ELECTROFOREZA PROTEINELOR SERICE

Electroforeza este o metoda fizico-chimica de analiza ce permite separarea proteinelor pe baza diferentelor intre vitezele de deplasare intr-un camp electric aplicat mediului respectiv. Ca urmare a caracaterului lor amfoter, proteinele poseda o sarcina electrica ce depinde de natura moleculei, pH si de compozitia mediului. Moleculele incarcate electric, aflate in solutie si supuse actiunii unui camp electric, vor migra catre electrodul de polaritate opusa. Viteza cu care se deplaseaza o particula intr-un camp electric depinde de mai multi factori: densitatea de sarcina electrica la suprafata particulei (functie de marimea sarcinii si de volumul particulei), densitatea particulei, gradientul de potential (reprezentat de raportul dintre diferenta de potential dintre electrozi si distanta dintre acestea), forta ionica a mediului, vascozitatea lui, temperatura. De aceeasi factori depinde si gradul de rezolutie al unei metode electroforetice, natura suportului folosit si pH-ul mediului fiind decisive. De-a lungul timpului s-au folosit mai multe suporturi electroforetice, gelul de agaroza fiind cel care asigura cea mai buna rezolutie. Se cunosc mai multe tipuri de electroforeza in gel de agaroza: tehnica standard, electroforeza in gel de SDS-agaroza (la care adaugarea SDS - sodium dodecil sulfat in compozitia suportului electroforetic permite separarea fractiunilor pe baza masei moleculare) si focalizarea izoelectrica. Electroforeza in gel de agaroza prezinta cateva avantaje, cele mai importante fiind: gradul mare de rezolutie, specificitate si sensibilitate rapiditatea, conferita de posibilitatea analizei simultane a mai multor parametri, ca urmare a independentei totale a celor doua module (de migrare si colorare) gradul mare de reproductibilitate prin implicarea minima a factorului uman la metodele manuale) diversificarea parametrilor investigati (proteine, lipoproteine, izoenzime, hemoglobine normale si patologice) aplicabilitatea in cazul mai multor lichide biologice (ser dar si urina, LCR si altele), precum si faptul ca pentru aceste lichide nu mai este nevoie de concentrarea lor, fiind astfel inlaturat un neajuns important care facea, de multe ori, impracticabila metoda pentru electroforeza proteinelor urinare, din LCR si din alte fluide hipoproteice

Electroforeza proteinelor serice separare beta1-beta2

Profil electroforetic normal

Hiper gama globulinemie

Banda dubla in zona de mobilitate alfa 2 - ser hemolizat -

Profil monoclonal in zona de mobilitate beta 2

Profil monoclonal in zona de mobilitate gama

Profil biclonal in zona de mobilitate gama

Electroforeza proteinelor serice separare beta total

Profil electroforetic normal

Hiper gama globulinemie

Benzi monoclonale in zona de mobilitate beta

Banda monoclonala in zona de mobilitate gama

Profil biclonal in zona de mobilitate beta

Profil biclonal in zona de mobilitate gama

Aspecte particulare

Pozitia 8 (gel stanga) fibrinogen in zona de mobilitate beta-gama. Pozitia10 (gel dreapta "benzi in mustata" corespunzatoare alfa si beta lipoproteinelor (in zonele de mobilitate alfa2 si beta). (A.Chiva- Investigatia electroforetica in diagnosticul de laborator-ghid de interpretare-Ed. Universitara Carol Davila , Bucuresti, 2008)

ELECTROFOREZA PROTEINELOR SERICE

Permite separarea proteinelor serice in 5 fractiuni (albumina, alfa1, alfa2, beta, gama globuline) la pH 9.2 sau in 6 fractiuni (albumina, alfa1, alfa2, beta 1, beta2, gama globuline) la pH 8.5. Utilizarea amidoschwarz-ului drept colorant confera rezolutie, specificitate si sensibilitate metodei, putand fi detectate, chiar si benzi monoclonale slab reprezentate.

Interpretarea principalelor modificari pe electroforeza proteinelor serice Modificari la nivelul albuminelor

bisalbuminemii tranzitorii sau permanente analbuminemie congenitala hipoalbuminemia apare in: o insuficienta aportului albuminelor in alimentatie (malnutritie cronica severa) o diminuarea sintezei: insuficienta hepatica (ciroze, hepatite) si inflamatii o pierderea lor accentuata pe cale urinara (sindrom nefrotic), digestiva (gastroenteropatie exudativa) sau cutanata(arsuri) o hipercatabolism: sindroame inflamatorii severe, endocrinopatii diverse (tireotoxicoza, sindrom Cushing) hiperalbuminemia fara semnificatie patologica importanta apare frecvent la pacientii cu hemoconcentratie locala sau sistemica sau in urma perfuziilor cu albumina

Alfa-1 globulinele si Alfa-2 globulinele

Cresc in: sindrom nefrotic diabet zaharat miocardoscleroza endocardite bacteriene arsuri boli infectioase reumatism reactii inflamatorii

In reactii de faza acuta se intesifica atat banda alfa-1 cat si alfa-2. Cresterea exclusiva a componentelor alfa-1 poate fi observata in: hepatita cronica reactii de faza acuta insotite de hemoliza terapie cu estrogeni sarcina

Cresterea predominanta a componentelor alfa-2 se intalneste in: poliartrita reumatoida boli cu complexe imune circulante

Scaderea alfa-1 globulinelor apare: in urma unei insuficiente hepatocelulare, malnutritiei sau pierderii de proteine in cazul deficitului congenital de alfa-1 antitripsina

Beta globulinele cresc in:

anemia feripriva dislipidemii boala Cushing gamapatii monoclonale(Ig A, Ig G, lanturi usoare Kappa sau Lambda) hepatite toxice

ciroze, inclusiv alcoolice sindrom nefrotic

Scaderi ale beta globulinelor pot apare in: insuficienta hepatica, malnutritie, pierderi proteice corelate cu diminuarea valorii transferinei in mobilitatea electroforetica in zona beta-1 scaderea fractiunii C3 a complementului, asociata cu o scadere a fractiunii beta-2

Gama globulinele cresc in:

infectii bacteriene parazitoze colagenoze poliartrita reumatoida obstructie biliara hepatita acuta sau cronica ciroza hepatica leucemii mielom multiplu boli inflamatorii

Estomparea sau absenta benzii gama sugereaza un deficit imun (agamaglobulinemie).

Modul de conservare si pastrare a probelor pentru electroforeza

Parametru Electroforeza proteinelor serice Proba de analizat ser Conservare 1 saptamana la 2-8C 1 luna la congelator

Factori de interferenta pentru determinarile electroforetice

Parametru Electroforeza proteinelor serice (standard si HR) Factori de interferenta plasma ca proba de analizat tratament cu anticoagulante hemoliza serului decongelarea probelor Efect prezenta fibrinogenului cu mobilitate beta-gama dublarea peak-ului in zona alfa2 sau beta-globulinica banda suplimentara in punctul de aplicare a probei

Despre electroforez Dei cunoscut nc de la sfritul secolului XIX, electroforeza se afirma c o metoda analitic de separare n urma lucrrilor referitoare la stadiul unor

proteine (1937) elaborate de Arne Tiselius, laureat al premiului Nobel, numit i printele electroforezei. Denumirea de electroforez provine din asocierea cuvntului grec electron (electric) cu cel latin phore (purtator), evidenindu -se astfel rolul esenial al cmpului electric n procedeul descris. Electroforeza este o metod de analiz i separare bazat, n principal pe criterii de sarcin electric i mas molecular. Migrarea diferenial a particulelor ncrcate electric se face sub aciun ea unui cmp electric continuu. Electroforeza proteinelor pe gel de agaroz este tehnica cea mai uoar i mai puin costisitoare, implicnd o cantitate limitat de materiale, un timp de lucru scurt i o reproductibilitate foarte bun. Separarea electroforetic a proteinelor serice prezint un interes major n testele clinice, datorit importantelor informaii pe care le ofer acestea n diverse afeciuni, precum i asupra modalitilor de tratare a acestora Electroforeza proteinelor serice ajut la diagnosticarea diferitelor cazuri clinice, cum ar fi cazuri de mielom multiplu, macroglobulinemie, amiloidoz, sindrom nefrotic, afectiuni hepatice, infecii acute i cronice sau cazuri n care nu se pot explica anumite simptome (oboseal, creterea vitezei de sedimentare a eritrocitelor, dureri de spate, osteoporoz, leziuni osoase, deficiene de imunoglobuline, cre terea calciului, proteinuria Bence Jones, insuficiene renale) PH ul solutiei de migrare joac un rol important n preluarea sarcinilor electrice. n cazul proteinelor, pH -ul la care sarcina global este nula se numete pH izoelectric.

PRINCIPIUL ELECTROFOREZEI

O protein n soluie care are un pH inferior punctului sau izoelectric se va comporta ca o baz i va accepta protonii H+. Ea va deveni astfel ncrcat pozitiv : n mediu acid O protein n soluie care are un pH superior punctului su izoelectric se va comporta ca un acid i va ceda protonii H+. Ea va deveni astfel ncrcat negativ : n mediu bazic Prin urmare stabilirea pH-ului electrolitului purttor constituie condiia eseniala pentru obinerea separrilor. Prin electroforeza serului, n condiiile amintite mai sus, se obin sae fraciuni: albumina,

1-, 2-, - si - globuline. Se poate realiza astfel i o electroforegram a fiecrei migrri. O electroforegram normal este reprezentat n modul urmator :

A. Fraciile proteice din ser separate prin electroforeza pe gel de agaroz. Pot fi observate fraciile albumin, a1 (orosmucoid, a1-antitripsin, a1-antichimotripsin), 2 (-lipoprotein, haptoglobulin, ceruloplasmin, Gc globulin, 2-macroglobulin[), 1 (transferin, hemopexin, -lipoprotein), 2 (IgA, complement C3) i ( fibrinogen, IgG, IgA, IgM, IgD, IgE).

B. Reprezentarea grafic (electroforegram) obinut n urma separrii proteinelor unui ser normal. Valori normale, exprimate procentual i n g/dl, ale fraciilor proteice.