Molekularna biologija Vjeba 1.

DNK ekstrakcija iz biolokih uzoraka Ekstrakcija DNK predstavlja jedan od primarnih postupaka u genetikom inenjerstvu i molekularnoj biologiji uope. To je prvi korak u karakterizaciji genetikog materijala. Budui da je DNK (tj. nukleinske kiseline) osnovni nosilac nasljednih informacija, za bilo kakvu direktnu genetiku karakterizaciju neophodno je poznavati metode i tehnike izolacije DNK. Kao izvor DNK moe nam posluiti bilo kakav organski dio ili ostatak koji sadri elije sa jedrom. DNK podlijee izvjesnim organsko-degradacijskim procesima, to u velikoj mjeri oteeva izolaciju iz zastarjelih uzoraka (ali je mogue!). Postupak izolacije i karakterizacije nasljednog materijala se iroko primjenjuje u fundamentalnoj, istraivakoj biologiji i njenim primijenjenim granama: medicini, farmaciji, hortikulturi, umarstvu, forenzici, veterinarstvu, itd. za dijagnostike analize i transformaciju svojstava odabranih resursa npr. dobijanje biljaka otpornih na suu, dijagnostika sklonosti za tumor, dijagnostika AIDS-a tj. zaraenosti HIV-om i drugih infekcija, provjera rodoslova i istokrvnih linija npr. pasa ili konja, itd. Miller-ov protokol za ekstrakciju DNA (isoljavanje) iz brisa bukalne sluznice 1. Princip Ova procedura sadri osnovne upute za izolaciju DNK iz oralnih briseva. Protokol se bazira na lizi nukleiranih elija pomou ekstrakcijskog pufera i digestiji proteina sa Qiagen proteinazom. Nakon digestije slijedi serija isoljavanja sa 6M NaCl-om. NaCl uklanja zaostale proteine. DNK se konano izdvaja precipitacijom dodavanjem hladnog etanola i resolubilizacijom u tris-EDTA puferu ili destilovanoj vodi. 2. Uzorak Bris bukalne sluznice, osuen na zraku ili uronjen u izopropanol. 3. Kvalitet postupka a. Prije zapoinjanja procedure uvjerite se da su svi reagensi, instrumenti i aparati ispravni i da zadovoljavaju bar minimalne standarde za kontrolu kvaliteta procesa. b. Minimalno jedna negativna kontrola mora biti zastupljena i proi cijelu proceduru od poetka do kraja i analizirana zajedno sa ostalim uzorcima. 4. Sigurnost a. Svi uzorci moraju biti tretirani kao infektivni. Radi line sigurnosti preporuuje se koritenje zatitne opreme u laboratoriji. b. Odbacivanje biohazardnog otpada se vri na za to predvienom mjestu. c. Dobro se upoznati sa protokolima o sigurnosti i pouzdanosti procedure, prije samog poetka rada. 5. Procedura

Potrebni materijal i reagensi (po uzorku): -tubice vol. 1,5 ml 3 kom -PVC rukavice par -99% etanol oko 500 l -70% etanol 200 l -TE pufer ili ddH2O 50 l -pufer za ekstrakciju 550 l -Qiagen Pronase 100 l Potrebna oprema: -srednjeturana centrifuga -vorteks -pipetori 20, 200 i 1000 l -frizeri 20 a. Sakupljanje uzoraka Uzorci se uzimaju brisom, tj. vatiranim tapiem trljajui po unutranjosti usne duplje. b. Protokol za ekstrakciju: tapi sa bukalnom sluznicom potopiti u sljedei pufer: REAGENSI Kern Lysis pufer 20% SDS Qiagen Pronase UKUPNO Inkubirati 1 sat na temp. 60 C Dodati 200 l 6M NaCl-a, snano protresti 1 minut, Centrifugirati na 2500 rpm 15 min., Nakon centrifugiranja supernatant prebaciti u novu tubicu, Protresti 15 sekundi, Centrifugirati na 2500 rpm 15 min., Supernatant prebaciti u novu tubicu, Dodati 2 x vol. hladnog apsolutnog etanola, Okrenuti tubicu par puta, Centrifugirati 10 min na 10 000 rpm, Dekantirati etanol, Dodati 200 l 70 % etanola, promukati 10 sekundi, Centrifugirati 5 min. na 13 000 rpm, Dekantirati etanol, Staviti u speedvac i osuiti. Dodati 50 l dest. H2O. Ostaviti preko noi da se resolubizira, ili staviti 30 minuta u KOLIINA 500 l 50 l 100 l 650 l

termoblok na 37 oC.

Molekularna biologija Vjeba 2. DNK ekstrakcija iz biolokih uzoraka metod organske ekstrakcije Protokol za ekstrakciju DNK iz brisa bukalne sluznice metodom organske ekstrakcije Princip Ova procedura sadri osnovne upute za izolaciju DNK iz oralnih briseva. Protokol se bazira na lizi nukleiranih elija pomou ekstrakcijskog pufera i digestiji proteina sa Qiagen proteinazom. Nakon digestije slijedi serija ispiranja sa smjesom fenol/hloroform/isoamilni alkohol. Fenol uklanja zaostale proteine, a hloroform zaostali fenol. DNK se konano izdvaja precipitacijom dodavanjem hladnog etanola i resolubilizacijom u tris-EDTA puferu ili destilovanoj vodi. Procedura Potrebni materijal i reagensi (po uzorku): -tubice vol. 1,5 ml 3 kom -PVC rukavice par -99% etanol oko 500 l -70% etanol 200 l -TE pufer ili ddH2O 50 l -pufer za ekstrakciju 550 l -Qiagen Pronase 100 l -Fenol/Hloroform/isoamil alkohol (25:24:1) tapi sa bukalnom sluznicom potopiti u sljedei pufer: REAGENSI Kern Lysis pufer 20% SDS Qiagen Pronase UKUPNO KOLIINA 500 l 50 l 100 l 650 l

Inkubirati 1 sat na temp. 60 C U digestirani sadraj se doda 250 l fenola i 250 l smjese hloroforma i izoamilnog alkohola. Smjesa, mlijenobijela suspenzija, se muka runo 10 minuta i nakon toga centrifugira 10 min na 13000 obrtaja. Paljivo odstraniti supernatant (u kojem je DNK), pazei da se tipom ne zahvati vrsti sloj. Prebaciti supernatant u istu tubicu i isprati sa 400 l hloroformacentrifugirati 10 minuta na max broj obrtaja i odstraniti supernatant u novu epicu. Dodati 900 l ohlaenog apsolutnog etanola (i po mogunosti 40 l 3M NaOAc koji pomae precipitaciju). Ostaviti na ledu 20 do 30 min. Sadraj centrifugirati 15-20 min na 13000 obrtaja; Dekantirati alkohol. Talogu dodati 900 l 96% etanola uvanog na sobnoj temperaturi. Centrifugirati 15 minuta na 13000 obrtaja. Paljivo odliti ili otpipetirati alkohol ukoliko ima vie DNK. (ovaj korak ponoviti dva puta).

Resolubilizirati DNK u 50 l TE pufera. Molekularna biologija Vjeba 3. Kvantitativna i kvalitativna analiza izolovane DNK Postoji nekoliko metoda za kvantitativnu i kvalitativnu analizu izolovane DNK: Elektroforeza na agaroznom gelu, UV spektrofotometrija, Real-time PCR, Picogreen reagens Quantiblot itd. Od ovih nabrojanih metoda najee se koriste elektroforeza na agaroznom gelu te UV spektrofotometrija. Elektroforeza DNK na agaroznom gelu Princip Elektroforeza oznaava gibanje estica u elektrinom polju, dok elektroforeza DNK predstavlja tehniku koje se primjenjuje za separaciju biolokih molekula, baziranu na fizikim osobinama molekule, kao to su veliina, oblik, izoelektrina taka molekule. Najee se primjenjuje u analitike svrhe, za separaciju i analizu DNK fragmenata razliite veliine. Snaga elektrinog polja podstie migraciju fragmenata DNK kroz gel. Molekule koje se separiraju elektroforetski najee u svojoj strukturi sadre anionske ili kationske grupe, pa su prema tome dipolarni joni. Fragmenti DNK putuju ka pozitivnoj elektrodi, anodi, zbog negativnog naboja koji nosi DNK molekula. Fragmenti vee molekulske mase migriraju sporije kroz gel, u odnosu na fragmente manje molekulske mase ija je migracija bra. Veliina fragmenata separiranih na gelu se determinira komparacijom uzorka sa DNK ladder-om, koji sadri fragmente DNK poznate veliine i slui kao referentni sistem. Izbor sistema pufera je bitan, jer o njemu ovisi koliina elektrine energije koja se moe primjeniti na sistemu. Ako je dovod struje previsok, dolazi do pretjeranog zagrijavanja, to moe uzrokovati denaturaciju uzorka, a ako je dovod struje prenizak, ne dolazi do pretjeranog zagrijavanja, ali elektroforeza traje dugo pa razdvojene zone nisu otre zbog difuzije. Protokol Pripremiti kadicu za izlivanje agaroznog gela. Gornji i donji rub kadice oblijepiti trakom. U prostor predvien za formiranje depova za uzorke staviti adekvatan ealj. Veliina depova ovisi o koliini uzorka koju analiziramo. Napraviti 1% rastvor agaroze u 30-50ml TBE pufera (ili prema veliini kadice) i prokuhati ga kako bi se napravio homogeni polimer. Smjesu ohladiti na oko 50C i dodati 1 l etidium-bromida (!). Rastvor agaroze izliti ravnomjerno u posudicu za gel, pazei da je to na skoro idealno ravnoj povrini. Kad se gel ohladi, uspemo TBE pufer, izvadimo ealj paljivo i skinemo trake koje smo koristili za oblikovanje gela. Postavimo gel u aparat za elektroforezu i pripremimo ga za punjenje uzoraka. Gel mora biti potopljen u TBE pufer. Uzorci (5 l)

se mijeaju na parafilmu sa (1 l) Load Dye pufera, koji olakava punjenje uzorka u depi (uzorak je tei i vidi se). Pored uzoraka, na gel nanosimo i 2 l markera koji e nam sluiti za kvalitativnu i kvantitativnu analizu uzorka koji ispitujemo nakon vizualizacije i dokumentacije. Marker sadri fragmente poznate veliine (u parovima baza-bp) i poznate gustine (ng), tako da mi na osnovu vizuelne inspekcije indirektno zakljuujemo o veliini, gustoi i kvalitetu naeg uzorka (loa, odlina ili osrednja ekstrakcija, degradirana DNK i sl.).

Slika 2. Slika agaroznog gela nakon elektroforeze uzoraka. Na sl.2 se vidi agarozni gel sa sedam traka. U prvoj se vidi marker koji sadri osam fragmenata poznate veliine (200-2000 bp). U traci 3, vidi se ukupno est bandova. Najkrai fragment je veliine 200-300bp, drugi oko 500, trei oko 900, a posljednja tri od 1500-1800 bp. Najintenzivniji band je drugi u prosjeku tri puta intenzivniji od ostalih znai vee koncentracije, a kvalitet ekstrakcije je odlian. UV spektrofotometrija Princip Spektrofotometrija je jedan od naina kvantifikacije biomolekula. To je, u principu, fotoelektrino mjerenje zraenja koje neka supstanca apsorbira na odreenoj valnoj duini. Prema podrujima valnih duina izvora svjetla, razlikuju se ultraljubiasta (200 - 400 nm), vidljiva (400 - 760 nm) i infracrvena (iznad 760 nm) spektrofotometrija. Ova metoda slui za kvantitativno odreivanje malih koliina otopljenih supstanci. Koliina apsorbiranog svjetla odreene valne duine odgovara koncentraciji ispitivane supstance. to se nukleinskih kiselina tie, spektrofotometrom se mjeri apsorbancija na 260 i 280 nm. Potpuno ista DNK ima OD (optical density ili optika gustoa) A260/A280 =1,8-2,0. Kontaminacija CH2O, fenolom i proteinima se rauna preko odnosa OD230/OD260. Ako je ovaj odnos vei od 0,5 prisutna je kontaminacija. Za odreivanje koncentracije DNK dobivene izolacijom, uzorak DNK jedinine apsorancije na 260 nm ima koncentraciju 50 mg/ml DNK. Da bi smo kvantifikovali DNK spektrofotometrijskom analizom potrebno je uzorak DNK razrijediti destilovanom vodom (1:100), izmjeriti apsorbanciju na 260 i 280 nm, i koncentraciju raunati po formuli: cDNK = A260 x R x 50 (mg/ml)

Protokol Pripremiti tubicu od 50 ml destilovane vode, pipete od 1000 i 20 l, te odgovarajue tipove. Kivete za spektrofotometar proprati destilovanom vodom. Uzorak DNK razblaiti 1:100 ( 1980 l ddH2O i 20 l uzorka), te mjeriti apsorbancu na 260, 280 i 230 nm. Nakon mjerenja izraunati koncentraciju i istou DNK. Molekularna biologija Vjeba 4. Polimerase chain reaction (PCR) Lanana reakcija sa polimerazom, polimerazna lanana reakcija, lanana sinteza polimerazom samo su neki od naina da se prevede naziv tehnike koja je doslovno izazvala revoluciju na polju molekularne genetike i biologije uopte. Polazna koliina DNK, koja je decenijama predstavljala ograniavajuci faktor u istraivanjima, svela se na doslovno jednu, dobro ouvanu molekulu a mukotrpne procedure izolacije i preiavanja dijelova genoma postale su jednostavnije. Pred istraivacima su se naglo otvorile nove mogunosti. Pored toga, gotovo da ne postoji drutvena djelatnost koju ova tehnika nije direktno ili indirektno dotakla i zauvijek izmijenila. Glavni krivci za ovakvu pometnju su Kary Mullis i njegovi suradnici iz Odjela za humanu genetiku Korporacije Cetus. U asopisu Science 1985. godine objavljen je nauni rad autora R. Saiki, K. Mullis, H. Erlich u kojem prvi put opisuju tehniku specifinog umnoavanja fragmenta DNK in vitro koju katalizira enzim DNK polimeraza I izolovan iz Escherichia coli. 1988. godine, opet u Science, isti tim naunika publicira rad1 u kome umjesto navedene polimeraze E. coli uvode termostabilnu DNK polimerazu I izolovanu iz bakterije Thermus aquaticus (Taq). Unato brojnim modifikacijama, raznovrsnim primjenama i automatizaciji procesa lanane sinteze polimerazom, osnovne odrednice ove tehnike utemeljene 1985. i 1988. nisu se znaajnije izmijenile. Osnovne premise na kojim se zasniva PCR su : u nativnom stanju DNK je dvostruki heliks, sastoji se od dva antiparalelna polinukleotidna lanca meusobno povezana vodikovim vezama, nukleotidi jednog polinukleotidnog lanca su meusobno povezani kovalentnom vezom izmeu dezoksiriboze jednog nukleotida i fosfatne grupe susjednog nukleotida, vodikove veze koje odravaju dva polinukleotidna lanca zajedno uvijek se formiraju izmeu komplementarnih baza tj. A-adenin se uvijek vee za T-timin a C-citozin za G-guanin, vodikove veze su energetski slabe i lako se remete zagrijavanjem (denaturacija), dok su kovalentne veze stabilne i pri zagrijavanju se odravaju, hlaenje dovodi do ponovnog uspostavljanja vodikovih veza izmeu komplementarnih baza (renaturacija), DNK replikaciju in vivo inicira RNK Pol I sintetizirajui kratke RNK sekvence, time kreirajui supstrat za DNK Pol I (slobodnu -OH- grupu dezoksiriboze na 3 kraju),
1

Primer-Directed Enzymatic Amplification of DNA with a Thermostable DNA Polymerase - Prajmerimaupravljano enzimatsko umnoavanje DNK posredstvom termostabilne DNK polimeraze

na optimalnoj temperaturi, DNK Pol I katalizira ugradnju slobodnih dezoksiribonukleotid-3-fosfata na postojei oligonukleotidni lanac sa slobodnom -OH- grupom na 3 kraju kada je isti vodikovim vezama povezan za matricu. Poavi od ovih premisa, Mullis2 je pretpostavio da moe postii umnoavanje specifinog dijela DNK molekule koji lei izmeu dva regiona ija je sekvenca poznata. Selekcija specifinog dijela DNK molekule postie se primjenom oligonukleotidnih prajmera, kratkih DNK sekvenci (20-30 nukleotida) koje su komplementarne krajevima definirane sekvence. U tipinoj PCR reakciji uestvuju dva prajmera sintetizirana u 53 pravcu tako da se na njihovom 3 kraju nalazi dezoksiriboza sa slobodnom -OHgrupom. Obino se obiljeavaju sa F (forward) i R (reverse). Na temperaturi od 95oC pucaju vodikove veze koje odravaju dvolananu strukturu molekule iji se dio umnoava (template DNA = matrica) te se ona denaturie. Sputanjem temperature stvaraju se uslovi za renaturaciju ali i za formiranje hibridnih molekula matrica-prajmer. DNK Pol I pronalazi takve hibride i, pod odgovarajuim uslovima, katalizira vezivanje fosfatne grupe dezoksinukleotid-3-fosfata za 3 -OH- grupu dezoksiriboze prajmera prema zakonu komplementarnosti. Rezultat je sintetiziran naspramni lanac komplementaran matrici koji moe posluiti kao matrica drugom prajmeru. Ovaj ciklus denaturacije zagrijavanjem, renaturacije hlaenjem i sinteze naspramnog lanca moe se ponavljati a svaki novosintetizirani lanac postaje matrica u narednom ciklusu. Takoer, sa porastom broja ciklusa eksponencijalno raste broj molekula specifino umnoavanog dijela DNK. Teoretski broj molekula ciljane sekvence koja se sastoji od sekvence prajmera i dijela DNK molekule izmeu prajmerskih sekvenci, iznosi 2n-2n (n - broj ciklusa) za svaku molekulu DNK matrice. Takoer teoretski, od jedne jedine molekule se, u 30 ciklusa, moe dobiti 230-2*30 = 1073741764 ciljanih fragmenata. Ponavljanje ciklusa moe biti efikasno sve dok ne nastane deficit neke od komponenti (prajmera, nukleotid-3-fosfata ili enzima). Ovisno od svrhe reakcije, veliine umnoavanog dijela DNK i eljene koncentracije, tipina PCR reakcija se odvija u 30-40 ciklusa.

TIPINA PCR REAKCIJA Tipina reakcija enzimatske amplifikacije DNK fragmenta odvija se u plastinim tubicama sa poklopcem, volumena 200 l. Plastika je termostabilna a zid tubice dovoljno tanak da omogui brzo i ravnomjerno zagrijavanje smjese. Volumen reakcije se kree od 25 - 100 l, ovisno o primjeni. Ovdje je naveden jedan primjer smjese i programa PCR reakcije.

temperaturni reim: SASTOJCI SMJESE: 95oC

2

5 min - denaturacija

1993. godine K. Mullis je za otkrie PCR dodijeljena Nobelova nagrada iz hemije

PCR pufer MgCl2 DNTPs Prajmer R Prajmer F Taq DNK ddH2O

2,5 l 1,5 l 1 l 1 l 1 l 0,2 l 1 l do 25 l

95oC 55oC
o

1 min - denaturacija 1,5 min vezivanje prajmera 35 ciklusa

72 C 2,5 min - sinteza komplementarnog lanca o 72 C 9 min zavrna elongacija

Molekularna biologija Vjeba 5. Sekvenciranje DNK fragmenata DNK sekvenciranje je proces utvrivanja redoslijeda baza unutar lanca DNK i predstavlja jednu od osnovnih metoda na kojima poiva genetiko inenjerstvo. Postoji vie tehnika sekvenciranja koje se meusobno razlikuju po svojim osnovnim principima: Maxam-Gilbertova metoda Sangerova metoda Automatsko sekvenciranje Sangerova metoda Ova metoda se bazira na dobijanju serije fragmenata DNK koritenjem etiri specifina dideoksinukleotida, kojima nedostaje OH grupa na poziciji 3-dezoksiriboze (ddNTP). PCR reakcija se odvija u tri standardne faze denaturacije, vezivanja prajmera i elongacije, koja je kljuna faza u ovom procesu. Proces izduivanja amplificiranog segmenta prestaje inkorporacijom jednog od ddNTP-a. Nedostatak OH grupe onemoguava dalju aktivnost DNK polimeraze. Samo markiranje ovih fragmenata moe se odvijati tokom ove faze ili koriteni prajmeri mogu biti ranije oznaeni radioaktivnim ili fluorescentnim markerom. Reakcija se razdvaja u etiri tubice gdje se u svaku dodaju male koliine razliitog ddNTP-a, npr. U C-reakciju dodaje se dATP, dCTP, dGTP, dTTP i mala koliina ddCTP. Krajnja analiza separiranih fragmenata odvija se na sekvencionom poliakrilamidnom gelu. Automatsko sekvenciranje Manuelno sekvenciranje DNK fragmenata podrazumjeva 4 odvojene reakcije, separirane u etiri odvojene linije na agaroznom ili poliakrilamidnom gelu i autoradiografsko detektiranje, dok je preduslov za uspjeno automatsko sekvenciranje simultanost detekcije markoranih fragmenata i procesa elektroforeze, te prednost pri

automatskoj detekciji imaju fluorescentni markeri. Meutim, bez obzira o kojoj se generaciji automatskog sekvenciranja radilo, principi svake poivaju na Sangerovoj metodi. Druga generacija fluorescentne tehnike bazira se na upotrebi fluorescentnih markera vezanih za chain terminator nukleotid. Svaki od ova 4 nukleotida fluorescira u razliitom spektru. Osnovna prednost ove metode je to se reakcija ne mora separirati u 4 tubice, dok se krajnja detekcija odvija prilikom elektroforeze, tomom prolaska markiranog fragmenta kroz polje djelovanja detektora. Detekcija mikrosatelita fragment analiza Bitno je naglasiti razliku izmeu standardnog sekvenciranja i detekcije STR lokusa ili nekih drugih fragmenata. Pri detekciji pojedinih sekvenci osnovni cilj je spoznaja tane sekvence datog dijela DNK. Kod fragment analize detekcija konane sekvence datog fragmenta nije krajnji rezultat. Kod STR lokusa, ta sekvenca se sastoji od ve poznatih repetitivnih jedinica, te je osnovni cilj analize STR lokusa utvrivanje broja ponavljanja pojedinih STR sekvenci unutar analiziranog lokusa. Kompjuterska analiza sekvenciranih DNK fragmenata Posljednih decenija, svaka analiza DNK fragmenata zahtjeva upotrebu kompjutera i razliitih softvera. Kompjuterska analiza moe se izdiferencirati u dva koraka. Prvi je vezan za unoenje sirovih podataka sa gela, dok je drugi korak analiziranje sekvenci, te kopletiranje i prezentiranje rezultata u vizuelno prihvatljivijem obliku. Danas postoji velik broj softvera koji se koriste u ovim analizama. Genetiko testiranje u svrhu dokazivanja oinstva Genetiko testiranje, openito predstavljeno, podrazumijeva sve analitike postupke koje se tiu karakterizacije nasljednih osobina (dijagnostika bolesti, prenatalno testiranje ili dokazivanje oinstva) na nivou metabolikog produkta (biohemijski postupci), hromosomskog komplementa (kariotipizacija i druge citogenetike metode) ili gena (DNK analize). Trei pomenuti metod je najsenzitivniji za detekciju suptilnih genetikih razlika. Ljudski genom pokazuje izuzetno nisku varijaciju u DNK sekvenci. Od 3,2 milijarde baza, oko 99,9% su istovjetne kod vas i kod vaeg kolege. Samo 0,1% genoma ini svakog od nas unikatim u smislu kombinacije osobina i odreuje to kako emo izgledati ili od kojih emo bolesti oboljevati. Kompletna nasljedna informacija neophodna za integritet i funkcionalnost bioloke jedinke sadrana je u 22 para homologih hromosoma i jednom paru gonosoma. Ogranieni broj lokusa (gena) u genomu ovjeka nalazi se uvijek na oba homologa hromosoma, a svaki je porijeklom od jednog od roditelja. Zahvaljujui toj injenici, mogue je ovim putem sa vrlo visokim stepenom pouzdanosti i egzaknosti potvrditi direktno srodstvo izmeu ispitivanih individua, to je svoju primjenu nalo naroito u dokazivanju oinstva i identifikaciji posmrtnih ostataka masovnih rtava (rat-genocid, pad aviona, WTC), poznato jo kao DNK ili genetiki fingerprint. Mikrosateliti su jedan od genetikih markera koji su za pomenute aplikacije izuzetno dobro optimizirani, jer su jednostavni za interpretaciju. To su u sutini, kratke tandemske ponavljajue sekvence koje su rasprene po cijelom genomu. Veliina tandema se kree od 2-7 bp npr. GA, koje se mogu ponavljati vei broj puta. Svaki lokus se tako javlja u velikom broju alelnih varijanti koje se meusobno razlikuju po veliini

ponavljajueg dijela. Mikrosateliti se transformiraju u genetike markere dizajniranjem PCR prajmera koji okruuju ponavljajui segment. Zadaci: 1. Numerisanjem pojedinih postupaka (1-6) odredite redoslijed u procesu dokazivanja oinstva: - Interpretacija genotipova - Ekstrakcija genomske DNK - PCR - Fluorescentna detekcija mikrosatelita na gelu visoke rezolucije - Procjena vjerovatnoe tanosti rezultata i izdavanje nalaza DNK analize - Agarozna gel elektroforeza. 2. Koristei se informacijama iz uvoda i opim znanjem o nasljeivanju kod ovjeka, uz analizu segregacije pojedinih alela za svaki sluaj pojedinano, odredite potencijalnog oca. Obrazloite! Otac A Otac B Dijete Majka Sluaj 1 15 18 16 17 14 18 14 16 Sluaj 2 16 18 13 19 15 19 15 17 Sluaj 3 17 19 18 24 19 23 23 26

3. Pomno prouite tri isprintana fingerprinta (djeteta, majke i potencijalnog oca). Kakav biste vi okarakterisali nalaz kao potvreno ili iskljueno oinstvo? Molekularna biologija Vjeba 6. Reverzna transkripcija (RT-PCR) Reverzna transkripcija je proces sinteze dvolananih DNK struktura (komplementarna DNK - cDNK) in vitro u prisustvu enzima reverzne transkriptaze, gdje se kao matrica koristi informaciona RNK (Kocher i Wilson 1991). Komplementarna DNK dalje slui kao matrica u standardnoj lananoj reakciji polimerizacije koja se oznaava kao reverzni PCR (RT-PCR). RT-PCR povezuje reverznu transkripciju iRNK matrice i PCR amplifikaciju analiziranog gena i omoguava otkrivanje prisutnosti transkripta, procjenu nivoa ekspresije i kloniranje cDNK produkata bez pravljenja banke gena. Reverzna transkripcija je dvostepeni proces. Prvi korak je dodavanje random hexamera u otopinu iRNK, te kratko inkubiranje smjese (komplementarno vezivanje heksamera), dok je drugi korak bila RT-PCR reakcija prema priloenom protokolu. Postoje tri tipa prajmera koji se koriste u konstruisanju cDNK: Random hexameri, oligo dT nukleotidi i gen specifini prajmeri. Ova metoda se koristi u molekularnoj dijagnostici i genskoj terapiji, npr. sluaju hronine mieloine leukemije, za detekciju i rano otkrivanje bolesti, te i u mnogim drugim sluajevima kao npr. u otkrivanju hepatitis A virusa, detekciju akutnih

respiratornih sindroma, detekciju virusa povezanih sa gastritisom, detekciju herpesvirusa, za kategorizaciju virusa gripe, zatim pri istraivanju SARS-a, raznih malignih tumora itd. Primjer mastermixa za reverznu transkripciju (lijevo) i PCR (desno): N=1 10xPCR Buffer II dNTPs mix MgCl2 RNK sintetaza Reverzna Transkriptaza Uzorak + Hexamer + Vod a 2 4 4 1 1 l l l l l N=2 4 8 8 2 2 l l l l l N=1 10xPCR Buffer dNTPs mix MgCl2 Prajmeri Taq polimeraza Sterilna voda cDNK 1 2 3 4 5 6 5 l 4 l 3 l 1+1 N=3 15 l 12 l 9 l 3+3 l 0.2 l 0.6 l l 35.8 107.4 1.5 1.5 l l l l

10 l

Slika pokazuje BCR/ABL translokaciju pozitivnog pacijenta: 1-beta aktin pacijenta, 2beta aktin pozitivna kontrola, 3- marker, 4- BCR/ABL pacijenta, 5- BCR/ABL pozitivna kontrola, 6- negativna kontrola. Molekularna biologija Vjeba 7. Izolacija proteina i 2D PAGE Izolacija proteina Prvi korak u bilo kojoj proteomskoj metodi je uspjena izolacija proteina. Proteini su jako nestabilne molekule i brzo podlijeu denaturaciji i degradaciji, metilaciji, fosforilizaciji i slinim procesima, te se mora sa njima paljivo postupati. Jedna od

nedostataka proteomskih metoda je ta to izolat proteina mora biti skoro apsolutno ist od bilo koje materije koja bi mogla kontaminirati izolat i prikazati lane rezultate, kao na primjer lipidi, nukleinske kiseline, urea, razni deterdenti koji se koriste za izolaciju i slino. Najee se za proteomske metode koristi izolat proteina iz elija u kulturi, ili iz krvi i plazme, a neto rjee iz tkiva, mada se i sa takvim izolatima dobivaju reprezentativni rezultati. Za izolaciju proteina koriste se razni puferi za lizu elija koji imaju odreene zajednike elemente: - Urea - Deterdent - Amfoliti - Reducirajui agensi - Inhibitori proteaza - RE H2O U vjebi emo koristiti jednostavni pufer za proteine u sastavu Tris-HCl, Glicerol, SDS, zbog toga to emo za uzorak uzeti salivu, i takav uzorak se moe koristiti samo za jednodimenzionalnu elektroforezu proteina. Izvoenje izolacije Na 200 l salive dodaemo 3 puta vie prije pripremljenog pufera za izolaciju ukupnih proteina (600 l). Uzorak treba izvorteksirati i centrifugirati 30 minuta na 15000 rpm. Nakon centrifugiranja odpipetirati supernatant u kome se nalaze otopljeni proteini i supernatant koristiti kao uzorak. Kvantifikacija proteina Kvantifikacija proteina se vri spektrofotometrijom pri emu se mjeri apsorbancija na 750nm. Za kvantifikaciju se koriste komercijalni kitovi: Lowryeva i Bradfordova metoda.

Dvodimenzionalna elektroforeza (2-DE) Dvodimenzionalna elektroforeza, razvijena poetkom sedamdesetih godina 20tog. stoljea (O'Farell, 1975), se smatra prvom opisanom metodom u proteomici. Ovom metodom se proteini razdvajaju u dvije dimenzije, bazirano na dvije nezavisne karakteristike proteina, tj. po svojoj izoelektrinoj taci (prva dimenzija) i po veliini (druga dimenzija). 2-DE omoguava simultano razdvajanje vie stotina proteina (gotovo svih proteina prisutnih u nekom uzorku). 2-DE metoda ukljuuje: - izoelektrino fokusiranje (IEF) prva dimenzija - SDS PAGE druga dimenzija - Bojenje poliakrilamidnog gela i vizualizaciju rezultata - Rezanje spotova od interesa - Masenu spektrometriju

Izoelektrino fokusiranje (IEF) predstavlja prvu dimenziju, gdje se proteini separiraju po svojoj izoelektrinoj taci (pH vrijednost pri kojoj je naboj molekula jednak nuli). Fokusiranje se obavlja na IPG (Immobilized pH Gradient) stripovima trake polakrilamidnog gela razliitog pH gradijenta. IPG stripovi se fabriki napravljeni i postoje razne duine stripova i razni rasponi pH po stripu. Odreeni stripovi se biraju zavisno od koliine proteina i vrste uzorka, a najee se koriste 17 centimetarski stripovi koji imaju pH raspon od 3-11. IEF se vri u posebnim kadicama na posebnom reimu struje. SDS PAGE (gel elektroforeza na poliakrilamidnom gelu uz prisustvo SDS-a) predstavlja drugu dimenziju ove metode. Nakon to se proteini razdvoje po svom naboju, treba ih i razdvojiti po njihovoj veliini. Veliina gela zavisi od veliine stripova, za male stripove se koriste mali gelovi i obrnuto. Za 2-DE se koriste 12-14% poliakrilamidni gelovi. Umjesto klasinih depova, na gelovima se ostavlja ravan rub na koji se nanose isfokusirani IPG stripovi koji se 1% agarozom poveu sa poliakrilamidnim gelom. Nakon nanoenja IPG stripa na gel, ukljuuje se slabi napon struje da separira proteine po veliini. Za razliku od kadice za IEF, vertikalna gel elektroforeza se vri uglavnom na 2-6 gelova istovremeno, mada postoje kadice koje mogu da prime 12 gelova, korisne za velike laboratorije u kojima se procesira mnotvo uzoraka. Bojenje poliakrilamidnog gela i vizualizacija rezultata. Nakon elektroforeze pristupa se bojenju poliakrilamidnih gelova. Gelovi se mogu bojiti raznim metodama, a uobiajene metode su: - srebro nitrat - coomassie brilliant blue G-250 - SYPRO Ruby - Ruthenium II tris fluorescentno bojenje. Rezanje spotova od interesa. Pri analizi gelova treba odrediti spotove od interesa, dakle dijelove za koje smatramo da su bitni za istraivanje. Spotovi od interesa se izrezuju sterilisanim skalpelom i pakuju u Eppendorf tubice od 1,5 ml, ako se koristi coomassie blue bojenje. Pri koritenju radioaktivnog oznaavanja, potrebno je imati posebnog robota koji ree spotove, poto spotovi nisu vidljivi golim okom. Masena spektrometrija. Proteini razdvojeni sa 2-DE mogu biti identificirani preko jedinstvenih karakteristika koje se mjere putem masene spektrometrije. Ove karakteristike su odreene analizom peptida koji su dobiveni proteolitikom digestijom proteina od interesa. Danas se odreuju dvije specifine karakteristike. Prva karakteristika je nazvana fingerprint peptidne mase, tj. odreuju se mase svih peptida u digestu. Druga karakteristika ukljuuje fragmentaciju selektiranih peptida unutar masenog spektrometra u serije sekvenci. Za fingerprinting peptida se koristi MALDI ToF MS (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation Time-of-Flight Mass Spectrometer), a za odreivanje sekvenci se koristi ESI-Q-IT-MS (ElectroSpray Ionisation-Quadrupole Ion Trap Mass Spectrometer). MALDI ToF MS je brza, senzitivna i tana metoda.