 kb) baz ifti uzunlu unda Yakla k 20000 (20 kb) baz ifti uzunlu unda Plazmiti Plazmiti

             

  

Gen transferi/genetik transformasyon/genetik mhendisli i tek bir hcreden btn bir organizma retmeyi hedefler. HCRE KAYNA I : EKSPLANT Kelime anlam yla ya ayan bir varl ktan al nm ya ayan para yada paralard r. Eksplant eksplant kltr ile elde edilir. Eksplant havyan ve bitkilerden elde edilebilir. Bitkilerden elde edilmi bir srgnn paras veya yapra n paras d r. Bitkilerde transformasyon iin kullan lacak hcreler; yaprak, gvde, hipokotil, kotiledonlar, embriyolar, reme hcreleri ya da kallus, sspansiyon ve protoplast kltrne ait hcrelerdir.

Eksplantlardan elde edilecek hcrelerin KOMPETANT ve TOTIPOTENT zellikte olmas gereklidir.

Gen aktar m yap lan hcrelerin di erlerinden ay rt edilebilmesi iin seici bir i aret (mark r) geni, Aktar lan genin bitkide ifade edilip edilmedi inin anla lmas na yard mc olmak zere raportr geni STAB L TRANSFORMASYON TRANS ENT TRANSFORMASYON

 

Agrobacterium arac l yla gen aktar m : Gnmzde, bitkilere gen aktar m nda en yayg n olarak kullan lan ara Agrobacterium tumefaciens bakterisidir. Bu bakteri sayesinde hemen hemen tm kltr bitki trlerinde transgenik bitkiler elde edilebilmektedir. Agrobacteriumun gen aktar m nda kullan lan 2 tr vard r. Bu trler tar m topraklar nda yzy llard r iftilerin nemli ba belalar ndan olmu tur. Agrobacterium tumefaciens: Bitkide ur-tmrolu umuna neden olur. Daha ok dikotiledon bitkileri konuku olarak seer. Agrobacterium rhizogenes: Bitkide saak kk olu umuna neden olur. Hem dikotoledonlarda hem de monokotiledonlarda etkilidir

A. tumefaciens in ta tmr olu urmas n n nedeni sahip oldu u Ti (Tumour inducing= tmr olu umunu te vik eden) plazmitinin T-DNA blgesini bitki genomuna entegre etmesidir. Ti plazmidi ba l ca 4 blgeden olu mu tur. Vir blgesi T-DNA aktar m iin gerekli olan trans faktrlerin retiminden sorumlu Ori blgesi replikasyon orijin noktas Opin blgesi bakteri metabolizmas iin gerekli olan proteinlerin, octopin ve nopalinin katabolizmas ndan sorumlu gen blgesi. T-DNA blgesi 24 bpl k sa ve sol u blgeleriyle s n rland r lm , bitki byme dzenleyici ve opin genlerini ta yan, bitkilerde tmr olu umdan sorumlu blge.

A. rhizogenes Yaralanan bitki blgelerinden salg lanan fenolik bile iklere kar kemo-hassas,  hem kendi genomlar nda hem de plazmidlerinde (Ri-root inducing) ta d klar genler arac l ile kendi DNA blgesini bitki genomuna aktar r ve bitkilerde saak kk (Hairy Root) hastal na yol aar.


Ri & Ti Plazmitlerinin Kar la t r lmas

Ti Plazmiti

Ri Plazmiti

T-DNA aktar m n n molekler mekanizmas

1. Agrobacteriumun bitki hcrelerine tutunmas ve koloni olu turmas 2. Virlens genlerin uyar lmas 3. T-DNA transferi 4. T-DNAn n bitki genomuna entegrasyonu 5. T-DNAn n genomda replikasyonu, transkripsiyonu ve translasyonu

1) Agrobacteriumun bitki hcrelerine tutunmas ve koloni olu turmas tmr olu umu iin gerekli olan ilk a amad r. Agrobacterium hcrelerinin yzeylerindeki polisakkaritlerin bitki hcrelerine tutunmada nemli rol oynad bildirilmektedir. Polisakkarit sentezi iin 20 kb bykl ndeki kromozomal attR lokusuna ihtiya duyulmaktad r. Bu lokus bakterinin bitki hcresine tutunmas iin gerekli olan genleri ta maktad r. Bakteri hcre duvar na tutunduktan sonra bakteri taraf ndan selloz lifleri sentezlenmekte ve bylece bitki hcre duvar nda ok say da bakteri y lmas gzlenmektedir.

2) Bakteri bitki hcre duvar na tutunduktan sonra, yaralanm bitki hcrelerinden salg lanan fenolik bile ikleri, Agrobacteriumun alg lanmas yla T-DNA aktar m i lemi ba lat l r. Normalde bitkilerde fitoaleksin ve lignin biyosentezinde rol ald tahmin edilen asetosringon (AS) gibi fenolik bile ikler, bakteri hcresine girerek vir genlerini uyarmaktad r. VirA proteini (91.6 kDa) yaralanm hcre taraf ndan salg lanan fenolik bile iklerle uyar l r. Uyar lan VirA, kendi fosfat n sitoplazmik bir DNA ba lanma proteini olan VirGyi fosforilizasyona u rat r. VirG daha sonra di er vir genlerinin ifadelerinin dzenlenmesinde transkripsiyonal faktr olarak grev yapar .

 

3) T-DNA transferi: T-DNAn n sa alt blgesi VirD2 proteini taraf ndan kesilir ve VirD2 proteini T-DNAn n 5 k sm na ba l kal r. Kesilmi T-DNA VirE proteini taraf ndan korunur. VirB proteini taraf ndan a lan k lcal bo luktan bitkiye transfer ba lat l r. T-DNA bitki hcre ekirde ine tek sarmal olarak girmekte ve kromozomlarla zorunlu bir rekombinasyon sonucunda birle mektedir. T-DNA ekirde e girdikten sonra, bir veya birka kopya halinde rastgele, bitki kromozomlar yla birle mekte ve bu birle mede kromozomlar n aktif k s mlar tercih edilmektedir.

Bitki hcresi ierisinde tek sarmal T-DNA kompleksinin ekirdek zar n geerek kromozomlara ynelmesinde en nemli grevi VirD2 ve VirE2 proteinleri stlenmektedir. VirD2nin ba l bulundu u T-iplikci i ile bitki DNAs nda mikro-homolog blgeler a lmakta ve T-DNAn n 3 ucu veya bu uca yak n blgeler bitki DNAs nda bulduklar homolog blgeler ilk temas (sinapsis) kurmaktad r. Bitki DNAs nda 3p5 ynnde yap sal a kl k olu makta ve bu a kl n 3 ucu endonkleaz enzimleri taraf ndan kesilerek, T-iplikci inin VirD2 proteinine ba lanan 5 ucundaki ilk nkleotid st sarmal bitki DNAs yla 5p3 ynnde e le mektedir. T-iplikci inin 3ucundaki fazla blgeler ve a lan bitki DNA paras endonkleaz veya 3p5 ekzonkleaz enzimleri taraf ndan paralanmaktad r. T-iplikci inin VirD2ye ba lanan 5 ucu ve di er 3 ucu, kesilen blgeden bitkinin alt sarmal DNAs ile birle mektedir.

T-iplikci inin 3p5 ynndeki bitki DNA sarmal na entegrasyonu tamamland ktan sonra, bitki DNAs onar lmakta ve T-iplikci i replikasyonla ift sarmal DNAya dn mektedir. T-DNAn n opin sentezi ve onc genlerinin transkripsiyonlar neticesinde opin retimi ve tmr olu umu meydana gelmektedir.

AGROBAKTER YUMLA GEN TRANSFER : ADIM-ADIM LEMLER N ZET

TOHUMLAR (DOMATES)


Transformasyonu d nlen bitki tohumlarlar n temiz hastal k ve zararlardan ari olmal d r. imlenme kabiliyetinin yksek olmas nemlidir.

TOHUMLARIN YZEY STER L ZASYONU



Domates tohumlar genellikle %20-50lik hipoklorit (ama r suyu) ve % 0.2- 0. Tween-20 solisyonuyal birkakez y kan r ve steril su ile durulan r. (Yzey Sterilizasyonu)

 MLEND RME

Temzlenmi olan tohumlar petri kaplar nda haz rlanm olan besin ortam nda imlendirilir. [Murashige ve Skoogs (MS)]

EKSPLANTLAR
   

Tohumlar n ekiminden yakla k 7 gn sonra domates tohumlar ndan kotiledon yapraklar olu ur. Kotiledonlar ieren fidecikler kesilerek s v MS ortam na transfer edilir. Bu yaprak paralar bu rnekte eksplantd r. Eksplant yapraktan, kotiledon yapraktan, embriyodan, hipokotilden, epikotilden olu abilecegini hat rlay n z!.

Besleme ve ndkleme Tabakas n n Haz rlanmas



ersinde MS/agar bulunan ortam n zerinde ttn kalus sspansiyon bulunan bir tabaka dklr. Bunun amac ttn kalus sspansiyonunun Agrobacteriumu indklemesini saglamakt r. (Vir genlerinin Uyar lmas n hat rlay n z!)

F LTRE DISKLER N N HAZIRLANIR



Olu turulan besi ortam ve kallus sspansiyon tabakas n n zeri bir filtre ka d yla (Disk) kapat l r.

Eksplantlar n Kesimi


Kotiledon yapraklar s v Besin ortam nda tekrar kesilerek kesim yzeyleri art r l r. Kesim yada yaralanma yzyleri Agrobacterium iin gen transfer yzeyleridir.

AGROBACTERIUM


Bir gece boyu eksplantlar filtre yzeyinde tutularak kompatent olmalar sa lan r. Eksplantlar Agrobacterium sspansiyonu ile mumale edilir.

Fazla AGROBACTERIUM Uzakla t r l r



Eksplantlarda bulunan fazla Agrobacterium filtre yard m yla uzakla t r l r.

DNA TRANSFER : Ko-Kltivasyon



Eksplantlar Agrobacterium ile 48 saat kltive edilir (cocultivation).

Besi Ortam n n Haz rlanmas



Ko-kltivasyondan sonra eksplantlar yeni bir besi ortam na al n r. Bu besi ortam nda seleksiyon iin antibiyotik ve bitki byme dzenleyicileri, zeatin riboside bulunur.

Eksplantlar n Transferi


Eksplantlar zeatin ieren MS besi ortam na al n r. Besi ortam nda kanamisin bulunur.

Rejenerasyon


Yakla k 3 hafta sonra, Eksplantlardan kallus olu umu ba lar. Kallus olu umu eksplantlar n yaral k s mlar ndan zeatinin etkisiyle gerekle ir.

Srgnlerin Olu umu



Yakla k 6 hafta sonra kallustan kan srgnler Zeatin ieren MS besi ortam na al n r.

Kklendirme Ortam


Yakla k 9 hafta sonra kallustan olu turulan srgnlerin kklendirme i lemine geilir. Bu ortam zeatin iermez ancak kanamisin ierir.

Transgenik Bitkiler


Yakla k 11 hafta sonra bitkiler MS besi ortam nda ve uygun antibiyotik artlarda kklenir.

Topra a Transfer


Kklenmi olan bitkiler saks lara transfer edilir. Akkilimasyon yada al t rma olay 4-5 gn srer. Bu a amaya 13 hafta sonra ula l r.

Seraya Transfer


Yakla k 15 hafta sonra bitkiler seraya transfere haz r hale gelir.

Biyolistik

Biyolistik, biyolojik ve balistik kelimelerinin k saltmalar n n birle tirilmesi eklinde adland r lan, hcrelerin DNA ile kapl h zland r lm mikro ta y c larla transfer edilmesinde kullan lan bir metottur.

  

   

1.Ate leme mili 2.Barut ate leyicisi 3. Mikro ta y c lar (tungsten partiklleri) ta yan makro ta y c (plastik mermi) 4. H zlanma tp 5. Durdurucu tabaka raf ve durdurucu tabaka 6. Makro ta y c y tutmu haldeki durdurucu tabaka 7. Ate lenmi mikro ta y c lar

Biyolistik (partikl bombard man ) Bu yntemin esas , yksek derecede h zland r lm mikrota y c ad verilen 1-2 m ap ndaki metal (o unlukla alt n ya da tungsten) partikller arac l yla, bir ate leme mekanizmas ndan yararlan larak DNAn n hedef dokulara aktar lmas d r. Mikro-ta y c lar makro-ta y c olarak adland r lan plastik bir silindir zerinden hedef dokulara do ru genellikle helyum gaz bas nc ile h zland r l r. Ate leme gerek mikro-ta y c lar n srtnmesinden do an srklenmeyi, gerekse yksek bas nl gaz okundan do abilecek hcre paralanmas n ve sesi engellemek iin vakum alt nda yap l r.

Metal partiklleri (Mikro-ta

y c lar)

 

Alt n partiklleri Tungsten partiklleri Tungsten partikllerinin ortalama aplar 0,5-2,0 mdir. Ancak dzensiz ekilleri ve belli hcre tipleri iin toksik etkili olmalar , DNA kelmesine neden olabilen yzey oksidasyonuna neden olmalar nedeniyle tercih edilmezler. Bunun yerine daha pahal olan ancak 1-3 m apta dzenli ekillere sahip olan alt n partiklleri kullan lmas tercih edilebilmektedir.

Metodun Uygulanmas
     

1. A ama: Partikllerin sterilizasyonu ve birbirlerinden ayr l mas 2. A ama: Partikllerin DNA ile kaplanmas 3. A ama: Mikro-ta y c lar n Makro ta y c lara yklenmesi 4. Eksplant n hedefe yerle tirilmesi 5. Ate leme 6. Seleksiyon ve rejenerasyon

Gen aktar m nda etkili faktrler

   

1.Partikl h zland rmada kullan lan helyum gaz n n bas nc 2. Mikro ta y c n n boyutu, tipi ve say s 3. Makro ta y c ile hedef doku aras ndaki uzakl k 4. DNAn n mikro ta y c partikllere yap mas iin kullan lan spermidin ve CaCl2n konsantrasyonu

Biyolistlik ynteminin ba l ca stnlkleri u ekilde s ralanabilir: -Kullan m kolayl , -Her ate lemede mikro-ta y c lar n birden fazla hcreye ula abilmesi, -Mikro-ta y c lara ba l genlerin biyolojik aktivitelerinin bozulmamas , -Polen, hcre kltrleri, bitki organlar , meristemler, kallus, olgunla mam embriyo, olgun embriyo paralar , yaprak paralar , mikrosporlar gibi e itli hedef dokulara uygulanabilmesi, -Mikro-ta y c lar n derin hcre katmanlar na ula abilmesidir.

Yntemin dezavantajlar
   

Dokulara zarar verebilmesi Ba ar l yntem iin denemelerin gerekmesi Ba ar l aktar m n s n rl yzdesi olmas Kullan lan malzemeler baz modellerde pahal

Mikro-enjeksiyon

Mikro-enjeksiyon En kesin biimde hcrenin istenilen blmesine DNAn n enjekte edilmesini sa layan mikro-enjeksiyon, kapiller mikropipetler yard m yla ve mikroskop alt nda gerekle tirilir. Mikro-enjeksiyonla protoplastlara, izole edilmi hcrelere, kallus, meristemler, zigotik ve mikrospor trevli proembriyolar gibi ok hcreli dokulara DNA aktar m mmkndr. Al c hcreler veya dokular sodyum alginat, agaroz veya poli-L-lisin ile ya da kapiler sistem kullan larak sabitlenir. DNA mikromaniplatr sistemine ba l kapiler bir mikropipet arac l ile do rudan hcrenin ekirde ine aktar l r. Hcre ve protoplastlara mikro-enjeksiyon yoluyla gen aktar m ttn, yonca ve baz Brassica trleri gibi e itli bitkilerde ba ar l bir ekilde uygulanmaktad r.

Mikro-enjeksiyon ynteminin avantajlar : Aktar lan DNAn n miktar optimize edilebilir. stenilen hcreye DNA aktar labilir. stenilen hcre k sm na DNA aktar m grsel olarak kontrol edilebilir. Mikrosporlar ya da birka hcreli pro-embriyolar gibi kk boyutlu hedef dokular kullan labilir. Zigotik embriyo kltr ve mikro-enjeksiyon yntemleri birlikte kullan larak her bitki trne gen aktar m yapabilmek mmkn olabilir.  Mikro-enjeksiyon ynteminin dezavantajlar ; Sadece bir hcreye DNA aktarabilmesi Deneyim gerektirmesi ve pahal olu u.

Protoplastlara gen aktar m Enzimatik yollarla hcre duvarlar uzakla t r lm bitki hcreleri, (yani protoplastlar) hcre sspansiyon kltr, kallus kltr ve farkl la m bitki dokular ndan izole edilebilir. PROTOPLAST: HUCRE DUVARI UZAKLA TIRILMI HCRE KISMIDIR

Kimyasal maddeler yard m yla, lipozomlarla veya membran geirgenli inin elektrik ak m ile de i tirilmesi (elektroporasyon) sonucunda protoplastlar gen aktar m nda kullanabilmektedir.

a) Kimyasal maddeler yard m yla gen aktar m : Polietilen glikol (PEG), polivinil alkol veya kalsiyum fosfat gibi kimyasal maddelerle protoplastlar n hcre zarlar n n geirgenlikleri geri dn ml olarak art r labilir. Genetik transformasyon iin protoplastlar, DNA ve kimyasal maddeler ile birlikte inkbe edilir. Bitki tr, kltr ko ullar , protoplast kayna ve izolasyon iin kullan lan yntemlerin yan s ra, transformasyon iin kullan lan tampon ve katyonla, ta y c DNAn n varl ve konsantrasyonu, plazmid ve ta y c DNA formu, hcre dngs, PEG gibi gen aktar m na yard mc kimyasal maddelerin konsantrasyonu gibi parametreler, protoplastlara gen akatr m frekans zerine etkilidir.


b) Lipozomlarla protoplastlara gen aktar m : DNA moleklleri, lipozomlar iinde kapsllendikten sonra e itli dokulara, hcre ve protoplast kltrlerine, pollen tplerine gen aktar m iin kullan l r. c) Elektraporasyon ile protoplastlara gen akatr m : Sspansiyon halindeki protoplastlara yksek voltajl elektrik ak m uyguland nda hcre zar n n geirgenli i geri dn ml olarak artar ve mikroporlar olu ur. Elektroporasyon s ras nda protoplastlar n bulundu u solsyonda DNA da bulundu undan membranda a lan porlardan DNA hcre iine girer porlar kapanarak hcrenin btnl sa lan r.