P R C T I Q U E S

D E B I O L O G I A M O L E C U L A R
CLONATGE I EXPRESSI DE PROTENES RECOMBINANTS HETERLOGUES

OBJECTIUS

- Subclonatge de fragments de la BFP (Protena Blava Fluorescent) en la GFP (Protena Verda Fluorescent) - Minipreparacions de DNA plasmdic - Obtenci de fragments de DNA mitjanant restricci amb endonucleases - Electroforesi en gel dagarosa - Puricaci de fragments de DNA de gels dagarosa - Reacci de lligament - Obtenci i transformaci de cllules competents dE.coli - Anlisi mitjanant eines bioinformUques - Expressi i puricaci de protenes recombinants - Inducci de lexpressi de protenes recombinants - Puricaci de variants de GFP - Detecci de lexpressi - Electroforesi en gel de poliacrilamida

PLA DE TREBALL

DILLUNS - CulUus de nit dE.coli BL21(DE3) i E.coli DH5 transformades amb pRSET_GFP i pRSET_BFP. DIMARTS - Minipreparaci de DNA plasmdic a parUr del culUu de nit de DH5. - Obtenci dels fragments de DNA per restricci amb endonucleases. - Expressi de la GFP o de la BFP a parUr del culUu de nit de BL21(DE3). - Preparaci de lelectroforesi en gel dagarosa. DIMECRES - Electroforesi en gel dagarosa. - Puricaci dels diferents fragments de DNA del gel. - Reacci de lligaci. - Preparaci de cllules competents dE.coli BL21(DE3). - Puricaci parcial de les dues protenes per cromatograa danitat. - Preparaci del gel SDS-PAGE. DIJOUS - Transformaci de la lligaci. - Anlisi per electroforesi de lexpressi i de la puricaci. DIVENDRES - Anlisi dels resultats. - Presentaci de les eines bioinformUques.

CULTIUS DE NIT DH5a_pRSETGFP / DH5a_pRSETBFP

En dos tubs estrils: En un tub estril:

DH5a_GFP DH5a_BFP
5 ml LB + 10 ml Ampicillina (50 mg/ml) + Repicat placa

BL21(DE3)_GFP BL21(DE3)_BFP
5 ml LB + 10 ml Ampicillina (50 mg/ml) + Repicat placa

37C 150 rpm O/N

Atenci

- Treball en condicions estrils (campana).

MINIPREPARACI DE DNA PLASMDIC

1. Transferir 1,5 ml dun culYu de nit a un tub Eppendorf. 2. Centrifugar durant 60 s, eliminar el sobrenedant per decantaci i repeYr els passos 1 i 2 per tal dobtenir el sediment duns 4,5 ml de culYu. 3. Afegir 250 l de la Soluci de Resuspensi de Cllules (buer P1) i pipetejar amunt i avall (o agitant en vrtex) ns que el sediment cel.lular esYgui completament resusps. 4. Afegir 250 l de la Soluci de Lisi Cellular (buer P2) i barrejar inverYnt amb suavitat el tub 10 vegades. NO AGITAR EN VRTEX. En aquest punt la soluci ha de tenir una aparena viscosa i ms clara si la lisi cellular sha produt. ConYnuar barrejant per inversi si la soluci es mant trbola. 5. Afegir 350 l de la Soluci de Neutralitzaci (buer N3) i barrejar inverYnt amb suavitat el tub 10 vegades. NO AGITAR EN VRTEX. Desprs daquesta operaci sha de formar un precipitat blanquins clarament visible. 6. Recollir les restes cellulars en 10 min de centrifugaci a velocitat mxima (12.000 rpm) a la minifuga. Sha dobservar la formaci dun sediment blanquins i compacte a les parets o al fons del tub. 7. Mentre sespera per la centrifugaci del pas anterior, inserir un Spin Filter o columneta de ltraci en un nou tub de microcentrfuga de 2 ml. Un cop centrifugat, tot evitant les parets del tub on hi ha part del sediment, pipetejar el sobrenedant i transferir-lo a la columneta sense arrossegar sediment. Quan totes les mostres hagin estat transferides a les respecYves columnes, centrifugar durant 30 s a la minifuga.

MINIPREPARACI DE DNA PLASMDIC

8. Treure la columneta del tub de microcentrfuga, eliminar-ne el ltrat que queda en linterior del tub i tornar a posar la columna en el tub de microcentrfuga. Afegir 750 l de Soluci de Rentat (buer PE) i rentar la rena per centrifugaci durant 30 s a la minifuga. 9. Treure la columneta del tub de microcentrfuga, eliminar-ne el ltrat, que queda a linterior del tub, i tornar a centrifugar durant 30 s a 12.000 rpm a la minifuga per eliminar les restes de la soluci de rentat. 10. Treure la columneta del tub de microcentrfuga. Posar la columna en un nou tub de microcentrfuga i deixar assecar durant 10-15 de minuts a lestufa a 37C perqu sevaporin les restes detanol. 11. Afegir 60 l de Soluci dEluci (buer EB). Eluir el DNA per centrifugaci durant 30 s a 12.000 rpm a la minifuga. 12. Eliminar la columna o Spin Filter. La soluci de DNA es pot guardar a -20C.

Atenci

- El tamp P1 es guarda a 4C. - Si letanol no selimina correctament pot interferir en reaccions enzimYques posteriors. - Retoleu correctament els tubs.

DIGESTI DE DNA PLASMDIC AMB ENZIMS DE RESTRICCI

EcoRI BtgZI PstI XhoI

En un nou tub Eppendorf: Minipreparaci DNA pRSET_GFP AmorYdor de digesY 10x Enzim 1 Enzim 2 17 ml 2 ml 0,5 37C ml >1h 0,5 ml 20ml Minipreparaci DNA pRSET_BFP 17 ml AmorYdor de digesY 10x 2 ml Enzim 1 0,5 37C Enzim 2 ml >1h 0,5 ml 20ml Atenci - Respectar lordre de la taula a lhora dafegir els volums. - Compte amb els volums. Descarregar la micropipeta al fons del tub. - Mantenir els enzims de restricci sempre al bloc trmic. - En les digesYons amb BtgZI suYlitza un nic enzim de restricci.

GFP

BtgZI

Amp

EcoRI

BtgZI

PstI

XhoI

BFP

BtgZI

Amp

DIGESTI DE DNA PLASMDIC AMB ENZIMS DE RESTRICCI

EcoRI PstI EcoRI PstI

Amp

Amp

EcoRI

PstI

EcoRI

PstI

Amp

DIGESTI DE DNA PLASMDIC AMB ENZIMS DE RESTRICCI

PstI XhoI PstI XhoI

Amp

Amp

PstI

XhoI

PstI

XhoI

Amp

DIGESTI DE DNA PLASMDIC AMB ENZIMS DE RESTRICCI

BtgZI BtgZI

BtgZI

BtgZI

Amp

Amp

BtgZI

BtgZI

BtgZI

BtgZI

Amp

PRODUCCI DE LA HIS_GPF

1. Inocular 150 l de culYu de nit BL21(DE3)_pRSET en 15 ml de medi LB + 30 l Ampicillina (50 mg/ml). 2. Incubar a 37C amb agitaci forta ns que la DO550 arribi a 0,8 - 1 UA (2,5 - 3 h). 3. Transferir 1 ml de culYu a un tub Eppendorf. Centrifugar 1 min a 12.000 rpm i eliminar el sobrenedant. Resuspendre el sediment en 100 l de tamp de crrega concentrat i 100 l H2O i guardar a -20C (mostra t=0). 4. Afegir 150 l dIPTG 200 mM. INDUCCI DEL CULTIU 5. Incubar a 37C amb agitaci forta 2,5 - 3 h. 6. Transferir 0,5 ml de culYu a un tub Eppendorf. Centrifugar 1 min a 12.000 rpm i eliminar el sobrenedant. Resuspendre el sediment en 100 l de tamp de crrega concentrat i 100 l H2O i guardar a -20C (mostra t=3). 7. Centrifugar la resta del culYu 10 min a 5.000 rpm, descartar el sobrenedant I guardar el sediment a -20C.

CULTIUS DE NIT BL21(DE3)

En un tub estril:

BL21(DE3)
15 ml LB + Repicat placa

37C 150 rpm O/N

Atenci

- Treball en condicions estrils (campana).

ELECTROFORESI DE DNA EN GEL DAGAROSA

1. Muntar el suport, collocant cinta adhesiva als extrems per evitar prdues. 2. Preparar 100 ml dagarosa 0.8% / 1.2% en un Erlenmeyer. Cal escalfar al microones per tal de dissoldre lagarosa.

0.8 g / 1.2 g 2 ml 98 ml
3. 4. 5. 6. 7. 8.

Agarosa Tamp TAE 50x Aigua desYllada

Deixar refredar a temperatura ambient i abocar al motlle. Collocar la pinta per tal de formar les butxaques. Deixar solidicar, treure la cinta adhesiva i la pinta. Collocar el gel a la cubeta i cobrir amb tamp TAE 1x (1 l aprox.). Connectar a la font elctrica i fer crrer 30 min a 100 V. Tenyir durant 15 min en una soluci de bromur deYdi.

ELECTROFORESI DE DNA EN GEL DAGAROSA

Mostres a carregar:

Agarosa 0.8%
1. 2. 3. 4. 9 ml pRSET_GFP + 3 ml amorYdor aplicaci 20 ml pRSET_GFP digerit (EcoRI + PstI / PstI + XhoI) + 5 ml amorYdor aplicaci 20 ml pRSET_BFP digerit (BtgZI) + 5 ml amorYdor aplicaci 10 ml marcadors

Agarosa 1.2%
1. 2. 3. 4. 9 ml pRSET_GFP + 3 ml amorYdor aplicaci 20 ml pRSET_BFP digerit (EcoRI + PstI / PstI + XhoI) + 5 ml amorYdor aplicaci 20 ml pRSET_GFP digerit (BtgZI) + 5 ml amorYdor aplicaci 10 ml marcadors

PURIFICACI DE FRAGMENTS DE DNA EN GEL DAGAROSA

1. Tallar la banda de DNA minimitzant al mxim la mida del fragment escindit. 2. Posar la banda de gel en un tub Eppendorf. Afegir 600l de Tamp de Solubilitzaci (buer QG). Incubar 15 min a 60C homogenetzant cada 5 min o ns que el fragment de gel esYgui totalment dissolt. 3. Mentre sespera en el pas anterior, inserir un Spin Filter o columneta de ltraci en un nou tub de microcentrfuga de 2 ml. 4. Aplicar la mescla a la columneta i centrifugar 60 s a velocitat mxima (12.000 rpm) a la minifuga. 5. Eliminar lelut del tub de 2ml i aplicar 750 l de Soluci de Rentat (buer PE). 6. Centrifugar a 12.000 rpm durant 30 s. Descartar lelut i centrifugar a 12.000 rpm durant 1 min a la minifuga. 7. Treure la columneta del tub de microcentrfuga. Posar la columna en un nou tub de microcentrfuga i deixar assecar durant 10-15 de minuts a lestufa a 37C perqu sevaporin les restes detanol. 8. Afegir 50 l de Soluci dEluci (buer EB) i incubar 1 minut sobre la poiata. 9. Centrifugar 1 minut a 12.000 rpm a la minifuga i recollir el DNA elut en un nou tub eppendorf. Eliminar la columna o Spin Filter. La soluci de DNA es pot guardar a -20C.

Atenci

- Si letanol no selimina correctament pot interferir en reaccions enzimYques posteriors. - Retoleu correctament els tubs.

REACCI DE LLIGAMENT

Control de relligats: DNA pRSET_GFP digerit DNA pRSET_BFP digerit AmorYdor lligasa 10x T4DNA lligasa 4 ml 4 ml 1 ml 1 ml 10ml H2O mQ DNA pRSET_GFP digerit AmorYdor lligasa 10x T4DNA lligasa 4 ml 4 ml 1 ml 1 ml 10ml

18C O/N

Amp

Amp

Amp

Amp

Amp

OBTENCI DE CLLULES COMPETENTS

1. Inocular 50 l de culYu de nit BL21(DE3) i DH5a en 5 ml de medi LB. 2. Incubar a 37C amb agitaci forta ns que la DO550 arribi a 0,45-0,55 UA (1,5- 2 h). 3. Posar el culYu en gel durant 15-30 min. (MANTENIR LES CLLULES SEMPRE EN GEL D'ARA ENDAVANT I TREBALLAR EN CONDICIONS DESTERILITAT) 4. Dispensar 1,5 ml de culYu en 2 tubs Eppendorf estrils (1,5 ml BL21(DE3) i 1,5 ml DH5a), i centrifugar 20 s a 12.000 rpm a la minifuga. 5. Eliminar el sobrenedant amb pipeta i resuspendre les cllules en 1 ml d'una soluci de CaCl2 0,1 M estril, prviament refredada en gel (resuspendre les cllules suaument amb la mateixa pipeta). 6. Mantenir en gel durant 20 min. 7. Centrifugar 20 s a 12.000 rpm a la minifuga. 8. Eliminar el sobrenedant amb una pipeta i resuspendre les cllules en 0,1 ml (100 l) de la dissoluci de CaCl2 0,1 M freda (com abans, colpejar els tubs suaument per resuspendre). 9. Les cllules sn a punt per a ser uYlitzades (Transformaci). Mantenir-les en gel.

PURIFICACI DE LA HIS_GFP

1. 2. 3. 4. 5.

Descongelar el sediment del culYu indut i resuspendrel amb cura en 2 ml de tamp A amb lajut duna pipeta automYca. Deixar 15 min a temperatura ambient. Afegir 200 l de la suspensi 50% de Ni-NTA agarosa directament al tub. Deixar 15 min a temperatura ambient tot homogenetzant per inversi cada minut. Transferir la suspensi a dos tubs eppendorfs i centrifugar a 2000 rpm a la nanofuga durant 40 segons. Guardar el sobrenedant (travs). Resuspendre amb lajut duna pipeta automYca cada tub en 1 ml de tamp B. Centrifugar a 2000 rpm a la nanofuga durant 40 segons. Descartar el sobrenedant. Resuspendre amb lajut duna pipeta automYca cada tub en 0,3 ml de tamp C i ajuntar-los en un sol tub. Centrifugar a 2000 rpm a la nanofuga durant 40 segons. Guardar el sobrenedant (eluci pH=5,9). Resuspendre amb lajut duna pipeta automYca el tub en 0,2 ml de tamp D i centrifugar a 2000 rpm durant 40 segons a la nanofuga. Guardar el sobrenedant (eluci pH=4,5).

6.

ELECTROFORESI DE PROTENES EN GEL DE POLIACRILAMIDA SDS. PREPARACI

1. 2. 3. 4. 5. 6.

Netejar amb cura els vidres i collocar el vidre peYt sobre el gran. Collocar els dos vidres a ladaptador, amb el vidre peYt a la part frontal. Tancar ladaptador, assegurant-se que les parts inferiors dels dos vidres estan ben alineades. Collocar ladaptador amb els vidres al suport i ajustar amb la pina. Assegurar-se, amb aigua desYllada, que no hi ha prdues. Eliminar laigua i assecar b. Preparar el gel separador. Amb aigua desYllada sevita la curvatura de la part superior del gel. Deixar polimeritzar. NO AFEGIR EL TEMED I EL PERSULFAT FINS JUST ABANS DABOCAR. Preparar el gel apilador. Collocar la pinta vigilant la formaci de bombolles i deixar polimeritzar. GEL SEPARADOR H2O Tamp gel separador Acrilamida/bisacrilamida TEMED Persulfat amnic 2,4 ml 2,5 ml 5 ml 4 l 100 l GEL APILADOR H2O Tamp gel apilador Acrilamida/bisacrilamida TEMED Persulfat amnic 2,3 ml 0,5 ml 0,67 ml 4 l 40 l

ELECTROFORESI DE PROTENES EN GEL DE POLIACRILAMIDA SDS. PREPARACI

7. 8. 9.

Desmuntar el suport i treure els vidres dels adaptadors. Muntar la cambra interior de la cubeta, amb dos gels amb el vidre peYt a linterior. Tancar la cambra, muntar la i cobrir amb tamp deluci 1x amb compte que cobreixi els vidres peYts sense sobrepassar els grans. Guardar a 4C.

ELECTROFORESI DE PROTENES EN GEL DE POLIACRILAMIDA SDS

Mostres a carregar 1. Marcadors de pes molecular 2. CulYu t=0 3. CulYu t=3h inducci 4. Travs de la cromatograa. 5. Fracci eluda.

Visualitzaci de lelectroforesi 1. Observar el gel en el transilluminador per detectar la uorescncia. 2. Incubar 15 minuts en tamp de Ynci i agitaci. 3. Deixar O/N destenyint amb aceYc 7%

TRANSFORMACI DE CLLULES COMPETENTS

1. Afegir 5 l de la reacci de lligament a un dels tubs amb 0,1 ml de cllules competents, 5 l de la reacci de control de relligats a l'altre tub i 1 l del control de transformaci al tercer. 2. Barrejar amb molta cura i deixar 10-15 min en gel. 3. Donar un xoc trmic transferint rpidament els tubs a 42C durant 90 s sense agitaci. CONTROLAR B AQUEST TEMPS. 4. Transferir immediatament els tubs al gel durant 10 min i seguidament afegir a cadascun 0,5 ml de medi LB lquid. 5. Incubar durant 30-45 min a 37C. Aquesta incubaci s necessria per a l'expressi del gen de resistncia a l'ampicillina i la recuperaci de les cllules. 6. Centrifugar 20 s a 12.000 rpm a la minifuga i eliminar 0,4 ml de sobrenedant. 7. Amb els 0,2 ml restants resuspendre el sediment cellular 8. Sembrar els 0,2 ml de la suspensi de cllules transformades en la placa de medi LB + ampicillina (50 g/ ml) corresponent. Retolar oportunament les plaques i estendre el lquid damunt del medi amb l'ajut d'una nansa de Drigalsky estril. 9. InverYr les plaques i incubar tota la nit en estufa a 37C.

PROTENES FLUORESCENTS

Green Fluorescence Protein (GFP)

Aequorea victoria

PROTENES FLUORESCENTS

Marcador

localitzaci subcellular nivell expressi protena presncia de tumors

Indicador

interacci de protenes sensor de la presncia de lligands peYts (Ca2+)

PROTENES FLUORESCENTS

En quina regi de la protena estan localitzats els residus responsables del color?

ObjecUu

BFP

GFP Subclonar diferents fragments del gen de la BFP en el gen de la GFP

CLONATGE. ETAPES

- Allament del fragment de DNA - Restricci de DNA genmic - Obtenci del cDNA - Sntesi qumica - Amplicaci per PCR - Uni a una molcula de vector - Introducci del DNA recombinant a la cllula hoste - Selecci - Anlisi dels plasmidis recombinants. - Restricci - Seqenciaci

CLONATGE. ENZIMS UTILITZATS

Endonucleases de restricci

T4 DNA lligasa

Fosfatasa alcalina

PolinucleUd quinasa

Transcriptasa inversa

RNAsa A / RNAsa H

Taq polimerasa

Nucleasa S1

ENZIMS DE RESTRICCI

Catalitzen la hidrlisi dun enlla fosfodister entre un carboni 3 i un grup fosfat. Tenen una funci de defensa en relaci amb els sistemes de meYlaci.

Tipus I: reconeixen una diana i tallen a latzar a ms de 1Kpb del lloc de reconeixement Tipus II: reconeixen una diana, normalment de 4-6 pb, i tallen el DNA en la seqncia de reconeixement Tipus III: reconeixen una determinada diana per tallen el DNA 24-26 pb corrent avall del lloc de reconeixement

ENZIMS DE RESTRICCI

Extrems llisos

Extrems cohesius

EcoRI PstI XhoI BtgZI

UNI AL VECTOR

DigesU del vector i el gen amb els mateixos enzims de restricci

Uni dels fragments de DNA

Formaci dels enllaos fosfodister catalitzada per la T4 DNA lligasa

DNA recombinant

UNI AL VECTOR

VECTORS

plasmidis de bacteris molcules de dsDNA (doble cadena) circulars extracromosmiques bacterifags fag l, l, etc cromosomes arUcials procariotes, llevat plasmidis de llevat i altres eucariotes virus eucariotes

VECTORS EN PROCARIOTES

Upus

plasmidis fags csmids bacterial arYcial chromosomes (BACs) transformaci transfecci recombinaci GenYca hibridaci amb cids nucleics immunoqumica

introducci a la cllula hoste

selecci

SELECCI GENTICA

auxotroes anUbiUcs anYbiYcs ms uYlitzats i concentracions efecYves

anUbiUc Amp Cab Cam Kan Rif Tet ampicillina carbenicillina cloramfenicol kanamicina rifampicina tetraciclina concentraci (mg/ml) 100 100 34 30 200 12.5 sense anUbiUc amb anUbiUc

SEQENCIACI

VECTORS DE CLONATGE

- origen de replicaci - marcador de selecci - lloc mlUple de clonatge (MCS)

VECTORS DEXPRESSI

- origen de replicaci - marcador de selecci - lloc mlUple de clonatge (MCS) - regions necessries per la transcripci - promotor - seqncia de terminaci - regions de regulaci - regions necessries per la traducci

VECTORS DEXPRESSI

VECTORS DEXPRESSI
CARACTERSTICA Promotor T7 Lloc hibridaci T7prom RBS Lloc inici ATG 6xHis tag T7 gene 10 leader Eptop Xpress Lloc tall enteroquinasa Gen protena fluorescent Lloc hibridaci T7term Origen f1 Gen bla (ampicillina) Origen pUC FUNCI
Permet una regulaci molt bona de lexpressi Permet la seqenciaci per 5 Uni al ribosoma Inici traducci Codifica per 6 His per a la purificaci Seqncia que proporciona estabilitat a la protena. Permet la detecci de la protena usant una antics contra aquesta regi. Permet eliminar per proteolisi tot aquest segment N-terminal GFP o BFP Permet la seqenciaci per 5 Permet lobtenci de DNA monocatenari Permet la selecci de els colnies transformades Permet la replicaci del plasmidi en E.coli

VECTORS DEXPRESSI. OPER LAC

repressor lac

lactosa permeasa

galactsid aceUltransferasa

-galactosidasa

VECTORS DEXPRESSI

pET22b

VECTORS DEXPRESSI. PROMOTOR DEL FAG T7

E. coli

RNA

IPTG induccci
T7 gene 1

T7 RNA polymerase T7 RNA polynerase Target gene

polymerase

lac o lac promoter T7 lisozim

lac o T7 promoter

lac repressor

lac repressor

vector

lac I gene

lac I gene

pLys

Chromosome

E. coli BL21(DE3)

PURIFICACI DE LA GFP

PURIFICACI DE LA GFP

pH 8

pH 4.5

imidazol

hisUdina

1. Obriu amb el programa Chromas les seqncies de GFP i de BFP obYngudes amb els oligonucleYds Prom i Term. Repasseu que no hi hagi cap indeterminaci de seqncia. Guardeu les seqncies en format FASTA de manera que es reprodueixi la cadena lectora des de 5 cap a 3. Anomena-les PromGFPFASTA, TermGFPFASTA, PromBFPFASTA i TermBFPFASTA. 2. Per a cada un dels vectors seqenciats, introduu els seus arxius FASTA generats en laplicaci MultAlin. ObYndreu lalineament de les dues seqncies (Prom i Term) i podreu acabar de completar la seqncia que no heu obYngut amb laltre oligonucleYd. 3. Heu de presentar per a cada vector (pRSET_GFP i pRSET_BFP) un arxiu en format FASTA que reprodueixi tota la seqncia possible. Anomeneu-les setGFPFASTA i setBFPFASTA.

4. Introduu els nous arxius FASTA generats (setGFPFASTA i setBFPFASTA) en laplicaci Webmap per tal dobtenir un mapa de restricci de cada vector i la traducci en els tres marcs possibles de lectura. IdenYcar en base a les dianes de restricci que marquen els inicis de cada part del gen el marc de lectura correcte. 5. Heu de presentar un mapa de restricci de cada vector i la seva traducci a seqncia aminoacdica. 6. Indiqueu per a cada un dels vectors quin segment de DNA correspon a la protena uorescent, a la cua dhisUdines, a la diana de lenteroquinasa i a leptop Xpress. 7. Creeu dos nous txers FASTA en el que es presenY nicament els gens de la GFP i de la BFP. Anomenals BFPFASTA i GFPFASTA.

8. Introduu els arxius GFPFASTA i BFPFASTA en laplicaci Codon usage per tal danalitzar ls de cod de cada gen. Compareu-lo amb el de la seqncia GFP salvatge, obYnguda a parYr de mRNA de Aequorea victoria. Tenen el mateix s de cod que la seqncia de la GFP salvatge? Quina creus que s la ra? 9. Introduu els arxius GFPFASTA i BFPFASTA en laplicaci MultAlin per tal de presentar una homologia de seqncia entre la BFP i la GFP. 10.Heu de presentar una llista de les mutacions a nivell de DNA i a nivell de protena entre la GFP i la BFP. 11.Indiqueu quines de les mutacions presenten cada un dels fragments subclonats per cada grup i indicar si el fragment subclonat ha introdut un canvi en el fenoUp. 12.Heu de presentar un resum dels diferents resultats que has anat obtenint al llarg de la setmana (unes tres o quatre pgines com a mxim).