TRK TOPLUMUNDA MTOKONDRYAL DNA DZ ETLLNN ARATIRILMASI SBAG-1606

Prof. Dr. Reyhan ner Hatice Mergen

Ocak 2000 Ankara

NDEKLER Sayfa No Tablo ve ekiller Dizini zet Abstract Giri KISIM I I.1 Mitokondri DNAs D-loop blgesi dizi eitliliinin Aratrlmas le ilgili almalar 7 I.2 Proje Kapsamnda Trk toplumunda mtDNAs D-loop blgesi dizi eitliliinin aratrlmas ile ilgili almalar 9 I.3 Materyal ve Metod I.3.2 Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) I.3.3 DNA Dizi Analizi I.3.4 DNA Dizi analizi ile elde edilen verilerin deerlendirilmesi iin kullanlan metodlar 16 I.4 Bulgular ve Tartma 19 KISIM II II.1 Mitokondriyal Hastalklar ile ilgili almalar 25 II.2 Proje kapsamnda yaplan mitokondriyal hastalklar ile ilgili almalar 28 II.3 Materyal ve Metod II.3.1 DNA izolasyonu 29 29 10 12 14 I.3.1 Genomik DNA zolasyonu 10 iii 1 2 3

II.3.2 Southern Blot Analizi (Delesyonlarn taranmas) 29 II.3.3 Probun Hazrlanmas 30 II.3.4 Prehibridizasyon ve Hibridizasyon 31 II.3.5 3243 A G Mutasyonunun Taranmas II.4 Bulgular ve Tartma II.4.1 Mitokondriyal hastalk tad phe edilen hastalar ile ilgili bulgular 33 II.4.2 Diabetes mellituslu 100 Trk hastada yaplan almalar ile ilgili bulgular 35 31 33

ii

III Sonu ve neriler IV. Kaynaklar Ekler Ek 1 Trk Diabet Cemiyeti tarafndan verilen

37 39

Celal ker Diabet Bilim dl belgesi .. 41 Ek 2 34. Ulusal Diabet Kongresi ve 3. Uluslarars Obesite Sempozyumu tebli zeti Ek 3 BJMG dergisinde baskda olan makale Ek 4 J. Biochemical and Biophysical Methods Dergisinde kabul edilen makale ... 58 Bibliyografik Bilgi Formu 67 42 44

iii

TABLO ve EKLLER DZN Sayfa No Tablo 1.Trk toplumunda gzlenen mtDNAs D-loop blgesine ait mutasyonlar. Tablo 2. Missens mutasyonlar ve ilgili hastalklar .. Tablo 3. tRNA mutasyonlarna bal hastalklar . Tablo 4. Proje kapsamnda incelenen hastalara ait bilgiler .. 20 27 27 28

ekil 1. nsan mtDNAs genom organizasyonu .. ekil 2. allan rneklerin blgesel dalm . ekil 3. nsan mtDNAs D-loop blgesinin nkleotid dizisi ve amplifikasyon ve DNA dizi analizi iin kullanlan primerlerlerin yerleri ekil 4. MtDNA dizi analizi resimleri ekil 5. MtDNAs D-loop blgesindeki nkleotid farkllklarna gre blgeler aras ilikiyi gsteren Neighbour-joining metoduna gre izilen filogenetik aa ekil 6. MtDNAsnda en yaygn grlen mutasyonlar ekil 7. tRNALeu geninde en sk grlen mutasyonlar ekil 8. Baz hastalara ait mtDNA delesyonu saptanmas iin uygulanan

4 11 13 21

24 26 32

Southern blot sonular 33 ekil 9. 3243 A- G mutasyonunun saptanmas iin Apa I enzimi ile kesime konmu 294 b byklndeki PCR rnnn agaroz jel grnts . 34

NSZ Mitokondriyal DNA (mtDNA) almalar son yllarda olduka nem kazanmtr. eitli insan toplumlarnn mtDNAsndaki polimorfik blgeler incelenerek insann evrimi , toplumlar aras ilikiler, tarih boyunca sre gelen g yollarnn belirlenmesi eklinde almalar yaplmaktadr. Bu projenin amac literatrde eksik olan Trk populasyonundaki mtDNA polimorfizmlerinin ortaya karlmas, dier toplumlarda kullanlan haplotip almalar dorultusunda Trk toplumundaki mtDNA haplotipinin belirlenmesi olmutur. Anadolunun tarih boyunca eitli uygarlklarn, ticaret ve g yollarnn zerinde yer ald dnlrse sunulan bu almada elde edilen bilgilerin nemli olduu aktr. Ayrca laboratuvarmzdaki olanaklar erevesinde eitli hastanelerden

mitokondriyal hastalk phesi ile gelen hastalarda mtDNAsnda mutasyon olup olmad incelenmeye allmtr. Baz toplumlarda diabet ile birlikte grlen 3243 A G mtDNA mutasyonu diabetli 100 Trk hastada aratrlmtr. Projeden salanan destek ile bir doktora rencisinin tez almas tamamlanmtr. Proje almalar srasnda elde edilen verilerin bir ksmnn deerlendirilmesi ile hali hazrda iki makale yayna kabul edilmitir. Bu projenin gerekletirilmesinde ve u andaki konumuna getirilmesinde destek veren Trkiye Bilimsel ve Teknik Aratrma Kurumuna, raporlarn deerlendirilmesinde ve projenin takibinde gsterdikleri ilgiden tr Salk Bilimleri Aratrma Grubu Yrtme Komitesine teekkrlerimizi sunarz.

ZET Son yllarda molekler biyolojide gelitirilen teknikler sayesinde ekirdek genomu ile ilgili almalarn yan sra mitokondriyal DNA (mtDNA) da ok allmaya balanmtr. Bu almalar hem mitokondriyal hastalklara neden olan mutasyonlarn saptanmas eklinde hem de toplumlarda mtDNAs zerindeki polimorfik nkleotid dizilerinin aratrlmasna dayanan toplumsal, arkeolojik ve evrimsel almalar eklinde grlmektedir. Bu projenin amac, Trk toplumunun mtDNAs D-Loop blgesindeki dizi eitliliinin aratrlmasdr. Trkiyenin farkl 5 corafik blgesinden (dou, bat, gney, orta ve kuzey olmak zere) en az 14er kii olmak zere toplam 75 kiiden alnan rneklerde DNA dizi analizi yntemi ile mtDNAsndaki polimorfik noktalar saptanmtr. D-loop blgesinde yaklak 600 baz ifti (b) uzunluunda deiken blgelerin dizi analizi yaplmtr. Yaplan alma sonucu Trkiyedeki corafik blgelerde genetik adan zgllk grlmemitir. Hibir blge kendi iinde ayr bir haplogrup oluturmamaktadr. Trkiye genelinde ise heterojen bir yap sz konusudur. Bu almann yan sra eitli hastanelerden mitokondriyal hastalk olduu phesi ile gelen toplam krkbe kiide MELAS mutasyonu olarak bilinen ancak pek ok farkl hastalklarda da sk rastlanan 3243 pozisyonundaki G A mutasyonu ve Southern blot yntemi ile mtDNA snda herhangi bir delesyonunun olup olmad aratrlmtr. allan hastalarn hi birinde bu mutasyonlara rastlanmamtr. Baz toplumlarda diabetli hastalarda grlen ve diabet ile ilikili olduu dnlen MELAS mutasyonu 53 inslin baml olmayan (Tip II, non-insuline-dependentdiabetes mellitus, NIDDM) ve 47si ise insline baml olan (Tip I, Insulinedependent-diabetes mellitus, IDDM) toplam 100 Trk diabet hastasnda taranmtr. allan hastalarn hi birinde bu mutasyonun bulunmamas diabet ile MELAS mutasyonu arasnda belirli bir ilikinin olmad grn savunan almalar desteklemitir. Anahtar szckler : Mitokondriyal DNA, polimorfik nokta, DNA dizi analizi, polimeraz zincir reaksiyonu, mitokondriyal hastalklar, mitokondriyal DNA mutasyonlar.

ABSTRACT In recent years due to the techniques developed in molecular biology, the studies on mitochondrial DNA (mtDNA) as well as nuclear DNA have increased with utmost interest. These studies have been concentrated on both the identification of mtDNA mutations which cause mitochondrial disease and changes. In the presented study the nucleotide differences in the D-loop region of mtDNA in Turkish population have been investigated. Total of 75 DNA samples from the individuals in which at least 14 individuals from 5 different geographic region of Turkey (eastern, western, northern, southern and central part of Turkey) have been sequenced. Sequencing region was limited for approximately 600 bp hypervariable regions of D-loop. Our results have clearly demonstrated that there seems no genomic discrimination between the geographic regions in Turkey. None of the regions have their on spesific haplotypes. Some degree of heterogeneity was observed through out the country besides this population study, total of 45 DNA samples from the individuals who were suspected having mitochondrial diseases where investigated. We searched them for the common 3243 A G alteration, known as MELAS mutation but also seen in many different diseases. These samples were also screened for the deletion form of the previously reported mitochondrial diseases such as Pearson. We did not detect any of these mutations in the studied individuals. It has been proposed that 3243 A G mutation is also associated with diabetes mellitus in some population. We have screened 53 patients with non-insuline dependent- diabetes mellitus (type II, NIDDM) and 47 patients with insuline dependent- diabetes mellitus (type I, IDDM) for this mutation. The absence of this mutation in all studied patients with diabetes mellitus support the previous studies that tehere is no significant relation between the MELAS mutation and diabetes mellitus. evoluation of the population genetics, evolution and archeological studies based on the polymorphic nucleotide

Key words: Mitochondrial DNA, polymorphic site, DNA sequencig, polymerase chain reaction, mitochondrial diseases, mitochondrial DNA mutations.

GR Mitokondri karyotik hcre organellerinden biridir. Hcrelerdeki says hcreden hcreye farkllk gsterir, rnein bir karacier hcresinde yaklak 1000 adet mitokondri bulunur. Bir d membran ve girintili kntl yaps olan bir i membran vardr. Mitokondrinin karyotlarda oksidatif fosforilasyon merkezi olduu 1948 de Eugene Kennedy ve Albert Lehninger tarafndan bulunmutur. Organizmada oksidatif ykm rnlerinden alnan elektronlarn molekler oksijene aktarlmas srasnda aa kan enerji ile ADP ve Pi den ATP sentezlenmesi olay oksidatif fosforilasyon olarak adlandrlr ( Lehninger, 1993). ADP + Pi + (H+)d tarafndan yrtlr. Kompleks I (Sksinat Dehidrogenaz Kompleksi): 39 polipeptit ierir ve bu polipeptitlerden 7 tanesi; ND1, ND2, ND3, ND4, ND4L, ND5, ND6 mitokondri genomu tarafndan sentezlenir. Kompleks II (NADH Dehidrogenaz Kompleksi): 4 polipeptit ierir ve bu polipeptitlerin hepsi ekirdek genomu tarafndan sentezlenir. Kompleks III (UQ-Cytc Oksidoredktaz Kompleksi): 10 polipeptit ierir ve bu polipeptitlerden sadece 1 tanesi, Cytb , mitokondri genomu tarafndan sentezlenir. Kompleks IV (Cytc Oksidaz Kompleksi): 13 polipeptit ierir ve bu polipeptitlerden 3 tanesi, COI, COII, COIII mitokondri genomu tarafndan sentezlenir. Kompleks V (ATP Sentaz Kompleksi): 12 polipeptit ierir ve bu polipeptitlerden 2 tanesi, ATPase6 ve ATPase8, mitokondri genomu tarafndan sentezlenir (Lehninger , 1993). nsan mitokondri DNAsnn genom organizasyonu ekil 1de grlmektedir. nsan mitokondri DNAs 16569 baz ifti (b) byklnde, kapal dairesel ift zincirli bir molekldr. nsan mitokondri DNAsnn tm baz dizisi ve genom organizasyonu 1981 ylnda Anderson ve arkadalar tarafndan ortaya karlmtr ve o zamandan beri, onun nkleotid numaralandrmas esas alnmaktadr. MtDNA zincirlerinden guanin ierii fazla olan zincire ar zincir (H zincir), sitozin ierii fazla olana ise hafif zincir (L zincir) denir.Ar zincirden 12S ve 16S ribozomal RNA (rRNA), 13 polipeptit ve 14 transfer RNA (tRNA) sentezlenir. Hafif zincirden ise bir polipeptit ve 8 tRNA sentezlenir (Anderson , 1981). ATP + H0 + (H+)i Oksidatif fosforilasyon mitokondri i membrannda yer alan 5 enzim kompleksi

Her iki zincirin bir birinden ayr replikasyon orijini vardr. Ar zincirin replikasyon orjini D-loop (Displacement loop) denen kontrol blgede yer alr. D-loop blgesi ise her iki zincire ait promotor blgelerini ierir. Ar zincirin promotoru PH= 392- 445 b blgelerinde yer almaktadr. Promotor blgede tane deimez baz dizileri olan blgeler ( Conserved Sequence Box ) bulunmaktadr. Bu dizilerin yerleri; CSBI: 213235, CSBII: 299-315, CSBIII: 346-363 baz iftleri arasndadr. D-loop blgesinde yer alan dier korunmu dizi ise 16147-16172 baz iftleri arasnda yer alan Termination Associated Sequences adverilen TAS kutusudur. Insan mtDNAsnda genler ok sk paketlenmitir. Genler aras blge yoktur. Genler iinde intronlara rastlanmaz. Genetik kodda farkllklar grlr. yle ki; UGA dur kodonu deildir ve triptofan kodlamaktadr. AGA arjinin kodonu ise mtDNAsnda dur kodonu olarak almaktadr (Watson , 1987). Mitokondri DNAsnn ekirdek DNAsndan bamsz replikasyon ve transkripsiyon sistemi vardr. Ancak mtDNAsnn replikasyonu ve transkripsiyonu iin gerekli btn enzimler ekirdek DNAs tarafndan kodlanr. Displacement loop diye adlandrlan mekanizmaya gre replike olur. Ar zincirin replikasyon orijininden sentez balar ve 5 3 saat ynnde ilerlerken H zincir alr. Yeni sentezlenen zincir L zincirin replikasyon orijinine geldii anda ters ynde yeni L zincir sentezlenmeye balar. Bylece iki zincirin replikasyonu birbirine ters ynde ilerler ve 5 3 ynnde devaml sentez olduu iin Okazaki fragmentleri iermez. OH dan itibaren ilk sentezlenen ve TAS blgesinde sonlanan 700 blik blgeye D-loop veya 7S blgesi denir ve kodlayc blge deildir (Wallace, 1992). Mitokondri DNAsnn transkripsiyonu ise D-loop blgesindeki iki promotordan itibaren birbirine ters ynde balar. Iki zincir ayn anda ve tamamen transkripsiyona urar. Sentezlenen ncl RNA daha sonra RNAase P ile kesilerek, tRNAlar, mRNAlar ve rRNAlar serbest kalr (Wallace, 1992). Mitokondri DNA genetii ekirdek DNAsnnkinden be ynden farkldr. Birincisi yukarda sz edildii gibi ekirdek DNAsndan bamsz olarak kendini eler ve proteinlerin sentezi iin kendi ribozomlar vardr. Bu durum mtDNAsna yar otonom zellik verir. kincisi, Giles tarafndan yaplan almalar insan mtDNAsnn maternal kaltmla getiini gstermitir. Anne, mtDNAsn tm ocuklarna verir (Giles, 1980). Ancak kz ocuklar bunu ikinci nesile aktarr. ncs replikatif

segresyon zellii vardr. Her bir insan hcresinde yzlerce mitokondri ve binlerce mtDNAs bulunur. Bir insan hcresinde hem mutant hem de normal mtDNAlar bulunabilir (heteroplazmi). Heteroplazmik hcreler hcre blnmesine urarsa mutant ve normal mtDNAlar yavru hcrelere dzensiz bir dalm gstererek geer. Sonuta tekrar tekrar blnen hcreler giderek saf mutant ya da saf normal mtDNA ieren genotipe dnr (homoplazmi). Drdncs mtDNA genomunun eik deerde ifadesi sz konusudur. Her organ sisteminin mitokondriyal enerjiye deiik oranlarda ihtiyac vardr. Mitokondriyal ATP retimi her organ iin gerekli minimum enerji dzeyinin altna dmemesi gerekir. Gerekli bu minimum enerjiye eik (treshold) enerjisi denmektedir. Eer eik enerjisinin altnda ATP retimi olursa bozukluklar ortay kmaya, sendromlarn kliniinde belirgin bozukluklar grlmeye balar. Mitokondri DNAsndaki genlerin ifadesi o organ iin gerekli minimum mitokondriyal ATP enerjisini salayacak ekilde olur. Beinci zellii ise mtDNAsnn evrim hznn ekirdek DNAsndan 10-20 kat daha fazla olmasdr. Yani mutasyonlara aktr. Bu zellik nedeniyle herhangi iki birey arasnda mtDNAnn 1000 nkleotidinden 4 nkleotidi farkllk gsterir. Doal ve lml mutasyon eitli insan topluluklarnda sabitleir. Bu zellik populasyon ve evrim almalarna deiik adan yaklam salamaktadr (Wallace, 1992). Mitokondri genomu ile yaplan molekler almalar mitokondriye bal hastalklarn aratrlmas amacyla mitokondri genomundaki genlerde yer alan mutasyonlarn saptanmas ve insan rklarnn aralarndaki ilikiyi saptamak iin populasyon almalar ve molekler arkeoloji aratrmalar zerine younlamtr. Bu projede yaplan almalar, Trk toplumundaki mtDNA D-loop bolgesi polimofik noktalarnn saptanmas ve mitokondriyal hastalklara neden olan baz mutasyonlarn taranmas eklinde iki ksma ayrlmtr.

I.1 MTOKONDR DNA'SI D-LOOP BLGES DiZi ETLLNN ARATIRILMASI LE LGL ALIMALAR Mitokondri DNA's insanlarda nemli dizi eitlilii gstermektedir. Yalnzca 16569 baz ifti uzunlua ve insan genomunda ok kk blgeleri kodlama potansiyeline sahip olmasna ramen insan toplumlarnda mtDNA dizi eitliliinin belirlenmesi yoluyla insann evrimi, kkeni ve g yollar hakknda ok nemli bilgiler elde edilmesini salamtr (Schon., 1989 ). nsann kkeninin aratrlmas ve eitli topluluklar arasndaki ilikilerin ortaya karlmas bakmndan mitokondri DNAsnn allmasnn iki nemli nedeni vardr. Birincisi, bireyin anneden ve babadan ald ekirdek DNAnn tersine mtDNA yalnzca anneden eey hcresine geer (Nakase, 1990). Mitokondri ekirdek dnda hcre stoplazmasnda yer almaktadr. Erkek ve dii eey hcreleri (yumurta ve sperm) memelilere zg dllenme srasnda birletikleri zaman, sperm yumurta hcresine sadece kromozomlarn vererek zigot oluumu gerekleir. Bu nedenle cinsiyeti hangi ynde geliirse gelisin byyen embriyoya aktarlan mitokondriler yalnzca yumurta hcresinin stoplazmasndan yani anneden kaynaklanr. ekirdek DNAs yoluyla yaplan evrimsel almalarda anne ve babadan gelen genlerin mayoz srasndaki rekombinasyon olaylarnn olmas nedeniyle ok kark genetik dzenlemeler ortaya kar. Halbuki mtDNAsnn rekombinasyona uramas gibi bir olay sz konusu deildir ve genetik zellikler, bireyden anneye, anneden anneanneye, anneanneden onun annesine doru gidilerek takip edilebilir. kincisi mtDNAs bireyler aras genetik farkllklarn llmesinde ekirdek DNAsndan daha duyarl bir molekler saat olabilir. Herhangi iki toplum ne denli uzun sre birbirlerinden ayr kalrlarsa, DNAlar zerinde meydana gelen mutasyonlardan tr ortaya kan genetik farkllklar o kadar ok olur. ekirdek DNAsnda mutasyon olmas ok yavatr. nk ekirdek DNAs hcre ekirdei iinde, proteinlerle birlikte daha korunmaldr. Halbuki kk, dairesel mtDNAs aktr ve ekirdek DNAsndan 10 kat daha fazla mutasyon biriktirir. Her milyon ylda bir, 100 nkleotidde 1-2 mutasyon olabilir. MtDNAsndaki mutasyonlar bal olarak daha ksa evrimsel sreleri ( birka yz bin yl ) belirlemek iin kullanlr.

Mitokondri ile yaplan populasyon almalarnda izlenen yollar ilk nceleri tm mitokondri DNAsnn eitli restriksiyon endonkleaz enzimleri ile kesilerek Southern blot analizi ile restriksiyon para uzunluklarnn (RFLP) analizine dayanmaktayd. Bu ekilde bir restriksiyon endonkleaz enziminin kesim noktasn ortadan kaldran yada yeni bir kesim noktas yaratan polimorfizmler bireyler arasndaki yada toplumlar arasndaki genetik farklln incelenmesinde kullanlrd.1985 ylndan sonra gelien polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) teknii nedeniyle nispeten kolaylaan DNA dizi analizi almalar sonunda mtDNAsndaki baz dizisi farkllklarnn aratrlmas almalar younluk kazanmtr (Passorio, 1993). Polimorfizm almalar, eitli restriksiyon endonkleaz enzimlerinin kesim noktalarna gre ortaya kan fragment uzunluklarnn (RFLP, Restriction Fragment Length Polymorphism) analizleri ve kodlayc olmayan D-loop blgesini kapsayan baz deiimlerinin DNA dizi analizi teknikleri ile aratrlmasn iermektedir. Asya Mool rk mtDNA'larnn yaklak %60'nn Afrika ve Avrupa toplumlarnda olmayan 1039. nkleotidde yer alan Alu I restiksiyon endonkleaz blgesini ierdiinin gsterilmesi bu almalara rnek olarak verilebilir (Ballinger, 1992). Italyan, Hindistan, in, Japon, Kore, Amerikan, ilkel ve gnmz Afrika toplumlar gibi pek ok insan toplumunda mtDNA kullanlarak yrtlen benzer almalarla bu toplumlarn kkeni, yaylm ve evrimleri konularnda geni bilgiler elde edilmitir. Ayrca D-loop blgesinde ortaya kan mutasyon oran her yl iin 7x10-8 olarak hesaplanm ve bu deiim oranna gre en son ortak insan mtDNA atasnn ya 143.000 + 18.000 yl olarak bulunmutur (Horai, 1996). Ayrca ilk insann Afrikada ortaya kt ve buradan dier ktalara yayld ortaya karlmtr. Kaliforniya niversitesi, Berkeleyden , Rebecca Cann, Allan Wilson ve Mark Stoneking 1987 ylnda Nature dergisinde yaynladklar Mitokondriyal DNA ve insann evrimi balkl aratrmada yaayan tm insanlarn genetik zelliklerinin bir ksm, yaklak 200 bin yl nce Afrikada yaam bir dii bireye dek izlenebildii ortaya atlm ve bu ekilde bugnk insann kkenlerine ilikin tartmalarda nemli yer tutan Mitokondriyal Havva gr ortaya atlm oldu (Cann ,1987).

I.2 PROJE KAPSAMINDA TRK TOPLUMUNDA MTOKONDR DNASI D-LOOP BLGES DZ ETLLNN ARATIRILMASI LE LGL ALIMALAR Tamamlanm olan bu projenin byk bir blmn, Trk toplumunda mitokondriyal DNA D-loop blgesi dizi eitliliinin DNA dizi analizi teknikleri kullanlarak ortaya karlmas oluturmutur. Bu almalarda materyal olarak kullanlan kan rnekleri Trkiye'de farkl corafik blgelerde yaayan ve aralarnda akrabalk ilikisi olmayan bireylerden salanmtr. Bugne dek yaplan almalar sonucunda ayn toplumun farkl corafik blgelerde yaayan bireylerinde farkl mtDNA mutasyonlarnn gzlenmesi nedeniyle mutasyonlarn corafik orijine bal olarak ortaya kt gr kabul edilmitir. Bu sonu gz nne alnarak proje kapsamnda allan rnekler farkl corafik blgelerden toplanmtr. Trkiye'nin dou, bat, kuzey ve gney olarak ayrlan blgelerinde yaayan bireylerin aile hikayeleri not edilerek iki nesil ncesine kadar ailenin bu blgede yaadna emin olunmutur. Her blgeden 15 birey olacak ekilde toplam 75 bireyin her birinden alnan kan rneklerinden DNA izolasyonlar gerekletirilmitir. Daha sonra mitokondriyal DNA genomunun D-loop blgesindeki polimorfik nokta mutasyonlarnn gsterilmesi iin DNA dizi analizi teknii uygulanmtr.

10

I.3 MATERYAL VE METOD Bu projede materyal olarak aralarnda akrabalk ilikisi olmayan 75 bireyden alnan yaklak 5 ml periferal kan rnekleri kullanlmtr. almamzda, Trkiye, Karadeniz Blgesi, I Anadolu Blgesi, Akdeniz Blgesi, Ege ve Marmara blgesi ve Dou ve Gneydou Anadolu Blgesi eklinde corafik blgelere ayrlarak bu 5 ayr corafik blgeden en az 14 birey olacak ekilde kan rnekleri toplanmtr. G durumlarnn anneannelerinin olabilecei dnlerek zellikle rneklerin annelerinin ve yaad blgeler de gz nne alnmtr. rneklerin corafik

dalm ekil 2de verilmektedir. I.3.1 Genomik DNA zolasyonu Bireylerden alnarak EDTA'l tplerde toplanan kan rneklerinden Yen ve arkadalarnn gelitirdii ynteme gre genomik DNA izolasyonu yapld (Yen el al, 1992). Yeteri kadar DNA elde edebilmek iin her bir rnek iin bu yntem 4-5 kez tekrarland. Bir ependorf tpne 200 l kan rnei konarak zerine 500 l TE tampon ( 20 mmol/l Tris-HCl, 1 mmol/l EDTA, pH 8.0 ) ilave edilip 13000 rpm'de 1 dakika santrifj edilerek ykand. Ykanm hcreler lizis tampon ile (TE tampon; 10 g/ml proteinaz K, % 0.5 SDS ) son hacim 400 l olacak ekilde kartrlarak 56 0C'de 1 saat inkbe edildi. Daha sonra 1.0 mol/l NaCl ile kartrlan rnekler 4 0C'de 2 saat inkbe edildi. zerine eit hacim fenol ilave edilerek 2500 rpm' de 2 dakika santrifj edildikten sonra sulu faz temiz bir ependorf tpne aktarld. zerine iki hacim etil alkol konarak DNA ktrld. ken DNA %70'lik etil alkol ile ykandktan sonra 100-200 l steril distile suda zld.

11

ekil 2. allan rneklerin blgesel dalm

12

I.3.2 Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) Mitokondri DNAs D-loop blgesi amplifikasyonu baz modifikasyonlarla birlikte Saiki ve arkadalarnn gelitirdii ynteme gre yaplmtr (Saiki , 1988). Mitokondriyal DNA zerinde yer alan polimorfik blgelerin tespiti iin mtDNA genomunun tamam blgelere ayrlarak incelenmitir. ekil 3de grld gibi HVR I ve HVR II blgelerinin asimetrik amplifikasyonlar iin kullanlan primer setleri u ekildedir; HVR I blgesi iin; L15926 (direkt) H16421(revers) HVR II blgesi iin; L16471(direkt) H00580 (revers) 5' GGGTAGCTAAAGTGAACTGTA - 3' 5' - TGCTTTGAGGAGGTAAGCTACATA - 3' 5' - TACACCAGTCTTGTAAACCGGAGA - 3' 5' - TTGATTTCACGGAGGATGGTGG - 3'

Asimetrik mtDNA amplifikasyonu iin primer setlerinin oranlar reaksiyon boyunca 1/100 olacak ekilde hesapland. Reaksiyon karm 100 l toplam hacim iinde; 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, % 0.1 TritonX-100, 2 mM MgCl2, 100 pmol 5' ve 1 pmol 3' primerleri, her bir dNTP'den 200 M 1 g DNA ve 2.5 U Taq DNA polimeraz olacak ekilde hazrland. PCR; DNA Thermal cycler'da , 30 dngde u programa gre gerekletirilmitir : 94 oC de 45 saniye denatrasyon; 50 oC de 1 dakika annealing; 72 oC de 3 dakika polimerizasyon.

13

AATACCAACT ATCTCCCTAA TTGAAAACAA AATACTCAAA TGGGCCTGTC CTTGTAGTAT AAACTAATAC ACCAGTCTTG TAAACCGGAG ATGAAAACCT TTTTCCAAGG ACAAATCAGA L15926 GAAAAAGTCTTTAACTCCACCATTAGCACCCAAAGCTAAGATTCTAATTTAAACTATTCT mitS1D CTGTTCTTTCATGGGGAAGCAGATTTGGGTACCACCCAAGTATTGACTCACCCATCAACA ACCGCTATGTATTTCGTACATTACTGCCAGCCACCATGAATATTGTACGGTACCATAAAT 16099 mit16140D ACTTGACCACCTGTAGTACATAAAAACCCAATCCACATCAAAACCCCCTCCCCATGCTTA CAAGCAAGTACAGCAATCAACCCTCAACTATCACACATCAACTGCAACTCCAAAGCCACC mitS2D CCTCACCCACTAGGATACCAACAAACCTACCCACCCTTAACAGTACATAGTACATAAAGC CATTTACCGTACATAGCACATTACAGTCAAATCCCTTCTCGTCCCCATGGATGACCCCCC mitS5D TCAGATAGGGGTCCCTTGACCACCATCCTCCGTGAAATCAATATCCCGCACAAGAGTGCT mitS2R ACTCTCCTCGCTCCGGGCCCATAACACTTGGGGGTAGCTAAAGTGAACTGTATCCGACAT mitS3D CTGGTTCCTACTTCAGGGTCATAAAGCCTAAATAGCCCACACGTTCCCCTTAAATAAGAC ATCACGATGGATCACAGGTCTATCACCCTATTAACCACTCACGGGAGCTCTCCATGCAT mit16560R TTGGTATTTTCGTCTGGGGGGTATGCACGCGATAGCATTGCGAGACGCTGGAGCCGGAGC ACCCTATGTCGCAGTATCTGTCTTTGATTCCTGCCTCATCCTATTATTTATCGCACCTAC mitS4D GTTCAATATTACAGGCGAACATACTTACTAAAGTGTGTTAATTAATTAATGCTTGTAGGA CATAATAATAACAATTGAATGTCTGCACAGCCACTTTCCACACAGACATCATAACAAAAA mitS6D mitS7D ATTTCCACCAAACCCCCCCTCCCCCGCTTCTGGCCACAGCACTTAAACACATCTCTGCCA AACCCCAAAAACAAAGAACCCTAACACCAGCCTAACCAGATTTCAAATTTTATCTTTTGG mit370R CGGTATGCACTTTTAACAGTCACCCCCCAACTAACACATTATTTTCCCCTCCCACTCCCA TACTACTAATCTCATCAATACAACCCCCGCCCATCCTACCCAGCACACACACACCGCTGC mitS1R TAACCCCATACCCCGAACCAACCAAACCCCAAAGACACCCCCCACAGTTTATGTAGCTTA CCTCCTCAAAGCAATACACTGAAAATGTTTAGACGGGCTCACATCACCCCATAAACAAAT H580

15900 15960 16020 16080 16140 16200 16260 16320 16380 16440 16500 16560 50 110 170 230 290 350 410 470 530 590 650

ekil 3. nsan mitokondri DNAs D-loop blgesinin nkleotid dizisi ve amplifikasyon ve DNA dizi analizi iin kullanlan primerlerin yerleri.

14

I.3.3 DNA Dizi Analizi DNA dizi analizi Sanger'in dideoksi zincir sonlanmas yntemine gre yapld (Sanger, 1977 ). DNA dizi analizi yaplacak olan blgeler PCR ile primer oranlar1/100 olacak ekilde ayarlanarak yukarda anlatld ekilde tek zincirli olarak oaltld. HVRI ve HVRII deiken blgelerin sekans iin drt internal primer kullanlmtr. HVS I (16040 -16340 ) blgesinde yaklak 300 nkleotid ve HVR II blgesinde (16510-270) 330 nkleotid analiz edilmitir. Amplifikasyon ve sekans reaksiyonlar iin kullanlan primerlerin dizileri ve D-loop blgesi zerindeki yerleimleri ekil 2de gsterilmitir. Sanger metodu, DNA zincirinin enzimatik sentezine ve sentezin, 2,3-

dideoksinkleotidtrifosfatlar (ddNTPler) kullanlarak, zgl bazlarda sonlandrlmas temeline dayanr. Sangere ikinci kez nobel dl kazandran bu teknikte; 1. DNA polimeraz tarafndan uzama iin zgl primer kullanlr 2. Zincir uzamas zgl bir bazda sonlandrlr 3. Tek zincirli DNAlar, poliakrilamid jel kullanlarak tek bir nkleotid uzunluuna dayal olarak birbirinden ayrlr. Zincir sonlanmasn salayan 2,3 ddNTPler, deoksiribozun 3 konumundaki hidroksil grubunun eksiklii ile, dNTPlerden ayrlrlar. DdNTPler DNA polimeraz tarafndan uzatlan DNA zincirlerindeki 5-fosfat gruplarna birletirilebilirler. Bununla birlikte, 3 hidroksil grubunun yokluu, dNTP ile baarlan fosfodiester ban kurmay nler. Bu durumda, DNA zincirinin uzamas gereklemez. Bylece DNA sentezi iin reaksiyon karmnda drt genel dNTP ile bir ddNTPnin az miktar bulunduunda bunlar arsnda zincir uzamas ve zgl zincir sonlanmas rekabeti olur. Drt ayr enzimatik reaksiyonda 4 farkl ddNTPnin kullanlmasyla kalp zincirin her A, C, G yada T pozisyonlarnda sonlandrlan oligonkleotid gruplar meydana getirilir. rnlerin ayrtrlmas, yksek rezolsyonlu denatre edici poliakrilamid jel elektroforezinde gerekletirilir.elektroforez mobilitesi en yksek olan bant primere yada baka deyile radyoaktif elemente en yakn yerde sonlanm , en kk DNA fragmentidir ve hangi ddNTP ile oluturulmu ise iaretten yada primerden sonra gelen ilk baz odur. Mobilitesi ilk banta en yakn olan ikinci bant ise ikinci baz gsterir. Bylelikle aadan yukarya doru mobilitesi giderek den bantlarn hangi

15

ddNTP ile oluturulduklar belirlenir ve 5 3 ynne doru olan baz dizilimi belirlenmi olur. a) SekansReaksiyonu Asimetrik amplifikasyon rn, eit hacimde 2.5 M (NH)4HCl ve iki hacim saf etanol ile ktrlr ve %70 'lik etanol ile kelti ykanarak 7-14 l steril distile suda zlr. DNA dizi analizi reaksiyonu, United Biochemical Coorparation firmasnn Version II sequencing reaksiyon kiti kullanlarak yaplmtr. Bu kit Sanger tarafndan gelitirilen DNA dizi analizi yntemine dayanmaktadr (Sanger ,1977). b) Sekans Jelinin Hazrlanmas Sekans reaksiyonundan sonra rnekler %6'lk denatre edici poliakrilamid jel zerinde elektroforeze tabi tutuldu. Sekans jeli, 100 ml son hacim ierisinde, 45 g re, 5.7 g akrilamid, 0.30 g bisakrilamid, 10 ml 10xTBE (1xTBE: 0.1 M Tris, 0.1 M Borik asit, 2mM EDTTA, pH : 8.3) olacak ekilde hazrlanr. Szlp havas alnan 100 ml jel karmna 600 l %10 amonyum per slfat ve 45 l TEMED ilave edilerek sekans elektroforezi camlarnn arasna 4 mm kalnlnda dkld. Polimerizasyon iin 2 saat beklendi. c) DNA Sekans Elektroforezi Polimerizasyonu tamamlanm jel yzeyindeki kristallemi re partiklleri suyla temizlenerek elektroforez aygtna yerletirildi. Yrtc tampon olarak 1X TBE kullanld. Jele, 80 watt, 1800 volt ve 50 mA elektrik akm verilerek 30 dakikalk n elektroforez uyguland. Daha sonra jele DNA rneklerinden 4 l uygulanarak, n elektroforez ile ayn koullarda elektrik akm verildi. d) Otoradyografi Elektroforez sonunda jel, Whatman 3MM kromatografi kad zerine alnarak jel kurutucuda 30 dakika kurutuldu. Daha sonra KODAK X-OMAT X-ray duyarl film ile kaplanarak gece boyu oda ssnda otoradyogram alnd.

16

I.3.4

DNA

DZ

ANALZ

LE

ELDE

EDLEN

VERLERN

DEERLENDRLMES N KULLANILAN METODLAR Elde edilen dizi farkllklarnn deerlendirilmesi blmmz Aratrma Grevlisi Hatice Mergen tarafndan, Amerikada Stanford niversitesi Antropoloji Blmnde aada sz geen bilgisayar programlar kullanlarak gerekletirilmitir. Sonularn deerlendirilmesi amacyla yaplan filogenetik analizler iin PHYLIP 3.5c bilgisayar program kullanlmtr (Felsenstein 1989). Dizilerdeki delesyon ve insersiyonlar ClustalX program ile kaldrlmtr (Higgins & Sharp. 1988). Sekanslarn Neighbor-Joining aac Phylip 3.5c paketi iinde bulunan NEIGHBOR program kullanlarak izildi. Sekanslar arasndaki genetik uzaklk, Kimura two parameter distance metodu kullanlarak ve transisyon/transversiyon oran 10 kabul edilerek hesaplanmtr ( Kimura, 1980). Gruplar arasndaki genetik yap ARLEQIN paketindeki Molecular Variance Analysis Program (AMOVA) ile hesaplanmtr ( Schneider , 1996 ). DISTANCE METOD (Uzaklk metodu) Metod sekans varyasyonlarnn yer ald input bilgisini alr ve bu bilgilerden kken alan baz lmlerle trler aras benzerlik ve farkllklar bularak bu bilgilerle uyum gsteren filogenetik aalar izmektedir. Filogenetik aalar distance matrixi temel alr ve buradaki operational taxonomic units (OTUs) lerin tm iftleri arasndaki genetik uzaklklar (distance) kullanr. Distance metodlarn en basiti, UPGMA ( Unweighted Pair Group Method using Arithmetic Avarage) olarak bilinen klastr algoritm tipidir. Bu metod basitlii ve hz nedeniyle ok fazla popularite kazanmtr. Klastr metodlar en uzak taxa ile bunu izleyen en yakn taxay birletirme yoluyla aa oluturan metodlarn toplamdr. Iki taxa birletirildiinde, kendi zelliklerini kaybederler ve yeni uzaklklar (distance) orijinal matriksten hesaplanr. Genelde bu metodlar sadece bifurcating aalara izin verir. Aa kollarnn uzunluu sfr olabileceinden bu bir snrlandrma deildir. Bu metod distance matriksin (dij) oluturulmas ile balar. En az uzakla sahip iki taxa birletirilir ( bunun ith ve j th taxalar arasnda olduu varsaylr) ve yeni OTU

17

oluturulur. I-th ve j-th taxalar iin dal uzunluklar, aralarndaki uzakln yars olarak alnr ( dij/2). Yeni distance matrix, buradaki ortalama uzaklk ile i-th ve j-th taxasn ieren tm uzaklklarn ye deitirilmesiyle oluturulur. Bylece k-th taxas iin klastrdaki uzaklk dik+djk/2 olarak tanmlanr. Dal uzunluu , OTUlar arasndaki ortalama uzaklk olarak alnr. Bylece tekrar en yakn uzakla sahip OTUlar yada iki taxa biraraya getirilerek birletirilir. Eer en kk uzaklk, k-th ve yeni ( i,j) klastr arasndaysa, l-th taxas iin yeni distance dil+djl+dkl/3 olarak tanmlanr. Genelde OTUi ve OTUj birletirilirse yeni distance dk(ij)=(Ti dki+Tj dkj) / ( Ti+Tj) Ti= OTUdeki taxa says KIMURA TWO PARAMETER DISTANCE METHOD Uzaklk Metodu) Kimura (1980) iki parametreli distance metodunda farkl transisyon ( iki pirimidin ve iki prin arasndaki T hesaplanmtr. Sekanslar sralandktan sonra, transisyon (tipI deiiklik) veya transversiyon (tipII deiiklik) yada her ikisini tayan sekanslar srayla PI, PII yada 1-PI-PII olarak belirtilir. Kimura t zaman sresince deiikliklerden sorumlu olan ayrlmalar, Pt= ( 1-2e _4(+)t +e-8t ) PIIt = ( 1-e _8t ) formllerine gre hesaplanr. Eer k= +2 her birim zamandaki baz deiiminin toplam oran ise , sekans aac iin yaklak uzakln lm; K= - ln [ ( 1- 2pI _pII) 1- 2pII ] ~ 2kt eklindedir. NEIGHBOUR-JOINING METODU Bir dier ok popler distance metodu ise Neighbour-Joining metodudur. Bu metod her dalda ayn evolusyon orann salayan gl tahminleri nedeniyle UPGMA metodunun hatalarn dzeltmektedir. Bununla birlikte unrooted 8 kksz ) aa oluturur. Modifiye edilmi distance matrix, her taxondaki evolusyon hzndaki farkllklarn dzeltilmesiyle oluturulmutur. UPGMA metoduna benzer olarak C, A G mutasyonu) ve transversiyonlar ( pirimidin ve prin arasndaki T, C <->A., G mutasyonu ) oranlarn srasyla ve olarak (ki Parametreli

18

nodelarn en uzak iftleri birletirilir ve bunlarn ortak atasal nodu aaca eklenir, terminal nodlar kesilerek aatan alnr. Bu sadece iki node kalncaya kadar srdrlr. Bu metod modifiye edilmi distance matrixin oluturulmasyla balar. Bunu yapmak iin; 1. ith terminal nodunun trnn dier tm taxalardan olan net uzakl ri= k dik forml kullanlarak hesaplanr. N= mevcut distance matrixteki terminal node says Dik= i ve k arasndaki distance ( dik=dki) 2. Mij rate-corrected distance mmkn olduunca nemsenmeyen i ve j ifti bulunur; Mij = dij - ( ri + rj) / ( N - 2) ( N= taxa says) uzunluu; siu= dij / 2 + ri rj / 2(N - 2) sju= dij - siu ve u dan her bir dier k terminal node ise dku= dik+djk-dij/2 bulunur. 4. Veri matrixten i,j nodlarnn uzaklklar kaldrlr. 5. Eer iki nodedan fazla kalrsa 1. basamaa gidilir. formlleri ile olarak bulunur. 3. i ve j nodelarile birleen yeni u nodu tanmlanr. U nun i ve j den olan dal

19

I.4 BULGULAR ve TARTIMA Trk toplumunda mtDNAs D-loop blgesi dizi eitliliinin saptanmas iin yaplan PCR ve DNA dizi analizleri sonucu 75 kiide toplam 75 nokta mutasyonu tespit edilmitir. Bu mutasyonlar ve D-loop blgesindeki yerleimleri Tablo 1de verilmitir. Bu mutasyonlardan 16223 nkleotitte C T , 16069 nkleotitte C T, 263 nkleotitte A G ve 152 nkleotitte T C deiimleri ekil 4 a, b, c ve dde gsterilmitir. Trklerin Asyadaki tarihleri 3000-4000 yl ncesine gitmektedir, Trkiye ayn zamanda ilk alarda kullanlan g yollar zerinde olup Avrupa ve Asya arasnda bir gei oluturmaktadr (nder,1998). Trkiye Cumhuriyeti 1923 ylnda kurulmu olmasna karn Trkler Anadoluda 11. Yzyldan beri yerleim gstermektedirler. Trkler Avrupadaki Ural dalar ile Asyadaki Altay dalar arasndan km UralAltaic insanlardr. Gnmz Trkiyesinde yerleim gsteren halkn ncleri Anadoluda Seluk Trkleri olarak bilinmektedir . Anadolu yarmadasnda birok Akdeniz, Ortadou ve Asya populasyonu yerleim gstermi ve eitli populasyonlar ve etnik gruplar lkenin bir ucundan dierine hareket etmilerdir. Sonuta populasyonlar Anadoludan Balkanlara ve aksi ynde birbirileriyle karmlardr. Trkiye, M.. 6500den beri Hattiler, Hititler, Frigler, Urartlar, Likyallar, Lidyallar, Ionyallar, Persler, Makedonyallar, Romanlar, Bizansllar, Seluklular ve Osmanllar gibi ok eitli rklar ve milletlere yuva olduu iin Uygarlklar beii olarak tanmlanmaktadr. Dolaysyla, Trk populasyonu ierisinde olduka fazla oranda farkl mitokondriyal haplotip beklenmektedir. eitli dnya populasyonlar iinde mtDNAnn D-loop blgesinin sekans analizini ieren birok alma bulunmaktadr (Cann 1987, Giles 1980, Torroni 1996). Tm bu almalar rklarn kkeninin ve g yollarnn deerlendirilmesinde ok yardmc olmaktadrlar. Yaptmz bu almada Anadolunun be farkl blgesinden en az 14 bireyi rastgele setik. Elimizdeki sekans bilgileri, iki deiken blgede 80 farkl nokta mutasyonun varln gstermitir. Bu polimorfizmlerin bazlar daha nce yaynlanm olmalarna karlk 15 tanesi yeni olup daha nce yaynlanmamtr. Avrupa populasyonlarnda gzlenip de Trk populasyonunda gzlenmeyen polimorfizmler de saptanmtr. (Torroni 1996, Piercy 1993, Callafell izilerek verilmitir. 1996). Bu polimorfizmler Tablo 1de alt

20

21

ekil 4. Mt DNA dizi analizi resimleri; a) nkleotit 16223 te C T, b) nkleotit 16069 te C T, c) nkleotit 263 te A G, d) nkleotit 152 de T C nokta mutasyonlar.

22

Ayrca sekans bilgileri referans diziden 263. pozisyonda farkllk gstermektedir; normalde adenin bulunmas gerekirken guanin bulunmaktadr (ekil 4c). 73. pozisyondaki A G dnm Trk populasyonunda ok yaygn olup skl %66.6dr ve tm lkeye yaylm durumdadr. Yaplan daha nceki almalar bu iki deiimin dier beyazlarda da ok yaygn olduunu gstermitir (Richards 1996 ve Piercy 1993). Horai ve arkadalar tarafndan tanmlanan ve H iplikiindeki yksek polimorfik blge olan 16519. nkleotitteki T C transisyonu da Trk gen havuzunda yksek sklkta bulunmaktadr. Comas ve arkadalarnn almasnda HVS II blgesindeki 73. nkleotitte A tayan bireyler ayr bir haplogrup olarak dnlmtr (Comas 1996). Buna karlk, bizim bilgilerimiz ayn haplogrubu paylaan bireyler arasnda pozisyon 73te bazlarnn A bazlarnn G tadn gstermitir. Benzer sonular 16519. nkleotitteki T C dnm iin de gzlenmitir. Bu nedenle bireyler bu yaygn mutasyonlar gz nnde bulunmakszn haplogruplanmtr. Baz bireylerin sadece bir veya iki deiimi gsterirken dierlerinin ayn blge ierisinde 8-9 deiimi gstermesi artcdr. Tablo Ide de gsterildii gibi bu yaygn mutasyonlarn dnda tm bireyler kendilerine zgl nkleotid paternine sahiptir. Trk populasyonundaki D-loop blgesindeki mutasyonlarn ortaya kma skl lkenin eitli blgelerine farkl ekilde yaylmtr. Richards ve arkadalar ilerinden 5i bu blgede hi deiiklik gstermeyen 14 Trk bireyi de ieren bir ok beyazda HVS I deki dizi varyasyonlarn analiz etmitir (Richards 1996). 16223. ntde gzlenen C T mutasyonu (ekil 4a) Horai ve arkadalarnn yapt almada Dou Asyada zellikle Mongoloid kiiler arasnda ok yaygn olarak bulunmutur. Bu mutasyon Trkler arasnda yaklak %11 sklkla zellikle gney blgelerinden alnan rneklerde gzlenmitir. Bu sonu Trkiyenin bu blgesinin 14. yy da Mongol istilasna uradna dair bilgileri desteklemektedir. Bu mutasyon 16311. nt de yer alan mutasyonla birlikte Negroid kiilerde de gzlenmitir. Bu kombinasyon bizim rneklerimizde sadece bir kiide bulunmutur (Horai 1996, Calafell 1996). Yaplan filogenetik analizler sonucu 5 farkl corafik blgeden elde edilen mutasyonlara bal olarak bu blgeler arasndaki genetik yap incelenmitir. Neighbour-joining metodu kullanlarak izilen filogenetik aa ekil 5te grlmektedir. Elde edilen bu bulgu polimorfizmlerin blgeler arasnda heterojen

23

dalm olduunu gstermektedir. Ayrca hibir blgenin kendine zgl bir genetik yaps olmad saptanmtr. Ancak Karadeniz , Dou-Gneydou Anadoludan alnan rneklerin birbirine yakn genetik zellik gsterirken, Marmara-Ege ve Akdeniz blgelerinin de birbirlerine yakn olduu bulunmutur. anadolu blgesi ise dier blgelerden farkl ancak Karadeniz ve Dou-Gneydou Anadolu blgelerine daha benzer olduu gzlenmitir (ekil 5 ). Trk toplumuna ait rnekler mtDNA veri tabanndan seilen

(http://www.gen.emory.edu/MITOMAP) Asya ve Avrupa toplumlarna ait rneklerle de karlatrldnda Trk rneklerinin beklendii ekilde genetik adan Asya ve Avrupa rnekleri arasnda yer ald bulunmutur. Anadolunun corafik konumu ve tarihte pek ok uygarla ev sahiplii yapm olmas ve eitli g yollar zerinde yer almas nedeniyle genetik adan heterojenlik gsterdii gr bir kez daha teyit edilmitir.

24

ekil 5. MtDNAs D-Loop blgesindeki nkleotit farkllklarna gre blgeler aras ilikiyi gsteren Neighbour-joining metoduna gre izilen filogenetik aa.

25

II.1 MTOKONDRYAL HASTALIKLARLA LGL ALIMALAR Mitokondride vcut enerjisini salayan adenozin trifosfat (ATP) retilir. Mitokondriyi etkileyen bir bozukluk olduu zaman vcudun yaamsal ATP kayna azalacaktr. Eer bu enerji azalmas btn vcudu etkileyecek dzeyde olursa vcudun tm sistemleri kmeye balar. zellikle enerjiye en fazla ihtiyac olan beyin, kalp, iskelet kas hcreleri en fazla zarar gren hcrelerdi r (Wallace,1992). Mitokondriyal hastalklara neden olan mutasyonlar drt ana gruba ayrmak mmkndr. Missens mutasyonlar : Bu grup mutasyonlar oligopeptitde amino asit deiikliine neden olan mutasyonlardr. Bu mutasyonlarn yerleri ve neden olduklar hastalklar Tablo 2de grlmektedir. Maternal kaltm gsteren ve optik sinirin dejenerasyonuyla akut veya yar akut grme kaybyla ortaya kan Lebers Hereditary Optic Neuropathy (LHON) hastalnda eitli mitokondriyal missens mutasyonlarndan biri veya birka birlikte grlr. En yaygn mutasyon ND4 geninde 11778. nkleotidde grlen G A mutasyonudur. Bu mutasyonla birlikte ilave dier missens mutasyonlarn beraber bulunmas hastaln kliniini ok ktletirir ( Newman , 1990). Neurogenic muscle weakness, Ataxia, Retinitis Pigmentosa (NARP) ad verilen retinitis pigmentosa ataxia fel, kalp zayfl, geliim bozukluu gibi bulgular gsteren hastalkta ise en yaygn grlen mutasyon ATPase6 geninin 8993. nkleotidindeki T G mutasyonudur ( Brown , 1992). Biyogenesis mutasyonlar: Genellikle tRNA genlerinde meydana gelen nokta mutasyonlardr. Bu mutasyonlardan en yaygn olanlar, yerleri ve ilgili olduklar hastalklar Tablo 3de grlmektedir. Mitokondriyal miyopati, ragged-red kas fiberleri ve bazen kalp, bbrek, sinir sistemi bozukluklar ortaya kar. Bu mutasyonlardan lsin tRNA geninde yer alan 3243. nkleotiddeki A G mutasyonu en yaygn mtDNA mutasyonudur. MELAS hastalarnda grlen bu mutasyon oligosemptomatik bir klinik gsterir. Pigmentary retinopati, iitme kayb, diabet, periyodik paraliz benzeri nbetler gibi klinik bulgular sz konusudur. O nedenle bu

26

mutasyon MELAS d dier multi-fonksiyonel hastalklarda da rastlanmtr (Hess 1991). Delesyon ve dublikasyon mutasyonlar: Kearn-Sayre sendromu, okler miyopati ve Pearson sendromu vakalarnda eitli delesyonlara rastlanmtr (Rtig 1990). ekil 6da en yaygn grlen delesyonlar verilmitir. Delesyonlara ayrca normal yalanma srecinde, diyabet vakalarnda da rastlanmaktadr (Ballinger, 1992). Mitokondri miktarnda azalma: Hcrelerde mitokondri saysnn az olmas sonucu yeni doanlarda lmcl solunum yetmezlii, kas zayfl karacier, bbrek yetmezlii laktik asidosiz ortaya kar. Mitokondri saysnn az olmas sonucu mitokondriyal gen rnlerinde azalma sz konusudur (Wallace,1992).

ekil 6. MtDNAsnda en yaygn grlen delesyonlar.

27

TABLO 2. Missens mutasyonlar ve ilgili hastalklar.

Hastalk LHON LHON LHON LHON LHON LHON LHON LHON LHON LHON NARP Mutasyonun yeri ND4/11778 ND1/3460 ND1/4160 Cyb/15257 ND1/4216 ND2/4917 ND2/5244 ND5/13708 Cyb/15812 ND1/4136 ATP6/8993 Nkleotid deiiklii G A A G T C G A T C A G G A G A G A A G T G

LHON:Lebers Hereditary Optic Neuropathy NARP:Neurogenic muscle weakness, Ataxia, Retinitis Pigmentosa

TABLO 3. tRNA mutasyonlarna bal hastalklar

Hastalk MERRF MELAS MMC LIMM LIMM FICP CIPO CIPO CIPO CPEO Mutasyonun yeri tRNALys 8344 RNA
Leu

Nkleotid deiiklii A G A G A G A G A G A G A G C G A G A G

3243 3260 15923 4317 10006 12308 12308

tRNA tRNA tRNA

Leu Thr

tRNAThr 15924
Ile Gly

tRNA tRNA

tRNASer 12246
Leu Leu

tRNA

MERRF:Myoclonic Epilepsy and Ragged-Red Muscle Fibers MELAS:Mitochondrial Encephalomyopathy,Lactic Acidosis and Stroke-like episodes MMC :Maternally Myopathy and Cardiomyopathy LIMM :Lethal Infantile Mitochondrial Myopathy FICP :Fetal Infantile Cardiomyopathy Plus, a MELAS -associated cardiomyopathy CIPO : Chronic Intestinal Pseudoobstruction with myopathy and Ophtalmoplegia CPEO : Chronic Progressive External Ophtalmoplegia

28

II.2

PROJE

KAPSAMINDA

YAPILAN

MTOKONDRYAL

HASTALIKLARLA LGL ALIMALAR Mitokondri DNAsnn 3243 pozisyonundaki A G mutasyonu MELAS hastalarnda grlmesine ramen MELAS olmayan fakat pek ok organda fonksiyon bozukluu grlen hastalklarda da rastlanan en yaygn mutasyondur. Bu nedenle mitokondriyal bozukluk phesi ile gnderilen hastalarda mtDNA delesyonu taramas yannda 3243 A G mutasyon taramas da yaplmtr. Projenin bu ksmnda yaplanlar ikiye ayrmak mmkndr; 1) Tablo 3 de grld gibi eitli hastanelerden mitokondriyal hastalk tad phesi olan hastalardan alnan kan rnekleri mtDNAsnda herhangi bir delesyon olup olmad ve yaygn olarak grlen 3243 A G mutasyonunu tayp tamad asndan taranmtr. 2) Pek ok toplumda diabet hastalarnda zellikle taranan mtDNAsndaki 3243 A G mutasyonu ve 10.5 kb delesyon 100 diabetli Trk hastada taranmtr. DNA izolasyonu iin gerekli kan rnekleri Glhane Askeri Tp Akademisi Endokrinoloji ve Metabolizma Bilim Dalnda tedavi gren ve diabet tans konan hastalardan toplanmtr.

Tablo 4. Proje kapsamnda incelenen hastalara ait bilgiler. phelenilen Hastalk Pearson Sendromu Kardiyomyopati Leigh Sendromu Renal Tubular Asidosiz Addison Gelen Hasta Says 15 12 1 7 10 Geldii Hastane Hacettepe niversitesi Hacettepe niversitesi Ankara niversitesi Hacettepe niversitesi GATA

29

II.3 MATERYAL VE METODLAR II.3.1 DNA zolasyonu: 400l kandan Yen ve arkadalarnn metodu uygulanarak total DNA izolasyonu yaplmtr. Bu metot ksm I de detayl olarak anlatlmtr. II.3.2 Southern blot analizi (Delesyonlarn Taranmas): mtDNA delesyonlarnn taranmas iin Southern blot yntemi kullanlmtr. DNAnn membrana transferi iin imdiye kadar kullanlan Southernin yukar doru transfer metodu yerine Zhou ve arkadalarnn 1994te gelitirdikleri aa doru transfer yntemi kullanlmtr (Southern 1975, Zhou 1994). DNA rnekleri Bam HI restriksiyon endonkleaz ile ticari firmann nerdii koullar altnda kesildi. Reaksiyon bir ependorf tpnn iinde aadaki ekilde gerekletirilmitir; 10
o

g genomik DNA, 10 U restriksiyon endonkleaz (Bam HI),

3 l 10xBam HI tamponu konup son hacim steril dH2O ile 30 lye tamamland. 37 C de gece boyu inkbe edildikten sonra, reaksiyon, iinde % 50 gliserol ve % 0.025 bromfenol mavisi bulunan Tris-asetat ( pH=8.0 ) tamponu ilave edilerek durduruldu. Kesilen DNA rnekleri ve marker olarak kullanlan Hind III ile kesilmi DNA s 1xTAE ile hazrlanm % 0.8lik agaroz jele yklenip 1xTAE iinde, 20V elektrik akm uygulanarak gece boyu yrtld. (1xTAE: 0.04 M Tris, 0.012 M Sodyum asetat, 0.018 M NaCl, 2mM EDTA, Asetik asit ile pH: 8.3 e ayarlanm). Elektroforez sonuna jel, 0.5 mg/ml etidyum bromr solsyonu iinde 2 dakika boyanarak 260 nm UV altnda incelendi ve marker fragmentlerinin jel zerindeki yerleri orijine olan uzaklklar llerek belirlendi. Jel uygun bir kap iine alnarak, DNAnn daha iyi transfer olabilmesi iin nce deprinasyonunu salamak amacyla, 0.25 N HCl zeltisi, sonra denatrasyonu salamak amacyla 1.5 M NaCl ve 0.4 N NaOH zeltisi ve son olarak ntralizasyonu salamak amacyla 1.5 M NaCl, 1M Tris-HCl ( pH 7.4 ) zeltisi ile muamele edildi. Ntralizasyon zeltisinden alnan ve distile su ile alkalanan jelin zerine nitroselloz membran dikkatlice yerletirildi. Nitroselloz membrann 2xSSC iinde slatlm birka Whatman 3 MM kad yerletirilir. Bu dzenek 10-15 cm yksekliinde olacak ekilde st ste konmu kuru kat peetelerin zerine ters

30

evrilerek dikkatlice yerletirildi. Bylece bir transfer piramidi hazrlanm oldu. Piramidin en stne transferin salanmas amacyla 10xSSC (1xSSC: 0.015 M Sodyum sitrat, 0.15 M sodyum klorr) emdirilmi snger kondu. ki saatlik transfer boyunca sngere zaman zaman 10xSSC damlatld. Transfer sonunda membran bir Whatman kad zerine alnarak, 260 nm UV k altnda 2 dakika bekletilerek veya 80 oC de vakum altnda 2 saat piirilerek DNAnn membrana skca balanmas saland. Membran Whatman kad arasna konulup stre naylon ile kaplanarak, iaretli prob ile hibridizasyona kadar +4 oC de sakland. II.3.3 Probun Hazrlanmas: Mitokondri genomunun D-loop blgesine ait prob aada anlatlan polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile hazrlanmtr. Sadece reaksiyonda kullanlan primer ifti Dloop blgesine aittir ve dizisi u ekildedir: (primerlerin yeri ve D-Loop blgesinin baz dizisi ekil 3de verilmektedir) Dloop D Dloop R 5- TACACCAGTCTTGTAAACCGGAGA - 3 5- TGCTTTGAGGAGGTAAGCTACATA - 3

PCR sonunda elde edilen 1.2 kblk amplifikasyon rnnn D-loop blgesine ait olduu DNA dizi analizi ile teyit edilmitir. Probun iaretlenmesi: Problar 32P-dATP nkleotidi varlnda ve DNA polimeraz I Klenow Fragmenti ile oligolabelling yntemine gre iaretlendi. Ksaca; syla denatre edilen 1 l prob ( 50-500 nmol) firmann kit iinde salad ve nerdii koullarda iaretleme tamponu ( labelling mixture) , dNTP karm (dTTP, dCTP, dGTP) nkleazsz BSA ( 400 mg/ml), 32P dATP ( 300 nM); Klenow (100U/ml) ile oda ssnda 60 dakika inkbe edilir. 95-100 oC de 3 dakika denatre edilerek buz zerine alnd. aretli prob DNA yapsna girmemi olan serbest radyoaktif nkleotidlerden arndrlmas iin, sephadex G-50 kolonundan geirildi.

31

II.3.4 Prehibridizasyon ve Hibridizasyon Hazrlanan membran, hibridizasyon torbasna alnr ve torbann iine 20 ml prehibridizasyon zeltisi (6xSSC+Denhardts) konarak, membrann slanmas saland. Hibridizasyon torbasnn az naylon yaptrma aleti ile stlarak kapatld. alkalamal su banyosunda 68 oC de en az 5 saat inkbasyondan sonra torbaya 95100 oC de 5 dakika denatre edilen prob eklenip torba yine skca kapatld. 68 oC de alkalamal su banyosunda 24 saat hibridizasyon iin brakld. Hibridizasyon sonras membran fazla radyoaktiviteden arndrlmak amacyla 68 oC de 3xSSC +% 0.5 sodyum dedosil slfat karm ile 10-20 dakika sreyle birka kez ykand. Her ykama sonrasnda membran Geiger sayac ile kontrol edilip membrann temizlenme derecesi belirlendi. Membran son ykama sonrasnda kurutularak, ince stre naylon ile kapland. Rntgen film kasetine yerletirilen membrann zerine X-ray duyarl film konarak, oda scaklnda 5-10 gn sreyle otoradyogram alnd. Prehibridizasyon zeltisi ( 20 ml) : 4 ml 5xFalvell, 1 ml % 4 sr serum albumini, 0.1ml PolyA,15ml H2O, 200l 50mg/ml (ss)Salmon sperm DNA 5xFalvell zeltisi:200 ml iinde; 1 g SDS, 2g Ficol 400, 2g PVP, 180ml 16.5xSSC, 20ml 1M Fosfat tamponu (pH:6.8), 6xSSC+Denharts zeltisi: Litrede, 5 g SDS, 0.2 g BSA, 0.2 g Ficol 400, 0.2 g PVP, 300 ml 20xSSC. II.3.5 3243 A G Mutasyonunun Taranmas tRNALeu Geninde gzlenen mutasyonlar ekil 7de verilmitir. 3243 pozisyonundaki A G mutasyonu da mt genomunda lsin tRNA geni iinde yer alr. Bu nedenle, tRNALeu MtEK D MtEK R gen blgesini amplifiye edecek ekilde zgl olarak dzenlenmi aadaki primerler kullanld. 5 ATGGAAACGGAGAAATTATG 3 5 CCTTCTCACTTGGCAAATAC 3

Amplifiye edilecek olan her bir DNA rnei iin amplifikasyon tp iinde aadaki reaksiyon karm hazrland: DNA 10xTampon ( enzimle beraber gelen ) 10 mM dNTP Direkt ve Revers primerler steril distile su 1-2 g 10 l 2.5 l 1 l ( 100 pmol) 86.5 l

32

DNA nn denatre olmas, muhtemel proteaz kontaminasyonunun nlenmesi ve ekzonkleaz aktivitesinin engellenmesi iin, 94 oC de 4 dakika tutulduktan sonra reaksiyon karmna 2.5 U Taq DNA polimeraz eklendi. Uygulanan PCR Program: 26 dng 94 oC de 1 dakika ( denatrasyon ) 58 oC de 1 dakika ( annealing ) 72 oC de 1 dakika ( zincir uzamas) 294 baz ifti (b) byklndeki amplifikasyon rnnden alnan 20 l rnek Apa I restriksiyon endonkleaz enzimi ile firmann ngrd koullarda reaksiyona konuldu. Kesim sonular % 2 lik agaroz jel elektroforezinde kontrol edildi.

ekil 7. tRNALeu geninde en sk grlen mutasyonlar

33

II.4 BULGULAR VE TARTIMA II.4.1 Mitokondriyal hastalk tad phe edilen hastalarla igili bulgular Mitokondriyal hastalk phesi ile eitli hastanelerden gelen hastalar ile ilgili bilgiler Tablo 4de grlmektedir. Toplam krkbe kiide PCRa dayal restriksiyon endonkleaz analizi ile 3243 A G mutasyonu ve Southern blot yntemi ile delesyon taramas yaplmtr. BamHI nn mtDNA zerinde tek kesim noktas vardr ve bu noktadan kesilen dairesel mtDNAs 16.5 Kilo baz (kb) byklnde dorusal hale gelir. Eer delesyon varsa daha kk bir para oluacaktr. Delesyon tipi mutasyonlar en doru ekilde Southern blot yntemi ile saptanabilir. Mitokondriyal hastalk phesi ile gelen hastalarda yaptmz delesyon taramasnda herhangi bir delesyona rastlanmamtr. ekil 8de baz hastalara ait Southern blot sonucu elde edilen 16.5 kb uzunluunda normal bantlar gsterilmektedir.

ekil 8. Baz hastalara ait mtDNA delesyonu saptanmas iin uygulanan Southern blot sonular

34

Mitokondri genomundaki lsin tRNA geninde 3243. konumda yer alan A G mutasyonu Apa I enzimi iin kesim blgesi oluturur. Bu blgenin 294 b lik PCR rn Apa I ile reaksiyona sokulduunda eer mutasyon varsa 179 ve 115 b lik iki fragment oluturur, mutasyon yoksa sadece 294 b fragment verir. ekil 9de grld gibi allan vakalarda bu mutasyona rastlanmamtr. 3243 A G mutasyonu MELAS hastalarnda grlmektedir. Ancak literatrde MELAS dnda eitli multifonksiyonel bozukluklarda da MELAS mutasyonuna ve eitli byklkteki mtDNA delesyonlarna rastlanmtr bu nedenle bu iki mutasyon mitokondriyal bozukluk olduu phe edilerek gnderilen hastalarda rutin olarak taranmtr. Mitokondriyal hastaln tehisi oldua zordur. Mitokondriyal genomdan sentezlenen rnler oksidatif fosforilasyona katlan enzim komplekslerine ait pek ok proteinden yalnzca 13 tanesidir. Bu nedenle oksidatif bozukluk bu metabolik yolda grev alan ve ekirdek DNA sndan sentezlenen proteinlerin genlerinde de olabilir. Bu nedenle bir hastaln mitokondriyal bir bozukluk olup olmadn anlayabilmek iin nce mt genomundan sentezlenen enzimlerin biyokimyasal olarak aktivitelerine bakmak daha gereki bir yaklam olur. Bozukluun mitokondriden kaynakland kesin olarak bilindikten sonra mtDNAsndaki mutasyonlar aratrlmaldr. Ancak yaptmz almada yukarda sz edilen iki mutasyonun olmamas mitokondriyal bir bozukluk olmadn gstermez. Mitokondriyal DNA zerindeki dier genlerde de eitli nokta mutasyonlar olabilir. En nemli noktalardan birisi de hastalktan etkilenen organdan alnan biyopsi rneklerinden elde edilen mtDNAsnn allmasdr. rnein mitokondriyal bozukluk sonucu ortaya kan bir bbrek yetersizliinde kandan elde edilen mtDNAsnda bir bozukluk grlmezken bbrek biyopsisinden elde edilen mtDNAsnda delesyona rastlanabilir. Her vakadan biyopsi rnei almak ounlukla mmkn olamamaktadr. Ancak son zamanlarda laboratuvarmzda eitli dokulardan mtDNA izolasyonu gelitirilmi ve allmaya balanmtr.

ekil 9. 3243 A G mutasyonunun saptanmas iin Apa I enzimi ile kesime konmu 294 b byklndeki PCR rnnn agaroz jel grnts.

35

II.4.2. Diabetes mellituslu 100 Trk hastada yaplan almalar ile ilgili bulgular almamzn konusunu Glhane Askeri Tp Akademisi Endokrinoloji ve Metabolizma Bilim Dalnda tedavi gren aralarnda akraba ilikisi olmayan ve 50 yan altndayken diabet tans konan hastalar oluturmutur. Hastalarn 53 insline baml olmayan (Tip II, non-insuline-dependent-diabetes mellitus, NIDDM) ve 47 si ise insline baml olan (Tip I, Insuline-dependent-diabetes mellitus, IDDM) diabetli hastalardr. IDDMli hastalarn 14 ve NIDDMli hastalarn 11 i ailevi diabet hikayesi gstermektedir. Bu ailevi diabetli hastalardan 3 IDDMli ve 4 NIDDMli hastann diabetik annesi vardr. NIDDMli hastalardan 4 nde diabetik retinopati, diabetik nropati ve diabetik ayak bulunmaktadr. 1 IDDMli hastada ise polidipsia ve polirea grlmtr. Sarlk, kas zayfl, zeka gerilii gibi bozukluklar hastalarn hibirinde grlmemitir. Son yllarda mitokondriyal gen mutasyonlarnn diabetes mellitus ve buna bal bozukluklara neden olduuna dair almalar yaplmtr. zellikle tRNA
Leu

geninin

3243. pozisyondaki A G mutasyonunun diabetle olan balants ngiltere, Fransa, Japonya, ve Tayvandaki diabetli hastalarda allmtr (Kadowaki 1994, Chuang 1995, alcolado 1995). Ballinger ve arkadalar anneden geen diabet ve sarl olan bir vakada mtDNA da 10.5 kb lk bir delesyon gstermitir (Ballinger 1992). Mitokondriyal lizin tRNAsnda 8244. Pozisyonunda A G mutasyonu ile diabetes mellitus arasndaki ilikiyi aratran almalar da yaplmtr (Lee 1997). Bu almada da insline baml olmayan (NIDDM) 53 diabetli Trk hasta ve insline baml olan (IDDM) 47 diabetli Trk hasta 3243 A G mutasyonu ve 10.5 kblk delesyon asndan taranmtr. Sz konusu mutasyonlar 100 hastann hibirinde bulunmamtr. Sphernia ve arkadalarnn Pima yerlileri arasndaki NIDDM li hastalarda ve Abad ve arkadalarnn eitli rk ve etnik gruptan olan IDDMli ocuk hastalarda yaptklar almalarda bizim sonularmza benzer sonular elde etmilerdir (Sperhnia 1995, Abad 1997). 3243 mutasyonu ile birlikte grlen diabet hastalarnn kliniinde hastalk anneden gei gstermektedir ve sarlkla beraber gitmektedir. Bu almada sunulan hastalarn bazlar anneden gei gstermesine ramen sarlk yoktur. Dominant gei gsteren hastalklarda snrl saydaki aile almalar hastaln anneden getii eklinde grlmesi normaldir. Annede varolan

36

mitokondri mutasyonlar tm ocuklarna geecek ve diabetle birlikte dier organ bozukluklar da kendini gsterecektir. Mitokondri mutasyonlarnn taranmasnda dier nemli bir nokta da etkilenen organa ait dokudaki mtDNAnn incelenmesi kandan elde edilen mtDNAnn incelenmesinden daha ok tercih edilir olmasdr . Ancak dibetes mellitusta kan rneinin incelenmesi yeterlidir. Gerekten de yaplan bir almada IDDMli hastalardan alnan pankreas biyopsi rneklerinde de bir anormallie rastlanmamtr (Imagawa 1995). Trk hastalar ile yaptmz almann sonucu IDDM nin ve NIDDM nin mtDNA mutasyonlarile belirli bir balants olmadn gsteren almalar desteklemektedir. Yaplan bu alma ekte de grld gibi Trk Diabet Dernei tarafndan dllendirilmitir. Balkan Journal of Medical Genetics dergisinde basma kabul edilmitir ( Ek1, Ek2).

37

III. SONU ve NERLER Toplumlarn birbirleri ile olan yaknlklarnn incelenmesinde, evrim almalarnda maternal kaltm gsteren mtDNAs zerinde ok allan bir konu olmutur. Bu amala Avrupa, Asya, Afrika ktalarndan eitli toplumlarda mtDNA dizi analizleri yaplm ve farkllklara gre haplogruplar oluturulmutur. Projemizin kapsamnda gerekletirilen bu alma bu ynde Trkiyede yaplan ilk almadr. Daha nce yurt d yaynlarda Trklere ait baz bilgiler grlmektedir. Ancak bunlar maalesef yurt dna eitli ekilde gnderilen rneklerdir. Bunlarn saylar azdr ve rnekler Trkiyenin belirli bir blgesine aittir. almamzda ise tm Trkiyenin farkl blgelerinden homojen dalm salayacak ekilde rnekler toplanp allmtr. Proje nerildiinde 50 kii ile snrlandrlan say 75 kiiye kartlmtr. Bu almann getirdii dier bir kazan ise populasyon almalarnda elde edilen verilerin deerlendirilerek toplumlar aras yaknlklar ortaya koyan filogenetik aalarn iziminde kullanlan bilgisayar programlarnn renilmesi ve kullanlabilir hale getirilmesidir. Projenin tali amalarndan olan mitokondriyal hastalklar ile ilgili almalarda baaryla yrtlmtr. Trk diabetli hastalarla yaplan alma Trk Diabet Cemiyeti tarafndan dllendirilmi ve Balkan Journal of Medical Genetics dergisinde basma kabul edilmitir (Ek.1, Ek.2). almalarmzda, materyal ve metot blmnde belirtildii gibi klasik Southern blotlama ynteminde uygulanan yukar doru DNA transferi yerine ok daha ksa srede transfere imkan salayan ve daha az kimyasal kullanmna neden olan Zhou ve arkadalarnn gelitirdii aa doru transfer ytemi kullanlmtr. Ayrca baz Southern blot almalarnda prob iaretlemek iin kullanlan kullanlmtr.
32

P yerine daha uzun

yarlanma mrne sahip olan ve salk asndan daha gvenli olduu kabul edilen 35S

38

Tm bu modifikasyonlarn uyguland Southern blot yntemi Journal of Biochemical and Biophysical Methods dergisinde short note olarak basma kabul edilmitir ( Ek.3 ). lkemizde de DNA seviyesindeki almalar olduka ilerlemitir. Bu nedenle kendi toplumumuza ait rneklerin yine kendi lkemizde allmas ve darya gnderilmemesi salanmaldr. Laboratuvarmzda yeterli alt yap ve bilgi birikimi salanmtr. Bundan sonra yaplabilecek populasyon almalarnda Anadoludaki daha kk ve kapal toplumlarn mtDNAs incelenebilir. Dier lkelerde olduu gibi, arkeoloji blmleri ile ortak yrtlen molekler arkeoloji almalar yaplabilir. Mitokondriyal hastalklarla ilgili olarak yine belli bir hastalk grubu seilerek mtDNA mutasyonlar aratrlabilir ya da mtDNA ekspresyonu ile ilgili almalar yaplabilir.

39

IV. KAYNAKLAR
Anderson S, Barrier AT, Barrell BG, et al . Sequence and organisation of the human mitochondrial genome. Nature 1981; 290: 457-465. Brown MD, Voljavec AS, Lott MT, Torron A, Yang CC, Wallace DC. Mitochondrial DNA complex I and III mutations associated with Lebers hereditary optic neuropathy. Genetics, 1992,130: 163-173. Calafell F, Underhill P, Tolun A, , From Asia to Europe: mitochondrial DNA sequence variability in Bulgarians and Turks. Am. J. Hum. Genet. 1996, 60: 35-49. Cann RL, Stoneking M and Wilson AC, Mitochondrial DNA and human evolution. Nature,1987, 235: 31-36. Comas D, Calafell F, Mateu E, Perez-Lezaun A, Bertranpetit J, Geografic variation in human mitochondrial DNA control region sequence: the population history of Turkey and its relationship to the European populations, Mol Biol Evol. 1996, 13: 1067-1077. Felsenstein J, PHYLIP-Phylogeny inference package (version 3.2).Cladistics, 1989,5:164166. Giles RE, Blanc H, Cann HM and Wallace DC, Maternal inheritance of human mitochondrial DNA, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1980, 77: 6715-6719. Hess JF, Parisi MA, Bennett JL, Clayton DA. Impairment of mitochondrial termination by point mutation associated with the MELAS subgroup of mitochondrial encephalomyopathies. Nature 1991, 351: 236-239. Higgins DG, Sharp PM. CLUSTAL: a package for performing multiple sequence alignment on a microcomputer. Gene, 1988, 73: 237-244. Horai S, Murayama K, Hayasaka K, et al. MtDNA polymorphisms in East Asian populations with special reference to the peopling of Japan. Am J Hum Genet. 1996, 59: 579-590. Kimura M, A simple method for estimating evolutionary rate of base substitutions through comparative studies nucleotide sequences, J Mol Evol. 1980, 16: 11-120. Lee HC., Song DY., Li HR., Park JO., Suh HC., Lee E., Lim S., Kim K. and Huh K. Mitochondrial gene transfer ribonucleic acid tRNA Leu (UUR) 3243 and tRNA lys 8344 Mutations and diabetes mellitus in Korea. J Clin. Endo and Metabolism, 1997, 82: 372374. Lehninger AL, Nelson DL, Cox MM. Principles of Biochemistry(2nded).NewYork:Worth Pub, Newman NJ, Wallace DC. Mitochondria and Lebers hereditary optic neuropathy. Am. J. Ophthalmol. 1990; 109: 726-730. nder AT., Trkiyenin etnik yaps, II. Bask, Bilim ve Sanat datm 1999.

40

Piercy R, Sullivan KM, Benson N, Gill P, the application of mitochondrial DNA typing to the study of white Caucasians genetic identification. Int J Leg Med, 1993,106: 85-90. Richards M, Corte-Real H, Forster P, Macaulay V, Wilkenson-Herbots H, Demaine A, , Paleolithic and neolithic lineages in the European mitochondrial gene pool. Am J Hum Genet.1996, 59: 185-203. Rtig A, Cormier V, Blanche S, et al. Pearsons marrow-pancreas syndrome: a multisystem mitochondrial disorder in infancy. J Clin. Invest, 1990, 86: 1601-1608. Saiki R.K, Gelfand DH, Stoffel S, Scharf SJ, Higuchi R, Horn GT, Mullis KB and Erlich HA.,Primer directed enzymatic amplication of DNA with a thermostable DNA polymerase, Science, 1988, 239:487-491. Sanger F, Nicklen S, and Coulson AR, DNA sequences with chain-terminating inhibitors, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1977, 74: 5463-5467. Schneider S, Kueffer JM, Roessli D, Excoffier L, Arlequin: a software environment for the analysis of population genetics data, version 1.0. Genetics and Biometry Lab, University of Geneva, Geneva, 1996. Schon EA, Rizzuto R, Moreas CT, Nakase H, Zeviani M, Dimauro S. A direct repeat is a hotspot for large-scale deletion of human mitochondrial DNA. Science 1989, 244: 346349. Southern EM, Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis, J.Mol.Biol, 1975, 98:503-517. Torroni A, Huoponen K, et al Classification of European mtDNAs from an analysis of three European populations. Genetics, 1996,144: 1835-1850. Torroni A, Huoponen K, Francalaci P, et al, Classification of European mtDNA from an analysis of three European populations. Genetics, 1996, 144: 1835-1850. Wallace DC. Diseases of the mitochondrial DNA. Annu Rev. Biochem. 1992, 61: 1175-1212. Watson JD, Hopkins NH, Roberts JW, Steitz JA, Weiner AM. Molecular Biology of the Gene ( 4th ed). Benjamin Commings Pub Com Ins. 1987. Yen MY, Yen T, Panc C, Liu J, Wei Y, Mitochondrial DNA mutation in Leber's Hereditary Optic Neuropathy. Invest. Opht. and Visual Sci,1992, 33:2561-2566. Zhou MY., Xue D., Gomez-Sanchez EP. and Gomez-Sanchez CE. mproved downward capillary transfer for blotting of DNA and RNA. Biotecniques, 1994, 16:58-59.

KISIM I

MTOKONDR DNASI D-LOOP BLGES DZ ETLLNN ARATIRILMASI LE LGL ALIMALAR

KISIM II

MTOKONDRYAL HASTALIKLARLA LGL ALIMALAR