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    16 Reaccidn en cadena de la polimerasa Alfredo G. Torres Tejeda y Beatriz Eugenia Baca Centro de Investigaciones Microbiologicas Instituto de Ciencias Universidad Autonoma de Puebla 2 reaccién en cadena de la polimerasa (RCP) fue desarrollada por Kary Mu- Ilis en los afios ochenta. Al igual que la técnica de secuenciacién del dcido desoxir bonucleico (DNA), la RCP ha revoluciona- do la genética molecular, haciendo posible el estudio y andlisis de una amplia gama de genes, que incluso pueden obtenerse a partir de un genoma complejo, como es el de los mamiferos donde pueden existir alrededor de cien mil genes. Muchas de las técnicas en genética mole- cular son muy costosas y laboriosas, La mayoria de ellas tiene que ver con la clona- cin y los métodos que estan diseftados para detectar secuencias especificas de DNA. En cambio, la técnica de RCP permite producir un enorme niimero de copias de una secuen- cia de DNA especifica (amplificarla), sin recurrira la clonacién (véase figura 1). La reaccién en cadena dela polimerasa El método se basa en las caracteristicas de la estructura quimica del DNA y su replica- cin semiconservativa. Es decir, de acuerdo con el modelo de Watson y Crick, ef DNA es un polimero formado por dos cadenas complementarias (cadenas antiparalelas), constituido por unidades de desoxirribonu- cledtidos de cuatro bases nitrogenadas ade- nina, guanina, citocina y timina unidas al aziicar desoxirribosa. La parte que no varia en la molécula del DNA consiste en desoxi- rribosas unidas por grupos fosfato. Especifi- camente el hidroxilo 3' del azicar de un desoxirribonuclestido se une al hidroxilo 5° del siguiente aziicar através del puente fos- fodiester (véase figura 2). Para duplicarse, el DNA se separa en sus dos cadenas com- Elementos, No, 23, Vol 3, 1995, pp. 16-21 plementarias; asi, cada una de ellas sirve de molde o plantilla. Al final del proceso se obtendran dos moléculas de DNA, cada una de ellas formada por una cadena original y tuna cadena complementaria que ha sido sin- tetizada “de novo.” La enzima que realiza este proceso se denomina DNA polimerasa. Esta enzima afiade los nucleétidos en el hi- droxilo 3 terminal de la cadena de DNA paterna, En otras palabras, se requiere una cadena con un grupo 3' OH disponible, el cual es el iniciador, para formar el enlace covalente fosfodiester 3'-5'. La reaccién de alargamiento, catalizada por la DNA poli- merasa, consiste en un ataque nucleofilico del tomo de fsforo del desoxirribonucles- tido (NTP) al 3' OH del iniciador, para formar la unin covalente fosfodiester (véa- se figura 2). E] aspecto més importante de la doble hélice de DNA es la especificidad de aparea- miento de las bases del modelo de Watson y Crick, quienes dedujeron que la adenina debe aparearse con la timina, y la guanina con la citocina, debido a las uniones hidrégeno que se establecen entre las bases y a la restric idm estérica que se produce. Las dos cadenas de DNA se separan fi- cilmente cuando las uniones hidrézeno de las bases se rompen. Esto se realiza cuando una solucién de DNA es calentada entre 77 y 100°C. Las bases complementarias se reasocian esponténeamente para formar la doble hélice cuando la temperatura descien- de, Este proceso de renaturalizacién se de- nomina alineamiento. La facilidad con la cual la doble hélice puede separarse y reaso- ciarse es crucial para las funciones biolégi- cas del DNA. El método RCP emplea ciclos repetidos de sintesis in vitro del DNA dirigida por un oligonucleétido iniciador. Las secuencias de los oligonuclestidos iniciadores se determi- nan en base a una parte conocida de la se- cuencia del DNA molde, ya que deben ser complementarias a cada una de las cadenas del DNA, dejando libres los lados opuestos para poder ser amplificados. Dichos oligo- rnucledtidos sirven como iniciadores para la sintesis in vitro del DNA, la cual es cataliza- da por la enzima DNA polimerasa, y ellos también determinan los extremos del frag- mento del DNA final que se obtiene. El pri cipio de la técnica de RCP esta ilustrado en las figuras 3 y 4. La distancia entre los oligonuclestidos iniciadores es determinada empiricamente y depende de muchos factores. La longitud entre los oligonucleétidos iniciadores para ensayos de diagndstico puede ser entre 50 y 1,500 bases de nucleétidos. Basicamente, cada ciclo de RPC consiste de tres etapas (figuras 3 y 4). 1) En la primera etapa, el DNA molde es incubado a alta temperatura (92-98°C, de 30-90 segundos), para separar las cadenas ‘complementarias, desnaturalizacién del DNA y asi hacerlas accesibles al apareamiento con el iniciador especifico. I) La etapa de alineamiento, en ta cual la mezela de reaccién es enfriada para per- mitir que los oligonuclestidos iniciadores se alineen o hibriden las secuencias comple- mentarias del DNA blanco. II1) La reaccién de extensién, general- mente Hevada a cabo a una temperatura in- termedia, en la cual la DNA polimerasa co- pia el DNA entre las secuencias correspon- diientes alos oligonuclestidos iniciadores. Estas tres etapas de la reaccin constitu- yen un ciclo térmico. Un protocolo tipico de la RPC incluye de 30 a 50 ciclos. Cuando cada ciclo térmico se completa, os fragmen- tos recientemente sintetizados sirven como DNA blanco, y en unos pocos ciclos mas, el producto predominante sera una tinica clase de fragmento de DNA cuya longitud corres- ponde a la distancia entre los oligonucledti- dos iniciadores. Asi, la repeticién del ciclo origina una acumulacién geométrica de las secuencias amplificadas, Los componentes de la reaccién 1) La DNA polimerasa. Inicialmente se em- ple6 la DNA polimerasa de Escherichia coli, ‘como enzima polimerizadora, pero debido a su inestabilidad térmica era necesario agre- sgarla en cada ciclo, haciendo muy costosa la prueba, Tomando en cuenta la serie de pro- blemas técnicos que se presentaban al usar enzimas que perdian su actividad por las altas temperaturas, se purificé una enzima termoestable a partir de bacterias Thermus aquatticus, que actualmente se conoce como ‘Taq DNA polimerasa. Esta enzima tiene un peso molecular cercano a los 93,910 Da y su temperatura Optima, en que se observa su actividad maxima, es entre 75 y 80°C; su tasa de incorporacién de nucleétidos, Keat, es de unos 150 nuclestidos‘seg /enzima 2) EI DNA molde. La concentracién de ESCISION POR LA ENZIMA GENE PARA La, BAM HL RESISTENCIA ‘A AMPICILINA, GEN PARA LA RESISTENCIA A UA TETRACICLINA (TET) (ANP) games Asoo caves gmTenylemy Been! ino PLASMIDO Bees NEY Rectan MEZCLA DE LOS PLASMIDOS CON CELULAS DE E.COL! co Zen We) ie err owen ted by MEDIO DE CULTIVO CON AMPICILINA rg? MEDIO DE CULTIVO CON AMPICILINA Y TETRACICLINA Figura 1. Clonacién del DNA. Las etapas en la clonacién de genes implican: el corte del DNA gue se vaa clonar con enzimas de retrccién (endonucleasas), la incorporacién del genoma en tun vector (plismido), el cual fue eortado con fa misma enzima de restrccién, La mezcia se liga dando lugar al plasmido recombi- ante. Los plasmidos son introducidos a una bacteria; usuaimen- te Escherichia coli. Una manera sencilla de detectarios poste- riormente en el laboratorio, es haciendo crecer las bacterias en tun medio de cultvo con un antibigtico, que permite la seleccién de las bacterias portndo plésmidos recombinants. 17 18 DNA molde en la reaccién depende de la fuente utilizada, e idealmente se requieren aproximadamente de 300 nanogramos a | microgramo de DNA genémico. En el caso de usarse genes clonados en plasmidos, de 25 a 100 nanogramos de su DNA son més que suficientes. 3) Los oligonuclestidos sintéticos inicia- dores, Se deben seleccionar dos oligonucleé- idos, que hibriden con regiones del DNA molde y que estén localizados en los extre- mos de la region de interés. La longitud de los oligonucledtidos es de 15 a 30 nuclesti- dos y su secuencia debe presentar la mayor si posible con la secuencia del DNA blanco, ya que de ello depende el éxito y la especificidad de la amplificacién. Se reco- mienda que la complementariedad entre el oligonuclestido y la secuencia molde sea cer- cana al 100%, en las tiltimas 5 a 6 bases del extremo 3' del oligonucleétido, para asegu- rar la amplificacién, Se debe evitar la com- plementariedad entre los dos oligonuclesti- dos, para que no se formen dimeros 0 conca- tendmeros, ademas de evitar oligonuclesti- dos que favorezcan la formacién de estruc- turas secundarias que interfieren con el ali- neamiento correcto, Idealmente, en cada 100 il de reaccién, la concentracién aceptable de cada oligonuclestido oscila entre 0.05 y 1.0 uM. 4) Los desoxirribonuclestidos de trifos- fato, (NTPs. Las concentraciones minimas de dNTPs disminuyen el indice de incorpo- que concentraciones muy altas disminuyen la especificidad de la reaccién, por lo que la concentracién debe optimizarse. Concentraciones entre 20 y 200 iM pro- porcionan resultados éptimos, debiéndose igualar la concentracién de cada uno de los. ‘cuatro dNTPs en concentraciones equimola- res. ‘Contaminacién de las reacciones de RCP Debido a que el RCP puede generar trillones de copias del DNA de la secuencia molde, la contaminacién de las reacciones de amplifi- cacin con productos de una reaccidn pre- via, ya sea con DNA exégeno o con otro ‘material celular, puede crear problemas tan- ton Ia investigacién como en la aplicacién diagnéstica. En general, la atencién debe ser muy cuidadosa en el procedimiento del laborato- rio; tan es asi, que la zona de preparacién de la reaccién debe estar separada de! dea de analisis del producto de la reaccién y, de esta forma, se minimiza el riesgo de conta- minacién. Ademés, se debe tener a la mano un sinnimero de controles negativos para monitorear y revelar los contaminantes. Se debe prevenir la formacién de aerosoles e incluir también un testigo positivo, particu- larmente en el caso de reacciones con fines diagnésticos. Andlisis del producto de una RCP Después de la amplificacién, al finalizar la reaccién, el DNA de interés puede ser colo- cado en un gel de agarosa (menos de la

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