Nkleotidler ve Nkleik Asitlerin Kromatografisi

Efe aml

4.13.1 Nkleik Asitlerin yon Deiim Kromatografisi

yon deiim kromatografisinin ilk kullanm alanlarndan biri nkleik asitlerin bileenlerine ayrlmasyd. Cohn 1953 ylnda anyon deiim kromatografisi kullanarak mono ve oligo nkleotidlerin ayrlmasn gerekletirmitir.

Nkleik asit hidroliz rnlerini ayrmak iin Polystrene'e apraz bal divinilbenzen'e kovalent olarak balanm kuvaterner aminler gibi kuvvetli bazik anyon deitiriciler kullanlmtr. Negatif ykl nkleotidler pH >7de ykl amin gruplarna balanrlar ve pH drlrken yrtme tamponunun tuz konsantrasyonunun arttrlmasyla srayla ayrlrlar.

Gnmzde ribonkleotidlerin ayrlmasnda DEAE-selloz iyon deitiriciler kulanlmaktadr. Drt byk ve birka kk ribonkleotid mikrogranler DEAE-sellozda, 70mM sodyum asetat kullanlarak, pH 4,1'de ayrlmtr.

Oligonkleotidlerin ayrlmas 7M re ieren ayrtrc kullanlarak DEAE-selloz yada DEAE-Sephadex ile yaplabilir. Son 20 birime kadar deoksiribo- ve ribo-oligonkleotidlerin rezolsyonu arivlenmitir.

4.13.2 Nkleik Asitlerin Jel Geirgenlik Kromatografisi

Bozulmam DNA moleklleri, deoksiribonkleotidlerden jel filtrasyon kromatografisi kullanlarak ayrlabilirler. Son nkleotidi ile iaretlenmi DNA, nkleozit trifosfatlardan, pH' 8 olan Tris-EDTA tampon ile dengelenmi Sephadex G-50'den geirilerek yaplabilir.
6

Bozulmam DNA jelden karlp zdrlr. aretli fraksiyonlar "Cerenkov saym" ile belirlenebilir. DNA ve RNA'larn mononkleotidlerden ayrlmas iin bir Sephadex jel kolon hazrlanp, ayrlmay hzlandrmak iin rnek solsyonun jelden santrifj ile geirilmesiyle yaplabilir.

ncelikle plastik bir rngann alt ksm bir miktar steril cam elyaf ile tkanr. rngann ii, 0,1M NaCl ieren Tris-EDTA tampon ile pH 8'de dengelenmi Sephadex G-50 ile doldurulur. rnga daha sonra 2000g'de 4 dakika santrifjlenir ve ieriin rnga boyunca skmas salanr.

Skma sonrasnda rngaya, son hacim 0,9 mL olana kadar Sephadex eklenir ve tekrar santrifjlenir. Kolon daha sonra 2 kez NaCl ieren tamponla ykanr. DNA yada RNA rnekleri kolona 0,1mL eklenir. 0,5mL'lik kk plastik bir tp rngann altna koyularak rn toplanr ve kolon nceki gibi santrifjlenir. DNA ve RNA'y iermesini beklediimiz ilk 0,1 mL rn olarak elde edilirken, mono ve oligonkleotidler rngann iinde kalr.
9

4.13.3 Nkleik Asitlerin Affinite Kromatografisi

Birok mRNA'nn 3' ucunda poliA (poliadenilik asit) segmenti tanmlandktan sonra, oligo(dT)-selloz yada polyU-Sephadex mRNA paralarnn total RNA ekstraktlarndan saflatrlmas iin affinite ligandlar olarak kullanlmtr
10

PoliA kuyruuna sahip RNA moleklleri seici olarak oligo(dT) ksmna balanm ve sonra dk tuz konsantrasyonuna sahip bir tamponla yrtlmtr. Ortamda bulunan ribonkleazlar inaktive etmek iin RNA saf su ierisinde 5 dakikalna 65 C scakla karlmtr.

11

Eit hacimde ykleme tamponu (20mM TrisHCl, pH 7,6; 0,5M NaCl; 1mM EDTA; %0,1 SDS), rnek ile kartrlm ve daha sonra bu karm 1 mL'lik oligo(dT)-selloz kolonuna yklenmitir. Kolonun srasyla steril su, 5mM EDTA ieren 0,1M NaOH, ve steril su ile rnein pH' 8 yada daha dk bir seviyeye gelene kadar ykanmas ile affinite destei salanmtr.
12

rnek eklendikten sonra, oligo(dT)'ye balanmayan moleklleri ayrmak amacyla kolon ykleme tamponuyla ykanmtr. PolyA'ya sahip olan RNA 10mM Tris-HCl (pH 7,6), 1mM EDTA, ve %0,05 SDS ile ayrlmtr. Ayrlan mRNA'ya, rnn NaCl konsantrasyonu 0,5M'a ayarlanarak tekrar ayn kolonda kromatografi uygulanabilir.
13

4.13.4 Nkleik Asitlerin Yksek Basnl Sv Kromatografisi

Nkleik asitler genel olarak iyon deiim ve boyut dlama teknikleri ile ayrlr. Drt transfer RNA, 50 dakikadan az srede zayf anyon deiim teknii ile HPLC'de ayrlr.
14

RNA'lar, 5M re iinde 0,25-0,66M NaCl, 20mM potasyum fosfat (pH 6,5) ve 0,2mM EDTA dorusal tuz gradiyenti ile ayrlr. Denatre ve denatre olmayan koullar altnda jel filtrasyonuyla yksek molekl arlkl RNA'nn preparatif ayrlmas bir LKB-TSKG 4000 SW kolonuyla gerekletirilmitir.

15

rnekler denatre olmayan (25mM KCl, 5mM MgCl2, 50mM Tris-HCl, pH 7,5) yada denatre (6M re, %0,1 SDS, 1mM EDTA, 75mM Tris-HCl, pH 7,5) tamponlara uygulanr. 17mm x 600mm'lik kolonlar ile 50g'a kadar RNA rezolsyon kayb olmadan ayrtrlabilir.

16

Kaynaklar
John F. Robyt & Bernard J. White, 1987, Biochemical Techniques: Theory and Practice, pp. 118-120

17