Prctica Determinacin de capsaicinoides en chile habanero por cromatografa de lquidos de alta resolucin

Hiptesis:

Introduccin Capsaicina C 1 8 H 2 7 NO 3 (P.M. 305.41g/mol) (8-metil-N-vanillil-6-nonenamida) es el componente activo de los pimientos picantes (Capsicum).

La capsaicina es un producto irritante; la administracin inicial causa dolor. El tratamiento prolongado causa insensibilidad al estmulo dolo roso e indu ce degeneracin selectiva de cierto s sen sores de neuronas primaria s. El pretratamiento de la capsaicina tambin induce de sensibilizacin va area de larga duracin de mucosa a varios irritantes qumicos y mecnicos. Los capsaicinoides son alcaloides que se encuentran presentes en las especies de Capsicum que incluye una amplia gama variedad de chiles. Aquellos le otorgan la pungencia que caracteriza el picor del chile habanero. Hasta el momento, se han identificado ms de 18 alcaloides, pero cerca del 90% de la pungencia total se debe a la presencia de dos de ellos: la capsaicina y la dihidrocapsaicina. La concentracin de capsaicinoides va desde 0.001 a 0.01% m/m en los chiles dulces como las pprikas hasta los chiles fuertes de un 0.1 hasta 1% m/m en base seca. El chile habanero es la especie que se ha reportado tener las mayores concentraciones de capsaicinoides, conteniendo alrededor del 1.7% m/m bs. Comnmente las extracciones se realiza a reflujo solventes orgnicos de polaridad media, tales como metano, etanol, acetonitrilo o acetona; sin embargo se ha encontrado que la extraccin por sonicacin presenta resultados equiparables.

Materiales 1 charola de aluminio 1 cuchillo 1 Embudo de Buchner 1 Esptula 1 Frasco de vidrio hermtico 5 Jeringas estriles 3 mL Mangueras 1 Matraz kitazato 1000 mL 1 Matraz volumtricos de 10 mL 1 Microesptula 1 Micropipeta 20-200 1 Micropipeta 200-1000 Papel aluminio 3 Papel filtro quantitativo 1 Piseta 1 Tubo de ensayo 10 x 100mn 1 Tubo de ensayo 25 x 150mn 1 Vaso de precipitado de 100 mL 13 Viales 1 vidrio de reloj

Equipos 1 Balanza analtica 1 bomba de vaco 1 Columna cromatogrfica de C18 4.6 x 150mm x 5 1 croamtrgrafo de lquidos de alta resolucin (HPLC)

1 Detector de arreglo de diodos y un detector de fluorescencia. 1 Estufa de convencin 1 Filtro milipore 1 Molino ciclotec Reactivos Acetonitrilo grado HPLC Agua bidestilada Objetivo Extraer y cuantificar la capsaicina y la dihidrocapsaicina en muestras de chiles habanero seco.

Procedimiento A. Secado de chiles habanero Se pesaron aproximadamente 50g de chile habanero frasco, se cortaron cuatro ranuras a los costados de chile para permitir que la humedad se pierda ms fcilmente, en una charola de aluminio se colocaron y se dejaron secar por 48 horas a 70C en una estufa de convencin. Se Dej enfriar y pesar el chile seco (calcular el porcentaje de humedad).Se moli y tamiz en un molino Ciclotec. Se Guard en chile molido en frascos hermticos hasta su uso. B. Extraccin de los Capsaicinoides Se pesaron aproximadamente 200mg de chile habanero seco y se coloco en un tubo de ensayo de 10x100mm, luego se colocaron los tubos de ensayo con las muestras en un vaso de precipitado de 100mL, luego se agregaron 5 mL de acetonitrilo grado HPLC a cada tubo de ensayo. Se sonifico por 2.5 horas (dejando descansar el equipo 10 minutos cada hora). Se filtro al vacio la muestra recogiendo el filtrado en un tubo de ensayo de 25 x 150mm colocado en el interior de un matraz quitatazo, para ello se transfiri cualitativamente a un matraz volumtrico de 10mL con ayuda de un embudo y se aforo, posteriormente se tomo una alcuota de 500 L y se adiciono 500 L de acetonitrilo. C. Determinacin de capsaicinoides Primero se prepararon 1000 L de solucin madre de capsaicina de 1000 ppm y otra dihidrocapsaicina de 500 ppm. Se prepararon 1000 L estndares de capsaicina (30, 60, 90, 120 y 150 ppm) y dihidrocapsaicina (16,32, 48,64,80)

Dihidrocapsaicina solucin madre de 500 ppm concentracin ppm 16 32 48 64 80 total Volumen a tomar

Capasaicina solucin madre de 1000ppm concentracin 32 64 96 128 160 480 total 30 60 90 120 150 volumen a tomar 30 60 90 120 150 450

Operar el cromatrafo de lquidos de alta resolucin de la siguiente forma: a. b. c. d. Composicin C 18 4.6 x 150 mm x 5 m. Composicin de fase mvil: 7% acetonitrilo, 21% agua, 72% metanol. Modo isocrtico a 1Ml/min. Tiempo de corrida 6 minutos e. ctor fluorescencia a exitacin 280 nm y/0 emisin 320nm, UV-Vis a 230 nm. Cul es el detector ms usando en este caso?

4. Determinar la cantdad de cpsaicinoides en la muestra por interpolacin lineal de las reas de los estndares de capsaicina y dihidrocapsaicina. Reportar el resultado en base seca y base humeda.

Notas: y y Una vez preparadas las muestras y los estndares cubrir con papel aluminio porque los capsaicinoides son fotosensibles. Si la muestra se saliera de las curvas de calibracin, realizar una dilucin adecuada de tal forma que la muestra tenga una seal aproximadamente igual a 100 ppm de casaicina y 40 ppm de dihidrocapsaicia en la alcuota.

Clculos

Resultados y discusiones

Observacin

Conclusin

Cuestionario Por qu analizamos dos alcaloides si hay 18?

Es ms viable la cromatografa de gases o la de lquidos?

Bibliografa